EA017403B1 - Использование семафорина 6а в качестве промотора миелинизации и дифференцировки олигодендроцитов - Google Patents

Использование семафорина 6а в качестве промотора миелинизации и дифференцировки олигодендроцитов Download PDF

Info

Publication number
EA017403B1
EA017403B1 EA200901067A EA200901067A EA017403B1 EA 017403 B1 EA017403 B1 EA 017403B1 EA 200901067 A EA200901067 A EA 200901067A EA 200901067 A EA200901067 A EA 200901067A EA 017403 B1 EA017403 B1 EA 017403B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
polypeptide
disease
vector
mammal
oligodendrocytes
Prior art date
Application number
EA200901067A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200901067A1 (ru
Inventor
Ален Шедоталь
Ша Ми
Фредерик Бернар
Original Assignee
Байоджен Айдек Эмэй Инк.
Сантр Насьональ Де Решерш Сьянтифик
Юнивесити Пьер Энд Мари Кюри
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Байоджен Айдек Эмэй Инк., Сантр Насьональ Де Решерш Сьянтифик, Юнивесити Пьер Энд Мари Кюри filed Critical Байоджен Айдек Эмэй Инк.
Publication of EA200901067A1 publication Critical patent/EA200901067A1/ru
Publication of EA017403B1 publication Critical patent/EA017403B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0622—Glial cells, e.g. astrocytes, oligodendrocytes; Schwann cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/08—Coculture with; Conditioned medium produced by cells of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение обеспечивает способы для лечения заболеваний, расстройств или повреждений, при которых наблюдается демиелинизация и дисмиелинизация, в том числе рассеянного склероза, посредством введения полипептида Sema6A.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к нейробиологии, неврологии и фармакологии. Более конкретно, оно относится к способам лечения заболеваний, связанных с миелинизацией центральной нервной системы, путем введения полипептида семафорин 6А (8ета6А).
Сведения о предшествующем уровне техники
С демиелинизацией и дисмиелинизацией связаны многие заболевания нервной системы, включая рассеянный склероз (М8), прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию (РМЬ), энцефаломиелит (ЕРЬ), миелолиз моста головного мозга (СРМ), Уоллеровскаую дегенерацию и некоторые наследственные заболевания, такие как адренолейкодистрофия, болезнь Александера и болезнь ПелицеусаМерцбахера (ΡΜΖ). Среди этих заболеваний наиболее распространенным является рассеянный склероз, которым страдают приблизительно 2,5 млн человек в мире.
Обычно рассеянный склероз начинается с поражения нервной системы возвратно-ремиттирующего характера, переходящего затем в хроническую фазу, при которой повреждение нервной системы увеличивается. Рассеянный склероз связан с разрушением миелина, олигодендроцитов и аксонов в участках хронического повреждения. Наблюдаемая при рассеянном склерозе демиелинизация не всегда постоянна, и на ранних стадиях развития заболевания отмечалась ремиелинизация. Для ремиелинизации нейронов центральной нервной системы (ЦНС) необходимы олигодендроциты.
В настоящее время доступны различные способы лечения рассеянного склероза, изменяющие течение заболевания, включая использование кортикостероидов и иммуномодуляторов, таких как интерферон-бета. Кроме того, поскольку олигодендроциты и миелинизация играют ключевую роль в развитии рассеянного склероза, предпринимались попытки разработки терапевтического воздействия для увеличения количества олигодендроцитов или для усиления миелинизации (см., например, Сойеп е! а1., патент США № 5574009; Сйапд е! а1., N. Епд1. 1. Мей. 346:165-73 (2002)). Тем не менее, крайне необходимо разрабатывать дополнительные способы лечения рассеянного склероза.
Семафорины представляют собой секретируемые или мембраносвязанные белки, контролирующие аксональное наведение и миграцию клеток (Кедап е! а1., Να!. №ιΐΓ5θί. 8(11): 1516-1524(2005)). Многие трансмембранные семафорины экспрессируются при развитии ЦНС, однако об их функциях ίη νίνο известно мало. Класс 6 семафоринов включает в себя четыре белка: 8ета6А-8ета6Э-. близкородственные трансмембранным семафоринам беспозвоночных (Еюге & Ри8сйе1. Ετοη!. Βίοδοί. 8:2484-2499 (2003)). Все семафорины содержат семафориновый домен (8ета) и плексин-семафорин-интегриновый домен (Ρ8Ι) (встречающийся в плексинах, семафоринах и интегринах) в Ν-концевой внеклеточной части.
Плексины представляют собой семейство молекул (семейство плексинов), распространенных среди различных видов животных (Митакат1 е! а1., ^еν. Эупат. 220: 246-258 (2001)). Плексины подразделяют на четыре подсемейства, плексин-А, -В, -С и -Ό. У мыши и человека выделены четыре представителя подсемейства плексин-А (плексин-А1, -А2, -А3 и -А4) (см. Катеуата е! а1., ВюсНеш. ВюрНук. Век. Соттип. 226: 396 402 (1996); Катеуата е! а1., Вюсйет. Вюрйук. Век. Соттип. 226: 524-529 (1996); Маейпш е! а1., Ргос. №!1. Асай. δοί. ϋδΑ 93: 674-678 (1996); Татадпопе е! а1., Се11 99: 71-80 (1999); и 8и!о е! а1., Месй. ^еν. 120: 385-396 (2003)). Эктодомены белков подсемейства плексин-А содержат участок размером приблизительно 500 остатков аминокислот, демонстрирующий значительную гомологию с семадоменом, общим для семафоринов (Мигакат1 е! а1., Эете1ор. Эуп. 220: 246-258 (2001)). Известно, что плексины типа А взаимодействуют с семафоринами класса 6 (ТоуоГики е! а1., Сепек Эете1ор. 18: 435-447 (2004)). Например, 8и!о и др. показали, что плексин-А4 является непосредственным рецептором для 8ета6А (1. ^итокск 25(14): 3628-3637 (2005)).
Сущность изобретения
Настоящее изобретение основано на обнаружении того факта, что семафорин 6А (8ета6А) экспрессируется в олигодендроцитах и регулирует их дифференцировку, продолжительность жизни и/или миелинизацию аксонов. Более того, некоторые полипептиды 8ета6А стимулируют выживание, пролиферацию и/или дифференцировку олигодендроцитов, а также миелинизацию нейронов. Изобретение, основанное на этих фактах, в целом относится к способам лечения заболеваний, связанных с демиелинизацией и/или дисмиелинизацией (например, рассеянным склерозом), путем введения полипептида 8ета6А.
В некоторых вариантах реализации изобретение включает способ стимулирования пролиферации, дифференцировки или выживания олигодендроцитов, включающий осуществление контакта олигодендроцитов с эффективным количеством композиции, содержащей выделенный полипептид 8ета6А. В других вариантах реализации изобретение включает способ стимулирования миелинизации нейронов, опосредованной олигодендроцитами, включая осуществление контакта смеси нейронов и олигодендроцитов с эффективным количеством композиции, включающей выделенный полипептид 8ета6А.
Настоящее изобретение относится к способу стимулирования пролиферации, дифференцировки или выживания олигодендроцитов у млекопитающих, или к способу стимулирования миелинизации нейронов у млекопитающих, включая введение нуждающимся в этом млекопитающим эффективных количеств композиции, включающей полипептид 8ета6А.
Также изобретение включает способ лечения заболевания, расстройства или повреждения, связанных с дисмиелинизацией или демиелинизацией, или связанных с гибелью олигодендроцитов или отсут
- 1 017403 ствием их дифференцировки у млекопитающих, включая введение нуждающимся в этом млекопитающим эффективных количеств композиции, включающей полипептид 8етабА.
Другой вариант реализации изобретения включает способ лечения заболевания, расстройства или повреждения, при которых происходит разрушение миелина у млекопитающих, включающий введение терапевтически эффективного количества композиции, включающей полипептид 8етабА.
Другой вариант реализации изобретения включает способ, в котором осуществляют связывание полипептида 8етабЛ с полипептидом плексин-А2 или полипептидом плексин-А4. В других вариантах реализации изобретения полипептид 8етабА является изолированным.
Дальнейшие варианты реализации изобретения включают способ лечения заболевания, расстройства или повреждения, при котором происходит разрушение олигодендроцитов или миелина, путем генной терапии ίη νίνο, которая включает введение млекопитающим (в участке поражения, расстройства или повреждения, или поблизости от него) вектора, содержащего последовательность нуклеотидов, которая кодирует полипептид 8етабА, таким образом, чтобы полипептид 8етабА экспрессировался с указанной последовательностью нуклеотидов у млекопитающего в количестве, достаточном для стимулирования удлинения аксонов нейронов, расположенных в месте повреждения или поблизости от него. В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение включает способ стимулирования пролиферации, дифференцировки или выживания олигодендроцитов, или стимулирования миелинизации нейронов у млекопитающих, включая введение млекопитающим, нуждающимся в данном лечении, эффективных количеств композиции, включающей полинуклеотид, кодирующий полипептид 8етабА.
Изобретение дополнительно включает способ лечения заболевания, расстройства или повреждения, связанного с дисмиелинизацией или демиелинизацией, или связанного с гибелью олигодендроцитов или отсутствием дифференцировки олигодендроцитов у млекопитающих, включающий введение нуждающимся в этом млекопитающим терапевтически эффективного количества композиции, содержащей полинуклеотид, кодирующий полипептид 8етабА. Изобретение далее включает способ лечения заболевания, расстройства или повреждения, при котором происходит разрушение миелина у млекопитающих, включающий введение терапевтически эффективного количества композиции, содержащей полинуклеотид, кодирующий полипептид 8етабА. В некоторых вариантах реализации осуществляют связывание полипептида 8етабА согласно настоящему изобретению полипептидом плексин-А2 или полипептидом плексин-А4. Полинуклеотид, используемый в способе согласно настоящему изобретению, может быть изолирован.
В некоторых вариантах реализации изобретения вектор представляет собой вирусный вектор, выбранный из группы, состоящей из аденовирусного вектора, альфавирусного вектора, энтеровирусного вектора, пестивирусного вектора, лентивирусного вектора, бакуловирусного вектора, герпесвирусного вектора, вектора на основе вируса Эпштейна-Барр, паповавирусного вектора, поксвирусного вектора, вектора на основе вируса коровьей оспы, и вектора на основе вируса простого герпеса.
В некоторых вариантах реализации изобретения, болезнь, расстройство, повреждение или заболевание выбирают из группы, включающей рассеянный склероз (М8), прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию (РМЬ), энцефаломиелит (ЕРЬ), миелолиз моста головного мозга (СРМ), адренолейкодистрофию, болезнь Александера, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера (ΡΜΖ), глобоидно-клеточную лейкодистрофию (болезнь Краббе), Уоллеровскую дегенерацию, ретробульбарный неврит, поперечный миелит, боковой амиотрофический склероз (АЕ8), болезнь Хантингтона, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, травмы спинного мозга, травмы головного мозга, лучевое поражение, неврологические осложнения химиотерапии, инсульт, ишемическую нейропатию зрительного нерва, недостаток витамина Е, изолированный синдром недостатка витамина Е, АВ, синдром Бессена-Корнцвейга, синдром Марчиафава-Бигнами, метахроматическую лейкодистрофию, невралгию тройничного нерва и паралич Белла. В некоторых вариантах реализации изобретения культивируемую клетку-хозяина получают из млекопитающего, которого лечат.
Некоторые полипептиды 8етабА включают фрагменты полипептидов 8етабА, варианты или производные полипептидов 8етабА, лишенные трансмембранного домена и цитоплазматического домена. Полипептиды 8етабА включают полипептиды, содержащие (ί) сигнальную последовательность, (ίί) кета-домен, (ш) ΡδΙ-домен, (ίν) внеклеточный домен, (ν) трансмембранный домен, (νί) цитоплазматический домен, и (νίί) комбинацию двух и более доменов, но не ограничиваются ими. В некоторых вариантах реализации изобретения у полипептида 8етабА отсутствует сигнальная последовательность, кетадомен, ΡδΙ-домен, трансмембранный домен, цитоплазматический домен или комбинация двух и более доменов. В некоторых вариантах, полипептид 8етабА содержит 8ета-домен, но лишен сигнальной последовательности, ΡδΙ-последовательности, трансмембранного домена и цитоплазматического домена. В некоторых вариантах полипептид 8етабА содержит аминокислотные остатки 1-б49 последовательности 8ЕС) ΙΌ N0: 2.
В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид 8етабА применяют посредством болюсной инъекции или хронического вливания. В некоторых вариантах полипептид 8етабА вводят непосредственно в центральную нервную систему. В некоторых вариантах полипептид 8етабА вводят непосредственно в участок хронического повреждения при рассеянном склерозе.
- 2 017403
В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид 8ешабА представляет собой полипептид слияния, содержащий компонент, отличный от 8ешабА. В некоторых вариантах компонент, отличный от 8ешабА. выбирают из группы, состоящей из фрагмента антитела 1д, копмонента сывороточного альбумина, целевого фрагменты, репортерного фрагмента и фрагмента, облегчающего очистку. В некоторых вариантах компонент антитела 1д представляет собой шарнирный фрагмент и Ре-фрагмент.
В некоторых вариантах полипептиды согласно настоящему изоберению конъюгированы с полимером. В некоторых вариантах полимер выбран из группы, состоящей из полиалкенилгликоля, полимерного сахара и полипептида. В некоторых вариантах полиалкенилгликоль представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ). В некоторых вариантах полипептиды согласно настоящему изобретению конъюгированы с 1, 2, 3 или 4 полимерами. В некоторых вариантах общий молекулярный вес полимеров составляет от 5000 до 100000 Да.
Перечень фигур, чертежей и иных материалов
Фиг. 1 представляет собой сравнение последовательностей изоформ полипептида 8етабЛ человека, т.е. изоформ Ά-Ό.
Фиг. 2 - сравнение последовательностей изоформ полипептида 8етабЛ мыши, т.е. изоформ 1-3.
Фиг. 3 - экспрессия 8етабЛ в нервной системе мыши. Экспрессию 8етабЛ в нервной системе мышей Р15 исследовали путем гибридизации ίη кйи. Было обнаружено, что большинство клеток, экспрессирующих 8етабЛ, находятся в белом веществе. Экспрессирующие 8етабЛ клетки в белом веществе, представляют собой олигодендроциты.
Фиг. 4 (изображения А-С): Иммунологический анализ олигодендроцитов 8етабА+/-(А) или 8етабА -/- (В), экспрессирующих миелиновый протеолипидный протеин (РЬР), в передней комиссуре (АС) мышей Р1б. (С) - определение количества клеток, экспрессирующих РЬР в АС на различных стадиях, а именно Р1б, Р30 и Р45.
Фиг. 5 (изображения А-Ό): (А) - созревание олигодендроцитов 8етабА -/- ίη νίίτο. Фрактальная размерность (ΡΌ) была измерена после 48 ч. Левые столбики демонстрируют ΡΌ олигодендроцитов 8етабА -/-, правые столбики демонстрируют ΡΌ олигодендроцитов 8етабА +/-, (В) - олигодендроциты 8етабА /- на стадии 48 ч, визуализованные путем фазово-контрастной микроскопии и иммуноокрашивания анти04 антителами. (С): Созревание ίη νίίτο олигодендроцитов 8етабА -/- на стадии 24 и 48 ч. Левые столбики демонстрируют стадию 24 ч, правые - 48(Ό): Олигодендроциты 8етабА+/- на стадии 48 ч, визуализированные путем фазово-контрастной микроскопии и иммуноокрашивания анти-04 антителами.
Фиг. б (изображения А-С): Миелинизация в совместных культурах клеток ганглиев задних корешков (ЭРС) и олигодендроцитов с добавлением 8етабА-Ре в различных дозах, (А) отрицательный контроль, (В) 0,1 мкг/мл и (С) 0,3 мкг/мл. Степень миелинизации показана путем иммуноокрашиваня с антителами анти-МВР.
Фиг. 7. Мышей подвергали действию купризона и исследовали экспрессию 8етабА при демиелинизации и ремиелинизации. Измеряли количество клеток, экспрессирующих 8етабА, на различных стадиях, т. е. 3-б недель.
Фиг. 8. Изображения А-В иллюстрируют гибридизацию ίη кйи с использованием рибозонда 8етабА в ткани человека, поврежденной вследствие рассеянного склероза, и интактной ткани, при увеличении х1 (А) и х10 (В), изображение С иллюстрирует иммуноокрашивание ткани человека, поврежденной вследствие рассеянного склероза, с использованием антитела человека к 8етабА при увеличении х10.
Фиг. 9 (изображения А-Ό): (А) Анализ методом Вестерн-блот экспрессии полипептида плексин-А2 у мышей плексин-А2 +/+ (дикий тип), плексин-А2 нулевой нокаут (р1ехш-А2-/-) и мутанта по плексинуА2, несущего одиночную аминокислотную замену (А39бЕ) в семафориновом домене (ΝΜΡ454); (В) выравнивание последовательностей плексина-А2, плексина-А4, плексина-А1 и плексина-А3 с целью определения положения аланина (39б); (С) анализ связывания 8етабА с белком плексин-А2 дикого типа, экспрессированным в клетках С08; и (Ό) анализ связывания 8етабА с мутантным белком плексин-А2 А39бЕ, экспрессированным в клетках С08.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения Определения
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют то же значение, которое обычно подразумевается специалистами в области, к которой относится данное изобретение. Настоящая заявка содержит определения, которыми следует руководствоваться в случае противоречий. Термины в единственном числе включают одновременно те же понятия во множественном числе, а термины во множественном числе включают те же понятия в единственном числе, если иное не предусмотрено контекстом. Все публикации, патенты и другие источники, упоминаемые в данной заявке, включены посредством ссылки во всей полноте для любых целей, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретно и индивидуально указана как включаемая посредством ссылки.
Хотя для реализации или тестирования изобретения можно применять методы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящей заявке, подходящие способы и материалы описаны ниже. Материалы, способы и примеры приведены исключительно с целью иллюстрации, и их не следует
- 3 017403 рассматривать как ограничение изобретения. Другие признаки и преимущества данного изобретения станут ясны из подробного описания и формулы изобретения.
Для дальнейшей характеристики данного изобретения представлены следующие термины и определения.
Следует отметить, что конкретный термин относится к одному или нескольким объектам, например термин полипептид следует понимать как представляющий один или несколько полипептидов. Точно также конкретный термин, а также понятия один или более и по меньшей мере один используются здесь как взаимозаменяемые.
В данном описании и формуле изобретения слово включать, или его варианты, например, включает или включающий обозначают включение любого из указываемых объектов или группы объектов, но без исключения любых других объектов или групп объектов.
В данном описании и формуле изобретения, термин состоит из и его варианты, такие как состоять из или состоящий из обозначают включение любого из указываемых объектов или группы объектов, причем ни один из дополнительных объектов или групп объектов не может быть добавлен к описываемому способу, структуре или композиции.
В данном описании и формуле изобретения термин состоит по существу из и его варианты, такие как состоять по существу из или состоящий по существу из обозначают включение любого из указываемых объектов или группы объектов и необязательное включение любых других указываемых объектов или группы объектов, которые принципиально не изменяют существенные или новые признаки описываемого способа, структуры или композиции.
В данной заявке термин антитело обозначает интактный иммуноглобулин или его антигенсвязывающий фрагмент. Антитела согласно настоящеиу изобретению могут относиться к любому изотипу или классу (например, Ό, С, Е и А) или подклассу (например, С1-4. А1-2) и содержать легкую цепь каппа (к) или лямбда (λ).
В данной заявке термин Ее обозначает часть тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит один или более доменов СН1, СН2 и СН3 константной области тяжелой цепи. Например, участок константной области тяжелой цепи антитела, который образуется при расщеплении папаином.
В данной заявке термин гуманизированное антитело обозначает антитело, в котором по меньшей мере часть последовательности, не являющейся человеческой, заменена на последовательность, принадлежащую человеку. Примеры способов создания гуманизированных антител можно найти в патентах США под номерами 6054297, 5886152 и 5877293.
В данной заявке термин химерное антитело обозначает антитело, которое содержит одну или более областей первого антитела и одну или более областей по меньшей мере одного другого антитела. Первое антитело и дополнительные антитела могут принадлежать одному или разным видам животных.
В данной заявке термин терапевтически эффективное количество относится к количеству, эффективному при дозировке, и периоде времени, необходимому для достижения желаемого терапевтического эффекта. Терапевтическим эффектом может являться, например, уменьшение симптомов, более длительное выживание, увеличенная подвижность и т.п. Терапевтический эффект не обязательно является излечением.
В данной заявке термин профилактически эффективное количество относится к количеству, эффективному при дозировке, и в периоде времени, необходимому для достижения желаемого профилактического эффекта. Обычно, поскольку профилактическую дозировку применяют до развития заболевания или на его ранних стадиях, профилактически эффективное количество меньше терапевтически эффективного количества.
В данной заявке термин полинуклеотид обозначает последовательность нуклеотидов полноразмерной кДНК, включая нетранслируемые 5' и З'-участки, кодирующие последовательности, а также фрагменты, эпитопы, домены и варианты последовательностей нуклеиновой кислоты. Полинуклеотид может представлять собой как полирибонуклеотид, так и полидезоксирибонуклеотид, которые могут являться модифицированными или немодифицированными молекулами РНК или ДНК.
Например, полинуклеотиды могут состоять из одно- и двухцепочечной ДНК, причем ДНК представляет собой смесь одно- и двухцепочечных участков; из РНК, которая также представляет собой смесь одно- и двухцепочечных участков; из гибридных молекул, состоящих из ДНК и РНК, которые могут быть одноцепочечными, или, что более характерно, двухцепочечными, или смесью одно- и двухцепочечных участков. Дополнительно, полинуклеотиды могут состоять из трехцепочечных участков, содержащих РНК или ДНК, или РНК вместе с ДНК. Полинуклеотиды могут также содержать одно или несколько модифицированных оснований или остовов ДНК или РНК, модифицированных для стабильности или по другим причинам. Модифицированные основания включают, например, тритилированные основания и необычные основания, такие как инозин. В ДНК и РНК можно вводить разнообразные изменения; таким образом, понятие полинуклеотид охватывает формы, модифицированные химическим, ферментативным или метаболическим путем.
В настоящем изобретении полипептид может состоять из аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями или модифицированными пептидными связями, т.е. пептидными изостерами, и мо
- 4 017403 жет содержать аминокислоты, не относящиеся к 20 генетически кодируемым аминокислотам (например, неприродные аминокислоты). Полипептиды согласно настоящему изобретению могут быть модифицированы в ходе природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, или с использованием способов химической модификации, хорошо известных специалистам в данной области. Такие модификации подробно описаны в различных источниках и более подробно в монографиях, а также в обширной научной литературе.
Модификации могут быть внесены в любой участок полипептида, включая пептидный остов, боковые цепи аминокислот, и амино- и карбоксиконцевые участки. Очевидно, один и тот же тип модификации может быть представлен в разной степени в различных сайтах данного полипептида. Также один полипептид может содержать несколько типов модификаций. Полипептиды могут быть разветвленными, например, в результате убиквитинирования, а также циклическими, с ветвлениями или без них. Циклические, разветвленные и разветвленные циклические полипептиды могут образоваться в результате естественных посттрансляционных процессов или могут быть получены путем синтеза. Модификации включают ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, аминирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение гема, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфотидилинозитола, перекрестное сшивание, циклизацию, образование дисульфидных мостиков, деметилирование, образование ковалентных перекрестных связей, образование цистеина, образование пироглютамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, формирование ОР1-якоря, гидроксилирование, иодирование, метилирование, миристиолирование, окисление, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизация, присоединение селена, сульфатирование. тРНК-опосредуемое присоединение аминокислот к белкам, например, аргинилирование и убиквитинирование (см., например, Рго1ешз-8йис1иге Аиб Мо1еси1аг Рторегйез, 2иб Еб., Т.Е. СгефН!ои, \ν.Η. Ргеешаи апб Сотрапу, Ыете Уогк (1993); Розйтапз1абопа1 Соуа1еи1 МобШсабои οί Рто1ешз, В.С. 1ойпзои, Еб., Асабешк Ргезз, Νον Уогк, рдз. 1-12 (1983); 8е1йет е! а1., Ме111 Епхушо1 182:626-646 (1990); Вайап е! а1., Апп ΝΥ Асаб 8а 663:48-62 (1992).)
Термины фрагмент, вариант, производное и аналог в отношении полипептида 8ета6А согласно настоящему изобретению включают любые полипептиды, сохраняющие, по меньшей мере, некоторую иммуногенность, т.е. способность вызывать иммунный ответ против зета6А, или сохраняющие природную функцию 8ета6А, например способность связываться с любым полипептидом семейства плексин-А, т. е. плексином-А1, плексином-А2, плексином-А3 или плексином-А4. Примером природной функции 8ета6А является его способность связываться с полипептидами плексин-А2 и плексин-А4. Полипептиды 8ета6А, описанные в данной заявке, могут включать фрагмент, вариант или производные молекулы без ограничений при условии, что полипептид 8ета6А сохраняет иммуногенность или одну из естественных функций. Полипептиды 8ета6А согласно настоящему изобретению могут включать протеолитические фрагменты 8ета6А, делеционные фрагменты и, в частности, фрагменты, которые легче достигают места своего действия в организме животного. Полипептидные фрагменты дополнительно включают любую часть полипептида, содержащую антигенный или иммуногенный эпитоп нативного полипептида, включая линейные, а также трехмерные эпитопы. Полипептиды 8ета6А согласно настоящему изобретению могут содержать варианты участков 8ета6А, включая фрагменты, описанные выше, а также полипептиды с аминокислотными последовательностями, нарушенными вследствие аминокислотных замен, делеций или вставок. Такие варианты могут существовать в природе, как аллельные варианты. Под аллельными вариантами понимаются альтернативные формы гена, занимающего определенный локус в хромосоме организма (Оеиез II, Ьетеш, В., еб., 1о1ш \νίΕ\· & 8оиз, Νον Υο^к (1985)). Неприродные варианты могут быть получены с использованием известных способов мутагенеза. Полипептиды 8ета6А могут нести консервативные или неконсервативные замены аминокислот, делеции или дополнительные аминокислоты. Полипептиды 8ета6А согласно настоящему изобретению могут также включать производные молекулы. Например, полипептиды 8ета6А согласно настоящему изобретению могут включать участки 8ета6А, содержащие модификации, которые придают им дополнительные особенности, отсутствующие у природных вариантов полипептида. Примеры этого включают белки слияния и белковые конъюгаты. В настоящем исследовании понятие полипептидный фрагмент или белковый фрагмент относится к короткой аминокислотной последовательности полипептида 8ета6А. Белковые или полипептидные фрагменты могут быть отдельно стоящими или быть частью большего полипептида, в котором фрагменты формируют часть участка. Типичные примеры полипептидных фрагментов согласно настоящему изобретению включают, например, фрагменты, состоящие из приблизительно 5 аминокислот, приблизительно 10 аминокислот, приблизительно 15 аминокислот, приблизительно 20 аминокислот, приблизительно 30 аминокислот, приблизительно 40 аминокислот, приблизительно 50 аминокислот, приблизительно 60 аминокислот, приблизительно 70 аминокислот, приблизительно 80 аминокислот, приблизительно 90 аминокислот, и приблизительно 100 аминокислот.
В данной заявке термины связанный, слитый или слияние взаимозаменяемы. Эти термины относятся к соединению двух и более элементов или компонентов любым способом, включая химическую конъюгацию и рекомбинантные методы. Слияние внутри рамки относится к соединению двух или бо
- 5 017403 лее открытых рамок считывания (ОКБ) с образованием протяженной, более длинной рамки считывания, с сохранением правильной рамки считывания исходной ОКБ. Таким образом, рекомбинантный белок, образованный в результате слияния, представляет собой единый белок, содержащий два или более сегментов, которые относятся к полипептидам, кодируемым исходными ОКБ (сегменты которых не объединяются в естественных условиях). Хотя рамка считывания, таким образом, является непрерывной в пределах двух слитых фрагментов, сегменты могут быть физически или пространственно разделены посредством, например, линкерной последовательности в рамке считывания.
Применительно к полипептидам, термин линейная последовательность, или последовательность, обозначает порядок аминокислот в полипептиде в направлении от амино- к карбоксильному концу, в котором соседние остатки образуют непрерывную первичную структуру полипептида.
В данной заявке термин экспрессия относится к процессу, в ходе которого ген образует биохимическое вещество, например РНК или полипептид. Этот процесс включает любые проявления функционального присутствия гена в клетке, включая, без ограничения, нокдаун генов, а также временную и устойчивую экспрессию. Он также включает, без ограничений, транскрипцию гена в матричную РНК (мРНК), транспортную РНК (тРНК), малую шпилечную РНК(мшРНК), малую интерферирующую РНК(миРНК), или любой другой продукт РНК и трансляцию такой мРНК в полипептид(ы). Если желаемый конечный продукт является биохимическим веществом, экспрессия включает создание этого вещества и любых его предшественников.
Под субъектом, или индивидуумом, или животным, или пациентом, или млекопитающим понимают любой субъект, в частности, относящийся к млекопитающим, в отношении которого желательно проведение диагностики, прогнозирования или терапии. Субъекты, относящиеся к млекопитающим, включают, не ограничиваясь ими, людей, одомашненных животных, сельскохозяйственно значимых животных, диких животных, спортивных животных, домашних животных, таких как собаки, кошки, морские свинки, кролики, крысы, мыши, лошади, крупный рогатый скот, коровы; приматов, таких как человекообразные обезьяны, обезьяны, орангутаны и шимпанзе; животных семейства псовых, таких как собаки и волки, семейства кошачьих, таких как кошки, львы и тигры, семейства непарнокопытных, таких как лошади, ослы и зебры; медведей; мясо-молочный скот, такой как коровы, свиньи и овцы; копытных, таких как олени и жирафы; грызунов, таких как мыши, крысы, хомячки и морские свинки, и т.д. В некоторых вариантах реализации изобретения под млекопитающими понимают субъектов-людей.
8ешабА
Изобретение основано на обнаружении того факта, что полипептиды 8етабА способствуют увеличению числа олигодендроцитов путем стимулирования их выживания, пролиферации и/или дифференцировки. Кроме того, изобретатели обнаружили, что полипептиды 8етабЛ способствуют миелинизации нейронов.
Известно, что природный полипептид 8етабЛ экспрессируется в развивающихся мозге, почках, легких и печени. 8етабЛ также обнаружен в тканях взрослых людей, например в коже (дендритные клетки) и в плацентарных тканях с высокой способностью к регенерации. Ген 8етабЛ человека состоит из 20 экзонов, включая 2 нетранслируемых экзона, занимающих приблизительно б0 т.п.н. (тысяч пар нуклеотидов) последовательности генома на 5 хромосоме.
Полноразмерный полипептид человека 8етабЛ состоит из сигнальной последовательности, внеклеточного домена, трансмембранного домена и цитоплазматического домена. Внеклеточный домен содержит кета-домен и плексин-семафорин-интегриновый домен (Ρ8Ι). Размер полноразмерных полипептидов человека 8етабЛ варьирует от приблизительно 971 аминокислоты до приблизительно 1049 аминокислот, в зависимости от варианта (см. фиг. 1). Подобные варианты существуют для 8етабЛ мыши (см., например, фиг. 2).
Последовательность полипептида из 1030 аминокислот описана как последовательность полипептида человека 8етабЛ и помещена в базу данных ОеиЬапк под номером ΝΡ-065847. Последовательность полипептида человека 8етабЛ обозначена в настоящей заявке как изоформа А и 8ЕО ГО N0:2. 8Е0 ГО N0:1 представляет собой последовательность нуклеотидов, кодирующую 8Е0 ГО N0:2. Последовательность полипептида из 1047 аминокислот описана как вариант последовательности полипептида человека 8етабА и помещена в базу данных ОепЬапк под номером ЕЛУ48937. Полипептид из 1047 аминокислот обозначен здесь как изоформа В и 8Е0 ГО N0:4. Последовательность нуклеотидов, кодирующая 8Е0 ГО N0:4, обозначена 8Е0 ГО N0:3. Еще один вариант полипептида человека 8етабА, состоящий из 971 аминокислоты, помещен в базу данных ОепЬапк под номером ЕЛУ48935. Полипептид из 971 аминокислоты обозначен в настоящей заявке как изоформа С и 8Е0 ГО Ν0:6. Последовательность полипептида из 975 аминокислот описана как вариант последовательности полипептида человека 8етабА и помещена в базу данных ОепЬапк под номером ЕЛУ48934. Полипептид из 975 аминокислот обозначен в настоящей заявке как изоформа Ό и 8Е0 ГО N0:8. Варианты 8етабА человека включают, не ограничиваясь ими, полипептид 8етабА изоформы А с делецией после аминокислоты 1001, в результате чего образуется полипептид из 1000 аминокислот (№1кауата е! а1., Оепоте Кек. 12(11): 1773-1784 (2002); §1таикЬегд е! а1., Ргос. Асаб. 8с1. И.8.А. 99(2б): 1б899-1б903 (2002)). Известны также другие варианты 8етабА (см., например, Рпк1е1 е! а1. Мо1 Сапсег ТНег. 7(1): 233-241 (2007)).
- б 017403
Также описана последовательность полипептида мыши 8еша6А и его варианты. Полипептид мыши 8еша6А из 1031 аминокислоты помещен в базу данных ип1Рго1КВ/8^188-Рго1 еп!гу под номером 035464. Этот полипептид обозначен здесь как изоформа 1 и ВЕС ΙΌ N0:10. Нуклеотидная последовательность, кодирующая ВЕС ΙΌ N0:10, обозначена 8ЕР ΙΌ N0:9. Еще одна полипептидная последовательность из 1005 аминокислот описана как последовательность полипептида мыши 8еша6Л и помещена в базу данных ОепЬаик под номером ЛР288666. Данная полипептидная последовательность обозначена как изоформа 2 и ВЕС ΙΌ N0:12. Последовательность нуклеотидов, кодирующая ВЕС ΙΌ N0: 2, обозначена ВЕС ΙΌ N0:11. Еще один вариант последовательности полипептида мыши 8еша6Л помещен в базу данных итРго1КВ/8то88-Рго1 под номером 035464. Данная последовательность полипептида обозначена в настоящей заявке как изоформа 3 и ВЕС ΙΌ N0: 14. Последовательность нуклеотидов, кодирующая ВЕС ΙΌ N0:14, обозначена ВЕС ВЕС ΙΌ N0:13. Варианты 8еша6Л мыши включают, не ограничиваясь ими, полипептиды с нижеследующими мутациями: А172У, Б201Р, N3370, 8585Н Р685В, ТК703-7048Е, Р7358, Р766Б, Ι856Τ, или К8РННСУЖУЕЖВ8ЕРРКУРрВЕА8863888Е88РУУЕКрЕ8ЕАЕИКрСПЕ8УАУЕ.
Известные полипептиды 8еша6А других животных, включают, не ограничиваясь ими, полипептиды шимпанзе, собаки и рыбы Иашо гепо. Известны варианты полипептидов 8еша6А шимпанзе, например, помещенные в базу данных ОепЬаик под номерами ХР_001150634, ХР_001150901, ХР_001150706, ХР_001151177, ХР_001151109, ХР_001151041, ХР_001150971 и ХР_517889. Не ограничивающими примерами вариантов полипептидов 8еша6А собаки являются последовательности, помещенные в базу данных ОепЬаик под номерами ХР_538552, ХР_859002, ХР_858964, ХР_858921, ХР_858886 и ХР_858843. Полипептиды 8еша6А и их варианты могут быть найдены у других животных.
Обозначения функциональных доменов 8еша6А определены ниже.
Таблица 1. Примеры доменов 8еша6А человека
Домен ЗетабА (изоформа А) 1030 а/к ЗетабА (изоформа В) 1047 а/к ЗетабА (изоформа С) 971 а/к ЗетабА (изоформа ϋ) 975 а/к
Сигнальная последовательность 1-18 1-18 1-18 1-18
Зета-домен 56-472 56-472 56-418 56-472
РЗЕдомен 514-551 514-551 456-492 514-551
Трансмембранный домен 650-670 667-687 591-611 595-615
Цитоплазматический домен 671-1030 688-1047 612-971 616-975
Таблица 2. Примеры доменов 8еша6А мыши
Домен ЗетабА (изоформа 1) 1031 а/к ЗетабА (изоформа 2) 1005 а/к ЗетабА (изоформа 3) 976 а/к
Сигнальная последовательность 1-18 1-18 1-18
8ета-домен 56-474 56-448 56-474
Р81-домен 514-547 488-521 514-547
Трансмембранный домен 650-670 624-644 595-615
Цитоплазматический домен 671-1031 645-1005 616-976
Специалисту в данной области будет понятно, что начальные и конечные остатки доменов, приведенные здесь, могут отличаться в зависимости от компьютерной программы, используемой для моделирования, или от способа, используемого для определения домена. Поэтому различные функциональные домены 8еша6А могут отличаться от указанных выше. Например, функциональные домены полипептида человека 8еша6А изоформы А, т.е. ВЕС ΙΌ N0: 2, могут варьироваться таким образом.
- 7 017403
Таблица 3. Вариации последовательности функциональных доменов 8Е0 Ш N0: 2
Сигнал, поел. Зетадомен Ρ8Ιдомен Транс мембранный домен Цитоплазматичес кий домен Участок низкой сложности
5МАВТ 1-18 56-487 514-569 648-670 671-1030 937-952
ΡΡ05ΙΤΕ п/а 24-512 п/а п/а п/а п/а
рРат п/а 56-491 514-565 п/а п/а п/а
υηίΡΟΓΐ/ 5ЗД58 РоП 1-18 24-512 п/а 650-670 671-1030 п/а
ΝΟΒΙ (ΝΡ 065847) п/а 56-472 514-551 п/а п/а п/а
К1о51егтапп еГ а1. 5-20 42-564 п/а 648-671 671-1030 п/а
На основании вариаций последовательности 8Е0 ГО N0: 2, специалист, обладающий средними навыками в данной области, может выявить варианты последовательностей 8Е0 ГО N03: 4, 6 и 8.
Последовательности функциональных доменов в 8Е0 ГО N0:10, т.е. изоформы 1 полипептида 8ета6А мыши, варьируются следующим образом:
Таблица 4. Вариации последовательности функциональных доменов 8Е0 Ш N0:10
Сигнал. поел. Зетадомен Ρ3Ιдомен Трансмембранный домен Цитоплазматический домен Участок низкой сложности
5 МАРТ 1-18 56-487 514-569 648-670 671-1031 937-951
ΡΒ03ΙΤΕ п/а 24-512 п/а п/а п/а п/а
рРат п/а 56-491 514-569 п/а п/а п/а
υηϊΡΐΌΐΚΒ/ 5ννί83 Рго1 1-18 24-512 п/а 650-670 671-1031 п/а
Сигнал, поел. Зетадомен Ρ8Ιдомен Трансмембранный домен Цитоплазматический домен Участок низкой сложности
ΝΟΒΙ (ΝΡ 061214) п/а 56-474 514-547 п/а п/а п/а
Кроме того, варианты последовательностей 8Е0 ГО N0:12 или 14, или других вариантов мыши или других животных могут быть легко выявлены на основании табл. 2-4.
Плексин-А2
Известно, что полипептид плексин-А2 связывается с полипептидом 8ета6А (8и1о е! а1. №игоп 53: 535 (2007)). Полноразмерный полипептид плексин-А2 человека (8ЕР ГО N0: 15) состоит из сигнальной последовательности, внеклеточного домена, трансмембранного домена и цитоплазматического домена. Внеклеточный домен содержит зета-домен и четыре ГРТ/ТЮ-домена, т.е. 1РТ/Т1О 1-4. 8ета-домен включает аминокислоты 50-523 в 8Е0 ГО N0: 15. ГРТ/ТЮ-домены 1-4 включают аминокислоты 873-967, 967-1053, 1056-1155 и 1158-1251 в 8Е() ГО N0: 15, соответственно. Специалисту в данной области будет понятно, что начальные и конечные остатки доменов, приведенные в настоящей заявке могут различаться в зависимости от компьютерной программы, используемой для моделирования, или от метода, используемого для определения домена.
Последовательности полноразмерных полипептидов человека плексин-А2 варьируют. Один пример варианта полипептида плексин-А2 имеет последовательность из 1894 аминокислот и помещен в базу данных ОепЬапк под номером NР 079455. Также, в данной области техники хорошо известны последовательности плексина-А2 других животных. Например, полипептиды мыши плексин-А2 описаны и помещены в базу данных ОепЬапк под номерами NР_032908, ААН68155, ЕОЫ2938, ЕОЫ2937 и NР_786926.
Плексин-А4
Также известно, что плексин-А4 является рецептором полипептида 8ета6А (8и1о е! а1. №игоп 53: 535 (2007)). Полноразмерный полипептид человека плексин-А4 (8ЕР ГО N0: 16) состоит из сигнальной последовательности, внеклеточного домена, трансмембранного домена и цитоплазматического домена. Внеклеточный домен содержит зета-домен, три Р81-домена, т.е. Р81 1-3, и 4 1РТ/Т1О-домена, т.е. 1РТ/Т1О 1-4. 8ета-домен включает аминокислоты 24-507 в 8Е() ГО N0: 16. Р81-домены включают аминокислоты 509-559, 655-702 и 803-856 в 8Е() ГО N0: 16, соответственно. 1РТ/Т1О-домены 1-4 в полипептиде плексин-А4 включают аминокислоты 858-952, 954-1037, 1040-1139 и 1142-1230 в 8Е() ГО N0: 16, соответственно. Специалисту в данной области будет понятно, что начальные и конечные остатки доменов, приведенные в настоящей заявке, могут различаться в зависимости откомпьютерной программы, используемой для моделирования, или от способа, используемого для определения домена.
Последовательности полноразмерных полипептидов плексин-А4 человека варьируют. Например, различные варианты плексина-А4 помещены в базу данных ОепЬапк под номерами ЕА^83796,
- 8 017403
ΝΡ_001099013, ЕА^83795, ААН28744 и ЕАЬ24077. Более того, описаны также последовательности плексина-А4 у других животных. Например, последовательности полипептидов плексин-А4 мыши помещены в базу данных ОепЬапк под номерами ΝΡ_786926, ВАС56599, ΕΌΕ13705 и ΕΌΕ13704.
Некоторые варианты реализации изобретения предусматривают использование полноразмерного или зрелого полипептида 8ета6А, или растворимого полипептида 8ета6А. Конкретнее, растворимые полипептиды 8ета6А согласно настоящему изобретению включают фрагменты, варианты или производные полноразмерного или зрелого полипептида 8ета6А. Приведенные выше табл. 1-4 описывают различные функциональные домены полипептида 8ета6А. Растворимые полипептиды 8ета6А согласно настоящему изобретению, как правило, включают часть или целый внеклеточный домен полипептида. Растворимые полипептиды 8ета6А согласно настоящему изобретению, как правило не имеют трансмембранного и/или цитоплазматического домена. Специалисту в данной области будет понятно, что полноразмерный внеклеточный домен 8ета6А может содержать дополнительные аминокислоты, или меньше аминокислот, на С- или Ν-конце экстраклеточного домена полипептида, и может содержать внутренние делеции.
Полипептиды 8ета6А человека, которые можно использовать в способах согласно настоящему изобретению включают, не ограничиваясь ими, полипептид 8ета6А, включающий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентична эталонной последовательности аминоксилот, причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей из аминокислот от 56 до 417 в 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 2; от а до 417 в 8Е0 ΙΌ N0:2; от Ь до 417 в 8Е0 ΙΌ N0:2; от 1 до 417 в 8Е0 ΙΌ N0:2; от 56 до с в 8Е0 ΙΌ N0: 2; от а до с в 8Е0 ΙΌ N0: 2; от Ь до с в 8Е0 ΙΌ N0: 2; от 1 до с в 8Е0 ΙΌ N0: 2; от 56 до с' в 8Е0 ΙΌ N0: 6; от а до с в 8Е0 ΙΌ N0: 6; от Ь до с' в 8Е0 ΙΌ N0: 6; от 1 до с' в 8Е0 ΙΌ N0: 6; от 56 до б в 8Е0 ΙΌ N0: 2; от а до б в 8Е0 ΙΌ N0: 2; от Ь до б в 8Е0 ΙΌ N0: 2; от 1 до б в 8Е0 ΙΌ N0: 2; от 56 до б' в 8Е0 ΙΌ N0: 6; от а до б' в 8Е0 ΙΌ N0: 6; от Ь до б' в 8Е0 ΙΌ N0: 6; от 1 до б' в 8Е0 ΙΌ N0: 6; от 56 до е в 8Е0 ΙΌ N0: 2; от а до е в 8Е0 ΙΌ N0: 2; от Ь до е в 8Е0 ΙΌ N0: 2; от 1 до е в 8Е0 ΙΌ N0: 2; от 56 до е' в 8Е0 ΙΌ N0: 6; от а до е' в 8Е0 ΙΌ N0: 6; от Ь до е' в 8Е0 ΙΌ N0: 6; от 1 до е' в 8Е0 ΙΌ N0: 6; от 56 до е в 8Е0 ΙΌ N0: 8; от а до е в 8Е0 ΙΌ N0: 8; от Ь до е в 8Е0 ΙΌ N0: 8; от 1 до е в 8Е0 ΙΌ N0: 8; от 56 до е' в 8ЕО ΙΌ N0: 4; от а до е' в 8ЕО ΙΌ N0: 4; от Ь до е' в 8ЕО ΙΌ N0: 6; от 1 до е' в 8ЕО ΙΌ N0: 8; от 56 до ί в 8ЕО ΙΌ N0: 2; от а до ί в 8ЕО ΙΌ N0: 2; от Ь до ί в 8ЕО ΙΌ N0: 2; от 1 до ί в 8ЕО ΙΌ N0: 2; от 56 до ί в 8Е0 ΙΌ N0: 6; от а до ί в 8Е0 ΙΌ N0: 6; от Ь до ί в 8Е0 ΙΌ N0: 6; от 1 до ί в 8Е0 ΙΌ N0: 6; от 56 до ί в 8ЕО ΙΌ N0: 8; от а до ί в 8ЕО ΙΌ N0: 8; от Ь до ί в 8ЕО ΙΌ N0: 8; от 1 до ί в 8ЕО ΙΌ N0: 8; от 56 до ί в 8ЕО ΙΌ N0: 4; от а до I1 в 8ЕО ΙΌ N0: 4; от Ь до ί в 8ЕО ΙΌ N0: 4; от 1 до ί в 8ЕО ΙΌ N0: 4; и комбинации двух или более указанных последовательностей аминокислот; причем а представляет собой любое целое число между 24 и 56, Ь (любое целое число между 19 и 21), с (любое целое число между 472 и 512), с' (любое целое число между 418 и 453), б (любое целое число между 514 и 569), б' (любое целое число между 455 и 510), е (любое целое число между 570 и 650), е' (любое целое число между 511 и 591), е (любое целое число между 570 и 595), и е' (любое целое число между 570 и 667); ί (любое целое число между 647 и 671), ί (любое целое число между 588 и 612), ί (любое целое число между 592-616), и ί1 (любое целое число между 664 и 688). В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид 8ета6А, который можно использовать в способах согласно настоящему изобретению, связывается с полипептидом плексин-А2 или плексин-А4.
Полипептиды 8ета6А человека, которые можно использовать в способах согласно настоящему изобретению включают полипептид 8ета6А, включающий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентична эталонной последовательности аминоксилот, причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей из аминокислот от 1 до 975 в 8Е0 ΙΌ N0: 8; от 19 до 417 в 8ЕО ΙΌ N0: 2; от 19 до 472 в 8ЕО ΙΌ N0: 2; от 19 до 551 в 8ЕО ΙΌ N0: 2; от 19 до 492 в 8ЕО ΙΌ N0: 6; от 19 до 647 в 8ЕО ΙΌ N0:2; от 19 до 588 в 8ЕО ΙΌ N0: 6; от 19 до 592 в 8ЕО ΙΌ N0: 8; от 19 до 664 в 8ЕО ΙΌ N0: 4; от 56 до 472 в 8ЕО ΙΌ N0: 2; от 56 до 551 в 8ЕО ΙΌ N0: 2; от 56 до 492 в 8ЕО ΙΌ N0: 6; от 56 до 647 в 8ЕО ΙΌ N0:2; от 56 до 588 в 8ЕО ΙΌ N0: 6; от 56 до 592 в 8ЕО ΙΌ N0: 8; от 56 до 664 в 8ЕО ΙΌ N0: 4; от 1 до 649 в 8Е0 ΙΌ N0: 2; [8ета6А-Ес человека из Κ&Ό] от 1 до 590 в 8Е0 ΙΌ N0: 6; от 1 до 594 в 8ЕО ΙΌ N0: 8; от 1 до 666 в 8ЕО ΙΌ N0: 4; от 18 до 703 в 8ЕО ΙΌ N0: 2; от 18 до 644 в 8ЕО ΙΌ N0: 6; от 18 до 648 в 8ЕО ΙΌ N0: 8; от 18 до 720 в 8ЕО ΙΌ N0: 4; от 1 до 648 в 8ЕО ΙΌ N0: 2; от 1 до 589 в 8ЕО ΙΌ N0: 6; от 1 до 593 в 8Е0 ΙΌ N0: 8; от 1 до 665 в 8Е0 ΙΌ N0: 4; и комбинации двух или более указанных последовательностей аминоксилот. В других вариантах реализации изобретения полипептид 8ета6А связывается с полипептидами плексин-А2 или плексин-А4.
В другом варианте реализации изобретения полипептиды человека 8ета6А, которые можно использовать в способах согласно настоящему изобретению включают полипептид 8ета6А, включающий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентична эталонной последовательности аминоксилот, причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей из аминокислот от 56-417 в 8ЕО ΙΌ N0: 2; 55-417 в 8ЕО ΙΌ N0: 2; 54-417 в 8ЕО ΙΌ N0: 2; 53-417 в 8ЕО ΙΌ N0: 2; 52
- 9 017403
417 в 5ЕС ΙΌ N0: 2; 51-417 в 8Ер ΙΌ N0: 2; 50-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 49-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 48-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 47-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 46-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 45-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 44-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 43-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 42-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 41-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 40-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 39417 в 5ЕС ГО N0: 2; 38-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 37-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 36-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 35-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 34-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 33-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 32-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 31-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 30-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 29-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 28-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 27-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 26417 в 5ЕС ГО N0: 2; 25-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 24-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 23-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 22-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 21-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 20-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 19-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 18-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 17-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 16-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 15-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 14-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 13417 в 5ЕС ГО N0: 2; 12-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 11-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 10-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 9-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 8-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 7-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 6-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 5-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 4417 в 5ЕС ГО N0: 2; 3-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 2-417 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-417 в 5ЕС ГО N0: 2; и комбинации двух или более указанных последовательностей аминоксилот, причем указанный полипептид 8ета6А связывается с полипептидами плексин-А2.
В дальнейших вариантах реализации изобретения полипептиды человека 8ета6А, которые можно использовать в способах согласно настоящему изобретению, включают полипептид 8ета6А, включающий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентична эталонной последовательности аминокислот, причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей из аминокислот 40-472 в 5ЕС ГО N0: 2; 41-472 в 5ЕС ГО N0: 2; 42-472 в 5ЕС ГО N0: 2; 43-472 в 5ЕС ГО N0: 2; 44-472 в 5ЕС ГО N0: 2; 45-472 в 5ЕС ГО N0: 2; 46-472 в 5ЕС ГО N0: 2; 47-472 в 5ЕС ГО N0: 2; 48-472 в 5ЕС ГО N0: 2; 49-472 в 5ЕС ГО N0: 2; 50-472 в 5ЕС ГО N0: 2; 51-472 в 5ЕС ГО N0: 2; 52-472 в 5ЕС ГО N0: 2; 53-472 в 5ЕС ГО N0: 2; 54-472 в 5ЕС ГО N0: 2; 55-472 в 5ЕС ГО N0: 2; 56-472 в 5ЕС ГО N0: 2; 57472 в 5ЕС ГО N0: 2; 58-472 в 5ЕС ГО N0: 2; 59-472 в 5ЕС ГО N0: 2; 60-472 в 5ЕС ГО N0: 2; 56-465 в 5ЕС ГО N0: 2; 56-466 в 5ЕС ГО N0: 2; 56-467 в 5ЕС ГО N0: 2; 56-468 в 5ЕС ГО N0: 2; 56-469 в 5ЕС ГО N0: 2; 56-470 в 5ЕС ГО N0: 2; 56-471 в 5ЕС ГО N0: 2; 56-472 в 5ЕС ГО N0: 2; 56-473 в 5ЕС ГО N0: 2; 56474 в 5ЕС ГО N0: 2; 56-475 в 5ЕС ГО N0: 2; 56-476 в 5ЕС ГО N0: 2; 56-477 в 5ЕС ГО N0: 2; 56-478 в 8Е0 ГО N0: 2; 56-479 в 8ЕС ГО N0: 2; 56-480 в 8ЕС ГО N0: 2; и комбинации двух или более указанных последовательностей аминоксилот.
В дальнейших вариантах реализации изобретения, полипептиды человека 8ета6А, которые можно использовать в способах согласно настоящему изобретению, включают полипептид 8ета6А, включающий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентична эталонной последовательности аминокислот, причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей из аминокислот 1-551 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-552 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-553 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-554 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-555 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-556 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-557 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-558 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-559 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-560 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-561 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-562 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-563 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-564 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-565 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-566 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-567 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-568 в 5ЕС ГО N0: 2; 1569 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-570 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-571 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-571 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-572 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-573 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-574 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-575 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-576 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-577 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-578 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-579 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-580 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-581 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-582 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-583 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-584 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-585 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-586 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-587 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-588 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-589 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-590 в 5ЕС ГО N0: 2; 1591 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-592 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-593 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-594 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-596 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-597 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-598 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-599 в 5ЕС ГО N0: 2; 1-600 в 5ЕС ГО N0: 2; и комбинации двух или более указанных последовательностей аминокислот.
В других вариантах реализации изобретения полипептиды человека 8ета6А, которые можно использовать в способах согласно настоящему изобретению, включают полипептид 8ета6А, включающий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентична эталонной последовательности аминокислот, причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей из аминокислот 1-649 в 5ЕС ГО N0: 2; 2-649 в 5ЕС ГО N0: 2; 3-649 в -649 в 5ЕС ГО N0: 2; 4-649 в 5ЕС ГО N0: 2; 5649 в 5ЕС ГО N0: 2; 6-649 в 5ЕС ГО N0: 2; 7-649 в 5ЕС ГО N0: 2; 8-649 в 5ЕС ГО N0: 2; 9-649 в 5ЕС ГО N0: 2; 10-649 в 5ЕС ГО N0: 2; 11-649 в 5ЕС ГО N0: 2; 12-649 в 5ЕС ГО N0: 2; 13-649 в 5ЕС ГО N0: 2; 14649 в 5ЕС ГО N0: 2; 15-649 в 5ЕС ГО N0: 2; 16-649 в 5ЕС ГО N0: 2; 17-649 в 5ЕС ГО N0: 2; 18-649 в 5ЕС ГО N0: 2; 19-649 в 5ЕС ГО N0: 2; 20-649 в 5ЕС ГО N0: 2; 21-649 в 5ЕС ГО N0: 2; 22-649 в 5ЕС ГО N0: 2; 23-649 в 5ЕС ГО N0: 2; 24-649 в 5ЕС ГО N0: 2; 25-649 в 5ЕС ГО N0: 2; 26-649 в 5ЕС ГО N0: 2; и комбинации двух или более указанных х последовательностей аминокислот.
Способы согласно настоящему изобретения дополнительно включают полипептид 8ета6А, включающий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентична эталонной последовательности аминокислот, причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей из
- 10 017403 аминокислот 1-640 в ЛТ) ГО N0: 2; 1-641 в 8Ер ГО N0: 2; 1-642 в 8Ер ГО N0: 2; 1-643 в ЛТ) ГО N0: 2; 1-644 в ЛТ) ГО N0: 2; 1-645 в ЛТ) ГО N0: 2; 1-646 в ЛТ) ГО N0: 2; 1-647 в ЛТ) ГО N0: 2; 1-648 в ЛТ) ГО N0: 2; 1-649 в ЛТ) ГО N0: 2; 1-650 в ЛТ) ГО N0: 2; 1-651 в ЛТ) ГО N0: 2; 1-652 в ЛТ) ГО N0: 2; 1653 в ЛТ) ГО N0: 2; 1-654 в ЛТ) ГО N0: 2; 1-655 в ЛТ) ГО N0: 2; 1-656 в ЛТ) ГО N0: 2; 1-657 в ЛТ) ГО N0: 2; 1-658 в ЛТ) ГО N0: 2; 1-659 в ЛТ) ГО N0: 2; 1-660 в ЛТ) ГО N0: 2; 1-661 в ЛТ) ГО N0: 2; 1-662 в 51Т) ГО N0: 2; 1-663 в ЛТ) ГО N0: 2; 1-664 в ЛТ) ГО N0: 2; 1-665 в ЛТ) ГО N0: 2; 1-666 в ЛТ) ГО N0: 2; 1-667 в ЛТ) ГО N0: 2; 1-668 в ЛТ) ГО N0: 2; 1-669 в ЛТ) ГО N0: 2; 1-670 в ЛТ) ГО N0: 2; и комбинации двух или более указанных последовательностей аминокислот.
Способы согласно настоящему изобретению дополнительно включают полипептид 8ета6Л, включающий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентична эталонной последовательности аминокислот, причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей из аминокислот 1-570 в ЛТ) ГО N0: 4; 1-571 в 51Т) ГО N0: 4; 1-572 в 51Т) ГО N0: 4; 1-573 в 51Т) ГО N0: 4; 1-574 в 51Т) ГО N0: 4; 1-575 в ЛТ) ГО N0: 4; 1-576 в ЛТ) ГО N0: 4; 1-577 в 51Т) ГО N0: 4; 1-578 в ЛТ) ГО N0: 4; 1-579 в 51Т) ГО N0: 4; 1-580 в 51Т) ГО N0: 4; 1-581 в 51Т) ГО N0: 4; 1-582 в 51Т) ГО N0: 4; 1583 в 51Т) ГО N0: 4; 1-584 в 51Т) ГО N0: 4; 1-585 в 51Т) ГО N0: 4; 1-586 в 51Т) ГО N0: 4; 1-587 в 51Т) ГО N0: 4; 1-588 в 8Е0 ГО N0: 4; 1-589 в 8Е0 ГО N0: 4; 1-590 в 8Е0 ГО N0: 4; и комбинации двух или более указанных последовательностей аминокислот.
Способы согласно настоящему изобретению дополнительно включают полипептид 8ета6Л, включающий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентична эталонной последовательности аминокислот, причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей из аминокислот 1-630 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-631 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-632 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-633 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-634 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-635 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-636 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-637 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-638 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-639 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-640 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-641 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-642 в 5ЕО ГО N0: 4; 1643 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-644 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-645 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-646 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-647 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-648 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-649 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-650 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-651 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-652 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-653 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-654 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-655 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-656 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-657 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-658 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-659 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-660 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-661 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-662 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-663 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-664 в 5ЕО ГО N0: 4; 1-665 в 5ЕО ГО N0: 4; 1666 в 8Е0 ГО N0: 4; и комбинации двух или более указанных последовательностей аминокислот.
Способы согласно настоящемй изобретению дополнительно включают полипептид 8ета6Л, включающий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентична эталонной последовательности аминокислот, причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей из аминокислот 45-492 в 5ЕО ГО N0: 6; 46-492 в 5ЕО ГО N0: 6; 47-492 в 5ЕО ГО N0: 6; 48-492 в 5ЕО ГО N0: 6; 49-492 в 5ЕО ГО N0: 6; 50-492 в 5ЕО ГО N0: 6; 51-492 в 5ЕО ГО N0: 6; 52-492 в 5ЕО ГО N0: 6; 53492 в 5ЕО ГО N0: 6; 54-492 в 5ЕО ГО N0: 6; 55-492 в 5ЕО ГО N0: 6; 56-492 в 5ЕО ГО N0: 6; 57-492 в 5ЕО ГО N0: 6; 58-492 в 5ЕО ГО N0: 6; 59-492 в 5ЕО ГО N0: 6; 60-492 в 5ЕО ГО N0: 6; 61-492 в 5ЕО ГО N0: 6; 56-485 в 5ЕО ГО N0: 6; 56-486 в 5ЕО ГО N0: 6; 56-487 в 5ЕО ГО N0: 6; 56-488 в 5ЕО ГО N0: 6; 56489 в 5ЕО ГО N0: 6; 56-490 в 5ЕО ГО N0: 6; 56-491 в 5ЕО ГО N0: 6; 56-492 в 5ЕО ГО N0: 6; 56-493 в 5ЕО ГО N0: 6; 56-494 в 5ЕО ГО N0: 6; 56-495 в 5ЕО ГО N0: 6; 56-496 в 5ЕО ГО N0: 6; 56-497 в 5ЕО ГО N0: 6; 56-498 в 8Е0 ГО N0: 6; 56-599 в 8Е0 ГО N0: 6; и комбинации двух или более указанных последовательностей аминокислот.
Способы согласно настоящемй изобретению дополнительно включают полипептид 8ета6Л, включающий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентична эталонной последовательности аминокислот, причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей из аминокислот 1-580 в 5ЕО ГО N0: 6; 1-581 в 5ЕО ГО N0: 6; 1-583 в 5ЕО ГО N0: 6; 1-584 в 5ЕО ГО N0: 6; 1-585 в 5ЕО ГО N0: 6; 1-586 в 5ЕО ГО N0: 6; 1-587 в 5ЕО ГО N0: 6; 1-588 в 5ЕО ГО N0: 6; 1-589 в 5ЕО ГО N0: 6; 1-590 в 5ЕО ГО N0: 6; 1-591 в 5ЕО ГО N0: 6; 1-592 в 5ЕО ГО N0: 6; 1-593 в 5ЕО ГО N0: 6; 1594 в 5ЕО ГО N0: 6; 1-595 в 5ЕО ГО N0: 6; 1-596 в 5ЕО ГО N0: 6; 1-597 в 5ЕО ГО N0: 6; 1-598 в 5ЕО ГО N0: 6; 1-599 в 5ЕО ГО N0: 6; 1-600 в 5ЕО ГО N0: 6; 2-590 в 5ЕО ГО N0: 6; 3-590 в 5ЕО ГО N0: 6; 4-590 в 5ЕО ГО N0: 6; 5-590 в 5ЕО ГО N0: 6; 6-590 в 5ЕО ГО N0: 6; 7-590 в 5ЕО ГО N0: 6; 8-590 в 5ЕО ГО N0: 6; 9-590 в 5ЕО ГО N0: 6; 10-590 в 5ЕО ГО N0: 6; 11-590 в 5ЕО ГО N0: 6; 12-590 в 5ЕО ГО N0: 6; 13-590 в 5ЕО ГО N0: 6; 14-590 в 5ЕО ГО N0: 6; 15-590 в 5ЕО ГО N0: 6; 16-590 в 5ЕО ГО N0: 6; 17-590 в 5ЕО ГО N0: 6; 18-590 в 8Е0 ГО N0: 6; 19-590 в 8Е0 ГО N0: 6; и комбинации двух или более указанных последовательностей аминокислот.
Способы согласно настоящемй изобретению дополнительно включают полипептид 8ета6Л, включающий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентична эталонной последовательности аминокислот, причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей из
- 11 017403 аминокислот 56-580 в 8Ер ГО N0: 8; 56-581 в 8ЕО ГО N0: 8; 56-583 в 8Ер ГО N0: 8; 56-584 в 8ЕО ГО N0: 8; 56-585 в 8ЕО ГО N0: 8; 56-586 в 8ЕО ГО N0: 8; 56-587 в 8ЕО ГО N0: 8; 56-588 в 8ЕО ГО N0: 8; 56589 в 8ЕО ГО N0: 8; 56-590 в 8ЕО ГО N0: 8; 56-591 в 8ЕО ГО N0: 8; 56-592 в 8ЕО ГО N0: 8; 56-593 в 8ЕО ГО N0: 8; 56-594 в 8ЕО ГО N0: 8; 56-595 в 8ЕО ГО N0: 8; 56-596 в 8ЕО ГО N0: 8; 56-597 в 8ЕО ГО N0: 8; 56-598 в 8ЕО ГО N0: 8; 56-599 в 8ЕО ГО N0: 8; 56-600 в 8ЕО ГО N0: 8; 56-601 в 8ЕО ГО N0: 8; 56602 в 8ЕО ГО N0: 8; 56-603 в 8ЕО ГО N0: 8; 56-604 в 8ЕО ГО N0: 8; 56-605 в 8ЕО ГО N0: 8; 45-595 в 8ЕО ГО N0: 8; 46-595 в 8ЕО ГО N0: 8; 47-595 в 8ЕО ГО N0: 8; 48-595 в 8ЕО ГО N0: 8; 49-595 в 8ЕО ГО N0: 8; 50-595 в 8ЕО ГО N0: 8; 51-595 в 8ЕО ГО N0: 8; 52-595 в 8ЕО ГО N0: 8; 53-595 в 8ЕО ГО N0: 8; 54595 в 8Е0 ГО N0: 8; 55-595 в 8ЕЦ ГО N0: 8; и комбинации двух или более указанных последовательностей аминокислот.
Способы согласно настоящему изобретению дополнительно включают полипептид Зета6А, включающий, состоящий по существу из, или состоящий из последовательности аминокислот, которая по меньшей мере на 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99 или 100% идентична эталонной последовательности аминокислот, причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей из аминокислот 1-580 в 8ЕО ГО N0: 8; 1-581 в 8ЕО ГО N0: 8; 1-583 в 8ЕО ГО N0: 8; 1-584 в 8ЕО ГО N0: 8; 1-585 в 8ЕО ГО N0: 8; 1-586 в 8ЕО ГО N0: 8; 1-587 в 8ЕО ГО N0: 8; 1-588 в 8ЕО ГО N0: 8; 1-589 в 8ЕО ГО N0: 8; 1-590 в 8ЕО ГО N0: 8; 1-591 в 8ЕО ГО N0: 8; 1-592 в 8ЕО ГО N0: 8; 1-593 в 8ЕО ГО N0: 8; 1594 в 8ЕО ГО N0: 8; 1-595 в 8ЕО ГО N0: 8; 1-596 в 8ЕО ГО N0: 8; 1-597 в 8ЕО ГО N0: 8; 1-598 в 8ЕО ГО N0: 8; 1-599 в 8ЕО ГО N0: 8; 1-600 в 8ЕО ГО N0: 8; 1-601 в 8ЕО ГО N0: 8; 1-602 в 8ЕО ГО N0: 8; 1-603 в 8ЕО ГО N0: 8; 1-604 в 8ЕО ГО N0: 8; 1-605 в 8ЕО ГО N0: 8; 2-595 в 8ЕО ГО N0: 8; 3-595 в 8ЕО ГО N0: 8; 4-595 в 8ЕО ГО N0: 8; 5-595 в 8ЕО ГО N0: 8; 6-595 в 8ЕО ГО N0: 8; 7-595 в 8ЕО ГО N0: 8; 8-595 в 8ЕО ГО N0: 8; 9-595 в 8ЕО ГО N0: 8; 10-595 в 8ЕО ГО N0: 8; 11 -595 в 8ЕО ГО N0: 8; 12-595 в 8ЕО ГО N0: 8; 13-595 в 8ЕО ГО N0: 8; 14-595 в 8ЕО ГО N0: 8; 15-595 в 8ЕО ГО N0: 8; 16-595 в 8ЕО ГО N0: 8; 17-595 в 8ЕЦ ГО N0: 8; 18-595 в 8ЕЦ ГО N0: 8; 19-595 в 8ЕЦ ГО N0: 8; и комбинации двух или более указанных последовательностей аминокислот.
В некоторых вариантах реализации изобретения, полипептид Зета6А согласно настощему изобретнию связывается с полипептидами подсемейства плексин-А. Например, полипептид Зета6А связывается с полипептидом плексин-А1, с полипептидом плексин-А2, с полипептидом плексин-А3, или с полипептидом плексин-А4. В других вариантах, 8ета6А может быть изолированным.
Под эталонной последовательностью аминокислот подразумевается указанная последовательность без внесения каких-либо замен аминокислот. Специалист с базовыми знаниями в данной области способен понять, что если замены аминокислот отсутствуют, то изолированью полипептид согласно настоящему изобретению состоит из последовательности аминокислот, которая идентична эталонной последовательности аминокислот.
Полипептиды Зета6А, описанные в настоящей заявке, могут включать различные изменения, такие как замены, вставки или делеции. Типичные аминокислоты, которые могут быть заменены в полипептиде, включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).
Также предусмотрены соответствующие фрагменты полипептидов Зета6А, по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90 или 95% идентичные полипептидам и эталонным полипептидам, описываемым здесь.
Как известно, идентичность последовательностей между двумя полипептидами определяется путем сравнения последовательности аминокислот одного полипептида с последовательностью другого полипептида. Рассматривая в данной заявке вопрос о том, является ли любой отдельно взятый полипептид по меньшей мере приблизительно на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99%, или 100% идентичным другому полипептиду, можно использовать методы и компьютерные программы, известные в данной области, такие как (без ограничения) программа ВЕ8ТЕГТ (Шщсоищи Зесщепсе ЛпаЕхй Раскаде, Уегаюп 8 Еог Ишх, Сеиейс8 Сотри1ег Сгоир. Ишуегайу Векеагсй Рагк, 575 8с1еисе Элуе. Майкоп, XVI 53711). ВЕ8ТЕ1Т использует алгоритм локального выравнивания Смита и Уотермана (8шйй апй Ша1егтап, Айуапсек т Аррйей Ма1йетайс8 2:482-489 (1981)) для определения сегмента наибольшей гомологии между двумя последовательностями. При использовании программы ВЕ8ТЕГТ, или любой другой программы для выравнивания последовательностей с целью определения того, является ли конкретная последовательность, например, на 95% идентичной последовательности, используемой для сравнения, в соответствии с настоящим изобретением, параметры, конечно, должны быть заданы таким образом, чтобы процент идентичности рассчитывался по всей длине эталонной последовательности полипептида и допускались пропуски в гомологии до 5% от общего числа аминокислот в последовательности, используемой для сравнения.
В соответствии со способами настоящего изобретения полипептид Зета6А или фрагмент полипептида может быть введен непосредственно в качестве готового полипептида. Как описано в другом месте настоящей заявки, полипептид Зета6А можно вводить в форме полинуклеотида, который поглощается
- 12 017403 клетками и экспрессируется в них. Например, полинуклеотид, кодирующий 8етабА. может быть введен в виде вирусного вектора.
Способы лечения с использованием полипептидов 8ешабА
В одном из вариантов реализации изобретения обеспечивается способ лечения болезни, заболевания или поражения, связанного с дисмиелинизацией и демиелинизацией, например рассеянного склероза, у животного, страдающего данным заболеванием, причем данный способ включает, состоит по существу из, или состоит из введения животному эффективного количества полипептида 8етабЛ или его фрагмента, растворимого полипептида 8етабЛ, или его вариантов, производных или аналогов.
Дополнительно изобретение ориентировано на способ стимулирования миелинизации нейронов у млекопитающих, причем данный способ включает, состоит по существу из, или состоит из введения млекопитающему терапевтически эффективного количества полипептида 8етабЛ или его фрагмента, растворимого полипептида 8етабЛ, или его вариантов, производных или аналогов.
В дополнительном варианте реализации изобретения обеспечиваются способы лечения болезни, заболевания или поражения, ассоциированных с гибелью олигодендроцитов или снижением их дифференцировки, например рассеянного склероза, болезни Пелицеуса-Мерцбахера или глобоидно-клеточной лейкодистрофии (болезни Краббе), у животных, страдающих от этого заболевания, причем данный способ включает, состоит по существу из, или состоит из введения животному эффективного количества полипептида 8етабЛ или его фрагмента, растворимого полипептида 8етабЛ, или его вариантов, производных или аналогов.
Другой вариант реализации изобретения включает способ стимулирования пролиферации, дифференцировки и выживания олигодендроцитов у млекопитающих, причем данный способ включает, состоит по существу из, или состоит из введения терапевтически эффективного количества полипептида 8етабЛ или его фрагмента, растворимого полипептида 8етабЛ, или его вариантов, производных или аналогов.
Настоящее изобретение ориентировано на способ стимулирования пролиферации, дифференцировки или выживания олигодендроцитов, включая осуществление контакта олигодендроцитов с эффективным количеством композиции, содержащей полипептид 8етабЛ. Далее настоящее изобретение ориентировано на способ стимулирования миелинизации нейронов, опосредованной олигодендроцитами, включая осуществление взаимодействия смеси нейронов и олигодендроцитов с эффективным количеством композиции, содержащей изолированный полипептид 8етабЛ.
Полипептид 8етабЛ, подлежащий использованию в способах лечения, указываемых здесь, может быть приготовлен и использован в качестве терапевтического агента, который индуцирует, способствует, активирует или стимулирует способность 8етабЛ к регуляции миелинизации нейронов олигодендроцитами. Дополнительно, полипептид 8етабЛ, подлежащий использованию в способах лечения, указываемых здесь, может быть приготовлен и использован в качестве терапевтического агента, который индуцирует, способствует, активирует или стимулирует способность 8етабЛ к регуляции дифференцировки, пролиферации и выживания олигодендроцитов.
Дальнейшие варианты реализации изобретения включают способ индукции пролиферации или выживания олигодендроцитов, с целью лечения заболевания, расстройства или поражения, при которых наблюдается разрушение олигодендроцитов или миелина, причем данный способ включает введение млекопитающему в месте повреждения, расстройства или поражения, или рядом с ним, в количестве, достаточном для снижения ингибирования аксонального удлинения и стимулирования миелинизации.
В другом варианте реализации изобретение ориентировано на способ стимулирования пролиферации, дифференцировки или выживания олигодендроцитов у млекопитающих, причем способ включает введение млекопитающему, нуждающемуся в лечении, эффективного количества композиции, содержащей изолированный полинуклеотид, который кодирует полипептид 8етабЛ, указанный здесь, или способ стимулирования миелинизации нейронов у млекопитающих, причем способ включает введение млекопитающему эффективного количества композиции, содержащей изолированный полинуклеотид, который кодирует полипептид 8етабЛ, указанный здесь.
Изобретение также включает способ лечения болезни, расстройства или поражения, связанных с миелином, или дисмиелинизацией, или демиелинизацией, или болезни, расстройства или поражения, связанных с гибелью олигодендроцитов или отсутствием их дифференцировки у млекопитающих, причем способ включает введение млекопитающему, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества композиции, содержащей изолированный полинуклеотид, который кодирует полипептид 8етабЛ.
В соответствии со способами настоящего изобретения полипептид 8етабЛ можно применять путем непосредственного назначения пациенту полипептида 8етабЛ. Альтернативно, полипептид 8етабА можно применять, используя экспрессионный вектор, который продуцирует специфический полипептид 8етабА. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид 8етабА применяется в способе лечения, который включает: (1) трансформацию или трансфекцию имплантируемой клетки-хозяина нуклеиновой кислотой, например, вектором, который экспрессирует полипептид 8етабА; и (2) имплантирование трансформированной клетки-хозяина млекопитающему в место повреждения, расстройства или
- 13 017403 поражения. Например, трансформированная клетка-хозяин может быть имплантирована в очаг хронического поражения при рассеянном склерозе. В некоторых вариантах реализации изобретения имплантируемую клетку-хозяин берут у млекопитающего, некоторое время культивируют, трансформируют или осуществляют трансфекцию изолированной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид 8етабА, и имплантируют обратно тому же млекопитающему, у которого была взята клетка. Клетка может быть (хотя и необязательно) взята из того же места, куда затем будет имплантирована. Такие способы реализации изобретения, известные как генная терапия ех νίνο, могут обеспечивать продолжительное снабжение полипептидом 8етабА, локализованное в месте действия, в течение ограниченного периода времени.
Заболевания и расстройства, которые можно лечить, или облегчать их течение, посредством способов, описываемых в настоящем изобретении, включают заболевания, расстройства или поражения, которые относятся к дисмиелинизаци и демиелинизации нейронов млекопитающих; более конкретно, заболевания и расстройства, при которых миелин, окружающий нейрон, отсутствует, или не полностью присутствует, или не формируется должным образом, или портится. Такие заболевания включают, без ограничения, рассеянный склероз, включая рассеянный склероз возвратно-ремиттирующего характера, вторично прогрессирующие и первично прогрессирующие формы рассеянного склероза; прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию (РМЬ), энцефаломиелит (ЕРЬ), миелолиз моста головного мозга (СРМ), адренолейкодистрофию, болезнь Александера, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера (ΡΜΖ), глобоидно-клеточную лейкодистрофию (болезнь Краббе), Уоллеровскую дегенерацию, ретробульбарный неврит и поперечный миелит.
Заболевания и расстройства, которые можно лечить или облегчать их течение, посредством способов, описываемых в настоящем изобретении, включают нейродегенеративные заболевания или расстройства. Такие заболевания включают, не ограничиваясь ими, боковой амиотрофический склероз, болезнь Хантингтона, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона.
Примеры дополнительных болезней, расстройств и поражений, которые можно лечить, или облегчать их течение, посредством способов, описываемых в настоящем изобретении, включают, не ограничиваясь ими, травмы спинного мозга, хроническую миелопатию или радикулопатию, травмы головного мозга, заболевания моторных нейронов, повреждения аксонов, контузии, паралич, лучевое поражение или другие неврологические осложнения химиотерапии, инсульт, большие лакуны, средние и большие непроходимости сосудов, лейкоареоз, ишемическую нейропатию зрительного нерва, недостаток витамина Е (синдром недостатка изолированного витамина Е, АК, синдром Бессена-Корнцвейга), недостаток витаминов В12, Вб (пиридоксин - пеллагра), тиамина, фолата, никотиновой кислоты, синдром Марчиафава-Бигнами, метахроматическую лейкодистрофию, невралгию тройничного нерва, паралич Белла или любые поражения нервной системы, при которых необходима регенерация аксонов, ремиелинизация или выживание, а также дивверенцировка/пролиферация олигодендроцитов.
Белки слияния и конъюгированные полипептиды
Некоторые варианты реализации изобретения включают использование полипептида 8етабА, слитого с частью гетерологичного белка с образованием белка слияния. Такие белки слияния могут быть использованы для достижения различных целей, например, для увеличения периода полужизни сыворотки крови, улучшения биодоступности, нацеливания ίη νίνο на специфический орган или тип ткани, улучшения рекомбинантным путем эффективности экспрессии, улучшение секреции клетки-хозяина, облегчения очистки и усиления связей в молекуле. В зависимости от желаемой цели гетерологичная часть может быть инертной или биологически активной. Также она может быть стабильно сшита с участком полипептида 8етабА, описываемого в изобретении, или расщеплена ίη νίίτο или ίη νίνο. Гетерологичные части, способные удовлетворять указанным условиям, известны в данной области знаний.
В качестве альтернативы экспрессии белка слияния выбранная гетерологичная часть может быть создана и химически связана с участком полипептида 8етабА, описываемого в изобретении. В большинстве случаев выбранная гетерологичная часть должна функционировать подобным образом при слиянии или связывании с участком полипептида 8етабА. Поэтому в нижеследующем описании гетерологичных аминокислотных последовательностей, если не указано иного, подразумевается, что гетерологичная последовательность может быть соединена с участком полипептида 8етабА в форме белка слияния или продукта химического связывания (включая ковалентные и нековалентные связи) с полипептидами или другими соединениями. Например, полипептиды 8етабА могут быть рекомбинантно слиты или химически связаны с молекулами, которые можно использовать как метки при детекционном анализе, и с эффекторными молекулами, например, гетерологичными полипептидами, лекарствами, радионуклидами, или токсинами (см., например, РСТ риЫ1еа1юп8 νθ 92/08495; νθ 91/14438; νθ 89/12б24; и.8. Ра1еп1 Νο. 5,314,995; и ЕР 39б,387).
Полипептиды 8етабА, которые могут быть использованы в способах лечения, описываемых здесь, включают производные, модифицированные, например, посредством ковалентного присоединения молекул любого типа, причем ковалентно присоединенная к полипептиду 8етабА молекула не вызывает ингибирования биологической функции 8етабА. Например, но не для введения каких-либо ограничений, полипептиды 8етабА, описываемые в настоящем исследовании, можно модифицировать, например, посредством гликозилирования, ацетилирования, пегилирования, фосфилирования, фосфорилирования,
- 14 017403 аминирования, образования производных белка с введением известных защитных/блокирующих групп, протеолитического расщепления, связывания с клеточными лигандами или другими белками, и т.д. Любые из многочисленных химических модификаций могут быть осуществлены с использованием известных способов, включая, но не ограничиваясь ими, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез туникамицина и т.д. Дополнительно, производное может содержать одну или более неприродных аминокислот.
Полипептиды 8ета6А, которые могут быть использованы в способах лечения, описываемых здесь, могут состоять из аминокислот, соединенных между собой пептидными связями или модифицированными пептидными связями, т.е. пептидными изостерами, и могут содержать аминокислоты, не относящиеся к 20 аминокислотам, кодируемым генами. Полипептиды 8ета6А могут быть модифицированы в ходе природных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, или с использованием подходов химических модификаций, хорошо известных специалистам в данной области. Такие модификации подробно описаны в различных текстах и более детально в монографиях, а также в обширно представленной научной литературе. Модификации могут быть внесены в любой участок полипептида 8ета6А, включая пептидный остов, боковые цепи аминокислот, и амино- и карбоксиконцевые участки, или в участки небелковой природы, например, углеводородные участки. Предпочтительно один и тот же тип модификации может быть представлен в той же или слегка отличающейся манере в различных сайтах данного полипептида 8ета6А. Также заданный полипептид 8ета6А может содержать несколько типов модификации. Полипептиды 8ета6А могут быть разветвленными, например, в результате убиквитинирования, а также циклическими, с ветвлениями или без них. Циклические, разветвленные и разветвленные циклические полипептиды 8ета6А могут образоваться в результате естественных посттрансляционных процессов или могут быть созданы синтетическими способами. Модификации включают ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, аминирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение гема, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липида или липидного производного, ковалентное присоединение фосфотидилинозитола, перекрестное сшивание, циклизация, образование дисульфидных мостиков, деметилирование, образование ковалентных перекрестных связей, образование цистеина, образование пироглютамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, формирование СР1-якоря, гидроксилирование, иодирование, метилирование, миристиолирование, окисление, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизация, присоединение селена, сульфатирование, тРНК-опосредованное добавление аминокислот к белкам, например, аргинилирование и убиквитинирование (см., например, Рго!е1П8-8!гис!иге Аиб Мо1еси1аг Ргорегйек, Т. Е. Сге1дй!оп, ^. Н. Егеетап аиб Сотрапу, Ыете Уогк 2пб Еб., (1993); Ро8йгап81айопа1 Соуа1еп1 Мобйкайоп О£ Ргокшк, В. С 1ойп8оп, Ей., Асабетк Рге§8, №\ν Уогк, рд§. 1-12(1983); 8ейкге1 а1., Ме!й Епхуто1 182:626-646 (1990); Вайаи е! а1., Апи ΝΥ Асаб δα 663:48-62 (1992)).
Данное изобретение также обеспечивает белки слияния, включающие, состоящие по существу из, или состоящие из слияния полипептида 8ета6А. В некоторых вариантах реализации изобретения, слияние полипептида 8ета6А связывается с плексином-А2 или плексином-А4. В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид 8ета6А, например, полипептид 8ета6А, содержащий 8ета-домены и Р81-домен, или полный внеклеточный домен (соответствующий аминокислотам от 1 до 649 в 8ЕЦ ΙΌ N0: 2), слит с гетерологичным полипептидным участком с формированием полипептида слияния 8ета6А.
Фармакологически активные полипептиды могут быстро деградировать ш у1уо, вызывая необходимость использования больших доз для достижения терапевтически эффективных концентраций в организме. Кроме того, полипептиды, не превосходящие 60 кДа, потенциально подвергаются гломерулярной фильтрации, что иногда приводит к нефротоксичности. Слияние или связывание полипептидных фрагментов может быть использовано для снижения или избежания риска такой нефротоксичности. Известны различные гетерологичные аминокислотные последовательности, т.е. полипептидные части или носители для увеличения стабильности терапевтических полипептидов ш угуо, например, полужизни сыворотки крови.
Благодаря длительному периоду полужизни, широкому распространению ш у1уо и отсутствию ферментативной или иммунологической функции, полноразмерный человеческий сывороточный альбумин (Н8А), или его фрагмент, широко используется в качестве гетерологичной части. Применяя способы и материалы, указанные в источниках ^еп е! а1., Ргос. №И. Асаб. 8ск И8А 89:1904-08 (1992) апб 8уеб е! а1., В1ооб 89:3243-52 (1997)), Н8А можно использовать для создания полипептида слияния 8ета6А, который проявляет фармакологическое действие за счет части 8ета6А и при этом демонстрирует значительно большую стабильность ш у1уо, например, в 10-100 раз выше. С-конец Н8А может быть слит с Νконцом части 8ета6А. Поскольку Н8А является исходно секретируемым белком, сигнальная последовательность Н8А может быть использована, чтобы добиться секреции белка слияния 8ета6А в культуральную среду, если белок слияния продуцируют эукариотические экспрессионные системы, например, клетки млекопитающих.
Сигнальная последовательность представляет собой полинуклеотид, кодирующий аминокислотную
- 15 017403 последовательность, которая инициирует транспорт белка через мембрану эндоплазматического ретикулума. Сигнальные последовательности, удобные для создания иммунослияний, включают сигнальные последовательности легкой цепи антитела, например антитело 14.18 (СйШек ей а1., й. 1ттипо1. Мейй. 125:191-202 (1989)) и сигнальные последовательности тяжелой цепи антитела, например сигнальную последовательность тяжелой цепи антитела МОРС 141 (8акапо ей а1., №11иге 28б:5774 (1980)). В качестве альтернативы могут использоваться и другие сигнальные последовательности (см. Майкоп, №с1. Асйбк Век. 12:5145 (1984)). Сигнальный пептид обычно отщепляется в просвете эндоплазматического ретикулума за счет действия сигнальных пептидаз. Это приводит к секреции белка иммунослияния, содержащего Ес-район и часть 8етабА.
В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность ДНК может кодировать сайт протеолитического расщепления между кассетой секреции и полипептидом 8етабА. Такой сайт расщепления может обеспечивать, например, протеолитическое расщепление кодируемого белка слияния, таким образом, отделяя Ес-домен от целевого белка. Пригодные сайты протеолитического расщепления включают аминокислотные последовательности, распознаваемые протеолитическими ферментами, такими как трипсин, плазмин, тромбин, фактор Ха или энтерокиназа К.
Кассета секреции может быть встроена в реплицирующийся экспрессионный вектор. Пригодные векторы включают линейные нуклеиновые кислоты, плазмиды, фагмиды, космиды и т. п. Типичным примером вектора экспрессии является рбС, в котором транскрипция ДНК иммунослияния находится под контролем энхансера и промотора цитомегаловируса человека (см., например, Ьо ей а1., ВйосЫт. ВйорЬук. Асйа 1088:712 (1991); апб Ьо ей а1., Ргойейп Епдйпеегшд 11:495-500 (1998)). Подходящие клетки-хозяева могут быть трансформированы или подвергнуты трансфекции ДНК, кодирующей полипептид 8етабА, и использованы для экспрессии и секреции полипептида 8етабА. Обычно используемые клетки-хозяева включаютиммортализованные клетки гибридомы, клетки миеломы, клетки 293, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки Не1а и клетки С08.
В одном из вариантов реализации изобретения полипептид 8етабА слит с шарниром и Ес-районом, т.е. с С-концевым участком константного района тяжелой цепи 1д. Потенциальные преимущества слияния 8етабА-Ес включают растворимость, стабильность ш νί\Ό и мультивалентность, например димеризацию. Используемый Ес-район может представлять собой Ес-участок молекул 1дА, Ι§Ό, или 1§С (шарнир-Сн2-Сн3). Альтернативно, он может также представлять собой Ес-участок молекул ЦЕ или ЦМ (шарнирСн2- Сн3-Сн4). Обычно используется Ес-участок молекулы ЦС, например, Ес-участок молекулы ЦС-, или 1дС4. В одном из вариантов реализации изобретения для слияния используется последовательность, начинающаяся в шарнирном участке сразу перед сайтом расщепления папаина, который определяет Есучасток молекулы ЦС химически (т.е. остаток 21б, что делает первый остаток константного участка тяжелой цепи остатком 11б, в соответствии с системой КаЬай), или аналогичными сайтами в других иммуноглобулинах. Точный сайт, по которому осуществляется слияние, не является критичным; некоторые конкретные сайты хорошо известны и могут быть выбраны для оптимизации биологической активности, секреции или характеристик связывания молекулы. Материалы и способы конструирования и экспрессии ДНК, кодирующей Ес-слияния, известны в данной области знаний и могут быть применены для того, чтобы получить 8етабА слияния, без дополнительных экспериментов. В некоторых вариантах реализации изобретения используют белок слияния, такой как описан в источнике (Сароп ей а1., И8 Райепй 5428130 апб 55б5335).
Полностью интактные участки Ес дикого типа проявляют эффекторные функции, которые могут быть нецелесообразны и нежелательны в белках Ес-слияния, используемых согласно способам настоящего изобретения. Поэтому, некоторые сайты связывания обычно делетируют из Ес-участка при конструировании кассеты секреции. Например, поскольку совместная экспрессия с легкой цепью нежелательна, сайт связывания для белка, связывающего тяжелую цепь, Вйр (НепбегкЬой ей а1., Iттиηο1. Тобау 8:11114 (1987)), делетирован из СН2-домена Ес-участка молекулы ЦЕ, так что данный сайт не мешает эффективной секреции иммуноглобулина. Также обычно делетируют последовательности трансмембранного домена, присутствующие в молекуле ЦМ.
Наиболее часто используют Ес-участок молекулы ЦС|. Альтернативно, в секреционной кассете можно использовать Ес-участок молекул других подклассов иммуноглобулина гамма (гамма-2, гамма-3 и гамма-4). Обычно в секреционной кассете используют 1§С1 Ес-участок иммуноглобулина гамма-1, который включает по меньшей мере часть шарнирного участка, Сн2-район и Сн3-район. В некоторых вариантах Ес-участок иммуноглобулина гамма-1 представляет собой Сн2-делетированный Ес, включающий часть шарнирного участка и Сн3-участок, но не С(|2-участок. Сн2-делетированный Ес был описан в следующем источнике (СйШек ей а1., Нит. АпййЬоб. НуЬпботак 1:47 (1990)). В некоторых вариантах, используется Ес-участок молекул ЦА, Ι§Ό, ЦЕ, или ЦМ.
Белки слияния 8етабА-Ес могут быть сконструированы во многих различных конфигурациях. В одной конфигурации С-конец части 8етабА слит непосредственно с Ν-концом части Ес-шарнира. В несколько другой конфигурации короткий полипептид, например, из 2-10 аминокислот, включен в слияние между Ν-концом части 8етабА и С-концом части Ес. Такой линкер обеспечивает конформационную подвижность, которая может усиливать биологическую активность при некоторых обстоятельствах. Если
- 1б 017403 в участке Рс сохранена значительная часть шарнирного участка, слияние 8етабА-Рс димеризуется, формируя тем самым двухвалентную молекулу. Однородная популяция мономерных Рс-слияний содержит моноспецифические, бивалентные димеры. Смесь двух мономерных Рс-слияний, каждое из которых имеет различную специфичность, содержит биспецифические, бивалентные димеры.
Любой из большого числа перекрестных линкеров, которые содержат соответствующую аминореактивную группу и тиол-реактивную группу, можно использовать для соединения полипептидов 8етабА с сывороточным альбумином в других гетерологичных пептидах. Примеры подходящих линкеров включают аминореактивные перекрестные линкеры, встраивающие тиол-реактивный малеимид, например, 8МСС, АМА8, ВМР8, ΜΒ8, ЕМС8, 8МРВ, 8МРН, КМИ8, и 6МВ8. Другие подходящие линкеры встраивают тиол-реактивную галоацетатную группу, например, 8ВАР, 81А, 8ΙΆΒ. Линкеры, предоставляющие защищенный или незащищенный тиол для реакции с сульфогидрильными группами, чтобы получить допускающую ослабление связь, включают 8РЭР. 8МРТ, 8АТА, и 8АТР. Данные реагенты являются коммерчески доступными (например, Р1егсе СйешюаЬ).
Химическое связывание не обязательно должно затрагивать Ν-концевую часть полипептида 8етабА или тиольную часть сывороточного альбумина. Например, слияния БетабА-альбумин можно получить, используя методики генной инженерии, при этом часть 8етабА может быть слита с геном сывороточного альбумина на его Ν-конце, С-конце, или обоих концах молекулы.
Для облегчения очистки или идентификации участка 8етабА можно получать слияние полипептидов 8етабА с гетерологичными пептидами. Например, для облегчения очистки 8етабА с использованием коммерчески доступной хроматографической среды можно присоединять к 8етабА гистидиновую метку.
В некоторых вариантах реализации изобретения конструкция слияния 8етабА используется для увеличения продукции участка 8етабА в бактериях. В таких конструкциях бактериальный белок, в норме экспрессирующийся и/или секретируемый на высоком уровне, используется в качестве Ν-концевого партнера для слияния с полипептидом 8етабА (см., например, 8ιηί11ι е! а1., Севе б7:31 (1988); Норр е! а1., Вю!есЬцо1оду б:1204 (1988); Ьа УаШе е! а1., Вю1ес1то1оду 11:187 (1993)).
При использовании части 8етабА на амино- и карбоксиконцах, подходящих для слияния молекулпартнеров, могут быть получены бивалентные или тетравалентные формы полипептида 8етабА. Например, часть 8етабА может быть слита с амино- и карбоксиконцом 1д части с целью получения бивалентного мономерного полипептида, содержащего две части 8етабА. При димеризации двух таких мономеров за счет 1д части образуется тетравалентная форма белка 8етабА. Такие мультивалентные формы можно использовать для достижения повышенной аффинности связывания с мишенью. Мультивалентные формы 8етабА также можно получить путем соединения частей 8етабА тандемно, с образованием конкатемеров, которые можно использовать как сами по себе, так и формировать слияния со сливающимися молекулами, такими как 1д или Н8А.
В некоторых вариантах реализации изобретения полипептиды 8етабА, которые можно использовать согласно способам настоящего изобретения, включают направляющую часть. Направляющая часть включает белок или пептид, который направляет молекулу в определенную часть тела, например, в мозг или его отделы. В некоторых вариантах полипептиды 8етабА, которые можно использовать согласно способам настоящего изобретения, присоединены или слиты с частью, направляющей молекулу в мозг. Части, направляющие молекулу в мозг, присоедины ковалентно (например, напрямую, путем трансляционного слияния, или посредством химического связывания либо непосредственно, либо через спейсерную молекулу, которая возможно может быть отщеплена), или нековалентно (например, посредством обратимых взаимодействий, которые осуществляют авидин, биотин, белок А, 1§С и т.п.). В других вариантах реализаци изобретения полипептиды 8етабА, которые можно использовать согласно способам настоящего изобретения, присоединены к еще одной части, направляющей молекулу в мозг. В других вариантах, часть, направляющая молекулу в мозг, присоединена к множеству полипептидов 8етабА, которые можно использовать согласно способам настоящего изобретения.
Часть, направляющая молекулу в мозг, связанная с полипептидом 8етабА, улучшает доставку в мозг такого полипептида 8етабА. Описано большое число полипептидов, которые, будучи слиты с белком или терапевтическим агентом, осуществляют доставку указанного белка или терапевтического агента через гематоэнцефалический барьер (ВВВ). Примеры, которые не следует рассматривать как ограничивающие, включают однодоменное антитело РС5 (АЬи1гоЬ е! а1., I. №игосйет. 95, 1201-1214 (2005)); тАВ 83-14, моноклональное антитело к человеческому рецептору инсулина (РагйгФде е! а1., Р1агтасо1. Век. 12, 807-81б(1995)); пептиды В2, Вб и В8, связывающиеся с человеческим рецептором трансферрина (НТГВ) (Х1а е! а1., I. У1го1. 74, 11359-113бб (2000)); моноклональное антитело 0Х2б к рецептору трансферрина (РагйгФде е! а1., I. Рйагтасо1. Ехр. ТНег. 259, бб-70 (1991)) и 8ЕО ΙΌ ΝΟκ: 1-18 оГ И.8. Ра!еШ Но. б30б3б5. Содержимое вышеуказанных источников включено в данный текст во всей полноте посредством ссылки.
Улучшенная доставка в мозг композиции, содержащей 8етабА, определена методами, хорошо известными в данной области знаний. Например, введение животному радиоактивно меченого полипептида 8етабА, связанного с частью, направляющей молекулу в мозг; определение локализации в мозге и
- 17 017403 сравнение локализации с эквивалентным радиоактивно меченым полипептидом 8ета6А, не связанным с частью, направляющей молекулу в мозг. Другие методы определения улучшения доставки белков в мозг описаны в вышеуказанных источниках.
Конъюгированные полимеры (отличные от полипептидов)
Некоторые варианты реализации изобретения включают полипептид 8ета6А, причем с полипептидом 8ета6А связаны (ковалентно) один или более полимеров. Примеры полимеров, подходящих для такого связывания, включают полипептиды (обсуждаемые выше), сахаридные полимеры и цепочки полиалкиленгликолей. Обычно, хотя и необязательно, полимер связан с полипептидом 8ета6А с целью улучшения одного или более пунктов из нижеследующих: растворимость, стабильность или биодоступность.
Полимеры, обычно используемые для связывания с полипептидом 8ета6А, относятся к классу полиалкиленгликолей. Наиболее часто используется полиэтиленгликоль (ПЭГ). Части ПЭГ, например 1, 2, 3, 4 или 5 полимеров ПЭГ могут быть связаны с каждым полипептидом 8ета6А для увеличения полужизни сыворотки крови, по сравнению с полипептидом 8ета6А без дополнительных компонентов. ПЭГ части молекулы являются не антигенными и биологически практически инертны. ПЭГ части, которые используют на практике, могут быть разветвленными или неразветвленными.
Число частей ПЭГ, присоединенных к полипептиду 8ета6А, а также молекулярный вес отдельных цепей ПЭГ, могут варьировать. Вообще, чем выше молекулярный вес полимера, тем меньше полимерных цепей присоединено к полипептиду. Обычно, суммарная масса полимеров, присоединенных к полипептиду 8ета6А, составляет от 20 до 40 кДа. Таким образом, если присоединена одна цепь полимера, ее вес в большинстве случаев составляет 20-40 кДа. Если присоединены две цепи, их вес в большинстве случаев составляет 10-20 кДа. Если присоединены три цепи, молекулярный вес каждой цепи в большинстве случаев составляет 7-14 кДа.
Полимер, например, ПЭГ, может быть связан с полипептидом 8ета6А через любую подходящую, доступную химически активную группу полипептида. Доступные химически активные группы могут представлять собой, например, Ν-терминальную аминогруппу или эпсилон-аминогруппу внутреннего лизинового остатка, или обе эти группы. Активированный полимер может вступать в реакцию и ковалентно связываться с любой из свободных групп полипептида 8ета6А. Свободные карбоксильные группы, соответствующим образом активированные карбонильные группы, гидроксил-, гуанидил-, имидазолокисленные углеводородные группы и меркаптогруппы полипептида 8ета6А (если являются доступными) также могут быть использованы в качестве химически активных групп для присоединения полимера.
В реакции связывания обычно используется от приблизительно 1.0 до приблизительно 10 молей активированного полимера на моль полипептида, в зависимости от концентрации полипептида. Обычно выбираемое соотношение отражает баланс между максимально возможным выходом прямой реакции и уменьшением побочных реакций (часто неспецифических), которые могут влиять на желаемую фрамакологическую активность полипептида 8ета6А. Предпочтительно, чтобы в результате сохранялось по меньшей мере 50% биологической активности полипептида 8ета6А (что может быть продемонстировано, например, посредством любого анализа, описанного здесь или известного в данной области знаний), и наиболее предпочтительным вариантом является сохранение почти 100% биологической активности полипептида 8ета6А.
Конъюгировать полимер с полипептидом 8ета6А можно, используя обыкновенные химические методы. Например, полиалкиленгликольная часть может быть соединена с лизиновой эпсилонаминогруппой полипептида 8ета6А. Связывание с лизиновой боковой цепью может быть осуществлено с активным сложным эфиром, содержащим Ν-гидроксилсукцинимид (НГС), таким как ПЭГсукцинимидилсукцинат (ПЭГ-СС) и сукцинимидилпропионат (ПЭГ-СП). Подходящие полиалкиленгликольные части включают, например, карбоксиметил-НГС и норлейцин-НГС, 8С. Данные реагенты являются коммерчески доступными. Дополнительные линкеры ПЭГ с химически активными аминогруппами могут быть заменены на сукцинимидиловую часть. Они включают, например, изотиоцианаты, нитрофенилкарбонаты (Р№), эпоксиды, бензотриазол-карбонаты, 8С-РЕС, трезилат, альдегид, эпоксид, карбонилимидазол и Р№-карбонат. Условия реакции обычно оптимизируют для достижения максимальной избирательности и выхода реакции. Такая оптимизация условий реакции известна специалистам со средним уровнем знаний в данной области.
ПЭГилирование может быть осуществлено путем любой из реакций ПЭГилирования, известных в данной области знаний (см., например, Еосик оп Сго\\111 Рас!ог§ 3:4-10 (1992), и Европейские патентные заявки ЕР 0154316 и ЕР 0401384). ПЭГилирование может быть проведено с использованием реакций ацилирования или алкилирования с химически активными молекулами полиэтиленгликоля (или аналогичного химически активного водорастворимого полимера).
ПЭГилирование путем ацетилирования, как правило, включает реакцию с активным производным полиэтиленгликоля в виде сложного эфира. Любая химически активная молекула ПЭГ может быть вовлечена в реакцию ПЭГилирования. Часто в качестве активированного сложного эфира ПЭГ используют ПЭГ, этерифицированный с Ν-гидроксилсукцинимидом (НГС). Термин ацилирование, используемый в данной заявке, включает, без каких-либо ограничений, следующие типы связей между терапевтическим
- 18 017403 белком и водорастворимым полимером, таким как ПЭГ: амидную, карбаматную, уретановую и т.п. (см., например, Вюсои)ида1е СНет. 5:133-140, 1994). Условия реакции обычно подбираются так, чтобы избежать использования температур, растворителей и значений рН, которые могут повредить или инактивировать полипептид 8ета6А.
Как правило, связь представляет собой амидную связь, и обычно по меньшей мере 95% продукта, образующегося в результате реакции, моно-, ди- или три-ПЭГилировано. Тем не менее, могут образовываться также некоторые варианты молекул с более высокой степенью ПЭГилирования, и их количество зависит от специфических условий реакции. При желании, очищенные варианты ПЭГилированных молекул можно отделить от смеси, в частности, от молекул, не вступивших в реакцию, посредством обычных способов очистки, включая, например диализ, высаливание, ультрафильтрацию, ионообменную хроматографию, гель-фильтрационную хроматографию, хроматографию с гидрофобным обменом и электрофорез.
ПЭГилирование посредством алкилирования обычно включает осуществление реакции терминального альдегидного производного ПЭГ с полипептидом 8ета6А присутствии восстановителя. Дополнительно можно изменять условия реакции, чтобы они способствовали ПЭГилированию главным образом только по ^терминальной аминогруппе полипептида 8ета6А, с образованием моно-ПЭГилированного белка. В любом случае, включая моно-ПЭГилирование или поли-ПЭГилирование, ПЭГ группы обычно присоединяются к белку через ОД-ЫН-группу. Со ссылкой на Сн2-группу данный тип связи называют алкильная связь.
Формирование производных путем восстановительного алкилирования с образованием N терминально меченных моно-ПЭГилированных продуктов использует различную способность к реагированию различных типов первичных аминогрупп (лизин по сравнению с ^терминальной группой), способных к образованию производных. Реакцию проводят при значении рН, которое позволяет использовать различия рКа между эпсилон-аминогруппами лизиновых остатков и ^терминальных аминогрупп белка. При таком селективном образовании производных можно контролировать присоединение водорастворимого полимера, содержащего химически активную группу, такую как альдегидная группа, к белку: связывание с полимером имеет место преимущественно на Юконце белка, и не наблюдается никаких значительных модификаций других химически активных групп, таких как лизиновые боковые цепи аминогрупп.
Полимерные молекулы, которые используются в методиках ацилирования и алкилирования, выбираются из водорастворимых полимеров. Обычно выбранный полимер модифицирован так, чтобы иметь лишь одну химически активную группу, например, активную эфирную группу для ацилирования или альдегидную для алкилирования, так что уровень полимеризации можно контролировать, в соответствии с тем, как это обеспечивается в описываемой методике. Типичным примером химически активного ПЭГ альдегида является полиэтиленгликоль-пропионовый альдегид, стабильный в водном растворе, или его моно-С1-С10-алкокси или арилоксипроизводные (см., например, Нат8 е1 а1., И.8. Ра1. №. 5252714). Полимер может быть разветвленным или неразветвленным. Полимеры, выбранные для реакций ацилирования, несут единственную химически активную эфирную группу. Полимеры, выбранные для реакций алкилирования, несут единственную химически активную альдегидную группу. Обычно водорастворимый полимер не выбирается из природных гликозильных остатков, поскольку их удобнее получать в рекомбинантных экспрессионных системах млекопитающих.
Способы приготовления ПЭГилированного полипептида 8ета6А обычно включают этапы: (а) осуществления реакции полипептида 8ета6А с полиэтиленгликолем (таким, как производное ПЭГ с химически активной эфирной или альдегидной группой) при условиях, в которых молекула оказывается пришитой к одной или более ПЭГ групп, и (б) получения продуктов реакции. В целом, оптимальные условия реакции для реакций ацилирования определяются для каждого конкретного случая на основании известных параметров и желаемого результата. Например, увеличение соотношения ПЭГ к белку обычно приводит к увеличению количества поли-ПЭГилированного продукта.
Восстановительное алкилирование, приводящее к образованию практически однородной популяции монополимер/полипептид 8ета6А, обычно включает этапы: (а) осуществления реакции белка 8ета6А или полипептида 8ета6А с химически активной молекулой ПЭГ в условиях, необходимых для восстановительного алкилирования, при значениях рН, подходящих для осуществления избирательной модификации Ютерминальной аминогруппы полипептида, и (б) получения продуктов реакции.
Для практически однородной популяции монополимер/полипептид 8ета6А условиями реакции восстановительного алкилирования являются те условия, при которых происходит селективное присоединение водорастворимой полимерной части к Юконцу полипептида. Такие условия реакции обычно определяются для различий рКа между аминогруппой лизиновой боковой цепи и Ютерминальной аминогруппы. Для целей настоящего изобретения, значения рН устанавливали обычно в интервале 3-9, обычно 3-6.
Полипептиды 8ета6А могут включать метку, т.е. часть, которая впоследствии может быть отщеплена в ходе протеолиза. Так, лизин может быть селективно модифицирован, если вначале провести его реакцию с НЮметкой. модифицированной линкером с низким молекулярным весом, таким как реагент
- 19 017403
Траута (Р1егсе), который взаимодействует как с лизином, так и с Ν-концом, а затем отщепить Нк-метку. Полипептид, образующийся в результате, будет содержать свободную 8Н-группу, которую можно селективно модифицировать ПЭГ, содержащим тиол-реактивную головную группу, например, такую как малеимидная группа, винилсульфоновая группа, галоацетатная группа, или свободная или защищенная 8Нгруппа.
Реагент Траута можно заменить на любой линкер, который устанавливает специфический сайт для присоединения ПЭГ. Например, его можно заменить на 8РЭР. 8МРТ, 8АТА, или 8АТР (Р1егсе). Также, можно провести реакцию взаимодействия белка с аминореактивным линкером, который встраивает малеимид (например, 8МСС, АМА8, ВМР8, МВ8, ЕМС8, 8МРВ, 8МРН, КМИ8, или 6МВ8), галоацетатную группу (8ВАР, 81А, 81АВ) или винилсульфоновую группу, а затем провести реакцию взаимодействия образовавшегося продукта с ПЭГ, содержащим свободные 8Н-группы.
В некоторых вариантах реализации изобретения полиалкиленгликольная часть соединена с цистеиновой группой полипептида 8ета6А. Такое связывание можно осуществить, используя, например, малеимидную группу, винилсульфоновую группу, галоацетатную группу или тиольную группу.
При желании, можно связать полипептид 8ета6А с полиэтиленгликольной частью через лабильную связь. Лабильную связь можно расщепить при, например, биохимическом гидролизе, протеолизе, или сульфидрильном расщеплении. Например, эту связь можно расщепить в 1и у|уо (физиологических) условиях.
Реакции можно осуществлять посредством любого доступного способа, используемого для осуществления взаимодействия биологически активных материалов с инертными полимерами, обычно при значениях рН, равных 5-8, например, рН 5, 6, 7 или 8, если химически активные группы находятся на альфа-аминогруппе на Ν-конце. Обычно данный процесс состоит из приготовления активированного полимера и последующего осуществления реакции взаимодействия белка с активированным полимером, с образованием белка, подходящего для использования.
Векторы
Векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды 8ета6А, можно также использовать в соответствии со способами настоящего изобретения. Выбор вектора и последовательностей, контролирующих экспрессию, с которыми соединены указанные нуклеиновые кислоты, зависит от желаемых функциональных характеристик, например, экспрессии белка и типа клеток-хозяев, которые будут подвергнуты трансформации.
Элементы контроля экспрессии, полезные для регуляции экспрессии кодирующей последовательности, хорошо известны специалистам в данной области знания. Их примеры включают, не являясь ограничениями, индуцибельные промоторы, конститутивные промоторы, сигналы секреции и другие регуляторные элементы. Если используется индуцибельный промотор, можно осуществлять его контроль, например, путем изменения статуса питания, или путем изменения температуры среды, в которой растут клетки-хозяева.
Вектор может включать прокариотический репликон, т. е. последовательность ДНК, способную к непосредственной автономной репликации и поддержанию рекомбинантной молекулы ДНК внехромосомно в бактериальной клетке-хозяине. Такие репликоны известны специалистам в данной области знания. Дополнительно, векторы, включающие прокариотический репликон, могут также включать ген, экспрессия которого представляет собой детектируемый маркер, например, устойчивость к некоторым препаратам. Примерами бактериальных генов устойчивости к препаратам являются гены, обеспечивающие устойчивость кампициллину или тетрациклину.
Векторы, включающие прокариотический репликон, могут также включать прокариотический промотор или промотор бактериофага, для управления экспрессией кодирующей последовательности гена в бактериальной клетке-хозяине. Промоторные последовательности, совместимые с бактериальными хозяевами, обычно предоставляются в плазмидных векторах, содержащих подходящие сайты рестрикции для вставки сегмента ДНК, который будет экспрессироваться. Примерами таких плазмидных векторов являются рИС8, рИС9, рВВ322 и рВВ329 (ВюВаб), рРЬ и рКК223 (Рйаттааа). Любые подходящие прокариотические клетки-хозяева могут быть использованы для того, чтобы экспрессировать рекомбинантную молекулу ДНК, кодирующую белок, используемый согласно способу настоящего изобретения.
Для целей настоящего изобретения можно использовать многочисленные системы экспрессионных векторов. Например, в одном классе векторов используются элементы ДНК, производные от вирусов животных, например вируса бычьей папилломы, вируса полиомы, аденовируса, вируса коровьей оспы, бакуловируса, ретровирусов (В8У, ММТУ или МОМЬУ) или вируса 8У40. В других векторах используются полицистронные системы с внутренними сайтами связывания рибосом. Дополнительно можно вести отбор клеток, включивших ДНК в хромосомы, если внести в них один или несколько маркеров, позволяющих вести отбор трансформированных клеток. Маркер может обеспечивать прототрофность ауксотрофному хозяину, устойчивость к биоцидным веществам (например, антибиотикам), или устойчивость к тяжелым металлам, например, к меди. Маркерный ген, используемый для отбора, может быть либо непосредственно связан с последовательностями ДНК, которые будут экспрессироваться, либо может быть внесен в ту же клетку при ко-трансформации. Ген неомицин-фототрансферазы (пео) является
- 20 017403 примером маркерного гена, используемого для отбора (8ои!йегп е! а1., 1. Мо1. Апа1. Оепе!. 1:327-341 (1982)). Для оптимального синтеза мРНК могут также требоваться дополнительные элементы. Эти элементы могут включать сигнальные последовательности, сигналы сплайсинга, а также транскрипционные промоторы, энхансеры и сигналы терминации.
В одном из вариантов реализации изобретения, можно использовать запатентованный вектор экспрессии Вюдеп ГОЕС. 1пс., называемый №08РБА (И.8. ра!еп! б,159,730). Данный вектор содержит промотор/энхансер цитомегаловируса, основной промотор бета-глобина мыши, точку начала репликации 8У40, последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста, экзон 1 и экзон 2 гена неомицинфототрансферазы, ген дигидрофолатредуктазы и лидерную последовательность. Было показано, что данный вектор способен к очень высокому уровню экспрессии при внесении его в клетки СНО, после отбора на О418-содержащей среде и росте на метотрексате. Разумеется, в настоящем изобретении можно использовать любой экспрессионный вектор, способный вызывать экспрессию в эукариотических клетках. Примеры подходящих векторов включают, не ограничиваясь ими, плазмиды ρс^NА3, рНСМУ/2ео, рСК3.1, рЕБ1/Н1к, ρΙΝΏ/68, рКс/НСМУ2, р8У40/2ео2, рТКАСЕК-НСМУ, рИВб/У5-Н1к, рУАХ1 и р2ео8У2 (доступные в 1пуйгодеп, 8ап П1едо, СА), и плазмиду рС1 (доступную в Рготеда, Майкоп, XVI). Другие экспрессионные векторы для эукариотических клеток известны специалистам в данной области и коммерчески доступны. Как правило, такие векторы содержат рестрикционные сайты, подходящие для вставки желаемого сегмента ДНК. Типичные векторы включают р8УБ и рК8У-10 (Рйагтааа), рВРУ-1, рт12б (1п!ета!юпа1 Вю!есйпо1од1ек), рТЭТ1 (АТСС31255), ретровирусный вектор экспрессии рМ1О и рЬЬ3.7, аденовирусный шаттл-вектор рЭС315 и векторы ААУ. Другие типичные векторные системы описаны, например, в И8 Ра!еп! б,413,777.
Вообще, скрининг большого количества трансформированных клеток с целью обнаружения тех клеток, которые экспрессируют достаточно высокий уровень полипептида, является обычным экспериментом, который можно осуществлять, например, при помощи роботизированных систем.
Часто используемые регуляторные последовательности для экспрессии в клетках-хозяевах млекопитающих включают вирусные элементы, которые определяют высокий уровень экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и энхансеры, происходящие из ретровирусных БТК, цитомегаловируса (СМУ) (например, промотор/энхансер СМУ), обезьяньего вируса 40 (8У40) (например, промотор/энхансер 8У40), аденовируса (например, основной поздний промотор аденовируса (Абт1Р)), полиомы, и сильные промоторы млекопитающих, например, природные промоторы иммуноглобулина и актина. Для дальнейшего описания вирусных регуляторных элементов и их последовательностей см. источники (8!ткк1, И8 Ра!. №. 51б80б2; Ве11, И8 Ра!. №. 4510245; апб ЗсЬайпег, И8 Ра!. №. 49б8б15).
Рекомбинантные экспрессионные векторы могут содержать последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точки начала репликации) и маркерные гены, используемые для отбора. Маркерные гены, используемые для отбора, ускоряют отбор клеток-хозяев, в которые встроился вектор (см., например, Ахе1, И8 Ра!. №к. 439921б; 4б34бб5 апб 5179017). Например, обычно маркерный ген, используемый для отбора, обеспечивает устойчивость к препарату, например, О418, гигромицину или метотрексату, клетки-хозяина, в которую встраивается вектор. Часто используемые маркерные гены, используемые для отбора, включают гендигидрофолат-редуктазы (ОНБК) (для использования в бЫг- клетках-хозяевах с отбором/ростом на метотрексате) и ген пео (для отбора О418).
Векторы, кодирующие полипептиды 8етабА, можно использовать для трансформации подходящих клеток-хозяев. Трансформацию можно осуществлять любым подходящим способом. Способы внесения экзогенной ДНК в клетки млекопитающих, хорошо известны в данной области знаний и включают декстран-опосредованную транфекцию, осаждение фосфатом кальция, полибрен-опосредованную транфекцию, слияние протопластов, электропорацию, энкапсулирование полинуклеотидов влипосомах и прямую микроинъкецию ДНК в ядра. Дополнительно, молекулы нуклеиновой кислоты можно вносить в клетки млекопитающих при помощи вирусных векторов.
Трансформацию клеток-хозяев можно осуществлять с использованием традиционных способов, подходящих для используемого типа вектора и клеток-хозяев. Для трансформации прокариотических клеток-хозяев можно использовать электропорацию и способ солевого воздействия (СоЬеп е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8с1. И8А б9:2110-14 (1972)). Для трансформации клеток позвоночных можно использовать электропорацию, способы катионно-липидного или солевого воздействия (см., например, СгаНат е! а1., У1го1оду 52:45б-4б7 (1973); №Ц1ег е! а1., Ргос. N311. Асаб. 8сБ И8А 7б:1373-7б (1979)).
Линия клеток-хозяев, используемая для экспрессии белка, может происходить из млекопитающих; специалист в данной области знания способен предпочтительно определить конкретные линии клетокхозяев, которые наилучшим образом подходят для экспрессии в них желаемого генного продукта. Типичные примеры линий клеток-хозяев включают, не ограничиваясь ими, клетки N80, 8Р2, клетки почки детенышей хомячка (ВНК), клетки почки обезьяны (С08), клетки человеческой гепатоклеточной карциномы (например, Нер О2), клетки А549 ЭС44 и ЭБХВ11 (линии яичника китайского хомячка, ОНБКминус), НЕБА (человеческая цервикальная карцинома), СУ1 (линия почки обезьяны), С08 (производное СУ1 с Т-антигеном 8У40), К1б10 (фибробласты китайского хомячка), ВАБВС/3Т3 (мышиные фибробласты), НАК (линия почки хомячка), 8Р2/0 (миелома мыши), Р3хб3-Ад3.б53 (миелома мыши), ВБА- 21 017403
1с1ВРТ (клетки эндотелия быка), ВАЛ (лимфоциты человека) и 293 (почка человека). Линии клетокхозяев обычно доступны в коммерческих службах, Американской Коллекции Клеточных Культур или в опубликованной литературе.
Экспрессию полипептидов в линиях продуцирующих клеток можно усиливать, используя известные методики. Например, для усиления экспрессии в различных условиях обычно используют глутаминсинтазную (68) систему (см., например, Европейские патенты № 021б84б, 025б055 и 0323997 и Европейскую патентную заявку № 893039б4.4.
Клетки-хозяева
Клетки-хозяева для экспрессии полипептида 8етабА для использования в соответствии со способами настоящего изобретения могут быть прокариотическими и эукариотическими. Типичные примеры эукариотических клеток-хозяев включают, не ограничиваясь ими, клетки дрожжей и млекопитающих, например клетки яичника китайского хомячка (СНО) (номер ССЬб1 в АККК), ΝΙΗ клетки эмбриона швейцарской мыши ΝΙΗ-3Τ3 (номер СКЕ1б58 в АККК) и клетки почки детенышей хомячка (ВНК). Другие подходящие эукариотические клетки-хозяева включают клетки насекомых и растений. Типичными прокариотическими клетками-хозяевами являются Е. сой и 81гер1отусе5.
Генная терапия
Полипептид 8етабА можно продуцировать ίη νίνο в организме млекопитающих, например у пациентов человека, с использованием методики генной терапии для лечения болезней нервной системы, заболеваний или повреждений, при которых стимулирование выживания, пролиферации и/или дифференцировки олигодендроцитов или стимулирование миелинизации нейронов может быть терапевтически выгодным. Данный подход включает применение подходящей нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид 8етабА, соединенной сучетом нормальной работы с подходящими последовательностями, контролирующими экспрессию. Как правило, данные последовательности встроены в вирусный вектор. Векторы, подходящие для такой генной терапии, включают аденовирусный вектор, альфавирусный вектор, энтеровирусный вектор, пестивирусный вектор, лентивирусный вектор, бакуловирусный вектор, герпесвирусный вектор, вектор на основе вируса Эпштейна-Барр, паповавирусный вектор, поксвирусный вектор, вектор на основе вируса коровьей оспы, вектор на основе аденосателлитного вируса и вектор на основе вируса простого герпеса. Вирусный вектор может представлять собой вектор, не способный к нормальной репликации. Обычно используются аденвирусные векторы с делецией генов Е1 или Е3. Когда используется вирусный вектор, вектор не содержит маркерного гена, используемого для отбора.
Фармацевтические композиции
Полипептиды 8етабА, используемые в соответствии со способами настоящего изобретения, могут входить в состав фармацевтических композиций для введения млекопитающим, включая человека. Фармацевтические композиции, используемые в соответствии со способами настоящего изобретения, включают фармацевтически пригодные носители, включая, например, ионообменные соединения, окись алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, например человеческий сывороточный альбумин, буферные вещества, например фосфаты, глицин, сорбиновая кислота, сорбат калия, смесь фрагментов глицеридов насыщенных жирных кислот растений, воду, соли или электролиты, например, сульфат протамина, гидрофосфат натрия, гидрофосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный оксид кремния, трисиликат магния, поливинил-пирролидон, вещества целлюлозной природы, полиэтиленгликоль, натриевая карбоксиметилцеллюлоза, полиакрилаты, воска, полимеры из блоков полиэтиленполиоксипропилена, полиэтиленгликоль и ланолин.
Композиции, используемые в соответствии со способами настоящего изобретения, можно применять посредством любого подходящего способа, например, парентерально, интравентрикулярно, орально, путем ингаляции спреем, локально, ректально, назально, буккально, вагинально или с использованием имплантированного резервуара. Термин парентерально, используемый в данной заявке, включает подкожное, внутривенное, внутримышечное, интраартикулярное, внутрисуставное, подложечное, интратекальное, внутрипеченочное, внутриочаговое и внутричерепное введение или вливание. Как было описано выше, полипептиды 8етабА, применяемые в соответствии со способами настоящего изобретения, работают в нервной системе, стимулируя выживание, пролиферацию и дифференцировку олигодендроцитов и миелинизацию нейронов. Сответственно, в способах настоящего изобретения, полипептиды 8етабА применяются таким образом, чтобы они могли проникнуть через гематоэнцефалический барьер. Такое проникновение осуществляться благодаря физико-химическим свойствам, присущим самой молекуле полипептида 8етабА, благодаря другим компонентам фармацевтической композиции, или за счет использования механического приспособления, например иглы, канюли или хирургического инструмента, позволяющих физически нарушить гематоэнцефалический барьер. Если полипептид 8етабА является молекулой, которой не свойственно проникновение через гематоэнцефалический барьер, например, при слиянии с частью молекулы, усиливающей проникновение, подходящими способами введения являются, например, интратекальный и внутричерепной, т. е. непосредственно в очаг хронического повреждения при рассеянном склерозе. Если полипептид 8етабА является молекулой, которой свойственно проникновение через гематоэнцефалический барьер, подходящим способом его введения может быть один или более из различных способов, описываемых ниже.
- 22 017403
Стерильные инъекционные формы композиций, используемые согласно способам настоящего изобретения, могут представлять собой водную или масляную суспензию. Данные суспензии могут быть приготовлены в соответствии с методиками, известными в данной области знания, с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих веществ и суспендирующих веществ. Стерильный инъекционный препарат может также представлять собой стерильный инъекционный раствор или суспензию в нетоксичном парентерально применяемом растворителе, например суспензию в 1,3-бутандиоле. К подходящим растворителям, которые можно использовать подобным образом, относятся вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Стерильные нелетучие масла также традиционно используются в качестве растворителей или суспендирующих веществ. Для этих целей можно использовать любое обычное нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Жирные кислоты, например, олеиновую кислоту и ее глицериновые производные, можно использовать для приготовления инъекционных растворов, так же, как и природные масла, применяемые в фармации, например оливковое масло или касторовое масло, в особенности их полиоксиэтилированные варианты. Данные масляные растворы или суспензии могут также содержать длинноцепочечный спирт в качестве растворителя или диспергирующего средства, например, карбоксиметилцеллюлозу или подобное диспергирующее вещество, которое обычно используется при приготовлении фармацевтически допустимых дозированных форм, включая эмульсии и суспензии. Также для приготовления лекарственных форм можно применять другие широко используемые поверхностно-активные вещества, например Т\уссп5. 8раи5 и другие эмульгаторы или усилители биодоступности, которые обычно используются в производстве фармацевтически допустимых твердых, жидких или других дозированных форм.
Парентеральное применение может осуществляться в виде одиночной болюсной дозы, вливания, или загрузочной болюсной дозы с последующим введением поддерживающей дозы. Эти композиции могут применяться в специфически указанном или варьирующем временном интервале, например один раз в день, или как требуется.
Некоторые фармацевтические композиции, используемые согласно способам настоящего изобретения, можно применять орально в допустимых дозированных формах, включая, например, капсулы, таблетки, водные суспензии и растворы. Некоторые фармацевтические композиции также можно применять в виде назальных аэрозолей или ингаляций. Такие композиции могут быть приготовлены в виде солевых растворов, включая бензиловый спирт или другие подходящие консерванты, вещества, способствующие абсорбции, для увеличения биодоступности, и/или другие традиционные растворители или диспергирующие вещества.
Количество полипептида 8етабЛ, который может быть связан с материалом носителей для создания единичной дозированной формы, варьируется в зависимости от организма, подвергаемого лечению, типа используемого полипептида и конкретного способа введения. Композицию можно вводить в виде единичной дозы, множественных доз или в течении установленного периода времени в виде вливаний. Дозовый режим также может быть подобран так, чтобы вызвать оптимальный желаемый ответ (например терапевтический или профилактический ответ).
В способах настоящего изобретения используется терапевтически эффективное количество или профилактически эффективное количество полипептида 8етабЛ. Такое терапевтически или профилактически эффективное количество может варьировать в соответствии со следующими факторами: стадия заболевания, возраст, пол и вес индивида. Терапевтически или профилактически эффективное количество также представляет собой то количество, при котором терапевтически полезное влияние преобладает над любыми токсическими или вредными эффектами.
Специфические дозы и режим лечения для любого отдельно взятого пациента зависят от значительного количества факторов, включая конкретный используемый полипептид 8етабЛ, возраст пациента, вес тела, общее здоровье, пол, диету, время применения, уровень экскреции, комбинацию с другими лекарственными препаратами и серьезность конкретного заболевания, лечение которого проводится. Оценка этих факторов может быть проведена медицинскими работниками со средними знаниями в данной области. Количество также зависит от индивидуального пациента, подвергаемого лечению, способа применения, типа лекарства, характеристик используемого вещества, серьезности заболевания, и желаемого эффекта. Количество, которое следует использовать, может быть определено на основании фармакологических и фармакокинетических принципов, хорошо известных в данной области знания.
Согласно способам настоящего изобретения полипептиды 8етабЛ обычно вводятся непосредственно в нервную систему, интрацеребровентрикулярно или интратекально, например, в очаг хронического поражения при рассеянном склерозе. Композиции для применения в соответствии со способами настоящего изобретения можно готовить таким образом, чтобы вводить дозу полипептида 8етабЛ 0,00110 мг/кг веса тела в день. В некоторых вариантах реализации изобретения дозировка составляет 0,01-1,0 мг/кг веса тела в день. В некоторых вариантах реализации изобретения дозировка составляет 0,001-0,5 мг/кг веса тела в день. Во многих вариантах реализации изобретения, дозировка составляет 5-100 мг/кг веса тела в день. В других вариантах реализации изобретения дозировка составляет 50-500 мг/кг веса тела в день. Настоящее изобретение также включает дозировку 100-1 г/кг веса тела в день. Примеры дозировок, не являющиеся ограничениями, используемых согласно способам настоящего изобретения, вы
- 23 017403 бираются из группы, состоящей из 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 мг/кг веса тела в день. Дозировки, используемые в настоящем изобретении, могут составлять 1-5 г/кг веса тела в день. Дозировки, имеющие промежуточные значения между указанными выше, также рассматриваются в пределах настоящего изобретения. Указанные дозировки могут вводиться субъектам, подвергающимся лечению, ежедневно, или не каждый день, или еженедельно, или в соответствии с любым другим режимом, определенным эмпирически. Типичный пример лечения определяет порядок применения во множественных дозах, в течение продолжительного периода, например, в течение по меньшей мере шести месяцев. Другие типичные примеры режимов лечения определяют порядок применения один раз каждые две недели, или один раз в месяц, или один раз каждые 3-6 месяцев. Типичные дозировки включают, не ограничиваясь ими, 1-10 мг/кг или 15 мг/кг каждый день, 30 мг/кг не каждый день, или 60 мг/кг один раз в неделю.
В некоторых вариантах реализации изобретения можно осуществлять лечение субъекта путем введения молекул нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид 8ета6А. Дозировки для нуклеиновых кислот варьируют в пределах приблизительно от 10 нг до 1 г, от 100 нг до 100 мг, от 1 мкг до 10 мг или от 30 до 300 мкг ДНК на одного пациента. Дозировки для инфекционных вирусных векторов варьируют от 10 до 100 или более вирионов на дозу.
В композиции, используемые в соответствии со способами настоящего исследования, также могут быть включены сопутствующие активные компоненты. Например, полипептид 8ета6А или белок слияния может быть совмещен и/или применен совместно с одним или более дополнительными терапевтическими веществами.
Изобретение включает в себя любой подходящий способ доставки полипептида 8ета6А в выбранную ткань, включая болюсную инъекцию водного раствора, или имплантацию системы с контролируемым высвобождением вещества. Использование имплантатов с контролируемым высвобождением вещества уменьшает число необходимых повторных инъекций.
Полипептиды 8ета6А, используемые в соответствии со способами настоящего изобретения, могут быть непосредственно влиты в головной мозг. Известны разнообразные имплантаты для прямого вливания в головной мозг, являющиеся эффективными способами для доставки терапевтических соединений в мозг людей, страдающих нейродегенеративными заболеваниями. Данные способы включают хронические вливания в мозг с использованием стереотаксически имплантированных насосов, временных внутритканевых катетеров, постоянных внутричерепных имплантированных катетеров и хирургически имплантированных, биодеградируемых имплантатов (см., например, 6111 е! а1., зирга; 8скагГеп е! а1., Шдк Асйуйу 1об1пе-125 1п1егзййа1 1тр1ап! Рог 61ютаз, 1п!. 1. КаЛайоп 0псо1оду Бю1. Ркуз. 24(4):583-591 (1992); базраг е! а1., Регтапеп! 1251 1тр1ап!з Гог Весштеп! Майдпап! 61ютаз, Ιη!. 1. Ваб1а!1оп 0псо1оду Бю1. Ркуз. 43(5):977-982 (1999); скар!ег 66, радез 577-580, Векехха е! а1., 8!егео1асйс 1п!егзИИа1 Вгаску1кегару, т ОйбепЬегд е! а1., Тех!Ьоок оГ 8!егео1асйс апб Рипс1юпа1 №игозигдегу, Мс6га\\-Нб1 (1998); апб Вгет е! а1., Тке 8аГе!у оГ 1п!егз!1ба1 Скето1кегару \\йк ВСNυ-^оабеб Ро1утег Ро11о\геб Ьу Ваб1а1юп Ткегару т !ке Тгеа!теп! оГ №\\1у Б1адпозеб Макдпап! Окотаз: Рказе I Тпа1, 1. №иго-0псо1оду 26:111-23 (1995).
Композиции могут также содержать полипептид 8ета6А, распределенный в биосовместимом материале-носителе, который функционирует в качестве системы доставки соединений или их поддержания. Подходящие примеры носителей с непрерывным высвобождением вещества включают полупроницаемые полимерные матрицы в виде формованных предметов, например суппозитории или капсулы. Имплантируемые или микрокапсульные матрицы с непрерывным высвобождением вещества включают полилактиды (и.8. Ра!еп! №. 3773319; ЕР 58,481), ко-полимеры Ь-глутаминовой кислоты и гамма-этил-Ьглутамата (81бтап е! а1., Вюро1утегз 22:547-56 (1985)); поли(2-гидроксиэтил-метакрилат), этиленвинилацетат (Ьапдег е! а1., 1. Вютеб. Ма!ег. Вез. 15:167-277 (1981); Ьапдег, Скет. Теск. 12:98-105 (1982)) или поли-Б-(-)-3гидроксимасляную кислоту (ЕР 133988).
В некоторых вариантах реализации изобретения полипептид 8ета6А вводят пациенту посредством прямого вливания в соответствующий район головного мозга (см., например, 6Ш е! а1., Бйес! Ьгаш юГизюп оГ дка1 се11 кпе-бейуеб пеиго!горЫс Гас!ог ш Рагктзоп б1зеазе, №!иге Меб. 9: 589-95 (2003)). Альтернативные методики также доступны и могут быть использованы, чтобы вводить полипептид 8ета6А в соответствии с изобретением. Например, стереотаксическая установка катетера или имплантата может быть осуществлена с использованием аппарата Райхерта-Мундингера и многофункциональной навигационной системы ΖΌ (2атогапо-0и)оупу). Компьютеризованный томографический сканер (СТ) с усилением контрастности позволяет осуществлять трехмерное многоплоскостное планирование воздействия, при инъекции 120 мл омнипака, 350 мг йода/мл, с толщиной среза 2 мм (8ТР, Р1зскег, Ргейигд, бегтапу). Данное оборудование позволяет планировать лечение на основе изучения магнитно-резонансных изображений, объединяя информацию, полученную СТ и МРТ, для точного подтверждения.
С той же целью можно использовать стереотаксическую систему Ьекзе11 (Бо\\т1з 8игдюа1, 1пс., Беса!иг, 6А), модифицированную для использования с 6Е СТ сканером (6епега1 Е1ес!йс Сотрапу, Мйтеаикее, ^Ι), а также стереотаксическую систему Вготеп-ВоЬег1з-ОТе11з (ВВ^) (Вабюшсз, Вигкпд!оп,
- 24 017403
МА). Таким образом, на начальных этапах имплантации кольцевая основа стереотаксической рамки ΒΚν может быть прикреплена к черепу пациента. Серии СТ срезов могут быть получены с интервалами в 3 мм, хотя район (выбранные ткани) с графической рамкой локализатора скреплен с основной платой. Компьютерную программу планирования лечения можно запускать на компьютере УАХ 11/780 (Όίβίΐηΐ Ес.|шртеп1 ίΌΓροπιΙίοη. Маупатй, Ма§8.) с использованием СТ координат изображений, полученных с графитового стержня, для сопоставления результатов СТ и ΒΚν.
Способы лечения заболеваний, связанных с демиелинизацией и дисмиелинизацией, описанные здесь, перед опробованием на человеке, как правило, тестированы ίη νίίτο, а затем ίη νίνο на приемлемой животной модели для оценки желаемого терапевтического или профилактического эффекта. Специалисту с базовыми знаниями в данной области известны приемлемые животные модели, включая трансгенных животных. Например, здесь описаны анализы ίη νίίτο, позволяющие продемонстрировать влияние полипептидов 8етабА на дифференцировку и выживание олигодендроцитов. Влияние полипептидов 8етабА на миелинизацию аксонов или дифференцировку олигодендроцитов можно тестировать ίη νίίτο согласно тому, как это описано в примерах. В заключение, тесты ίη νίνο можно осуществить, получив трансгенных мышей, экспрессирующих полипептид 8етабА, или воздействовав полипептидом 8етабА на мышей или крыс в условиях модели.
Диагностика и наблюдение нейродегенеративных заболеваний
Некоторые варианты реализации настоящего изобретения ориентированы на способ диагностики или мониторинга неврологического заболевания или состояния субъекта, посредством: (а) получения образца, например, ткани или пробы биологической жидкости, например, крови или спинномозговой жидкости (ЦСЖ) от субъекта, подвергаемого диагностике или наблюдению, (Ь) измерения уровня полипептида 8етабА в образце и (с) сопоставление уровня полипептида 8етабА с образцом сравнения.
Под термином диагностика подразумевается идентификация индивида как имеющего конкретное заболевание или состояние. Под термином наблюдение подразумевается постоянная и/или периодическая проверка на наличие данного заболевания или феномена. В одном из вариантов реализации изобретения способ наблюдения нейродегенеративного заболевания включает отбор проб биологических жидкостей в нескольких временных точках с интервалом как часть наблюдения состояния пациента при лечении нейродегенеративного заболевания. В другом варианте реализации изобретения способ наблюдения нейродегенеративного заболевания включает отбор проб биологических жидкостей в нескольких временных точках с интервалом, как часть наблюдения состояния пациента при лечении рассеянного склероза.
В одном из вариантов реализации изобретения заболеванием или состоянием, в отношении которого необходимо осуществлять диагностику или наблюдение, является рассеянный склероз. В других вариантах заболевание или состояние может быть выбрано из группы, включающей прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию (РМЬ), энцефаломиелит (ЕРЬ), миелолиз моста головного мозга (СРМ), адренолейкодистрофию, болезнь Александера, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера (ΡΜΖ), глобоидно-клеточную лейкодистрофию (болезнь Краббе), Уоллеровскую дегенерацию, ретробульбарный неврит, поперечный миелит, боковой амиотрофический склероз (АЬ8), болезнь Хантингтона, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, травмы спинного мозга, травмы головного мозга, лучевое поражение, неврологические осложнения химиотерапии, инсульт, ишемическую нейропатию зрительного нерва, недостаток витамина Е, синдром недостатка изолированного витамина Е, АК, синдром Бессена-Корнцвейга, синдром Марчиафава-Бигнами, метахроматическую лейкодистрофию, невралгию тройничного нерва и паралич Белла.
Пробы биологических жидкостей включают, не ограничиваясь ими, кровь, мочу и спинномозговую жидкость (ЦСЖ). Способы, посредством которых можно получить биологические жидкости, включают, не ограничиваясь ими, биопсию тканей, венопункцию, сбор мочи и спинномозговую пункцию. В одном из вариантов реализации изобретения, проба биологической жидкости представляет собой ЦСЖ или кровь.
Ткани включают, не ограничиваясь ими, эпителий, мышечную ткань, соединительную ткань или нервную ткань. В одном из вариантов реализации изобретения ткань представляет собой эпителий, например участок кожной ткани. В другом варианте реализации изобретения дендритные клетки, отобранные из ткани или биологической жидкости, например ЦСЖ или крови, используют для обнаружения экспрессии 8етабА.
Проба биологической жидкости берется у субъекта. В некоторых вариантах реализации изобретения субъект относится к позвоночным. Позвоночные включают, не ограничиваясь ими, человека, мышей, крыс, овец, коз, свиней, рогатый скот, лошадей, рептилий, рыб, амфибий и эмбрионы птиц, рептилий и рыб. В одном из вариантов реализации изобретения субъект является человеком. В другом варианте реализации изобретения субъект является человеком, страдающим или предположительно страдающим неврологическим заболеванием, выбранным из списка, включающего рассеянный склероз, прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию (РМЬ), энцефаломиелит (ЕРЬ), миелолиз моста головного мозга (СРМ), адренолейкодистрофию, болезнь Александера, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера (ΡΜΖ), глобоидно-клеточную лейкодистрофию (болезнь Краббе), Уоллеровскую дегенерацию, ретробульбарный
- 25 017403 неврит, поперечный миелит, боковой амиотрофический склероз (АЬ8), болезнь Хантингтона, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, травмы спинного мозга, травмы головного мозга, лучевое поражение, неврологические осложнения химиотерапии, инсульт, ишемическую нейропатию зрительного нерва, недостаток витамина Е, синдром недостатка изолированного витамина Е, АВ, синдром БессенаКорнцвейга, синдром Марчиафава-Бигнами, метахроматическую лейкодистрофию, невралгию тройничного нерва и паралич Белла. В отдельном варианте реализации изобретения, субъект является пациентом с рассеянным склерозом, у которого недавно обнаружили по меньшей мере одно состояние, выбираемое из группы, включающей оцепенение, слабость, нарушение зрения, потеря равновесия, головокружение, гиперактивность мочевого пузыря, утомление и депрессия. В значении, используемом здесь, недавно может означать 3, 5, 7, 10, 14 или 21 день.
Уровень экспрессии 8ета6А в образце может служить индикатором стадии болезни, например, серьезности заболевания или состояния, предрасположенности субъекта к заболеванию, прогноза в отношении субъекта или эффективности применяемой терапии против заболевания.
Настоящее изобретение далее обеспечивает способы детекции присутствия полипептида 8ета6А в образце, полученном от субъекта. Любой способ, известный в данной области знания, может быть использован для детекции белков или мРНК. Такие методы включают, не ограничиваясь ими, окрашивание Кумасси синим, иммунодиффузию, иммуноэлектрофорез, иммунохимические способы, анализ связывания лигандов, иммуногистохимическе подходы, агглютинацию и анализ комплемента [Ваз1с апб С11шса1 1ттцпо1оду, 217-262, 81!ез апб Тегг, ебз., Арр1е!ои & Ьаиде, ШпгаК СТ, (1991), источник, включенный посредством ссылки]. Способ детекции мРНК 8ета6А хорошо известен в данной области знания (Тиап Воску, ВесотЫпап! Рго!ет Рго!осо1з: Пе!ес!юи апб 1зо1а11оп (Ме!1обз 1п Мо1еси1аг Вю1оду) (МеШобз ш Мо1еси1аг Вю1оду) (1з! еб. Нитаиа Ргезз, РА 1997)). Примерами, не представляющими собой ограничения, являются нозерн-гибридизация (гибридизация ДНК-РНК), гибридизация 1и з1!и, или ОТ-ПЦР.
Многочисленные иммунологические анализы конкурентного и неконкурентного связывания белков хорошо известны специалисту в данной области знаний. Антитела, используемые в таких анализах, могут быть не мечеными, например, антитела, используемые в реакции агглютинации, или мечеными для использования в различных методах анализа. Метки, которые можно использовать, включают радионуклиды, ферменты, флюорофоры, хемилюминесцентные молекулы, субстраты ферментов или кофакторы, ингибиторы ферментов, частицы, красители и т. п. для использования в радиоиммунологическом анализе В1А), ферментативных иммуноанализах, например твердофазном иммуноферментном анализе (ТИФА, ЕЫ8А), флуоресцентном иммуноанализе, вестерн-гибридизации и т.п.
При диагностике или мониторинге неврологического заболевания у субъекта уровень полипептида 8ета6А в образце можно сопоставлять с уровнем полипептида 8ета6А в образце сравнения. Подходящие образцы сравнения могут включать, не ограничиваясь ими, ткани или пробы биологических жидкостей, полученные от индивида, не страдающего расстройствами нервной системы. В одном из вариантов реализации изобретения образец сравнения может быть получен от субъекта, не страдающего нейродегенеративным заболеванием. В другом варианте реализации изобретения образец сравнения может быть получен от субъекта, не страдающего рассеянным склерозом. Дополнительно, в качестве внутреннего стандарта или контроля можно использовать известный белок, продуцируемый субъектом, например альбумин, если измерять его количество в сыворотке крови или общем белке.
Наборы для диагностики
Наборы для диагностики также рассматриваются в настоящем изобретении. Такие наборы позволяют проводить детекцию, диагностику или наблюдение нейродегенеративных заболеваний. Методика одиночного теста, используемая в данных наборах для диагностики, уменьшает время, необходимое для диагностики дейродегенеративного заболевания индивида и/или снижает время, необходимое для детекции дифференциально экспрессируемых белков в пробе биологической жидкости пациента, если проводится наблюдение прогрессии заболевания и/или эффекта от лечения заболевания пациента.
Один из вариантов реализации изобретения ориентирован на создание диагностического набора для детекции, диагностики или наблюдения нейродегенеративных заболеваний у пациентов, с использованием антитела или антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с полипептидом 8ета6А, описываемым здесь, и детектируемой метки. В другом варианте реализации изобретение ориентировано на создание диагностического набора для детекции, диагностики или наблюдения рассеянного склероза у пациентов с использованием антитела или антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с полипептидом 8ета6А, и детектируемой метки.
В некоторых вариантах реализации изобретения, антитело помечено ферментами, необходимыми для детекции, например пероксидазой хрена, β-галактозидазой, люциферазой, щелочной фосфатазой, глокозооксидазой и т.п. В вариантах, когда оно помечено ферментом, необходимым для детекции, детекция антитела осуществляется посредством добавления дополнительных реагентов, которые используются ферментом для образования детектируемого продукта реакции. Например, пероксидаза хрена, взаимодействующая с пероксидом водорода и диаминобензидином.
Антитело может быть также помечено биотином, и в этом случае его детекцию можно проводить посредством непрямого измерения связывания авидина или стрептавидина. Антитело может быть также
- 26 017403 помечено определенными заранее полипептидными эпитопами, распознаваемыми вторичным репортером (например, последовательности пары лейциновой застежки, сайты связывания вторичных антител, металлсвязывающие домены, эпитопные метки).
Наборы, которые рассматриваются в настоящем изобретении, предназначены для детекции, диагностики или наблюдения нейродегенеративных заболеваний у позвоночных, включая, но не ограничиваясь ими, человека, мышей, крыс, овец, коз, свиней, рогатый скот, лошадей, рептилий, рыб, амфибий и эмбрионы птиц, рептилий и рыб.
Наборы для диагностики, которые рассматриваются в настоящем изобретении, содержат некоторые или все важнейшие компоненты, необходимые для осуществления желаемого иммунологического анализа, в соответствии с настоящим изобретением. Набор для диагностики может представлять собой форму, упакованную для коммерческого использования, как комбинацию одного или несскольких контейнеров, содержащих необходимые реагенты. Обычные компоненты набора очевидны для специалиста в данной области, и описаны в многочисленных публикациях, включающих, например, следующий источник (Наг1ο\ν апй Ьапе; АпйЬоФек А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬогаЮгу Рге§8, Со1й 8рппд НагЬог, Ν.Υ. 1988), включенный в данный документ во всей полноте посредством ссылки. Обычные компоненты набора могут включать такие предметы, как, например, микропланшеты, буферы для поддержания рН анализируемой смеси (такие как, но не ограничивась ими, ТгЕ. НЕРЕ8, фосфат, карбонат и т.п.), связанные вторичные антитела, например, связанный с пероксидазой антимышиный 1д6 (или любой анти-1д6 для животного, из которого происходит первое антитело), стабилизаторы, биоциды, инертные белки, например, бычий сывороточный альбумин, или подобные, и другие стандартные реагенты.
Наборы для диагностики, которые рассматриваются в настоящем изобретении, также могут включать наборы, подходящие для использования в домашних условиях, а также в клиниках, врачебных кабинетах или лабораториях. Примеры наборов для домашнего тестирования можно найти в примере в И8 5б02040, который включен в настоящий документ посредством ссылки.
Термин детекция, используемый в данной заявке, в контексте детекции наличия белка у пациента, включает определение количества белка или способности пациента экспрессировать некоторое количество белка, оценку прогноза в отношении вероятных последствий болезни и перспективы выздоровления, мониторинг уровня белка в течение периода времени как меры состояния больного, и наблюдение уровня белка для определения предпочтительного терапевтического режима для пациента, например, страдающего нейродегенеративным заболеванием.
Примеры
Пример 1. 8етабА, включенный в природу олигодендроцитов
Олигодендроциты созревают, проходя через серию стадий развития от клеток-предшественников олигодендроцитов (которые экспрессируют N62), дифференцирующихся в премиелинизирующие олигодендроциты (которые экспрессируют 01 и 04), и затем, наконец, в зрелые миелинизирующие олигодендроциты (которые экспрессируют 01 и 04, основной белок миелина (МВР) и антипротеолипидный белок (РЬР)). Такм образом, посредством слежения за присутствием и отсутствием маркеров N62, 01, 04, МВР и РЬР можно определить стадию развития конкретной клетки и оценить роль полипептидов 8етабА в природе олигодендроцитов. Также известно, что транскрипционный фактор-2 олигодендроцитов (Θ1ί§-2) экспрессируется в линии олигодендроцитов, поэтому его можно использовать как маркер для детекции олигодендроцитов (см. Υοкοο е1 а1. Атег. 1. о£ Ра111.1б4: 1717-1725 (2004) (Для общего обзора биологии олигодендроцитов см., например, Ваитапп апй Ркат-Ошк Р11У5Ю1. Вет. 81: 871-927 (2001); Вгак е1 а1., 1пк 1. Пет. Вю1. 49: 209-220 (2005).
Моноклональные антитела против 04 и МВР были получены из компании Сйешюоп. Моноклональное антитело против РЬР (клон АА3, 1:10) любезно предоставлено проф. С. ЕиЬегхк! (Хататига е1 а1., 1. №игос11ет. 57(5): 1б71-80 (1991)). Моноклональное антитело против клеток-предшественников астроцитов (АРС) было получено из УЭДВ ш1егпа1юпа1 (ЕоШепау 8ои§ Во18, Егапсе). Антитело против С№а§е было получено из компании 81дта. Антитело против N62 (АВ5320) было получено из компании СИепнсоп. Антитело против 8етабА человека было получено из Ρ&Ό 8у51ет5 (М1ппеаро118, ΜΝ). Антитела против Nа2+ и параноидина были получены из компании 81дта. Анти-тус антитело (9Е10, 1:100) было получено из 8ап1а Сгих Вю1ес11по1оду (8С-40). мРНК 8етабА экспрессируется в олигодендроцитах
Экспрессию мРНК 8етабА анализировали путем гибридизации ш δίΐιι в свежем замороженном головном мозге (сагиттальные срезы) и спинном мозге (коронарные срезы) мышей Р1 и Р15. Анестезию швейцарских мышей (йатзег Ье 6епе51 8а1п1 Ые, Егапсе) осуществляли посредством ингаляции изофлюорана (АЬЬой), затем мышей декапитировали. Мозг и зрительные нервы немедленно замораживали в изопентане (-50°С) и хранили при -80°С до гибридизации. Срезы тканей затем фиксировали в течение 10 мин в 4% РЕ А, промывали в РВ8, рН 7,4, подвергали действию протеиназы К (10 мкг/мл; 1птйгодеп, СагЬЬай, СА) в течение 3-5 мин, затем фиксировали в течение 5 мин в 4% РЕА, промывали в РВ8, ацетилировали и промывали в РВ8 1% Тгйоп Х-100. Препараты инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре в буфере для гибридизации (50% формамид, 5х 88С, 1х ПепйагйРк, 250 мкг/мл дрожжевой тРНК, и 500 мкг/мл спермы сельди, рН 7.4), и затем проводили гибридизацию срезов тканей при 72°С в течение ночи в присутствии рибопроб 8етабА (0,5 нг/мкл), меченных дигоксигенином. После гибриди- 27 017403 зации срезы промывали в течение 2 ч в 2х 88С при 72°С и блокировали в 0.1 М Тгщ, рН 7.5, 0.15 М №1С1 (В1) содержащего 10% нормальной козьей сыворотки (N08) в течение 1 ч при комнатной температуре. После блокирования препараты инкубировали в течение ночи при комнатной температуре в присутствии антидигоксигениновых антител, связанных с щелочной фосфатазой (1:5000; Коске Б|адпо511с5) в растворе В1, содержащем 1% N08. После дополнительных промывок активность щелочной фосфатазы определяли с помощью нитро-голубого хлорида тетразолия (ΝΒΤ) (337.5 мкг/мл) и 5-бромо-4-хлоро-3индолилфосфата (ВС1Р) (175 мкг/мл) (Коске Б|адпо511с5). Срезы заключали в Мо\\ю1 (Са1Ыоскет/Мегск, СагЫаб!, Оегтапу). Как показано на фиг. 3, мРНК 8ета6А обширно экспрессируется в белом веществе ЦНС мышей Р15, в олигодендроцитах на стадии постнатального развития. Белок 8ета6А экспрессируется в олигодендроцитах.
Экспрессия белка 8ета6А в олигодендроцитах мышей на срезах мозга Р15 (из мозга, фиксированного в 4% РЕА) была подтверждена двойным иммуноокрашиванием 8ета6А и РЬР, 8ета6А и АРС (маркер олигодендроцитов), и 8ета6А и С№а§е (маркер олигодендроцитов и Шванновских клеток). Срезы блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре (КТ) в РВ8, содержащем 0,2% желатин (Рго1аЬо, ЕоШепау-коик-Вохк, Егапсе) и 0,25% Тгйоп Х-100 (РВ8-О-Т), и затем инкубировали в течение ночи при КТ в присутствии первичных антител, например антимышиных 8ета6А антител, анти-РЬР антител, антиАРС антител, и анти-С№а§е антител. Культуры затем смешивали с 4% РЕА при комнатной температуре в течение 10 мин., промывали, а затем насыщали и пермеабилизировали в буфере РВ8, содержащем 10% N08 и 0,2% Тгйоп-Х100, в течение 30 мин. Вторичные антитела, например СΥ3-связанные антитела для 8ета6А и Е1ТС-связанные антитела для РЬР, АРС, и С№а§е растворяли в РВ8, содержащем 10% N08 и 0,1 % Тгйоп Х-100 в течение 1 ч и после промывки инкубировали в течение 1 ч при КТ в присутствии вторичных антител. После промывки культуры заключали в Мо\\то1 (Са1Ь1оскет/Мегск, Саг1йаб!, Оегтапу).
Двойное иммуноокрашивание показало, что все клетки, экспрессирующие 8ета6А, также экспрессируют АРС, С№а§е или РЬР в белом веществе (данные не представлены). Тем не менее, некоторые клетки, экспрессирующие РЬР, АРС и С№а§е, не экспрессируют 8ета6А. Таким образом, вероятно, белок 8ета6А экспрессируется в клетках линии олигодендроцитов или в олигодендроцитах на специфической конкретной стадии созревания. Следовательно, совместное иммуноокрашивание 8ета6А и маркеров олигодендроцитов, РЬР, АРС или С№а§е подтверждает, что олигодендроциты экспрессируют 8ета6А ш у1уо.
На тех же самых срезах мозга Р15 (мозжечок, кора) иммуноокрашивание с белками, специфичными для олигодендроглии, например, РЬР, было совмещено с 8ета6А при гибридизации ш кйи. Стандартная гибридизация ш ίάιι была осуществлена, как показано выше, за исключением уменьшения времени обработки протеиназой К (10 мкг/мл) до 2 мин. После гибридизации ш §йи с рибопробой 8ета6А срезы промывали в РВ8-Т, блокировали в течение 1 ч при КТ в РВ8-О-Т и инкубировали в течение ночи при КТ в присутствии анти-РЬР антител (клон АА3) и затем инкубировали в присутствии биотинилированных кроличьих антикрысиных антител (1:200; Бако, 01о8!гир, Бепшагк) и НКР-связанного стрептавидина (1:400; Атегакат). Срезы подвергали диаминобензидиновой реакции (коричневый осадок). Все клетки, экспрессирующие транскрипт 8ета6А, окрашивались фиолетовым и были также окружены коричневым осадком, указывающим на экспрессию РЬР (данные не представлены). Экспрессия белка 8ета6А регулируется при развитии.
Экспрессию 8ета6А и АРС на коронарных срезах переднего мозга мышей Р15, Р30 и Р45 также анализировали путем двойного иммуноокрашивания, с использованием антимышиных 8ета6А и антиАРС антител, как описано выше. Сильная экспрессия АРС наблюдалась на всех различных возрастах, но максимум совместно меченных АРС/8ета6А клеток наблюдался у мышей Р15, где 65% олигодендроцитов (АРС+ клеток) экспрессировали 8ета6А (данные не представлены). Доля АРС-положительных клеток, также экспрессирующих 8ета6А в белом веществе, снижалась до 14% у Р30 и падала до 8% у Р45 (данные не представлены). Это демонстрирует, что экспрессия 8ета6А регулируется в ходе развития и достигает максимального значения на стадии Р15, во время пика миелинизации.
Пример 2. Экспрессия 8ета6А на различных стадиях дифференцировки олигодендроцитов
Экспрессия 8ета6А была также продемонстрирована ίπ уйго в очищенных культурах олигодендроцитов. Кору больших полушарий мышей от РО до Р5 разрезали и переносили в культуральную среду, состоящую из БМЕМ с 10% сывороткой крови теленка. Диссоциацию ткани осуществляли путем просеивания ткани через нейлоновое сито с размером ячеек 70 мкм (ВБ Вюкаепсек) в культуральной среде. Суспензию клеток распределяли на пластиковых чашках для клеточных культур, 100 мм диаметром, покрытых полиорнитином. Клетки-предшественники олигодендроцитов селективно смывали путем осторожного спринцевания культуральной средой клеточного слоя. Смытые клетки затем дважды пересевали на 12-часовой срок на непокрытые пластиковые чашки для культур, чтобы дать возможность закрепиться оставшимся астроцитам и клеткам микроглии. Незакрепившиеся и слабо закрепившиеся клетки (олигодендроциты) культивировали на 60 мм пластиковых чашках для культур. Культуры окрашивали с помощью антимышиных 8ета6А антител и анти^О2 (маркер клеток-предшественников олигодендроцитов), либо анти-О4 (маркер клетоклинии олигодендроцитов на стадии пре-олигодендроцита) и анти-МВР ан
- 28 017403 тител (маркер зрелых олигодендроцитов). СУ3-связанные антитела использовали в качестве вторичных антител, чтобы визуализировать экспрессию 8ета6А, а для NС2, 04 и МВР использовали Е1ТСсвязанные антитела. После 24 ч ш νίΙΐΌ различные типы клеток экспрессировали NС2: некоторые очень слабо дифференцированные морфологически клетки были мечены только НТС ^С2+) и, следовательно, были 8ета6А-негативными; другие, более дифференцированные (с большим количеством отростков), экспрессировали NС2 и, на низком уровне, 8ета6А, в теле клетки, но не в отростках (данные не представлены). После 48 ч ш νίΙΐΌ 04-позитивные клетки сильно экспрессировали 8ета6А (данные не представлены). После 72 ч ш νί!ΐΌ МВР-положительные клетки сильно экспрессировали 8ета6А (данные не представлены). Это показывает, что 8ета6А более активно экспрессируется в дифференцированных (04 и МВР+) олигодендроцитах (что наблюдается также ш νί\Ό).
Пример 3.
8ета6А-нокаутированные мыши демонстрируют уменьшение миелинизованных аксонов. Для создания 8ета6А-нокаутированных мышей кассета, кодирующая СП4-трансмембранный домен βгалактозидаза-неомицин-фототрансферазы (ТМ-(Адео) и плацентарную щелочную фосфатазу человека (РЬАР), разделенные участками внутренней посадки рибосомы (1ВЕ8), была встроена в 17-ый интрон 8ета6А, как описано в источнике (Ье1дй!оп е! а1., №!иге, 410: 174-179). Оставшаяся Ν-терминальная часть белка 8ета6А до аминокислоты 623 (и поэтому лишенная трансмембранного и цитоплазматического доменов) была слита с β-галактозидазой и заключена в эндоплазматический ретикулум. Для того, чтобы изучить нарушения миелинизации, исследовали перехваты Ранвье у мышей, дефектных по 8ета6А. В перехватах Ранвье экспрессируются некоторые хорошо изученные белки, имеющие характерную экспрессию и функцию в этом месте. Антитела, полученные против белков, вовлеченных в образование перехвата Ранвье, например параноидина, были использованы для обнаружения экспрессии белков. Перехваты Ранвье являются хорошо организованными структурами, где осуществляется тесное взаимодействие между аксоном, подвергающимся миелинизации, и олигодендроцитами. В соответствии с характерной экспрессией белков в перехватах Ранвье можно визуализовать различные участки: потенциал-управляемые каналы для визуализации центрального участка и параноидин для визуализации двух доменов, окружающих центральный участок перехвата Ранвье, который называется кластером параноидин/№г' каналов. Экспрессию каналов и параноидина визуализовали иммуногистохимически в зрительных нервах у мышей Р16 с использованием антител против №г' каналов и параноидина (данные не представлены). Иммуногистохимические исследования показали, что у мышей, дефектных по 8ета6А, достоверно снижается число кластеров параноидин/№:' каналов (-40,54%; п=3) (данные не представлены). Этот результат свидетельствует о том, что у мышей Р16, дефектных по 8ета6А, аксоны менее миелинизированы, чем у дикого типа.
8ета6А-нокаутированные мыши демонстрируют сниженную экспрессию РЬР в олигодендроцитах.
Чтобы выяснить, нормально ли происходит дифференцировка и пролиферация олигодендроцитов у мышей, дефектных по 8ета6А, три главных аксональных тракта, передняя комиссура (ПК), мозолистое тело (МТ) и зрительный нерв (3Н), пометили посредством нерадиоактивной гибридизации ш кйи и определили количество клеток, экспрессирующих РЬР. Анализировали три возраста в случае ПК и МТ, Р16, Р30 и Р45 (3 животных для каждого срока) и Р16 в случае 3Н. Никаких достоверных изменений экспрессии РЬР не наблюдалось в МТ на всех возрастах (данные не представлены). Однако количество клеток, экспрессирующих РЬР, было снижено в случае возраста Р16 в ПК у мышей 8ета-/- (-43%) по сравнению с детенышами дикого типа (фиг. 4). Такое снижение у Р16 объясняется значительным снижением числа клеток, экспрессирующих РЬР (-60%), и также оно сопряжено с 30% снижением поверхности ПК. Снижение менее выражено в ПК у Р30 (-20%) и становится нормальным у взрослых особей, как показано на фиг. 4. Подобным образом, экспрессия РЬР в зрительном нерве Р16 также демонстрирует подобное снижение (-26%) (данные не представлены). Тем не менее, никаких достоверных изменений не было обнаружено в клетках, экспрессирующих транскрипционный фактор-2 олигодендроцитов (0йд-2), относящихся к линии олигодендроцитов, в ПК (данные не представлены). Эти результаты свидетельствуют о возможной роли 8ета6А либо в дифференцировке олигодендроцитов ш νί\Ό. либо в их способности к миграции и колонизации аксональных трактов.
Олигодендроциты, дефектные по 8ета6А, демонстрируют задержку дифференцировки.
Олигодендроциты выделяли из 8ета6А-/- новорожденных мышей и анализировали их способность к дифференцировке согласно способу, описанному в источнике (Вегпагй е! а1., 1 №игокс. Век. 65: 439-445 2001). В общем, целые полушария головного мозга мышей Р0-Р10 или крыс разрезали в растворе фосфатного буфера и переносили в культуральную среду, состоящую из ЭМЕМ (1пуЦгодеп 31966047) с добавлением пенициллина (50 ед./мл), стрептомицина (50 мкг/мл) (1пуЦгодеп 15140), сыворотки крови теленка (10%) (С1Ьсо 16030074), 5 нг/мл РЭСЕВВ (81дта Р3201) и 5 нг/мл ЬЕСЕ (81дта Е0291). Диссоциацию ткани осуществляли путем просеивания ткани через нейлоновое сито с размером ячеек 70 мкм (ΒΌ В1окс1епсек) в культуральной среде. Суспензию клеток распределяли на пластиковых чашках для клеточных культур, 100 мм диаметром, покрытых полиорнитином (81дта Р3655). Культуры инкубировали при 37°С во влажном инкубаторе, в атмосфере 95% воздуха-5% С02. Культуральную среду меняли через 4
- 29 017403 дня после посева клеток и затем дважды в неделю. После 8-10 дней инкубирования клеткипредшественники олигодендроцитов селективно смывали путем осторожного спринцевания культуральной средой слоя клеток. Смытые клетки затем дважды пересевали на 12-часовой срок на непокрытые пластиковые чашки для культур, чтобы дать возможность закрепиться оставшимся астроцитам и клеткам микроглии. Незакрепившиеся и слабо закрепившиеся клетки (олигодендроциты) культивировали на б0 мм пластиковых чашках для культур, покрытых полиорнитином, в химически охарактеризованной среде, содержащей 0,5% эмбриональной телячьей сыворотки (РС8), 10 мкМ инсулина, 100 мкг/мл трансферрина, 0,5 мкг/мл альбумина, 2 мкМ прогестерона, 100 мкМ путресцина, 40 нг/мл трийодотиронина, 40 нг/мл Ь-тироксина, 40 нМ й-биотина и 100 нМ гидрокортизона. При отсутствии дополнительного митогена эти субкультуры давали начало почти гомогенной популяции клеток, содержащей более 90% Са1-С позитивных клеток после 10 дней инкубирования (см. Вектгй е! а1., Ιη!. I. Эеу. №игокс1. 7(4): 401-409, 1989). Для поддержания этих клеток на стадии клеток-предшественников олигодендроцитов (КПО) и для предотвращения преждевременной дифференцировки перед обработкой в культуральную среду добавляли РОСРАА (10 нг/мл) (в случае крыс) или РЭСРВВ (10 нг/мл) и ЬРСР (10 нг/мл в случае крыс и 20 нг/мл в случае мышей). После удаления митогена дифференцировка КПО происходила в течение 24-72 ч (Вод1ег е! а1., Ргос. №!1. Асай. δα. И8А. 87(1б): б3б8-б372, 1990; Оигзпй е! а1. ЕМВ0 I. 1б(2): 30б-317, 1997). К химически охарактеризованной среде был также добавлен белок 8етабА-Рс, полученный от Κ&Ό кук!етк.
Стадию созревания олигодендроцитов можно оценить путем измерения морфологической сложности культивируемых олигодендроцитов, например, путем измерения фрактальной размерности (ФР) клеток. 1й. Фиг. 5 демонстрирует определение ФР очищенных олигодендроцитов (визуализированных с помощью фазового контраста или меченных анти-04 антителам), полученных от 8етабА+/- и 8етабА-/мышей, после 24 и 48 ч культивирования ίη νίΙΐΌ. Фигура демонстрирует, что хотя достаточная часть 8етабА+/- олигодендроцитов имеют ФР порядка 1.25 после 48 ч, большинство 8етабА-/- олигодендроцитов имеют ФР лишь порядка 1.05-1.15 (η=3) (изображение А фиг. 5). ФР 8етабА+/- и 8етабА-/олигодендроцитов после 24 ч культивирования ίη ν 11го сходна с ФР 8етабА-/- олигодендроцитов после 48 часов культивирования (данные не представлены). Эти результаты показывают, что у мышей 8етабА-/наблюдается задержка дифференцировки олигодендроцитов.
После 72 ч культивирования, олигодендроциты подвергали иммуноокрашиванию с анти-04 антителами (маркер дифференцировки олигодендроцитов) и анти-МВР антителами (маркер уже дифференцированных олигодендроцитов) для измерения степени дифференцировки олигодендроцитов. В качестве вторичных антител использовали Р1ТС-связанные антитела для 04 и СУ3-связанные антитела для МВР. Под микроскопом анализировали случайно выбранные поля зрения. После 72 ч число 04+/МВР+ клеток у 8етабА-/- снижалось до 40,09% по сравнению с диким типом (данные не представлены). Данные ίη νίΙΐΌ поддерживают вывод о том, что дифференцировка олигодендроцитов задерживается в олигодендроцитах, лишенных 8етабА.
Пример 4. 8етабА-Рс стимулирует миелинизацию ίη νίΙΐΌ
Роль 8етабА в миелинизации была исследована ίη νίΙΐΌ путем воздействия 8етабА-Рс на совместные культуры нейронов заднекорешковых ганглиев (3КГ) и олигодендроцитов и последующей оценки миелинизации посредством иммуноцитохимического анализа и вестерн-гибридизации. В этих исследованиях было необходимо сначала создать первичные культуры нейронов 3КГ и олигодендроцитов.
Заднекорешковые ганглии эмбрионов крыс породы 8ргадие Оа\\'1еу Е14-Е17 помещали на покровные стекла, покрытые поли-Ь-лизином (100 мкг/мл). Их выращивали в течение 2 недель на Нейробазальной среде (ΙηνίϋΌ^η 21103049) с добавлением В27 (Ιηνί^Ό^η 17504). Для удаления пролиферирующих глиальных клеток культуры обрабатывали фтордезоксиуридином (20 мкм) дважды в неделю. Приготовление олигодендроцитов осуществляли, как описано в примере 3.
Для изучение совместного культвирования олигодендроциты добавляли к капельной культуре нейронов ЗКГ в присутствии или в отсутствие 100-300 нг/мл 8етабА-Рс (Κ&Ό кук!етк, 114б-8б-025). Культуральную среду (Нейробазальная среда с добавлением В27 и 100 пд/ий N6Р) заменяли, и свежий 8етабА-Рс добавляли к клеткам каждые 3 дня. Для выявления изменений миелинизации 3-недельные культуры метили анти-МВР антителами, подвергали действию δΌδ-РАСЕ и анализировали путем вестерн-гибридизации.
На фиг. б показано, что добавление белка 8етабА-Рс усиливает миелинизацию дозозависимым образом, от негативного контроля до 0,1 мкг/мл и от 0,1 до 0,3 мкг/мл. Вестерн-гибридизация также показывает, что экспрессия МВР увеличивается при добавлении 8етабА-Рс, в количестве, например, от 0,1 до 0,3 мкг/мл (данные не представлены). Эти данные, таким образом, свидетельствуют, что полипептиды 8етабА могут способствовать миелинизации или индуцировать ее.
Пример 5. 8етабА-Рс включен в процесс ремиелинизации ίη νί\Ό
В качестве экспериментальной модели, в которой важная демиелинизация воспроизводимо индуцируется в обширных областях в мозге мышей, использовали обработку купризоном (хелатором меди) (см. Ма!кикЫта е! а1., Вгат Ра11ю1. 11 (1), 107-11б, 2001). Мыши возраста 8 недель получали 0,2% купризон с пищей в течение б недель, что вызывало гибель зрелых олигодендроцитов за счет апоптоза. За клеточной
- 30 017403 гибелью непосредственно следовало увеличение численности клеток микроглии и фагоцитоз миелина. После прекращения воздействия купризона или даже во время продолжительного воздействия купризона, клетки-предшественники олигодендроцитов начинали пролиферировать и заселять демиелинизованные области. Если воздействие купризона прекращали, в течение последующих нескольких недель наблюдалась почти полная ремиелинизация. С использованием купризоновой модели, можно анализировать экспрессию 8етабА во время демиелинизации и ремиелинизации. После воздействия купризона и последующего прекращения воздействия наблюдалось достоверное увеличение числа олигодендроцитов, экспрессирующих 8етабА, в мозолистом теле мозга мышей, подвергнутых воздействию купризона, которое начиналось на сроке 3 недели после применения купризона, досигало пика на сроке 4 недели (+310%, п=3) и затем возвращалось к базовому уровню экспрессии на сроке б недель (фиг. 7). Данные клетки, экспрессирующие 8етабЛ в месте повреждения, все были положительны в отношении маркера о11д-2. Для того, чтобы охарактеризовать данное усиление экспрессии 8етабЛ, животным, подвергнутым действию купризона, вводили Вгйи за одну неделю до их умерщвления. Некоторые олигодендроциты, экспрессирующие 8етабЛ, были Вгйи-позитивными, что свидетельствует о том, что они произошли от предшественников, которые дифференцировались в процессе индукции демиелинизации, вызванной купризоном.
Пример б. 8етабЛ может участвовать в экспериментальном аллергическом энцефаломиелите (ЭАЭ)
Для индукции ЭАЭ был использован 20-аминокислотный пептид, представляющий собой основу последовательности Миелинового Олигодендроцитного Гликопротеина (МОГ) мыши. День инициации ЭАЭ обозначили день 1 эксперимента и, начиная с дня 7, каждый день проводили клиническую оценку ЭАЭ, при этом мышей относили к следующим классам заболевания, в соответствии со следующими критериями: нет заболевания (0); сниженный тонус хвоста (1); слабость конечностей или частичный паралич (2); паралич конечностей (3); полный паралич (4); состояние агонии (5). Эти классы отражают эволюцию болезни, связанной с демиелинизацией. После индукции ЭАЭ за счет введения 20-аминокислотного пептида, у мышей 8етабЛ-/- наблюдали меньше дефектов поведения, чем у контрольных животных. Средние значения критериев для мышей 8етабЛ-/- достигали лишь 0,5, в то время как средние значения критериев для контрольных животных достигали 3.5 (данные не представлены). Только у 25% мышей 8етабЛ-/- проявлялись признаки заболевания (данные не представлены). Эти эксперименты свидетельствуют, что 8етабЛ может участвовать в индукции ЭАЭ и, вероятно, других, более обширных, аутоиммунных заболеваний, например, рассеянного склероза.
Дополнительно изучали мышей плексин-А4 -/- на способность индукции ЭАЭ (см. УататоЮ е( а1., 1п(. 1ттипо1. ΌΘΙ : 10.1093/тйтт/йхп00б (4ап. 2008)). Хотя мыши 8етабЛ-/- демонстрировали устойчивость к ЭАЭ, как показано выше, мыши плексин-А4 -/-, напротив, демонстрировали повышенную чувствительность к индукции ЭАЭ (см. там же). Более того, был проведен ίη νίίτο анализ пролиферации Тклеток у мышей 8етабЛ-/- и плексин-А4 -/- (см. там же). У мышей плексин-А4 -/- наблюдали достоверно повышенную пролиферацию Т-клеток, в то время как у мышей 8етабЛ-/- не наблюдали отличий в пролиферации Т-клеток (см. там же). Эта информаци свидетельствует, что устойчивость к ЭАЭ у мышей 8етабЛ-/-, вероятно, не вызвана нарушениями в иммунном ответе у мышей 8етабЛ-/-.
Пример 7. Полипептид 8етабЛ экспрессируется у человека в тканях, пораженных рассеянным склерозом
Для того, чтобы определить, отличается ли экспрессия 8етабЛ у человека в тканях, пораженных рассеянным склерозом, и в непораженных тканях, экспрессию 8етабЛ измеряли путем стандартной гибридизации ίη δίίπ и иммуноокрашивания в человеческих тканях, пораженных рассеянным склерозом (пробы из неокортекса). Пробы тканей, пораженных рассеянным склерозом, были получены из (Не Гейегайоп йе Хенго1од1е а! (Не 8а1ре1пеге Но8рйа1, 75013 Рале. Осуществляли стандартную гибридизацию ш 8Йи. Ткани фиксировали путем выдерживания в 4% параформальдегиде и заключали в парафин. Для гибридизации ш 8Йц, вначале удаляли воск из тканей воздействием ксилена (3 х 5 мин.), а затем регидратировали ткани путем проводки срезов по снижающемуся градиенту этанола (100, 80, 70, 50%), затем вода и РВ8. Затем срезы тканей фиксировали в течение 10 мин в 4% РГЛ, промывали в РВ8, рН 7.4, подвергали действию протеиназы К (50 мкг/мл; 1птйгодеп. СаткЬай, СА) в течение 15 мин при 37°С, затем фиксировали в течение 5 мин в 4% РГА, промывали в РВ8, ацетилировали и дегидратировали этанолом (50, 70, 80, 100%). Препараты инкубировали в течение 2 ч при б8°С в буфере для гибридизации и обрабатывали, как указано в примере 1. Препараты инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре в буфере для гибридизации (50% формамид, 5х 88С, 1х ЭепНагйГх. 250 мкг/мл дрожжевой тРНК и 500 мкг/мл спермы сельди, рН 7.4), и затем проводили гибридизацию срезов тканей при 72°С в течение ночи в присутствии рибопроб 8етабА (0.5 нг/мкл), меченных дигоксигенином. После гибридизации срезы промывали в течение 2 ч в 2х 88С при 72°С и блокировали в 0,1 М Ττίδ, рН 7,5, 0,15 М ЫаС1 (В1), содержащего 10% нормальной козьей сыворотки (N08) в течение 1 ч при комнатной температуре. После блокирования препараты инкубировали в течение ночи при комнатной температуре в присутствии анти-дигоксигениновых антител, связанных с щелочной фосфатазой (1:5000; РосНе О|адно511С5) в растворе В1, содержащем 1% N08. После дополнительных промывок, активность щелочной фосфатазы определяли с помощью нитро- 31 017403 голубого хлорида тетразолия (кВТ) (337,5 мкг/мл) и 5-бромо-4-хлоро-3-индолилфосфата (ВОР) (175 мкг/мл) (Воске О1адпок11ск). Как показано на изображениях А и В фиг. 8, мРНК 8ета6А обширно экспрессируется в человеческих тканях, пораженных рассеянным склерозом, но не экспрессируется в непораженных тканях.
Для того, чтобы показать, что для тканей человека, пораженных рассеянным склерозом, характерен высокий уровень экспрессии 8ета6А, было проведено иммуноокрашивание тканей, пораженных рассеянным склерозом, и непораженных тканей. Срезы блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре (ВТ) в РВ8, содержащем 0,2% желатин (Рго1аЬо, Еоп1епау-коик-Во1к, Ргапсе) и 0,25% Тгбоп Х-100 (РВ8С-Т), и затем инкубировали в течение ночи при ВТ в присутствии античеловеческих 8ета6А антител, полученных из Β&Ό кук1етк (МшпеароНк, М№). Затем срезы инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в присутствии СУ3-связанных антител (1асккоп [ттипогехеагск). растворенных в РВ8-С-Т. После промывки в РВ8-С-Т (3 х 10 мин) срезы заключали в Мо\\ю1 (Са1Ыосйет/Мегск, Саг1к1аб1 Сегтапу). Как показано на изображении С фиг. 8, в тканях, пораженных рассеянным склерозом, наблюдается высокий уровень экспрессии 8ета6А, в то время как в непораженных тканях наблюдается низкая экспрессия 8ета6А, или ее не наблюдается вовсе (изображения А и В фиг. 8).
Для того, чтобы определить потенциальную возможность использования экспрессии 8ета6А в качестве биомаркера, экспрессию 8ета6А измеряли в тканях пациентов, страдающих рассеянным склерозом, и было показано, что 8ета6А не экспрессируется у этих пациентов (данные не представлены). Хорошо известно, что клетки крови, например дендритные клетки, экспрессируют 8ета6А (см. Саибет е1 а1. ТттипораШ. ΙπίεΛ. Όίκ. 168(2): 453-465 (2006)). Также известно, что дендритные клетки присутствуют в спинномозговой жидкости (ЦСЖ) (см. РакЬепкоу е1 а1. Вгаш 124(3): 480-492 (2001)).
Для оценки экспрессии 8ета6А в дендритных клетках и дифференциальной экспрессии 8ета6А при сравнении тканей, пораженных рассеянным склерозом, и непораженных тканей, отбирали образцы тканей, например, кожных тканей, или биологических жидкостей, например крови или ЦСЖ, у пациентов для определения состояния рассеянного склероза.
Образцы тестировали для оценки экспрессии 8ета6А, например, посредством ЕЫ8А. Наличие экспрессии в образце на частичном уровне может служить индикатором возможного рассеянного склероза, или потенциальной возможности развития рассеянного склероза. В дополнительных вариантах реализации изобретения, такой анализ можно использовать для оценки эффективности конкретной терапии рассеянного склероза. Если сыворотка или ЦСЖ демонстрирует экспрессию 8ета6А, считается, что пациент, от которого они были получены, возможно, болен рассеянным склерозом. Альтернативно, можно сконцентрировать дендритные клетки из отобранных образцов, и тогда экспрессию 8ета6А в образце можно измерить, например, посредством ЕЫ8А. В соответствии с этим способом обнаружение 8ета6А можно использовать как маркер уже имеющегося или потенциального заболевания рассеянным склерозом.
Пример 8. Полипептид 8ета6А взаимодействует с полипептидом плексин-А2
Для того, чтобы выявить взаимодействие между полипептидами 8ета6А и полипептидами плексин-А2, рекомбинантный Ес-димеризованный АР-меченный эктодомен (внеклеточный домен) 8ета6А (АР-8ета6Аес1-Ес) был внесен в клетки мышей линии фибробластов (Ъ клетки), экспрессирующие полноразмерные полипептиды мышей плексин-А2, как описано в источнике (8и1о е1 а1., I. №игокс1. 25: 36283637 (2005)). Для создания рекомбинантного эктодомена 8ета6А, последовательность, соответствующая эктодомену 8ета6А мыши (8ета6Аес1: аминокислоты 18-648), была амплифицирована и встроена в вектор Ар1ад-4 (любезно предоставленный Ότ. I. Е1ападап, Натуатб Мебюа1 8с1оо1, ВокЮп, МА) (АР8ета6Аес1) (см. Е1ападап е1 а1., МеИобк Епхуто1 327: 17-35 (2000)). Для димеризации рекомбинантныхбелков, фрагмент, кодирующий АР-8ета6АесЕ был встроен в рЕЕ-Ес (АР-8еша6Аес1-Ес: АР-8еша6Вес1Ес; вектор экспрессии рЕЕ-Ес любезно предоставлен Όγ. 8. Ю-щаЮ 0кака ИшуеткИу). Клетки эмбриональной почки человека 293Т (НЕК293Т) трансформировали вектором рЕЕ-АР-8еша6Аес1-Ес (вектор экспрессии рСАСС8 любезно предоставлен Όγ. I. М1уа/ак1, 0кака ИшуеткИу) с использованием ЫроЕес1ашше Р1ик (Iην^ί^одеη, Саг1кЬаб, СА) и культивировали в ЬМЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) в течение 5-7 дней в атмосфере 5% С02 при 37°С. Супернатанты культур были собраны и профильтрованы через 0,22 мкм фильтр.
Для того, чтобы создать Ь-клетки, экспрессирующие плексин-А2, было осуществлено присоединение к кДНК, кодирующей полноразмерный белок мыши плексин-А2, сигнальной последовательности 8ета3А мыши, присоединение к ней же тус-метки (ССЕОКЬЕЕЕОЬ: 8ЕЦ ΙΌ N0: 17) на Юконце, в также лигирование полученной последовательности в вектор экспрессии рСАСС8. Ь-клетки подвергли совместной трансформации вектором, эспрессирующим плексин-А2, и вектором р8Т-пеоВ (Ка1оЬ, е1 а1., Се11 81гисЬ ЕнпсЕ 12: 575-580, 1987) в соответствии с кальций-фосфатным способом (С1еп апб 0кауата, Мо1. Се11 Вю1. 7: 2745-2752, 1987) и осуществили отбор трансформированных клеток с использованием СЕNЕΤIСIN (СГВС0). Ь-клетки культивировали в культуральной среде ΌΗ10. Клеточные линии, стабильно экспрессирующие белки плексин-А2, изолировали путем иммуноокрашивания с анти-тус антителами 9Е10 (см. Еуап, е1 а1., Мо1. Се11 Вю1. 5: 3610-3616, 1985).
Для того, чтобы показать связывание 8ета6А с плексином-А2, Ь-клетки, стабильно экспрессирую- 32 017403 щие полноразмерные белки мыши плексин-А2, инкубировали в 250 мкл НВЗЗ в присутствии 0,5 мг/мл ВЗА, 0,1% ΝΝ3, и 20 тМ НЕРЕЗ, рН 7,0 (раствор НВНА), содержащего 1% ЕВЗ и рекомбинантные белки АР-ЗетабАесй-Ес (культуральный супернатант), в течение 1 ч на льду, как описано в источнике (Е1ападап апб Ьебег, Се11 б3: 185-194 (1990)). После удаления раствора НВНА клетки подвергали действию 250 мкл 10 тМ Тпк-НС1, рН 8,0 с добавлением 0,1% ТгИоп Х-100 для того, чтобы перевести в раствор рекомбинантные белки, связанные с поверхностью клеток. Для оценки активности АР проводили колориметрический анализ клеточных лизатов, как описано в источниках (Е1ападап апб Ьебег, Се11 б3: 185-194 (1990) апб Е1ападап ей а1., МейГобк Еп/уто! 327: 17-35 (2000)).
Было показано, что Ес-димеризованный АР-меченный эктодомен ЗетабА связывается с высокой аффинностью с Ь-клетками, экспрессирующими плексин-А2. Значение константы диссоциации (Кб) для взаимодействия ЗетабА с плексином-А2 составляет 3.21 нМ (данные не представлены). Значение Кб сопоставимо со значением Кб для взаимодействия ЗетабА с плексином-А4, составляющим 3,5б пМ, согласно источнику (Зийо ей а1., I. №игокск 25: 3б28-3б37 (2005)).
Пример 9. Единичная мутация в плексине-А2 может нарушать связывание ЗетабА
Для того, чтобы выявить свит связывания плексина-А2/плексина-А4 с ЗетабА, исследовали мутантных мышей С57ВЬб/1, а именно NΜΕ454. Мыши NΜΕ454 (любезно предоставленные Όγ З. Аскегтап, Дасккоп ЬаЬк, Ваг НагЬог, ИЗА) были идентифицированы в работе по скринингу рецессивных мутаций в пределах всего генома после мутагенизирования №этилА-нитрозомочевиной (ЭНМ) С57ВЬб/1. Гистологический анализ мутантных мышей NΜ^454 позволил выявить гиперцеллюлярный молекулярный слой в мозжечке, который выглядел подобно молекулярному слою, обнаруживаемому у мышей с полным отсутствием плексина-А2 и ЗетабА (Вепаиб ей а1. ΝηΕιιό №игокс1епсе, т ргекк (2008)).
Для того, чтобы определить, произошла ли мутация у линии мышей NΜΕ454 в гене плексина-А2 или гене ЗетабА, было проведено картирование мутантного гена с использованием микросателлитных маркеров. Потомки Е2 (п=11), демонстрирующие мутантный фенотип NΜΕ454, были получены путем внутреннего скрещивания потомков Е1, полученных от скрещивания (С57ВЬб/1 X ВЛЬВ/сВу), и пораженные (мутантные) потомки Е2 были идентифицированы гистологически. Затем потомки Е2 были генотипированы при помощи полифорфных микросателлитных маркеров, В1М1й155 и В18М1й178, которые тесно сцеплены с генами плексина-А2 и ЗетабА, соответственно. Сцепления с В18М1й178 обнаружено не было (Х2=1,2; Р>0,5). Однако тесное сцепление было обнаружено с В1М1й155 (Х2=33,0; Р<0,0001). Этот результат, объединенный с фенотипическим анализом, подтверждает, что мутация у линии NΜΕ454 затрагивает ген плексина-А2 (Р1хпа2).
Для того, чтобы определить точную локализацию мутации, был проведен анализ экспрессии плексина-А2 в мозжечке и неокортексе с помощью вестерн-гибридизации. Анализ выявил, что полоса размером около 250 кДа присутствовала у гомозиготных мутантных мышей NΜΕ454 (п=2), мышей дикого типа и гетерозиготного контроля NΜΕ454 (п=2), но отсутствовала у обычных нокаутированных по гену плексина-А2 мышей, как показано на изображении А фиг. 9. Эти данные свидетельствуют, что мутация, полученная с помощью ЭНМ, не приводит к образованию нулевой аллели или формированию укороченного белка плексин-А2. Для дальнейшей локализации мутации все экзоны гена плексин-А2 (Р1хпа2) были полностью секвенированы на геномной ДНК гомозиготных мутантов NΜΕ454 (п=3) и контрольных мышей дикого типа (п=2). Секвенирование выявило мононуклеотидную замену цитозина в положении 1187 на аденин, приводящую к замене аланина (39б) на остаток глутаминовой кислоты. Более того, выравнивание последовательностей плексина-А2 позвоночных показало, что этот остаток аланина, локализованный в семафориновом домене, является эволюционно консервативным в обоих рецепторах ЗетабА, а именно в белках плексин-А2 и плексин-А4 (изображение В фиг. 9). Тем не менее, выравнивание показало, что этот остаток аланина (39б) отсутствует в плексине-А1 и плексине-А2, которые, как известно, не связывают ЗетабА (изображение В фиг. 9) (см. также Зийо ей а1. I. №игокск 25: 3б28 (2005); Зее а1ко Зийо ей а1. №игоп 53: 535 (2007)).
Для того, чтобы определить, влияет ли аланин (39б) у гомозиготных мутантов NΜΕ454, на связывание плексина-А2 с ЗетабА, был осуществлен направленный мутагенез с целью внесения той же точечной мутации цитозина 1187 (ОСО йо ОАО) в кДНК плексина-А2 с использованием набора ОшкСКапце ΙΙ ХЕ З1йе-В1гесйеб Мийадепеык К1й (Зйгайадепе). Для мутагенеза были использованы следующие праймеры:
Прямой праймер (ЗЕР ΙΌ ΝΟ: 18)
5'-ОСАОТОСАССААСОАОССТОТСССААТСС-3'
Обратный праймер (ЗЕР ΙΌ ΝΟ: 19)
Б'-ССАТТСССАСАСССТССТТСеТССАСТСС-З'
Мутантная конструкция (плексин-А2А39бЕ) была полностью секвенирована, и было подтверждено, что только цитозин 1187 в ней заменен на аденин.
Указанная кДНК плексин-А2А39бЕ была затем экспрессирована в клетках СОЗ7, и ее способность к связыванию ЗетабА-АР была исследована с использованием того же способа, как указано в примере 8 (см. Зийо ей а1. №игоп 53: 5354 (2007)). Результаты анализа связывания показали, что ЗетабА-АР связывается очень сильно с клетками СОЗ7, экспрессирующими плексин-А2 дикого типа (изображение С фиг.
- 33 017403
9). Однако 8ета6А-АР совершенно не связывается с клетками, экспрессирующими плексин-А2А396Е (изображение Ό фиг. 9), хотя как белок дикого типа, так и мутантный белок экспрессируются на сходном уровне.

Claims (50)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ стимулирования пролиферации, дифференцировки или выживания олигодендроцитов ίη νίΐΓΟ, включающий осуществление контакта указанных олигодендроцитов с эффективным количеством композиции, включающей выделенный полипептид семафорин 6А (8ета6А).
  2. 2. Способ стимулирования олигодендроцит-опосредованной миелинизации нейронов ίη νίΐτο, включающий осуществление контакта смеси нейронов и олигодендроцитов с эффективным количеством композиции, включающей выделенный полипептид 8ета6А.
  3. 3. Способ стимулирования пролиферации, дифференцировки или выживания олигодендроцитов у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему эффективного количества композиции, включающей выделенный полипептид 8ета6А.
  4. 4. Способ стимулирования миелинизации нейронов у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему эффективного количества композиции, включающей выделенный полипептид 8ета6А.
  5. 5. Способ лечения заболевания, расстройства или повреждения, связанного с дисмиелинизацией или демиелинизацией, у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему терапевтически эффективного количества композиции, включающей выделенный полипептид 8ета6А.
  6. 6. Способ лечения заболевания, расстройства или повреждения, связанного с гибелью олигодендроцитов или отсутствием дифференцировки олигодендроцитов у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему терапевтически эффективного количества композиции, включающей выделенный полипептид 8ета6А.
  7. 7. Способ лечения заболевания, расстройства или повреждения, при которых наблюдается разрушение миелина у млекопитающего, включающий введение терапевтически эффективного количества композиции, включающей выделенный полипептид 8ета6 А.
  8. 8. Способ стимулирования пролиферации, дифференцировки или выживания олигодендроцитов у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему эффективного количества композиции, включающей выделенный полинуклеотид, который кодирует полипептид 8ета6А.
  9. 9. Способ стимулирования миелинизации нейронов у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему эффективного количества композиции, включающей выделенный полинуклеотид, который кодирует полипептид 8ета6А.
  10. 10. Способ лечения заболевания, расстройства или повреждения, связанного с дисмиелинизацией или демиелинизацией у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему терапевтически эффективного количества композиции, включающей выделенный полинуклеотид, который кодирует полипептид 8ета6А.
  11. 11. Способ лечения заболевания, расстройства или повреждения, связанного с гибелью олигодендроцитов или отсутствием дифференцировки олигодендроцитов у млекопитающего, включающий введение нуждающемуся в этом млекопитающему терапевтически эффективного количества композиции, содержащей выделенный полинуклеотид, который кодирует полипептид 8ета6А.
  12. 12. Способ лечения заболевания, расстройства или повреждения, при которых наблюдается разрушение миелина у млекопитающего, включающий введение терапевтически эффективного количества композиции, содержащей выделенный полинуклеотид, который кодирует полипептид 8ета6А.
  13. 13. Способ по любому из пп.1-12, в котором указанный полипептид 8ета6А связывает полипептид плексин-А2.
  14. 14. Способ по любому из пп.1-13, в котором указанный полипептид 8ета6А включает последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80% идентична эталонной последовательности аминокислот, причем указанная эталонная последовательность аминокислот выбрана из группы, состоящей из последовательностей:
    - 34 017403
    ί. От 56 до 417 в 8ЕО Ю N0: 2;
    Н. От а до 417 в 8ЕО Ю N0:2; ίίί. От Ь до 417 в 8ЕО Ю N0:2; ίν. От 1 до 417 в 8ЕО Ю N0:2; ν. От 56 до с в 8Е0 Ю N0: 2; νί. От а до с в 8Е0 Ю N0: 2; νϋ. От Ь до с в 8Е0 Ю N0: 2; νϋί. От 1 до с в 8Е0 10 N0: 2; ίχ. От 56 до с' в 8Е0 Ю N0: 6;
    х. От а до с' в 8Е0 Ю N0: 6;
    XI. От Ь до с' в 8Е0 Ю N0: 6; χΐί. От 1 до с' в 8Е0 Ю N0: 6; χίϋ. От 56 до ά в 8Е0 Ю N0: 2; χΐν. От а до ό в 8Е0 Ю N0: 2;
    XV. От Ь до ό в 8Е0 Ю N0: 2;
    χνΐ. От 1 до ά в 8Е0 Ю ΝΟ: 2; χνϋ. От 56 до 0' в 8Е0 Ю N0: 6; χνϋϊ. От а до сГ в 5Е0 Ю N0: 6; χίχ. От Ь до с!' в 8Е0 Ю N0: 6; хх. От 1 до 0' в 8Е0 Ю N0: 6;
    ΧΧΪ. От 56 до е в 8Е0 Ю N0: 2; χχϋ. От а до е в 8Е0 Ю ΝΟ: 2; χχϋί. От Ь до е в 8Е0 Ю N0: 2; χχίν. От 1 до е в 8Е0 Ю N0: 2; χχν. От 56 до е’ в 8Е0 Ю N0: 6; χχνϊ. От а до е' в 8Е0 Ю N0: 6; χχνϋ. От Ь до е’ в 8Е0 Ю N0: 6; χχνίίί. От 1 до е' в 8Е0 Ю N0: 6; ΧΧΪΧ. От 56 до е” в 8Е0 Ю N0: 8; ххх. От а до е” в 8Е0 Ю N0: 8; χχχί. От Ь до е в 8Е0 Ю N0: 8; χχχϊϊ. От 1 до е” в 8Е0 Ю N0: 8; χχχΐϋ. От 56 до е”' в 8Е0 Ю N0: 4; χχχϊν. От а до е’ в 8Е0 Ю N0: 4; χχχν. От Ь до е'” в 8Е0 Ю N0: 6; χχχνί. От 1 до е’ в 8Е0 Ю N0: 8; χχχνΐί. От 56 до ΐ в 8Е0 Ю N0: 2; χχχνίϋ. От а до ΐ в 8Е0 Ю N0: 2; χχχίχ. От Ь до ΐ в 8Е0 Ю N0: 2; χΙ. От 1 до ΐ в 8Е0 Ю N0: 2;
    - 35 017403 χΐί. От 56 до ί' в 8ЕО Ю ΝΟ: 6; χΙ'ιί. От а до ί’ в 8ЕО Ю N0: 6;
    χΐίίί. От Ь до Г в 8ЕО Ю N0: 6;
    χΐίν. От 1 до 1' в 8ЕО Ю N0: 6; χΙν. От 56 до ΐ в 8Е0 Ю N0: 8;
    χΙνί. От а до ΐ” в 8Е0 Ю N0: 8; χΙνίί. От Ь до Т” в 8Е0 Ю N0: 8;
    χΙνίϋ. От 1 до ΐ в 8Е0 Ю N0: 8; χΐίχ. От 56 до τ'” в 8Е0 Ю N0: 4;
    I. Ота до Г” в 8ΕΩ Ю N0: 4;
    Ιί. От Ь до Г” в 8ΕΩ Ю N0: 4;
    Ιίί. От 1 до ΐ”' в 8ΕΩ Ю N0: 4;
    Ιίίί. От 56 до 1000 в 8Е0 Ю N0: 2; Ιίν. От а до 1000 в 8ЕО Ю N0: 2;
    Ιν. От Ь до 1000 в 8ΕΩ Ю N0: 2; Ινί. От 1 до 1000 в 8ΕΩ Ю N0: 2;
    Ινϋ. От 56 до 1047 в 8Е0 10 N0: 4;
    Ινίϋ. От а до 1047 в 8ЕО Ю N0: 4;
    Их. От Ь до 1047 в 8Е0 Ю N0: 4;
    1х. От 1 до 1047 в 8ΕΩ Ю N0: 4; Ιχί. От 56 до 971 в 8ЕО Ю N0: 6;
    Ιχίί. От а до 971 в 8ΕΩ Ю N0: 6;
    Ιχίϋ. От Ь до 971 в 8ЕО Ю N0: 6;
    Ιχίν. От 1 до 971 в 8ЕО Ю N0: 6;
    Ιχν. От 56 до 975 в 8ΕΩ Ю N0: 8;
    - 36 017403
    Ιχνϊ. От а до 975 в 8Е0 Ю N0: 8;
    Ιχνϋ. От Ь до 975 в 8ЕО Ю N0: 8;
    Ιχνίίί. От 1 до 975 в 8Е0 Ю N0: 8;
    Ιχίχ. От 19 до 417 в 8ЕО Ю N0: 2;
    Ιχχ. От 19 до 472 в 8Е0 Ю N0: 2;
    Ιχχί. От 19 до 551 в 8Е0 Ю ΝΟ: 2;
    Ιχχίί. От 19 до 492 в 8Е0 Ю N0: 6;
    Ιχχϋί. От 19 до 647 в 8Е0 Ю N0:2;
    Ιχχίν. От 19 до 588 в 8Е0 10 N0: 6;
    Ιχχν. От 19 до 592 в 8Е0 Ю N0: 8;
    Ιχχνϊ. От 19 до 664 в 8Е0 Ю N0: 4;
    Ιχχνϊί. От 56 до 472 в 8Е0 Ю N0: 2;
    Ιχχνϊϊί. От 56 до 551 в 8Е0 Ю N0: 2;
    Ιχχίχ. От 56 до 492 в 8Е0 Ю N0: 6;
    Ιχχχ. От 56 до 647 в 8Е0 Ю N0:2;
    Ιχχχί. От 56 до 588 в 8Е0 Ю N0: 6;
    Ιχχχίί. От 56 до 592 в 8Е0 Ю N0: 8;
    Ιχχχίϋ. От 56 до 664 в 8Е0 Ю N0: 4;
    Ιχχχίν. От 1 до 649 в 8Е0 Ю N0: 2;
    Ιχχχν. От 1 до 590 в 8Е0 Ю N0: 6;
    Ιχχχνϊ. От 1 до 594 в 8Е0 Ю N0: 8;
    Ιχχχνϋ. От 1 до 666 в 8Е0 Ю ΝΟ: 4;
    Ιχχχνϊϋ. От 18 до 703 в 8Е0 Ю N0: 2;
    Ιχχχϊχ. От 18 до 644 в 8Е0 Ю N0: 6;
    хс. От 18 до 648 в 8Е0 Ю N0: 8;
    χοί. От 18 до 720 в 8Е0 Ю N0: 4;
    хси. От 1 до 648 в 8ΕΩ Ю N0: 2 хеш. От 1 до 589 в 8Е0 Ю N0: 6;
    χοίν. От 1 до 593 в 8Е0 Ю N0: 8;
    χον. От 1 до 665 в 8Е0 Ю N0: 4 и χονί. комбинации двух или более указанных последовательностей аминокислот, где а представляет собой любое целое число между 24 и 5б, Ь представляет собой любое целое число между 19 и 21, с представляет собой любое целое число между 472 и 512, с' представляет собой любое целое число между 418 и 453, б представляет собой любое целое число между 514 и 5б9, 6' представляет собой любое целое число между 455 и 510, е представляет собой любое целое число между 570 и б50, е' представляет собой любое целое число между 511 и 591, е представляет собой любое целое число между 570 и 595, и е' представляет собой любое целое число между 570 и бб7; £ представляет собой любое целое число между б47 и б71, I1 представляет собой любое целое число между 588 и б12, £ представляет собой любое целое число между 592-б1б и £ представляет собой любое целое число между бб4 и б88.
  15. 15. Способ по п.14, в котором указанная последовательность аминокислот по меньшей мере на 90%
    - 37 017403 идентична указанной эталонной последовательности аминокислот.
  16. 16. Способ по п.14 или 15, в котором указанная последовательность аминокислот идентична указанной эталонной последовательности аминокислот.
  17. 17. Способ по любому из пп.1-16, в котором указанный полипептид 8ета6А является циклическим пептидом.
  18. 18. Способ по п.17, в котором указанный циклический пептид включает молекулу биотина, присоединенную к Ν-концу, и остаток цистеина, присоединенный к С-концу указанного циклического пептида.
  19. 19. Способ по п.17, в котором указанный циклический пептид включает остаток цистеина, присоединенный к Ν- и С-концу указанного циклического пептида, причем указанный Ν-концевой остаток цистеина является ацетилированным.
  20. 20. Способ по любому из пп.18 или 19, в котором к указанному С-концевому цистеину присоединена группа ΝΉ2.
  21. 21. Способ по любому из пп.1-20, в котором указанный полипептид присоединен к части, не являющейся 8ета6А.
  22. 22. Способ по п.21, в котором указанная часть, не являющаяся 8ета6А, представляет собой гетерологичный полипептид, слитый с указанным полипептидом 8ета6А.
  23. 23. Способ по п.22, в котором указанный гетерологичный полипептид выбран из группы, включающей полипептид иммуноглобулина или фрагмент полипептида иммуноглобулина, полипептид сывороточного альбумина или фрагмент полипептида сывороточного альбумина, направляющий полипептид, репортерный полипептид и полипептид, облегчающий очистку, и комбинацию по меньшей мере двух указанных гетерологичных полипептидов.
  24. 24. Способ по п.23, в котором указанный гетерологичный полипептид выбран из группы, включающей с-тус, плацентарную щелочную фосфатазу человека, шарнир иммуноглобулина и Ес-участок и комбинацию двух или более указанных гетерологичных полипептидов.
  25. 25. Способ по п.21, в котором указанная часть, не являющаяся 8ета6А, представляет собой полимер, конъюгированный с полипептидом 8ета6А.
  26. 26. Способ по п.25, в котором полимер выбран из группы, включающей полиалкиленгликоль, полимерный сахар и полипептид.
  27. 27. Способ по п.26, в котором полимер представляет собой полиалкиленгликоль.
  28. 28. Способ по п.27, в котором полиалкиленгликоль представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ).
  29. 29. Способ по п.25, в котором указанный полипептид 8ета6А связан с 1, 2, 3 или 4 полимерами.
  30. 30. Способ по любому из пп.25-29, в котором общий молекулярный вес полимеров составляет от 5000 до 100000 Да.
  31. 31. Способ по любому из пп.3-13, в котором у указанного млекопитающего диагностировано заболевание, расстройство или повреждение, при которых наблюдается дисмиелинизация, демиелинизация или нейродегенерация.
  32. 32. Способ по п.31, в котором указанное заболевание, расстройство или повреждение выбрано из группы, включающей рассеянный склероз, прогрессирующую мультифокальную лейкоэнцефалопатию, энцефаломиелит, миелолиз моста головного мозга, адренолейкодистрофию, болезнь Александера, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, глобоидно-клеточную лейкодистрофию (болезнь Краббе), Уоллеровскую дегенерацию, ретробульбарный неврит, поперечный миелит, боковой амиотрофический склероз, болезнь Хантингтона, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, травмы спинного мозга, травмы головного мозга, лучевое поражение, неврологические осложнения химиотерапии, инсульт, ишемическую нейропатию зрительного нерва, недостаток витамина Е, изолированный синдром недостатка витамина Е, АВ, синдром Бессена-Корнцвейга, синдром Марчиафава-Бигнами, метахроматическую лейкодистрофию, невралгию тройничного нерва и паралич Белла.
  33. 33. Способ по п.31, в котором указанное заболевание, расстройство или повреждение представляет собой рассеянный склероз.
  34. 34. Способ по любому из пп.3-33, в котором введение указанной композиции осуществляют путем болюсной инъекции или хронического вливания.
  35. 35. Способ по п.34, в котором указанную композицию вводят непосредственно в центральную нервную систему.
  36. 36. Способ по п.35, в котором указанную композицию вводят непосредственно в очаг хронического поражения при рассеянном склерозе.
  37. 37. Способ по любому из пп.1 или 2, в котором указанное осуществление контакта включает трансфекцию указанных олигодендроцитов полинуклеотидом, который кодирует указанный полипептид 8ета6А и функционально связан с последовательностью контроля экспрессии, и эффективную экспрессию указанного полипептида 8ета6А.
  38. 38. Способ по любому из пп.8-13, в котором указанный полинуклеотид кодирует указанный полипептид 8ета6А и функционально связан с последовательностью контроля экспрессии.
  39. 39. Способ по п.38, в котором указанный полинуклеотид вводят в виде вектора экспрессии.
  40. 40. Способ по п.39, в котором указанный вектор экспрессии представляет собой вирусный вектор.
    - 38 017403
  41. 41. Способ по любому из пп.8-13, в котором указанное введение включает обеспечение культивируемых клеток-хозяев, включающих указанный полинуклеотид и экспрессирующих указанный полипептид 8ета6А, и введение указанных культивируемых клеток-хозяев в указанное млекопитающее, причем указанный полипептид 8ета6А экспрессируется в указанном млекопитающем.
  42. 42. Способ по п.41, в котором указанные клетки-хозяева вводят указанному животному в участок нервной системы, пораженный заболеванием, расстройством или повреждением, или в зоне такого участка.
  43. 43. Способ по любому из пп.41 или 42, в котором указанные культивируемые клетки-хозяева получают трансформацией или трансфекцией реципиентных клеток-хозяев полинуклеотидом согласно п.37 или 38 или вектором согласно п.39 или 40 и последующим культивированием указанных трансформированных или трансфецированных клеток.
  44. 44. Способ по любому из пп.41-43, в котором указанные культивируемые клетки-хозяева получены из млекопитающего, в отношении которого осуществляют лечение.
  45. 45. Способ по любому из пп.3-44, в котором указанный полипептид 8ета6А экспрессируется в количестве, достаточном для того, чтобы уменьшить ингибирование пролиферации, дифференцировки или выживания олигодендроцитов в участке нервной системы, пораженном заболеванием, расстройством или повреждением, или в зоне такого участка.
  46. 46. Способ по любому из пп.3-45, в котором указанный полипептид 8ета6А экспрессируется в количестве, достаточном для того, чтобы уменьшить ингибирование миелинизации нейронов в участке нервной системы, пораженном заболеванием, расстройством или повреждением, или в зоне такого участка.
  47. 47. Способ по п.40, в котором вирусный вектор выбирают из группы, состоящей из аденовирусного вектора, альфавирусного вектора, энтеровирусного вектора, пестивирусного вектора, лентивирусного вектора, бакуловирусного вектора, герпесвирусного вектора, паповавирусного вектора, поксвирусного вектора.
  48. 48. Способ по п.47, в котором указанный герпесвирусный вектор выбирают из группы, состоящей из вектора на основе вируса простого герпеса и вектора на основе вируса Эпштейна-Барр.
  49. 49. Способ по п.47, в котором указанный поксвирусный вектор представляет собой вектор на основе вируса коровьей оспы.
  50. 50. Способ по любому из пп.39, 40 или 47-49, в котором указанный вектор вводят путем, выбранным из группы, состоящей из местного введения, внутриглазного введения, парентерального введения, интратекального применения, субдурального введения и подкожного введения.
EA200901067A 2007-02-02 2008-02-04 Использование семафорина 6а в качестве промотора миелинизации и дифференцировки олигодендроцитов EA017403B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US89899207P 2007-02-02 2007-02-02
PCT/US2008/001444 WO2008097503A2 (en) 2007-02-02 2008-02-04 Use of semaphorin 6a for promoting myelination and oligodendrocyte differentiation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200901067A1 EA200901067A1 (ru) 2010-02-26
EA017403B1 true EA017403B1 (ru) 2012-12-28

Family

ID=39682299

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200901067A EA017403B1 (ru) 2007-02-02 2008-02-04 Использование семафорина 6а в качестве промотора миелинизации и дифференцировки олигодендроцитов

Country Status (17)

Country Link
US (1) US9107884B2 (ru)
EP (1) EP2114433B1 (ru)
JP (1) JP5492567B2 (ru)
KR (1) KR20090123873A (ru)
CN (1) CN101631559A (ru)
AU (1) AU2008214337B2 (ru)
BR (1) BRPI0806849A2 (ru)
CA (1) CA2677228C (ru)
EA (1) EA017403B1 (ru)
GE (1) GEP20135853B (ru)
IL (1) IL200123A (ru)
MX (1) MX2009008178A (ru)
NZ (1) NZ578816A (ru)
SG (1) SG178744A1 (ru)
UA (1) UA99452C2 (ru)
WO (1) WO2008097503A2 (ru)
ZA (1) ZA200905379B (ru)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8871205B2 (en) * 2009-11-25 2014-10-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for the treatment of immune disorders
DK3590960T3 (da) * 2012-02-29 2023-04-24 Takeda Pharmaceuticals Co Igg-stimuleret remyelinisering af perifere nerver
MX2017005834A (es) 2014-11-05 2017-11-17 Voyager Therapeutics Inc Polinucleotidos aad para el tratamiento de la enfermedad de parkinson.
KR102599909B1 (ko) 2014-11-14 2023-11-09 보이저 테라퓨틱스, 인크. 근위축성 측삭 경화증(als)을 치료하는 조성물 및 방법
RU2749882C2 (ru) 2014-11-14 2021-06-18 Вояджер Терапьютикс, Инк. Модулирующие полинуклеотиды
US10906948B2 (en) * 2015-02-23 2021-02-02 Seagull Therapeutics Sas Non-natural Semaphorins 3 and their medical use
JP6924708B2 (ja) * 2015-06-29 2021-08-25 ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア Ｂ１ｓｐ融合タンパク質の治療薬、方法、および使用
IL302748A (en) 2016-05-18 2023-07-01 Voyager Therapeutics Inc modulatory polynucleotides
JP7109040B2 (ja) * 2016-07-25 2022-07-29 国立大学法人金沢大学 線維化抑制剤
WO2018204786A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
CN109536506B (zh) * 2018-12-10 2022-03-22 潍坊科技学院 一种调控日本沼虾生长发育的类胰岛素受体基因及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003102584A2 (en) * 2002-05-30 2003-12-11 Curagen Corporation Semaphorin-like proteins and methods of using same

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773319A (en) 1971-12-16 1973-11-20 Fabcor Ind Inc Corrugated sheet inverting machine
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
WO1986005807A1 (en) 1985-04-01 1986-10-09 Celltech Limited Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
EP0291194B8 (en) 1987-04-27 2003-10-22 Inverness Medical Switzerland GmbH Immunoassays and devices therefor
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
WO1989012624A2 (en) 1988-06-14 1989-12-28 Cetus Corporation Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
IE63847B1 (en) 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
EP0521985B1 (en) 1990-03-20 1997-09-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region
US5219837A (en) 1990-06-21 1993-06-15 Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of stimulating myelination of cells
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
AU660297B2 (en) 1990-11-09 1995-06-22 Stephen D. Gillies Cytokine immunoconjugates
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
DE69332859T2 (de) 1992-11-13 2003-12-18 Idec Pharmaceuticals Corp., San Diego Konsensus-kozak-sequenzen zur säugetier-exprimierung
US6068829A (en) 1995-09-11 2000-05-30 The Burnham Institute Method of identifying molecules that home to a selected organ in vivo
PT981637E (pt) 1997-03-14 2005-09-30 Biogen Idec Inc Metodo para integrar genes em sitios especificos em celulas de mamifero atraves de recombinacao homologa e vectores para a realizacao do mesmo
EP1365018A1 (en) 2002-05-23 2003-11-26 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) CD100 semaphorin in myelination

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003102584A2 (en) * 2002-05-30 2003-12-11 Curagen Corporation Semaphorin-like proteins and methods of using same

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEDOTAL A.: "Multiple functions for slits and semaphorins in the nervous system," J NEUROCHEM., vol. 98, no. Suppl.1, July 2006 (2006-07), pages 42-42, XP009108248, abstract *
MORRIS DEREK ET AL.: "Animal knockout and human studies identify SEMA6A and PLXNA2 as schizophrenia candidate genes", AMERICAN JOURNAL OF MEDICAL GENETICS PART B., vol. 141B, no. 7, 28 October 2006 (2006-10-28), page 737, XP009108225, ISSN: 1552-4841, abstract *
THEAUDIN M. ET AL.: "Oligodendrocyte guidance molecules in multiple sclerosis lesions," EUROPEAN J. NEUROL, vol. 11, no. Suppl. 2, September 2004 (2004-09), pages 121-122, XP009108247, abstract *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008097503A2 (en) 2008-08-14
CA2677228A1 (en) 2008-08-14
CA2677228C (en) 2015-12-08
AU2008214337A1 (en) 2008-08-14
JP2010518007A (ja) 2010-05-27
CN101631559A (zh) 2010-01-20
JP5492567B2 (ja) 2014-05-14
EP2114433A2 (en) 2009-11-11
BRPI0806849A2 (pt) 2015-06-23
SG178744A1 (en) 2012-03-29
MX2009008178A (es) 2009-10-26
US20100189713A1 (en) 2010-07-29
AU2008214337B2 (en) 2012-07-05
US9107884B2 (en) 2015-08-18
EA200901067A1 (ru) 2010-02-26
IL200123A (en) 2013-05-30
WO2008097503A8 (en) 2009-11-05
GEP20135853B (en) 2013-06-25
KR20090123873A (ko) 2009-12-02
WO2008097503A3 (en) 2008-12-24
UA99452C2 (ru) 2012-08-27
EP2114433B1 (en) 2014-04-09
IL200123A0 (en) 2010-04-15
ZA200905379B (en) 2014-01-29
NZ578816A (en) 2012-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA017403B1 (ru) Использование семафорина 6а в качестве промотора миелинизации и дифференцировки олигодендроцитов
Willnow The low-density lipoprotein receptor gene family: multiple roles in lipid metabolism
Law et al. Decreased anxiety, altered place learning, and increased CA1 basal excitatory synaptic transmission in mice with conditional ablation of the neural cell adhesion molecule L1
ES2341842T3 (es) Bloqueo del crecimiento axonal mediado por el receptor de nogo.
US20090175846A1 (en) Oligodendrocyte-Myelin Glycoprotein Compositions and Methods of Use Thereof
JP4580618B2 (ja) 神経変性疾患におけるタンパク質凝集に関する材料および方法
JP2012072193A (ja) 脱髄に関連する状態の処置
JP2008509152A (ja) 神経機能におけるｔａｊ
JP2002507898A (ja) アポリポ蛋白質ｅトランスジェニック動物および解析方法
JP2019513752A (ja) 神経変性疾患を治療するためのｔｄｐ−４３のミトコンドリア局在化阻害剤
CA2185788A1 (en) Neuron promoter and uses
CA3149107A1 (en) Use of tpk as a target in alzheimer&#39;s disease
US20080199443A1 (en) Bone Morphogenetic Variants, Compositions and Methods of Treatment
JP4399160B2 (ja) ａｐｏＥに関連する疾患を治療する方法
US20090233854A1 (en) Novel application of apelin
KR20050042826A (ko) 쥐피알54 넉-아웃 포유류 및 이를 이용한 스크리닝 방법
JP3787473B2 (ja) セマフォリン受容体
Navone et al. Expression of KIF3C kinesin during neural development and in vitro neuronal differentiation
JP2002543425A (ja) アルツハイマー病の治療のための化合物の同定法
US20110064721A1 (en) Cathepsin-d neuroprotection
WO2003040304A2 (en) Method of proliferation in neurogenic regions
JP2007505617A (ja) 受容体
KR101449100B1 (ko) 신경세포 데브리스 제거용 오스테오폰틴
ES2201547T3 (es) Icam-4 y usos diagnosticos de las mismas.
Wosnitzka Using novel and validated tools to study the distribution and biosynthesis of brain-derived neurotrophic factor in the rodent brain

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): KZ RU