EA016528B1 - Создание химических строительных блоков из растительной биомассы посредством избирательной деполимеризации - Google Patents

Создание химических строительных блоков из растительной биомассы посредством избирательной деполимеризации Download PDF

Info

Publication number
EA016528B1
EA016528B1 EA200970866A EA200970866A EA016528B1 EA 016528 B1 EA016528 B1 EA 016528B1 EA 200970866 A EA200970866 A EA 200970866A EA 200970866 A EA200970866 A EA 200970866A EA 016528 B1 EA016528 B1 EA 016528B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
enzymatic
enzyme
stage
monomeric
polymer
Prior art date
Application number
EA200970866A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200970866A1 (ru
Inventor
Андре Кольтерманн
Ульрих Кеттлинг
Томас БРЮК
Маркус РАРБАХ
Original Assignee
Зюд-Хеми Аг
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE200710013047 external-priority patent/DE102007013047A1/de
Priority claimed from EP07011507A external-priority patent/EP2017349A1/en
Application filed by Зюд-Хеми Аг filed Critical Зюд-Хеми Аг
Publication of EA200970866A1 publication Critical patent/EA200970866A1/ru
Publication of EA016528B1 publication Critical patent/EA016528B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12N9/0061—Laccase (1.10.3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/12—Disaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/16—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an alpha-1, 6-glucosidase, e.g. amylose, debranched amylopectin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/20—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an exo-1,4 alpha-glucosidase, e.g. dextrose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/22—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a beta-amylase, e.g. maltose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C13—SUGAR INDUSTRY
    • C13B—PRODUCTION OF SUCROSE; APPARATUS SPECIALLY ADAPTED THEREFOR
    • C13B35/00—Extraction of sucrose from molasses
    • C13B35/005—Extraction of sucrose from molasses using microorganisms or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C13—SUGAR INDUSTRY
    • C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
    • C13K1/00—Glucose; Glucose-containing syrups
    • C13K1/02—Glucose; Glucose-containing syrups obtained by saccharification of cellulosic materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C13—SUGAR INDUSTRY
    • C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
    • C13K1/00—Glucose; Glucose-containing syrups
    • C13K1/06—Glucose; Glucose-containing syrups obtained by saccharification of starch or raw materials containing starch
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C13—SUGAR INDUSTRY
    • C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
    • C13K13/00—Sugars not otherwise provided for in this class
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C13—SUGAR INDUSTRY
    • C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
    • C13K13/00—Sugars not otherwise provided for in this class
    • C13K13/002—Xylose

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к способу ферментативной обработки необработанного полимерного сырья, включающему следующие стадии: а) предпочтительно отделение растворимых компонентов от необработанного полимерного сырья, b) обработку необработанного полимерного сырья ферментативной системой для высвобождения определенных растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков из нерастворимого необработанного полимерного сырья и с) отделение определенных мономерных или олигомерных строительных блоков, полученных на стадии b), из остатков необработанного полимерного сырья. Предпочтительно ферментативная система, используемая на стадии b), обладает не более чем 50%, предпочтительно не более чем 20%, более предпочтительно не более чем 10%, более предпочтительно не более чем 5%, более предпочтительно не более чем 2%, более предпочтительно не более чем 1% других ферментативных активностей, помимо ферментативной активности, приводящей к высвобождению указанных определенных мономерных или олигомерных строительных блоков из необработанного полимерного сырья согласно стадии b). Дополнительные аспекты изобретения касаются применения "менее чистых" и, таким образом, менее дорогостоящих ферментативных систем на последующих стадиях ферментативной обработки и способов определения оптимальной последовательности стадий ферментативной обработки посредством анализа используемого необработанного полимерного сырья.

Description

Изобретение относится к способу ферментативной обработки необработанного полимерного сырья, включающему следующие стадии: а) предпочтительно отделение растворимых компонентов от необработанного полимерного сырья, Ь) обработку необработанного полимерного сырья ферментативной системой для высвобождения определенных растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков из нерастворимого необработанного полимерного сырья и с) отделение определенных мономерных или олигомерных строительных блоков, полученных на стадии Ь), из остатков необработанного полимерного сырья. Предпочтительно ферментативная система, используемая на стадии Ь), обладает не более чем 50%, предпочтительно не более чем 20%, более предпочтительно не более чем 10%, более предпочтительно не более чем 5%, более предпочтительно не более чем 2%, более предпочтительно не более чем 1% других ферментативных активностей, помимо ферментативной активности, приводящей к высвобождению указанных определенных мономерных или олигомерных строительных блоков из необработанного полимерного сырья согласно стадии Ь). Дополнительные аспекты изобретения касаются применения менее чистых и, таким образом, менее дорогостоящих ферментативных систем на последующих стадиях ферментативной обработки и способов определения оптимальной последовательности стадий ферментативной обработки посредством анализа используемого необработанного полимерного сырья.
Предпосылки данного изобретения
Создание химических строительных блоков на биологической основе из возобновляемых ресурсов в последнее время привлекает повышенное внимание из-за глобального ограничения ископаемых нефтехимических ресурсов. Предпочтительное сырье для создания таких химических продуктов на биологической основе получают из возобновляемой растительной биомассы (Катт с1 а1., 2006).
Современные процессы производства продуктов на биологической основе преимущественно используют субстраты из пищи и с кормового рынка, такие как масла, сахара и крахмалы. Самое первое поколение сырья обладает точно определенным химическим составом и низкой структурной сложностью. Дополнительно, такие субстраты могут быть получены с относительно высокой чистотой только с незначительным количеством сопровождающих загрязнителей. Тогда как их использование является как технологически, так и экономически привлекательным, их длительная широкомасштабная поставка является небезопасной, потому что использование первичного сырья в химических процессах на биологической основе находится в жестокой борьбе с их постоянно увеличивающейся глобальной потребностью в пищевой промышленности.
Альтернативные субстраты указанного выше первичного сырья получают из дешевых субпродуктов лесного хозяйства и сельскохозяйственных отходов, состоящих из растительного материала, который не имеет применения в качестве источника пищи. Примеры такого обозначенного вторичного сырья для производства представляют собой остаточный растительный материал от фермерской деятельности, такой как солома зерновых и пшеничная солома, а также различные отходы, связанные с древесиной. Эта лигноцеллюлозная биомасса (ЪСВ) отличается от первичного биологического сырья своим сложным химическим и структурным составом. Основные компоненты ЬСВ представляют собой высокополимерные материалы, такие как целлюлоза (приблизительно 35-50% мас./мас.), гемицеллюлоза (приблизительно 20-35% мас./мас.) и лигнины (приблизительно 10-25% мас./мас.). Белки, жиры и другие соединения составляют второстепенные фракции в большинстве ЬСВ исходных материалов (Бала, 2005), но могут быть представлены в больших количествах в особых сельскохозяйственных отходах, таких как остатки от производства масла. Так как ЬСВ состоит из многих химически различных компонентов, ее нисходящая обработка является технически сложной, что, в свою очередь, ограничивает экономическую годность данных биопроцессов, основанных на ЬСВ.
Техническая проблема
Для того чтобы создать ценные химические субстанции и строительные блоки с помощью экономически выгодных биопроцессов, основанных на ЬСВ сырье, важным является не только (ί) как восстановить и очистить большую часть ее различных химических составляющих, но и (ίί) как получить их достаточно чистыми. В отличие от различных и высокополимерных объектов, которые составляют ЬСВ, ее преимущественные продукты обработки являются низкомолекулярными. В основном, экономически привлекательные продукты могут быть созданы из всех компонентов ЬСВ: глюкоза, полученная из целлюлозы, является универсальным исходным материалом для создания ценных химических промежуточных продуктов, таких как сорбит. Пентозные сахара, такие как ксилоза и арабиноза, полученные из фракций гемицеллюлозы ЬСВ, являются исходными материалами для ценных низкопитательных и некалорийных заменителей сахара, таких как ксилит и арабинит. Белки из ЬСВ могут быть гидролизованы для получения энантиомерно чистых Ь-аминокислот. Лигнины могут служить в качестве источника фенольных соединений, замещающих ароматические, полученные посредством нефтехимических процессов. Текущее технологическое ограничение для использования обработанного вторичного сырья в основном связано с его сложным химическим составом.
Большинство современных процессов, использующих ЬСВ, сконцентрированы на целлюлозной части субстрата. При использовании других компонентов, обычно их гидролизуют на неизбирательных стадиях процесса, таких как предварительная обработка серной кислотой, гидролизующей все гемицеллюлозы на одной стадии процесса. Продукты таких неизбирательных стадий способа, как правило, обладают низкой и, в некоторых случаях, отрицательной коммерческой ценностью.
Функционирующий в настоящее время 1одеп процесс для ферментативного получения биоэтанола использует обработку парами разбавленной кислоты при 200-250°С для того, чтобы сделать подвижной фракцию гемицеллюлозы из ЬСВ, которая содержит смесь различных гексозных и пентозных сахаров. На отдельной ферментативной стадии нерастворимая фракция целлюлозы гидролизуется на гексозные (глюкозные) сахара. После разжижения фракций гемицеллюлозы и целлюлозы, нерастворимое сухое вещество лигнинов является физически отделенным от пульпы и сжигается для образования энергии для последующей обработки оставшихся фракций ЬСВ. Объединенные фракции целлюлозы и гемицеллюлозы ферментируют вместе на отдельной стадии для образования биоэтанола. Полученный этанол последовательно получают из ферментационного бульона посредством дистилляции. Так как большинство коммерчески доступных организмов (т.е. пекарских дрожжей, Бассйаготусек еегеу181ае), используемых для процесса ферментации, не способны утилизировать пентозные сахара, при этом компоненты ЬСВ, хотя и обладают большой коммерческой ценностью, когда они присутствуют в чистой форме, в процессе отбрасываются вместе с присутствующими остаточными отходами (Ьает&гб апб Воиккеаи, 2003).
В последнее время были приняты попытки для создания пентозной фракции ЬСВ, доступной для
- 1 016528 ферментативного превращения в биоэтанол. В такой исправленной схеме процесса, разжиженная фракция гемицеллюлозы отделяется от остальных компонентов ЬСВ после стадии предварительной обработки. Хотя все остающиеся фракции ЬСВ обрабатывают, как описано ранее, специально сконструированные микроорганизмы {т.е. сконструированные штаммы 2утошопа§ шоЬШк) со способностью использовать пентозные (ЬаМотб апб Воиккеаи, 2003; Ьупб с1 а1., 2005), а также гексозные сахара, используют на стадии раздельной ферментации для эффективного превращения разжиженной и подготовленной гемицеллюлозы в биоэтанол. Полученную ферментационную пульпу подают в последовательный традиционный технологический поток для получения биоэтанола. Хотя производство биоэтанола из сложных пентозных смесей выглядит коммерчески ценным, избирательная переработка гексозы, пентозы, и лигнина в ценные продукты и химические строительные блоки является привлекательным альтернативным путем использования компонентов ЬСВ.
Одна проблема, свойственная для всех используемых в настоящее время способов предварительной обработки, состоит в одновременном и неизбирательном гидролизе и высвобождении различных химических строительных блоков, которые составляют компоненты ЬСВ (8айа, 2005). В настоящее время коммерчески применяемые и экономически доступные способы предварительной обработки используют жесткие химические и физические способы обработки, которые могут включать комбинацию обработки кислотами или основаниями при повышенных температурах (Вашок е1 а1., 2005). Полученные гидролизаты ЬСВ содержат множество нежелательных побочных продуктов, полученных при химической модификации строительных блоков ЬСВ. Присутствие таких загрязнителей обычно препятствует последующей ферментативной или каталитической обработке или цельноклеточной ферментации продуктов (8айа, 2005) и, следовательно, значительно снижает коммерческую ценность потоков продукции, полученной из ЬСВ с помощью таких методов.
Таким образом, техническая проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, состоит в том, чтобы предоставить способ получения химических строительных блоков из возобновляемой растительной биомассы.
В особенности, техническая проблема состоит в том, чтобы предоставить способ получения ценных химических строительных блоков из ЬСВ, который избегает неудобств и недостатков известного уровня техники.
Сущность изобретения
Согласно первому аспекту, настоящее изобретение относится к способу ферментативной обработки необработанного полимерного сырья, включающему следующие стадии: (а) обработку необработанного полимерного сырья ферментативной системой для высвобождения определенных мономерных или олигомерных строительных блоков из необработанного полимерного сырья и (Ь) отделение определенных мономерных или олигомерных строительных блоков, полученных на стадии а) от остатков необработанного полимерного сырья.
Согласно предпочтительному аспекту, стадии а) и Ь) выполняют в растворителе (жидкая среда). Предпочтительно, (необработанное) полимерное сырье обрабатывают в присутствии растворителя, в котором оно нерастворимо, т.е. в котором оно не находится в растворенной форме. Таким образом, (необработанное) полимерное сырье предпочтительно представляет собой нерастворимое необработанное полимерное сырье. Растворитель предпочтительно представляет собой водный растворитель. Далее предпочтительно, ферментативная стадия а) высвобождает растворимые мономерные или олигомерные строительные блоки из необработанного полимерного сырья, т.е. мономерные или олигомерные строительные блоки, которые растворимы в используемом растворителе и, таким образом, могут растворяться в нем. Согласно дополнительному предпочтительному аспекту, отделение растворимых (растворенных) определенных мономерных или олигомерных строительных блоков, полученных на стадии а), от остатков нерастворимого (не растворенного) необработанного или обработанного полимерного сырья (стадия Ь) достигается за счет жидкостного-твердотельного разделения. Можно использовать любой традиционный способ жидкостного-твердотельного разделения, включая методы фильтрации или центрифугирования.
Согласно другому предпочтительному аспекту, изобретение содержит или отдельный объединенный способ, состоящий из стадии а) и стадии Ь) или серии последовательных стадий обработки, где стадию а) и стадию Ь) повторяют по меньшей мере один раз. На каждой стадии обработки растворимые мономерные или олигомерные продукты получены из нерастворимого необработанного или обработанного полимерного сырья посредством последующего добавления специальной ферментативной системы, с последующим отделением растворимых мономерных или олигомерных продуктов от нерастворимых остатков полимерного сырья. Можно использовать любой традиционный способ жидкостноготвердотельного разделения, включая методы фильтрации и центрифугирования.
Согласно предпочтительному аспекту, определенный мономерный или олигомерный строительный блок(и), высвобождаемый из необработанного или обработанного полимерного сырья на каждой стадии обработки а), представляет собой один специфический продукт, выбранный из левой колонки табл. 1, приведенной ниже. Другими словами, только один специфический мономерный или полимерный строительный блок высвобождается из необработанного или обработанного полимерного сырья на каждой
- 2 016528 стадии обработки а) с использованием ферментативной системы или комбинации ферментативных систем, имеющих такой же продукт. Примеры таких комбинаций ферментов перечислены в табл. 1.
Согласно одному предпочтительному аспекту изобретения было обнаружено, что присутствие (значительных) количеств лигнина является полезным в способе настоящего изобретения. Таким образом, избирательность и, следовательно, чистота потоков продукции, полученной на стадии ферментативной обработки, может быть неожиданно увеличена за счет присутствия лигнина в полимерном сырье. Изменение наблюдаемой ферментативной избирательности может быть вызвано измененными поверхностными свойствами в присутствии лигнина, однако изобретение не ограничено только таким предположением теоретического механизма.
Таким образом, согласно предпочтительному варианту осуществления, необработанное полимерное сырье содержит по меньшей мере 1 мас.% лигнина, предпочтительно, по меньшей мере 3 мас.% лигнина, более предпочтительно, по меньшей мере 5 мас.% лигнина. В частности, преимущественные результаты можно получить, если необработанное полимерное сырье содержит по меньшей мере 10 мас.% лигнина, предпочтительно, по меньшей мере 20 мас.% лигнина. Количество лигнина, присутствующего в сырье, может быть определено способами, известными специалистам в данной области. Согласно одному из вариантов осуществления содержание лигнина может быть вычислено в соответствии со способом, описанным А. 81ш1сг с1 а1., в Ос1спшпа1юп о£ 81гие1ига1 СагЬоЬубга1ск и Ыщип ίη Вюшакк, ЬЛР, Тссйшса1 Керой ΝΚΕΤ/ΤΡ-510-42618, 1аииагу 2008. Согласно другому варианту осуществления, содержание лигнина может быть вычислено в соответствии со способом, описанным Нки е1 а1., в 1оигиа1 о£ Ашша1 8с1сисс, 1987. 65: рр. 244-255 для отмытого кислотой лигнина (ЛОЬ).
В соответствии с вышеуказанной неожиданной находкой, согласно дополнительному предпочтительному аспекту изобретения, стадия лигнинолитической ферментативной обработки не выполняется в способе настоящего изобретения. Также, более предпочтительным является то, что содержание лигнина в полимерном сырье, вычисленное в виде мас.% от общего состава полимерного сырья, не снижалось в ходе стадий (а) и (Ь) или их повторения. Содержание лигнина может быть определено, как указано выше.
Согласно особенно преимущественному аспекту изобретения, способ обработки настоящего изобретения содержит по меньшей мере одну стадию обработки (предварительная стадия обработки), предшествующую стадии а), для отделения (удаления) растворимых компонентов от необработанного или обработанного (нерастворимого) полимерного сырья. Таким образом, данную стадию выполняют перед ферментативной обработкой необработанного или обработанного полимерного сырья. Было обнаружено, что эффективность стадии(й) последующей ферментативной обработки может быть неожиданно увеличена посредством такой предварительной стадии(й) обработки для удаления растворимых компонентов из необработанного или обработанного полимерного сырья. Предпочтительные условия такой предварительной стадии(й) обработки дополнительно обсуждаются ниже.
Согласно предпочтительному варианту осуществления, тот же самый или сходный растворитель (жидкая среда), используемый для следующей стадии ферментативной обработки а), используют на предварительной стадии(ях) обработки. Отдельную предварительную стадию(и) обработки для удаления растворимых компонентов предпочтительно выполняют при тех же и более предпочтительно при более высоких температурах, чем последующая стадия ферментативной обработки а), для увеличения эффективности экстрагирования. Даже более предпочтительно, экстрагирование растворением посредством предварительной стадии(й) обработки должно выполняться при более высоких температурах и давлениях (принцип автоклава), но при укороченном времени обработки, по сравнению со следующей стадией ферментативной обработки. Снова, необработанное или обработанное полимерное сырье предпочтительно нерастворимо в используемом растворителе, и компоненты, подлежащие растворению, растворимы в нем. Отделение растворимых компонентов от нерастворимого необработанного или обработанного полимерного сырья предпочтительно выполняют традиционными способами жидкостноготвердотельного разделения.
Согласно другому варианту осуществления изобретения, отдельная предварительная стадия(и) обработки для удаления растворимых компонентов из (необработанного или обработанного) полимерного сырья перед стадией а) может быть повторена во множестве пошаговых циклов по меньшей мере из двух предварительных стадий обработки. В предпочтительном варианте осуществления указанные циклы осуществляют с изменением состава растворителей, температурных и временных профилей для увеличения эффективности экстрагирования растворением.
Предварительная стадия(и) обработки может содержать одну или несколько предварительных стадий физико-химической обработки и/или одну или несколько стадий промывки, как определено в данном описании.
В настоящем изобретении, согласно одному предпочтительному аспекту, было обнаружено, что отделение высвобожденного (растворимого) мономерного или олигомерного строительного блока(ов) от (нерастворимого) необработанного или обработанного полимерного сырья после определенной обработки ферментативной системой обеспечивает значительные преимущества относительно создания химически чистых прибыльных базовых химикатов и химических строительных блоков из сложных природных субстратов, таких как ЬСВ, посредством использования стадий избирательной каталитической обработ
- 3 016528 ки. Такие стадии избирательной каталитической обработки высвобождают определенные химические мономерные или олигомерные компоненты из сложного полимерного сырья с низкими количествами других загрязнителей в продукте, полученном посредством стадии обработки. Предпочтительное техническое решение для обеспечения такой специфичности и избирательности в гидролизе ЬСВ состоит в использовании избирательных ферментативных стадий. Базовые химикаты можно использовать в качестве заменителей исходных материалов в традиционных нефтехимических процессах, а также исходных материалов для новых путей химического и биохимического синтеза, и поэтому обладают высокой коммерческой ценностью.
Дополнительные предпочтительные аспекты и варианты осуществления детально описаны ниже.
Определения
Термин необработанное полимерное сырье означает сложные смеси различных нерастворимых полимерных субстратов, таких как углеводы, полимерные липиды, полипептиды, полинуклеотиды и полимерные фенилпропаноиды в различных массовых соотношениях, которые обычно получают из растительного материала. В дополнение к таким нерастворимым полимерным субстратам необработанное полимерное сырье обычно содержит растворимые мономерные или олигомерные компоненты. Необработанное полимерное сырье включает в качестве неограничивающих примеров отходы лесного хозяйства, сельскохозяйственной и пищевой промышленности, а также городские отходы. Когда основными полимерами являются целлюлоза и лигнин, такое необработанное полимерное сырье называют необработанное лигниноцеллюлозное сырье, или лигноцеллюлозная биомасса, или ЬСВ.
Необработанное лигниноцеллюлозное сырье из сельскохозяйственной деятельности содержит, но, не ограничиваясь ими, пшеничную солому, солому зерновых, навоз жвачных животных, тростниковый Ьатдазз, свекловичную пульпу и травянистый материал, такой как просо прутьевидное, 8епсеа Б-езребеха 8ета1а и траву Ботдйит зибаи. Сырье, поставляемое лесным хозяйством в виде отходов, содержит, но, не ограничиваясь ими, древесную кору, древесную щепку и ненужные лесоматериалы. Лигниноцеллюлозное сырье, полученное из пищевой промышленности, охватывает, но, не ограничиваясь ими, мякоть плодов, остатки целой агавы, остатки кофе и отходы маслобойки, такие как фильтр-прессная лепешка из семян рапса и производственные стоки. Необработанное сырье, полученное из пульпы и бумажной промышленности, включает в качестве неограничивающих примеров бумажную пульпу и стоки бумажной фабрики. Необработанное сырье, полученное из городских отходов, охватывает, но, не ограничиваясь ими, бумажные отходы, остатки овощей и остатки фруктов.
Термин обработанное полимерное сырье, как использовано в данном описании, означает (остатки) необработанное полимерное сырье после по меньшей мере одной стадии ферментативной обработки (стадия а).
Термин стадия промывки означает любую предварительную стадию обработки необработанного или обработанного полимерного сырья с использованием по меньшей мере одного растворителя для того, чтобы экстрагировать растворимые компоненты из нерастворимого полимерного сырья без модификации или изменения структуры самого полимерного сырья.
Термин стадия физико-химической обработки означает любую предварительную стадию обработки необработанного или обработанного полимерного сырья для того, чтобы экстрагировать растворимые компоненты из нерастворимого полимерного сырья, включая модификацию или изменение структуры самого полимерного сырья.
Термин полимерный субстрат означает субстанции, состоящие или из особенного мономерного компонента или из ограниченного разнообразия определенных мономерных компонентов, ковалентно связанных вместе в линейную или частично разветвленную молекулярную структуру. Нерастворимая фракция необработанного лигниноцеллюлозного сырья содержит значительные количества таких полимерных субстратов, например целлюлозы, кеилана, маннана и галактана. Дополнительно, оно также содержит полимерные субстраты, такие как лигнин, арабиноксилан, глюкороноксилан, глюкоманнан и ксилоглюкан.
Термин ферментативные системы означает белково-подобные объекты, которые способны каталитически превращать полимерные или олигомерные субстраты в меньшие олигомерные или мономерные компоненты (строительные блоки). В дополнение к использованию одного фермента для образования мономерных или олигомерных продуктов из полимерного субстрата, термин ферментативная система также включает смеси, содержащие более чем один фермент, который образует определенный мономерный или олигомерный продукт из полимерного сырья посредством синергического или параллельного действия. Таким образом, термины ферментативная система и смеси ферментов используют в данном описании взаимозаменяемо, и оба могут содержать один или несколько ферментов или ферментов активности, соответственно.
Термин мономерные или олигомерные строительные блоки означает мономерные или олигомерные продукты, которые высвобождены из необработанного полимерного сырья с использованием ферментативной системы. Олигомерный будет включать соединения с двумя или более мономерными блоками.
Термин ферментативная активность фермента относится к каталитической активности фермента в
- 4 016528 соответствующих условиях, при которых фермент служит в качестве белкового катализатора, который превращает специфические полимерные или искусственные субстраты в специфические олигомерные или мономерные продукты.
Термин загрязняющая ферментативная активность описывает ферментативные активности используемой ферментативной системы, которые ведут к олигомерным или мономерным продуктам, отличным от желаемого олигомерного или мономерного продукта(ов), которые образуются согласно запланированной (основной или первой) ферментативной активности ферментативной системы.
Термин искусственный субстрат означает субстрат, в большинстве случаев низкой молекулярной массы, который после взаимодействия искусственного субстрата с ферментативной системой дает измеримые изменения в физико-химических свойствах искусственного субстрата, которые коррелируют с активностью выбранной ферментативной системы. Указанные физико-химические свойства и искусственные субстраты, дающие такие изменения в физико-химических свойствах после взаимодействия с ферментативной системой, известны специалистам в данной области и содержат, но без ограничений, изменения в спектрофотометрически измеряемых свойствах поглощения или флуоресцентного излучения, изменения в хроматографической подвижности, подлежащие определению посредством жидкостной или газовой хроматографии, и изменения молекулярной массы, подлежащие определению посредством масс-спектроскопии.
Подходящие искусственные субстраты для ферментов, ферментативных систем и измеримых продуктов реакции перечислены ниже в табл. 2.
Термин высвобождать означает превращение нерастворимого полимерного субстрата в растворимый мономерный или олигомерный продукт посредством физического, химического или каталитического процесса, такого как гидролиз, окислительная или восстановительная деполимеризация.
Подробное описание изобретения
Основное
Согласно первому аспекту, изобретение содержит отдельный объединенный способ или серию последовательных стадий обработки для получения базовых химикатов или химических строительных блоков из необработанного полимерного сырья. На каждой стадии обработки растворимые мономерные или олигомерные продукты (строительные блоки) образуются из нерастворимого необработанного или обработанного полимерного сырья за счет взаимодействия необработанного или обработанного полимерного сырья со специфической ферментативной системой, которая предпочтительно в высокой степени свободна от ферментативных активностей, образующих продукты реакции, отличные от планируемых (мономерный или полимерный строительный блок), с последующим отделением растворимого мономерного или олигомерного строительного блока(ов) от нерастворимого необработанного или обработанного полимерного сырья.
Согласно предпочтительному варианту осуществления, способ включает отделение растворимых компонентов от (нерастворимого) полимерного сырья, такого как ЬСВ, перед или в комбинации с отдельным объединенным способом или перед и в комбинации с одной или несколькими стадиями серии последовательных (ферментативных) стадий обработки, как определено в предыдущем параграфе.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения, первоначальное отделение растворимых компонентов от (нерастворимого) необработанного полимерного сырья перед стадиями ферментативной обработки содержит по меньшей мере одну предварительную стадию физикохимической обработки с последующим жидкостным-твердотельным разделением. Указанная стадия(и) физико-химической обработки может включать в качестве неограничивающих примеров инкубирование необработанного полимерного сырья с растворителем при повышенной температуре и/или увеличенном давлении, и/или взаимодействие необработанного полимерного сырья с химикатами. Такие химикаты включают в качестве неограничивающих примеров разбавленные или концентрированные кислоты или основания. Предпочтительно, физико-химическую предварительную обработку выполняют при рН, равном 1-13 и более, предпочтительно при рН, равном или 2-5, или 8-11. Согласно дополнительному предпочтительному варианту осуществления, физико-химическая предварительная обработка объединена с одной или несколькими стадиями промывки, предпочтительно, для дополнительного снижения растворимых компонентов в необработанном полимерном сырье.
Согласно предпочтительному варианту осуществления, предварительную стадию(и) обработки, как определено в данном описании, выполняют при температуре в диапазоне от 20 до 210°С, предпочтительно 50-175°С. Диапазон давления для каждой отдельной предварительной стадии обработки может варьировать от 1 до 300 бар и предпочтительно будет варьировать от 1 до 100 бар. Предпочтительная длительность предварительной стадии(й) обработки зависит от состава необработанного или обработанного полимерного сырья и может находиться в диапазоне от нескольких секунд до 1 недели. Более предпочтительно, время обработки для каждой отдельной предварительной стадии обработки может не превышать 1 ч.
Указанная стадия(и) промывки перед стадией(ями) ферментативной обработки содержит по меньшей мере одну стадию промывки по меньшей мере одним растворителем, предпочтительно, по меньшей мере одним водным растворителем. Наиболее предпочтительны, но без ограничений, вода и/или водные
- 5 016528 буферы. Предпочтительно, за стадией промывки следует жидкостное-твердотельное разделение. Согласно одному из вариантов осуществления стадия промывки выполняют при отсутствии фермента или катализатора.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, жидкая среда, используемая для отдельной предварительной стадии(й) обработки, в частности, стадии(й) промывки, содержит меняющиеся концентрации неорганических солей и/или других химических компонентов, которые могут оказывать влияние на ионную силу, рН и/или гидрофобность среды, для увеличения экстрагирования растворимого материала, предпочтительно, до и после каждой стадии ферментативной обработки. Предпочтительно, жидкая среда, используемая для отдельной предварительной стадии обработки характеризуется рН, равным 1-13. Предпочтительно жидкая среда, используемая для отдельной предварительной стадии обработки, содержит неорганическую кислоту, основания и соли, такие как хлористый водород, серная кислота, аммиак, хлорид натрия, гидроксид натрия, сульфат аммония, фосфат натрия, ацетат натрия, цитрат натрия, тартрат натрия, сульфат натрия, и/или органические компоненты буфера, например, глицин, глицерин и/или Ττίΐοη-Χ 100, для изменения гидрофобности. Предпочтительно, ионная сила жидкой среды, используемой для отдельной предварительной стадии обработки, находится в диапазоне от 0,1-10М эквивалентов сульфата натрия (ионная сила 1~1,7-170). В другом предпочтительном варианте осуществления жидкая среда свободна от любых органических растворителей и/или соединений, которые не смешиваются с водой.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения, отдельная стадия(и) промывки применяется повторно к необработанному или обработанному полимерному сырью с меняющимися составами растворителя с использованием меняющихся профилей времени, температуры и давления для максимального увеличения экстрагирования особого растворимого компонента.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна предварительная стадия физико-химической обработки перед ферментативной обработкой необработанного полимерного сырья разработана для (первичного) удаления лигнина, смолы и/или белково-подобных компонентов из необработанного полимерного сырья. Предпочтительно, используют жидкую среду с ионной силой (I), превышающей 1, и в другом предпочтительном варианте осуществления все последующие предварительные стадии(я) обработки, в частности стадии(я) промывки, выполняют с использованием жидкой среды с более низкой ионной силой, чем в начальной предварительной стадии физико-химической обработки.
Способы отделения растворимых и нерастворимых компонентов известны специалистам в данной области и содержат такие стадии обработки, как осаждение, декантация, фильтрация, микрофильтрация, ультрафильтрация, центрифугирование, выпаривание летучих продуктов и экстрагирование органическими или неорганическими растворителями. Согласно предпочтительному варианту осуществления, предварительная стадия(и) обработки содержит обработку водными растворителями, органическими растворителями или любыми их комбинациями или смесями предпочтительно с этанолом или глицерином.
Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения, ферментативную обработку выполняют в водной среде, определенные мономерные или олигомерные строительные блоки, высвобожденные из необработанного или обработанного полимерного сырья, растворимы в водной среде, и отделение согласно указанной выше стадии Ь) выполняют жидкостным-твердотельным разделением растворимых строительных блоков в водной среде от нерастворимого необработанного или обработанного полимерного сырья.
Важные примеры полимерных субстратов, которые составляют большую часть компонентов полимерного сырья, их мономерные или олигомерные продукты деградации (строительные блоки) и ферментативные системы, полезные для создания чрезвычайно чистых продуктов из каждого из полимерных субстратов, содержащихся в необработанном или обработанном полимерном сырье, перечислены ниже в таблице 1.
На стадиях обработки настоящего изобретения, химические строительные блоки полимерных субстратов, таких как гемицеллюлоза, целлюлоза, лигнины, глюканы, белки и липиды, высвобождаются посредством взаимодействия полимерного сырья со специфическими ферментативными системами. Ферментативное расщепление отдельных компонентов сырья в чрезвычайно чистые растворимые продукты основано на применении субстратспецифичных препаратов ферментов, которые, согласно предпочтительному варианту осуществления, в высокой степени свободны от активностей, которые высвобождают другие компоненты, отличные от планируемых продуктов на соответствующей стадии обработки.
Определение состава необработанного полимерного сырья
Молекулярный состав необработанного сырья, подлежащего использованию в описанных в данном описании способах, может быть определен методами, известными специалистам в данной области. Например, состав лигниноцеллюлозного материала может быть определен с использованием комбинации пиролиза, газовой хроматографии и масс-спектрометрии. Библиотека методов, описывающих вероятные аналитические методики определения компонентов ЬСВ, перечислены на:
Ьйр://тетете1.ееге.епегду.доу/Ь1ота88/апа1у11са1 ргоссбигс5.1Ит1# 8атр1ез.
- 6 016528
Согласно одному из вариантов осуществления, стандартные методики, включающие некоторые физические и ферментативные реакционные стадии, могут быть использованы для эмпирического количественного определения компонентов полимерного сырья на основе полученных продуктов реакции.
Реестр базы данных для обыкновенного сырья, содержащей соотношения масс для большей части классов обыкновенного сырья, может быть найден по ссылке на:
1Шр:/\\\\\\1.ееге.епегц\'.с|о\.Ь1О1па8тГеес181оск ба1аЬа8ез.Ь!т1.
При иллюстрации анализа компонентов сырья, необработанное полимерное сырье сначала должно быть частично гидролизовано перед тем, как оно может быть подвергнуто дальнейшему анализу.
Перед гидролизом сырья, образец необработанного сырья (1 г) должен быть помещен в тигель и сушиться при 50°С до тех пор, пока не будет достигнута постоянная масса. Сухую массу записывают до третьего десятичного знака для получения в печи сухой массы (ОЭА) образца.
Для методики гидролиза, 1 г хорошо размолотого сырья (2 мкм) помещают в напорную трубу и добавляют 3 мл 72% об./об. серной кислоты. Напорную трубу устанавливают на водяную баню при 30°С и инкубируют в течение 1 ч. Используя мешалку, образец перемешивают каждые 5-10 мин без удаления образца с бани. Перемешивание является важным для того, чтобы гарантировать равномерное распределение кислоты в частицах. Кислоту разбавляют до 4% добавлением 84 мл дважды дистиллированной воды (д.д.) с использованием бюретки и образец смешивают переворачиванием трубы несколько раз, чтобы исключить фазовое разделение.
Для того чтобы определить нерастворимую в кислоте лигниновую фракцию сырья, автоклавированный гидролизный раствор фильтруют в вакууме через предварительно взвешенный фильтровальный тигель.
Фильтрат задерживается в фильтровальной колбе, и аликвоту 50 мл переносят в бутылку для хранения образца. Полученный образец будет использован в последующей методике для определения содержания лигнина и углеводов. Определение лигнина, растворимого в кислоте, должно выполняться в пределах шести часов гидролиза.
Для определения лигнина, не растворимого в кислоте, д.д. воду добавляют для количественного переноса всех оставшихся нерастворимых частиц из напорной трубы в фильтровальный тигель. Нерастворимые частицы следует промыть минимум 50 мл д.д. воды и последовательно тигель и нерастворимые в кислоте остатки должны быть высушены при 105°С в течение 4 ч или до тех пор, пока не будет достигнута постоянная масс. После инкубирования образцы удаляют из печи и охлаждают в эксикаторе. Массу \\'2 тигля и сухого остатка записывают до ближайшего 0,1 мг, прежде чем тигель и остаток помещают в муфельную печь при 575°С на 24 ч.
Тигель осторожно удаляют из печи, переносят прямо в эксикатор и охлаждают в течение определенного количества времени, которое равно начальному времени охлаждения тигля. Тигель и золу взвешивают (масса Ά3) и помещают обратно в печь до тех пор, пока не будет достигнута постоянная масса. Масса Ά2, скорректированная на оставшуюся золу (Ά3), равна массе нерастворимого в кислоте лигнина, содержащегося в необработанном сырье.
В отличие от сложных измерений, требующихся для получения количества нерастворимого в кислоте лигнина, количество растворимого в кислоте лигнина может быть легко определено спектрофотометрически. Сначала фоновые измерения проводят для водной 4% об./об. серной кислоты на соответствующем спектрофотометре. Используя начальную гидролизную жидкость, измеряют поглощение при 320 нм и при максимальном поглощении фильтрата гидролизата, которое обычно составляет около 198 нм. По мере необходимости образец растворяют, чтобы привести к диапазону поглощения 0,7-1,0 А единиц. Поглощение образца до третьего десятичного знака используют для вычисления количества растворимого в кислоте лигнина (Л8Ь), присутствующего в образце согласно нижеприведенному расчету:
% А51>= (иУаЬв*ОбъеМфИЛЬтра,г*фактор разбавления) / (е*0Шобраввц) *100
ОЭА = сухая масса высушенного в печи образца необработанного сырья;
иУаЬ8 = среднее ϋν-νίδ поглощение для образца при 320 нм;
Объемфильтрат = объем фильтрата гидролизата;
Е = коэффициент экстинкции раствора гидролизата биомассы при максимальном поглощении образца (численные значения коэффициентов экстинкции для большого количества необработанного полимерного сырья можно найти по адресу;
1И1р: / \\\\\\1^ΐΌ.ί2ΐκ'ΐ·2ν.2()νΙιΐ()ΐικΐ8τηικι1ν1^η1 ргосебигез .Ыт1# затр1ез).
Раствор гидролизата образца также можно использовать для определения структурных углеводов, содержащихся в гемицеллюлозной фракции сырья с использованием методики, основанной на ВЭЖХ.
Такое определение сначала требует отдельной калибровочной смеси для ϋ-целлобиозы, глюкозы, ксилозы, галактозы, арабинозы и маннозы. Концентрации, приготовленные для стандарта каждого сахара, должны находиться в диапазоне между 0,1-4 мг/мл. Для каждого набора калибровочных стандартов должен быть приготовлен независимый подтверждающий калибровочный стандарт (С.А8), попадающий в середину подтвержденного диапазона калибровочной кривой (т.е. 2,5 мг/мл). €V8 должен быть проанализирован ВЭЖХ после каждой серии калибровок и через постоянные интервалы на всем протяжении
- 7 016528 последовательности анализа, охватывая группы образцов. СУ8 используют для подтверждения качества и стабильности калибровочных кривых каждой серии.
мл гидролизного раствора, полученного на начальной стадии после гидролиза образца, переносят в 50 мл коническую колбу Эрленмейера. Для нейтрализации образца добавляют карбонат кальция до рН 5-6 и после отстаивания раствора супернатант может быть декантирован. После отстаивания раствор будет обладать приблизительно нейтральным рН.
Сахарные калибровочные СУ8 стандарты и образцы теперь готовы для ВЭЖХ анализа с использованием сахарной колонки 81юбех® 8Р0810 (РЬепотепех) или Аттех® НРХ-87Р (ВюВаб), оборудованной соответствующей защитной колонкой.
Вливаемый объем образца должен быть от 10 до 50 мкл в зависимости от концентрации и ограничений обнаружителя. Образцы элюируют д.д. водой при скорости потока 0,6 мл/мин и температуре колонки 80°С. Лучше всего элюирование образца может наблюдаться при использовании определения показателя преломления.
Перед анализом хроматограммы должны быть объединены и содержание отдельных сахаров должно быть определено по отношению к соответствующим кривым стандартов для каждого сахаридного компонента.
Ферментативные системы
В вариантах осуществления, описываемых в данном описании, специфичности используемых смесей ферментов являются индивидуальными для получения чистых мономерных потоков продукции (определенный мономерный или полимерный строительный блок(и)), полученных из различных классов полимерных субстратов.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ферментативные системы, применяемые к определенному необработанному или обработанному полимерному сырью, могут содержать не более 50% других ферментативных активностей, которые могут приводить к продуктам, отличным от предпочтительного продукта, из обозначенного полимерного сырья.
В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения смеси ферментативных систем, применяемых к необработанному или обработанному полимерному сырью, могут содержать не более чем (или менее чем) 20%, предпочтительно не более чем (или менее чем) 10%, более предпочтительно не более чем (или менее чем) 5%, более предпочтительно не более чем (или менее чем) 2%, наиболее предпочтительно не более чем (или менее чем) 1% других ферментативных активностей, которые могут приводить к продуктам, отличным от предпочтительного продукта из обозначенного полимерного сырья.
Процентное содержание других ферментативных активностей может быть в плановом порядке определено с использованием стандартных способов определения соответствующей ферментативной активности. Таким образом, главная ферментативная активность, присутствующая в ферментативной системе, приводит к высвобождению желаемого определенного мономерного или полимерного строительного блока из необработанного или обработанного полимерного сырья, количество которого должно составлять по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99% всех ферментативных активностей, присутствующих в ферментативной системе.
Ферментативные активности могут быть определены согласно стандартным способам, известным специалисту в данной области и как описано в данном описании.
Согласно одному предпочтительному варианту осуществления вышеуказанные процентные содержания могут быть легко определены посредством обработки необработанного полимерного сырья ферментативной системой согласно вышеуказанной стадии а) и анализа высвобожденных растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков после жидкостного-твердотельного отделения от нерастворимого необработанного полимерного сырья согласно стадии Ь). Таким образом, если высвобожденные мономерные или олигомерные строительные блоки содержат более чем 50 мол.% желаемого специфического строительного блока (основываясь на общем содержании твердого вещества), считают, что другие ферментативные активности, присутствующие в ферментативной системе, составляют менее чем 50%. Аналогично, если высвобожденные мономерные или олигомерные строительные блоки содержат более чем 80, 90, 95, 98 или 99 мол.% желаемого специфического строительного блока, считается, что другие ферментативные активности, присутствующие в ферментативной системе, составляют менее чем 20, 10, 5, 2 или 1 мол.%, соответственно. Соответственно, в данном случае полагают, что главная ферментативная активность, присутствующая в ферментативной системе и ведущая к высвобождению желаемого определенного мономерного или олигомерного строительного блока из необработанного полимерного сырья, составляет по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, более предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99% от всех ферментативных активностей, присутствующих в ферментативной системе. Согласно дополнительному варианту осуществления мол.% заменен на мас.% в указанном выше определении процентного содержания ферментатив
- 8 016528 ной активности (активностей).
Согласно одному из вариантов осуществления, ферментативные активности могут быть определены путем измерения скорости превращения выбранного полимерного субстрата, как определено выше. В альтернативном варианте осуществления ферментативные активности, присутствующие в ферментативной системе, могут быть определены посредством использования искусственных субстратов. В зависимости от простоты и надежности используемых способов определения, можно измерить или превращение самого субстрата, или альтернативно, образование специфического продукта в результате ферментативно катализируемой реакции. В особых случаях каталитические промежуточные продукты самого фермента (т. е. оксидоредуктазы) могут быть определены спектрофотометрически.
Тестирование составленных смесей ферментов на ферментативные активности известно специалистам в данной области. Библиотека подходящих тестов для специфических ферментативных активностей приведена по ссылке на:
1Шр://\у\у\у.81дтаа10пс11.сот/Лгса оГ 1п1сгс81/В|оскст1са18/Епхут с Ехр1огсг/Ксу Кскоигсск/Аккау ЫЬгагу/Аккаук Ьу Епхутс Штс.ЫтГ
Примеры специфических тестов на определение ферментативных активностей конкретных классов ферментов перечислены ниже.
В особом случае, как эндо-, так и экзоцеллюлазная активность может быть измерена в 0,5 мл 50 мМ реакционного буфера МЕ8 (рН 6), содержащего 10 мМ СаС12, 4 мМ п-нитрофенил-бета-Э-целлобиозида и 200 мкл раствора для разбавления фермента. Реакцию следует инкубировать при 50°С в течение 30 мин. Глициновый буфер (100 мМ, рН 4) добавляют для остановки реакции. Затем ферментативная активность может быть определена посредством измерения количества высвобождаемого п-нитрофенола спектрофотометрически при 430 нм. Значения поглощения п-нитрофенола переводят в микромоли нитрофенола с использованием стандартной кривой, связывающей микромоли нитрофенола с поглощением. Одна единица целлюлазной активности представляет собой количество фермента, требующееся для высвобождения 1 мкмоль п-нитрофенола/мин в условиях анализа (ОТооб, Т.М. и В1а!, К., 1988).
В другом особом случае, арабинофуранозидазная активность может быть определена в 1 мл 50 мМ фосфата натрия (рН 7), содержащем 4-100 мкМ 4-нитрофенил-альфа-Ь-арабинофуранозида (ρΝΡ-АгаГ) и раствор для разбавления фермента (4 нМ-8 мкМ). Реакцию можно инкубировать при 37°С и количество высвобожденного 4-нитрофенола измеряют при 400 нм.
Ферментативная активность может быть вычислена с использованием коэффициента экстинкции 10500 М-1см-1 4-нитрофенола при 400 нм (Тау1ог с! а1., 2006).
В другом особом случае ксилозидазная активность может быть определена с использованием онитрофенол-замещенного бета-Э-ксилопиранозида (ΘΝΡ-бета-Э-ксилопиранозид) в качестве субстрата (СГси с! а1., 1986). Основной раствор субстрата (10 мМ) приготавливают в 100 мМ цитратном буфере (рН 5). Раствор для разбавления фермента, подлежащего тестированию, приготавливают в д.д. воде. Реакция содержит равные молярные количества субстрата и раствора фермента в 200 мМ боратном буфере при 25°С и рН 9,8. Для определения ферментативной активности высвобождение о-нитрофенола регистрируют спектрофотометрически при длине волны 410 нм. Ферментативная активность в единицах/мг фермента пропорциональна высвобожденному количеству о-нитрофенола и может быть вычислена, как описано для активности целлюлазы.
В другом особом случае, лакказную активность определяют с использованием окислительного теста с гваяколом. Готовят свежий основной раствор 10 мМ в 50 мМ цитратном буфере(рН 4,3, 40°С). Реакцию проводят в 2 мл 50 мМ цитратного буфера с использованием 10 мкл основного раствора для разбавления фермента (1-3 нМ) и различных количеств субстрата (5-20 мкл). Затем скорость окисления гваякола измеряют спектрофотометрически при 465 нм. Скорость окисления гваякола может быть определена с использованием коэффициента экстинкции 5200 М-1см-1 для продуктов окисления гваякола (8тпиоу с! а1. 2001).
В другом особом случае, активность марганцевой пероксидазы (МиР) может быть измерена в 50 мМ тартратном буфере (рН 3, 25°С) посредством добавления 100 мкМ Н2О2 к реакционной смеси, содержащей 0,5 мкМ/мл МиР и 5-200 мкМ Ми2+. За образованием Ми3+ наблюдают спектрофотометрически при 238 на (КтаФкир с! а1., 2005).
Для определения того, содержит ли пригодная конкретная ферментативная система (перечисленная в табл. 1) для производства желаемого продукта, нежелательные активности из любой другой ферментативной системы (перечисленной в табл. 1), образующей другой нежелательный продукт из того же или другого полимерного субстрата, можно провести тестирование на данную активность с использованием специфического полимерного субстрата или искусственного субстрата, как описано выше, посредством использования любых способов, как описано выше.
Например, если предполагают, что конкретная ферментативная система, содержащая целлюлазы, как указано в табл. 1, содержит нежелательную ксилозидазную активность (как указано в табл. 1), основная целлюлазная активность может быть протестирована сначала с использованием искусственного целлюлозного субстрата и определением количества глюкозы, высвобожденной после добавления определенного количества ферментативной системы за единицу времени. Когда целлюлазная активность пре
- 9 016528 парата будет определена, тот же самый препарат фермента можно протестировать на ксилозидазную активность посредством приведения ферментативной системы в контакт с искусственным ксилановым субстратом, с последующим измерением количества ксилозы, высвобожденной определенным количеством фермента в единицу времени. Посредством измерения относительных скоростей превращения для определенного периода времени как с целлюлазным, так и с ксилозидазным субстратами с использованием определенного количества фермента, могут быть вычислены специфические активности для каждого класса субстратов.
Пригодные субстраты для определения любой ферментативной активности, как указано в таблице 1, приведены в табл. 2.
В альтернативном варианте осуществления подход для определения того, содержит ли ферментативная система любые независимые загрязняющие ферментативные активности, состоит в разделении компонентов указанного препарата способами, такими как электрофорез или хроматография. Отдельные компоненты препарата могут быть обнаружены с использованием специальных способов, таких как колориметрическое окрашивание или обнаружение компонентов по оптической плотности или других способов, известных специалистам в данной области.
Относительный % распределения белково-подобных компонентов может быть определен с использованием количественных способов, таких как денситометрия, или любых других эквивалентных способов, известных специалистам в данной области, в комбинации с соответствующими математическими вычислениями.
Определение последовательности
Перед отдельными или серийными стадиями ферментативной обработки требуется высвободить определенные мономерные или олигомерные продукты (строительные блоки) из необработанного или обработанного полимерного сырья, растворимые компоненты необработанного полимерного сырья, предпочтительно, отделяют посредством одной или многих предварительных стадий(и) обработки.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения предварительная стадия(и) обработки для отделения растворимых компонентов необработанного или обработанного полимерного сырья перед ферментативной обработкой представляет собой комбинацию по меньшей мере одной предварительной стадии физико-химической обработки и одной или нескольких стадий промывки. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения, стадию(и) промывки для отделения растворимых компонентов от необработанного или обработанного полимерного сырья перед ферментативной обработкой предпочтительно выполняют с гидрофильным растворителем(лями), предпочтительно водным растворителем(лями), таким как вода. Как указано выше, было обнаружено, что стадия(и) промывки и предварительная стадия(и) физико-химической обработки увеличивают эффективность последующей стадии(й) ферментативной обработки.
Согласно дополнительному предпочтительному варианту осуществления, предварительную стадию физико-химической обработки применяют только перед первой стадией ферментативной обработки (стадия а) необработанного полимерного сырья. Такая предварительная стадия физико-химической обработки может быть объединена по меньшей мере с одной стадией промывки перед первой стадией ферментативной обработки (стадия а) необработанного полимерного сырья. Более того, предпочтительно, стадии предварительной обработки обработанного полимерного сырья содержат по меньшей мере только одну стадию промывки без дополнительных предварительных стадий физико-химической обработки.
Стадии физико-химической предварительной обработки для полимерного сырья могут включать, но без ограничения, экстрагирование горячей водой, низкотемпературный паровой взрыв, кислотный паровой взрыв, аммиачный паровой взрыв и обработку ультразвуком. Их можно использовать для физического изменения необработанных полимерных субстратов для того, чтобы увеличить поверхностную доступность растительных волокон и снизить кристалличность целлюлозной фракции (Рик е1 а1., 1985; Каток е1 а1., 2005; К1п1еу е1 а1., 2005). Предпочтительно указанные выше стадии предварительной обработки изменяют физические свойства структуры необработанного полимерного субстрата таким образом, что субстрат становится более доступным для последующих ферментативных стадий, но или высвобождает ограниченные количества своих химических строительных блоков, или не высвобождает их вообще. Кроме того, их можно использовать для дополнительного удаления растворимых субстанций, содержащихся в необработанном полимерном сырье, перед приведением необработанного полимерного сырья во взаимодействие с ферментативной системой для предотвращения загрязнения продуктов данной стадии ферментативной обработки растворимыми субстанциями, содержащимися в сырье.
Когда две или более стадии способа используются последовательно, последовательность таких стадий способа и, таким образом, последовательность добавления смеси ферментов, как описано в таблице 1, зависит от специфического состава используемого необработанного полимерного сырья. Последовательность стадий способа и ферментативных систем выбирают таким образом, чтобы минимизировать дозировки и стоимость ферментативных катализаторов, а также время контактирования сырья, ведущее к высвобождению желаемых продуктов. Дополнительно, выбранная последовательность стадий должна оптимизировать чистоту, а также рентабельность мономерных или олигомерных продуктов реакции, высвобождаемых из полимерного субстрата. Следовательно, последовательность стадий способа зависит от
- 10 016528 сырья и продуктов.
Согласно одному предпочтительному варианту осуществления изобретения, фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих глюкозу, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой глюкозу, и фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов и ферментативных систем, высвобождающих ксилозу, согласно табл. 1, и соответствующие определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой ксилозу.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения, фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов и ферментативных систем, высвобождающих ксилозу, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой ксилозу, и фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих глюкозу, согласно табл. 1, и соответствующий определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой глюкозу.
Согласно одному предпочтительному варианту осуществления специфическая последовательность ферментативных обработок, необходимых для расщепления конкретного сырья на составляющие блоки, может быть определена эмпирически, даже если состав сырья неизвестен. Следовательно, возможно расщеплять необработанное полимерное сырье на раздельных стадиях обработки с множеством смесей ферментов различных продуктов, как указано в табл. 1. Для каждой из стадий обработки чистоту и состав полученного потока продукции измеряют с использованием аналитических методов, известных специалисту в данной области, содержащих, но без ограничения, спектроскопические и хроматографические методы, как описано выше для анализа состава сырья и для определения ферментативной активности.
Используя результаты данных измерений, можно выбрать кинетически благоприятную смесь ферментов, приводящую к самым чистым потокам продукции в качестве основой стадии обработки сырья. После повторения промывки нерастворимых остатков, полученных в результате указанной отдельной ферментативной обработки, остатки снова обрабатывают другим множеством смесей ферментов, за исключением смеси ферментов, выбранных для основной обработки. Для всех таких ферментативных обработок состав полученного продукта определяют способами, как описано выше. Смесь ферментов, приводящих к самому чистому потоку продукции, выбирают в качестве вторичной стадии обработки конкретного сырья. Остающийся нерастворимый материал, полученный при второй обработке, снова тщательно промывают и снова тестируют с оставшимися ферментативными системами, как описано выше. Этот процесс аналитического определения и выбора самых чистых потоков продукции, полученных из каждой из оставшихся смесей ферментов таблицы 1, предпочтительно повторяют до тех пор, пока сырье или не будет расщеплено полностью, или нерастворимые остатки сырья, остающиеся после повторения ферментативных обработок, не будут представлять значительной экономической выгоды для оператора, по сравнению со стоимостью возможной дополнительной обработки.
Согласно одному предпочтительному аспекту изобретения, ферментативную систему, дающую самую высокую чистоту определенных растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков после обработки необработанного полимерного сырья ферментативной системой, и отделение определенных растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков от остатков необработанного полимерного сырья (обработанного полимерного сырья) выбирают для первой стадии ферментативной обработки согласно стадии а).
Согласно дополнительному предпочтительному аспекту изобретения, вторая ферментативная система, выбранная для второй стадии ферментативной обработки согласно стадии а), представляет собой ферментативную систему, которая дает самую высокую чистоту определенных растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков после обработки обработанного полимерного сырья (полученного в виде остатков от предыдущей стадии ферментативной обработки) ферментативной системой и отделения определенных растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков от необработанного полимерного сырья.
Согласно еще одному дополнительному предпочтительному аспекту изобретения, любые последующие стадии ферментативной обработки выполняют в порядке снижения чистоты определенных растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков, полученных после обработки обработанного полимерного сырья (полученного на предыдущей стадии ферментативной обработки) соответствующей ферментативной системой и отделения определенных растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков от обработанного полимерного сырья.
В другом варианте состав сырья определяют посредством указанных выше аналитических методик перед выбором последовательности вариантов ферментативной обработки. Таким образом, согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения, используемые ферментативные системы и последовательность их использования определяют посредством первичного анализа необработанного
- 11 016528 полимерного сырья.
Один такой предпочтительный вариант осуществления изобретения направлен на способ, в частности, определения ферментативных систем, подлежащих использованию, и их последовательности, где, предпочтительно, после отделение растворимых компонентов от необработанного полимерного субстрата, как описано выше, нерастворимое необработанное полимерное сырье (a) сначала обрабатывают в раздельных ферментативных обработках каждой из множества ферментативных систем (смесей), таких, как перечислено в табл. 1 (предпочтительно выбранной из тех, что высвобождают растворимые мономерные или олигомерные сахаридные строительные блоки из полимерного сырья);
(b) для каждой ферментативной обработки, определенные мономерные или олигомерные строительные блоки, высвобожденные из необработанного полимерного сырья, анализируют на чистоту определенных мономерных или олигомерных строительных блоков, предпочтительно, после жидкостноготвердотельного отделения (растворимых) определенных мономерных или олигомерных строительных блоков от (нерастворимого) необработанного полимерного сырья;
(c) ферментативную систему, дающую самую высокую чистоту, выбирают для первой стадии ферментативной обработки согласно стадии а) по п.1;
(б) необязательно, последовательность стадий а)-с) повторяют с остатками необработанного или обработанного полимерного сырья для определения ферментативной системы, которую нужно использовать на последующей стадии ферментативной обработки.
В альтернативном варианте осуществления после отделения растворимых компонентов от необработанного или обработанного полимерного сырья, как описано выше, избирательные смеси ферментов, как указано в табл. 1, применяют к целевым компонентам сырья, имеющим самое большое массовое отношение в составе сырья. После ферментативной обработки, чистоту полученного потока продукции определяют, как описано выше, для аналитического определения компонентов сырья. Согласно предпочтительному варианту осуществления желательно, чтобы чистота составляла более чем 75 мас.%, предпочтительно более чем 90 мас.%, более предпочтительно более чем 95 мас.%, более предпочтительно более чем 99 мас.% от общего содержания твердого вещества (предпочтительно растворимой фракции), состоящего из определенных мономерных или олигомерных строительных блоков.
Если ферментативное расщепление компонента сырья с наибольшей массой приводит к чистому потоку продукции (как определено выше), такую обработку можно применять в качестве основной стадии для обработки сырья. Промывка полученной нерастворимой пульпы и последующее жидкостноетвердотельное отделение макрочастиц от супернатанта будет подготовкой для следующих стадий обработки. Оставшиеся нерастворимые частицы, полученные при основной обработке сырья, будут обработаны специфическими ферментативными системами, такими как ферментативные системы, перечисленные в таблице 1, которые нацелены на компоненты сырья, имеющие второе наибольшее массовое отношение в составе сырья. Полученный поток продукции снова должен быть анализирован посредством указанных аналитических способов для установления чистоты продукта перед тем, как выбранную ферментативную обработку можно будет считать вторым вариантом обработки сырья. Затем нерастворимые остатки, полученные при второй ферментативной обработке, могут быть промыты и обработаны, как описано выше. Через повторяющиеся обработки специфическими ферментативными системами, перечисленными в табл. 1, которые всегда нацелены на полимерный субстрат, состоящий из компонента с самым большим массовым отношением в оставшемся нерастворимом остатке сырья, полученного на предыдущих циклах ферментативной обработки, сырье может быть последовательно расщеплено на составляющие его блок.
Дополнительный предпочтительный аспект изобретения направлен на способ, в частности, определения ферментативных систем, которые нужно использовать, и их последовательности, где, предпочтительно, после отделения растворимых компонентов от необработанного полимерного сырья, как описано выше, нерастворимое необработанное полимерное сырье (a) сначала обрабатывают в раздельных ферментативных обработках каждой из множества ферментативных систем (смесей), таких как указано в табл. 1 (предпочтительно выбранных из ферментативных систем, высвобождающих растворимые мономерные или олигомерные сахаридные строительные блоки из полимерного сырья) для определения мономерных или олигомерных строительных блоков, имеющих наибольшее массовое отношение в необработанном полимерном сырье;
(b) определенные мономерные или олигомерные строительные блоки, имеющие наибольшее массовое отношение в необработанном полимерном сырье, анализируют на чистоту, предпочтительно, после отделения от необработанного полимерного сырья;
(c) если определенная чистота составляет более чем 75 мас.%, предпочтительно более чем 90 мас.%, более предпочтительно более чем 95 мас.%, более предпочтительно более чем 99 мас.% от общего содержания твердого вещества, состоящего из определенных мономерных или олигомерных строительных блоков, соответствующую ферментативную систему выбирают для первой стадии ферментативной обработки согласно стадии а) по п.1;
(б) если чистота, определенная согласно стадии Ь), ниже требуемой согласно стадии с), определен- 12 016528 ные мономерные или олигомерные строительные блоки, имеющие следующее наибольшее массовое отношение в необработанном полимерном сырье, анализируют на чистоту, предпочтительно после жидкостного-твердотельного отделения от (нерастворимого) необработанного полимерного сырья, соответственно, до тех пор, пока чистота не будет удовлетворять требованиям согласно стадии с), и соответствующую ферментативную систему выбирают для первой стадии ферментативной обработки согласно стадии а) по п.1;
(е) необязательно последовательность стадий а)-д) повторяют с остатками необработанного или обработанного полимерного сырья для определения ферментативной системы, которую нужно использовать на последующей стадии ферментативной обработки.
Еще один дополнительный предпочтительный аспект изобретения направлен на способ, в частности, определения ферментативных систем, которые нужно использовать, и их последовательности, где необработанное полимерное сырье (a) сначала обрабатывают в раздельных ферментативных обработках каждым из множества ферментов или ферментативных систем (смесей), например, перечисленных в табл. 1 (предпочтительно, выбранных из ферментов и ферментативных систем, высвобождающих растворимые мономерные или олигомерные сахаридные строительные блоки из полимерного сырья), для определения ферментативной обработки, которая ведет к самому высокому выходу мономерных или олигомерных строительных блоков, содержащихся в необработанном полимерном сырье;
(b) выбирают такие ферментативные обработки, которые дают определенный мономерный или олигомерный продукт с чистотой более чем 75 мас.%, предпочтительно более чем 90 мас/%, более предпочтительно более чем 95 мас.%, более предпочтительно более чем 99 мас.% от общего содержания твердого вещества (предпочтительно после отделения от нерастворимого необработанного или обработанного полимерного сырья);
(c) среди оставшихся ферментативных обработок определяют обработку с самым высоким выходом мономерного или олигомерного продукта;
(ά) необязательно последовательность стадий а)-с) повторяют с остатками необработанного или обработанного полимерного сырья для определения ферментативной системы, которую нужно использовать на последующей стадии ферментативной обработки.
Согласно дополнительному предпочтительному аспекту изобретения, ферментативные системы, используемые на стадии ферментативной обработки, используют в последовательности в соответствии с последовательностью, доступной согласно указанным выше способам определения ферментативных систем, которые нужно использовать.
Согласно другому предпочтительному аспекту изобретения, ферментативные системы, для которых определение благоприятной последовательности применения обсуждалось выше, содержат или состоят из ферментов, высвобождающих растворимые мономерные или олигомерные сахаридные строительные блоки из (необработанного) полимерного сырья. Согласно дополнительному предпочтительному варианту осуществления изобретения, соответствующие ферменты и ферментативные системы представляют собой ферменты и ферментативные системы, обладающие (основной) активностью, направленной на расщепление олиго- или полисахаридов и/или высвобождение растворимых мономерных или олигомерных сахаридных строительных блоков из необработанного или обработанного полимерного сырья.
Согласно одному из вариантов осуществления для определения выхода или чистоты определенных растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков (продукта), полученного в конкретной ферментативной обработке с последующим отделением определенных растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков от (остатков нерастворимого) необработанного или обработанного полимерного сырья после инкубирования с ферментом, гидролизную суспензию (с ферментом и полимерным сырьем) центрифугируют при 10000 д в течение 15 мин. Супернатант (содержащий определенные растворимые мономерные или олигомерные строительные блоки) обрабатывают, как описано в данном описании ниже в примерах, и подвергают ΗΡΛΕ-ΡΆΌ анализу (Όίοικχ. Са., ИЗА, б) для определения сахара и уроновой кислоты в его составе.
Как указано выше, согласно предпочтительному аспекту изобретения, используемые ферментативные системы, по существу, не должны содержать или содержат в малой степени загрязняющие ферментативные активности, которые высвобождают из необработанного или обработанного полимерного сырья мономерные иди олигомерные строительные блоки, отличные от запланированных.
Таким образом, согласно предпочтительному варианту осуществления, ферментативная система, используемая на определенной стадии ферментативной обработки, обладает не более чем 50%, предпочтительно не более чем 20%, более предпочтительно не более чем 10%, более предпочтительно не более чем 5%, более предпочтительно не более чем 2%, более предпочтительно не более чем 1% загрязняющих (других) ферментативных активностей, которые не были использованы на предыдущей стадии ферментативной обработки, использующей различные ферментативные системы, или которые могут служить причиной высвобождения других определенных мономерных или олигомерных строительных блоков, которые не были высвобождены на предыдущих стадиях ферментативной обработки, или, согласно одному дополнительному варианту осуществления, которые только могут служить причиной высвобожде
- 13 016528 ния продуктов из полимерных субстратов, которые изначально по существу отсутствовали в полимерном сырье. Процентное содержание других или загрязняющих ферментативных активностей в ферментативной системе может быть вычислено, как изложено выше. По существу, отсутствовали в, согласно предпочтительному варианту осуществления, означает менее чем 20 мас.%, предпочтительно менее чем 10 мас.%, предпочтительно менее чем 5 мас.%, предпочтительно менее чем 2 мас.%, предпочтительно менее чем 1 мас.% от общего полимерного сырья.
Однако согласно преимущественному и предпочтительному варианту осуществления изобретения ферментативная система, используемая на конкретной стадии ферментативной обработки, обладает в качестве загрязняющих ферментативных активностей одной или несколькими такими ферментативными активностями, которые использовались на предыдущей стадии ферментативной обработки, использующей различные ферментативные системы, или, согласно дополнительному варианту осуществления, ферментативные системы, которые только могут служить причиной высвобождения других мономерных или олигомерных строительных блоков из полимерных субстратов, которые изначально, по существу, отсутствовали в необработанном или обработанном полимерном сырье. Другими словами, было обнаружено, что когда конкретный мономерный или олигомерный строительный блок был предварительно высвобожден из необработанного или обработанного полимерного сырья на предыдущей стадии ферментативной обработки (или не присутствовал в необработанном полимерном сырье сначала), не существенно, что ферментативная система, используемая на последующей стадии, по существу, свободна от соответствующей ферментативной активности, используемой в качестве основной активности на любой предыдущей стадии ферментативной обработки. Одно преимущество данного варианта осуществления состоит в том, что менее чистые и, таким образом, менее дорогостоящие ферментативные системы можно использовать на второй и последующих стадиях ферментативной обработки.
В конкретном случае такого способа ферментативное превращение ксилана в ксилозу выполняют в одну стадию обработки после ферментативной обработки целлюлозы, с последующим удалением продукта глюкозы на предыдущей стадии обработки. Таким образом, смеси ферментов, обозначенные в таблице 1, для превращения ксилана в ксилозу также могут содержать любые загрязняющие ферментативные активности, которые специфичны для обработки целлюлозы.
Дополнительно, согласно дополнительному предпочтительному варианту осуществления изобретения, ферментативные системы, используемые для обработки конкретного компонента необработанного или обработанного полимерного сырья могут содержать загрязняющие (другие) ферментативные активности, если они действуют на специфические промежуточные продукты реакции, вытекающие из предшествующих ферментативных реакций, и если финальные конечные продукты идентичны. Другими словами, дополнительный предпочтительный вариант осуществления изобретения направлен на способ, в котором ферментативная система, используемая на конкретной стадии ферментативной обработки, обладает основной ферментативной активностью (как описано выше) и содержит по меньшей мере одну дополнительную ферментативную активность, которая приводит к такому же определенному мономерному или олигомерному строительному блоку(ам) из необработанного или обработанного полимерного сырья, что и основная ферментативная активность ферментативной системы, в частности, из разных полимерных субстратов, присутствующих в необработанном или обработанном полимерном сырье.
В конкретном случае необработанный полимерный субстрат содержит как целлюлозу, так и крахмал (амилозу), и представляющий интерес продукт на соответствующей стадии обработки представляет собой глюкозу. Затем может допускаться загрязнение смеси ферментов, обозначенных в табл. 1, для превращения целлюлозы (целлюлазные активности), с сопровождающими побочными активностями для превращения крахмала (амилазные активности), как обозначено в табл. 1. Поэтому ферментативная система не должна содержать другие ферментативные активности, превышающие определенную пропорцию, за исключением амилазных активностей. В данном случае, исходный продукт для различных ферментативных реакций может быть различным, но продуктом в каждом случае является глюкоза.
Согласно одному предпочтительному варианту осуществления, сырье представляет собой целлюлоза-ксилан-обогащенное сырье, и фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих глюкозу, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой глюкозу, и фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов и ферментативных систем, высвобождающих ксилозу, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой ксилозу. Более того, в данном варианте осуществления, предпочтительно, фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а), выбирают из группы: бета-глюкозидазы из А. шдег или из Т. геехек целлобиогидролазы Ι-ΙΙ из Т. гехеек эндо-бета-1-4-Э-глюканаза Ι-У из Т. гехеек и фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии а), выбирают из группы: эндоксиланазы из А. шдег или Т. гее^е! или С. 1Ьегтосе11ит; ксилозидазы из А. шдег или Т. геекек
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления сырье представляет собой целлюлоза-ксилан-обогащенное сырье, и фермент или ферментативную систему, используемую на первой ста
- 14 016528 дии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов и ферментативных систем, высвобождающих ксилозу, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой ксилозу, и фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих глюкозу, согласно табл.1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой глюкозу. Более того, в данном варианте осуществления, предпочтительно, фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а), выбирают из группы: эндоксиланазы из А. шдег или Т. гееке» или С. (НегтосеНит; ксилозидазы из А. п1дег или Т. гееке1, и фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии а), выбирают из группы: бета-глюкозидазы из А. шдег или из Т. гееке1; целлобиогидролазы Ι-ΙΙ из Т. гекее1; эндо-бета-1-4-Э-глюканазы Ι-ν из Т. гекеек
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления сырье представляет собой арабинан-пектин-обогащенное сырье, и фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих арабинозу, согласно табл.1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой арабинозу, и фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих уроновую кислоту, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой уроновую кислоту. Более того, в данном варианте осуществления, предпочтительно, фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а), выбирают из группы: эндоарабиназы из А. гиде г; арабинофукозидазы из А. шдег, и фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии а), выбирают из группы: пектиназы (пектатлиаза, полигалактоуреназа) из А. аси1еа!ик, А. шдег или С. ]арошсик.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления, сырье представляет собой арабинан-пектин-целлюлоза-обогащенное сырье, и фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих арабинозу, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой арабинозу, фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих глюкозу, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой глюкозу, и фермент или ферментативную систему, используемую на третьей стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих уроновую кислоту, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой уроновую кислоту. Более того, в данном варианте осуществления, предпочтительно, фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а), выбирают из группы: эндоарабиназы из А. шдег; арабинофукозидазы из А. шдег, фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии а), выбирают из группы: бета-глюкозидазы из А. шдег или из Т. гееке1; целлобиогидролазы Ι-ΙΙ из Т. гекее1; эндо-бета-1-4-Э-глюканазы Ι-ν из Т. гекее1, и фермент или ферментативную систему, используемую на третьей стадии а), выбирают из группы: пектиназы (пектатлиаза, полигалактоуреназа) из А. аси1еа!ик, А. шдег или С. ]арошсик.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления сырье представляет собой галактанпектин-обогащенное сырье, и где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих галактозу, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой галактозу, и где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих уроновую кислоту, согласно табл.1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой уроновую кислоту. Более того, в данном варианте осуществления, предпочтительно, фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а), выбирают из группы: эндогалактоназы из А. шдег или из С. (НегтосеНит; бета-галактозидазы из А. шдег или К. ТгадШк, и фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии а), выбирают из группы: пектиназы (пектатлиаза, полигалактоуреназа) из А. аси1еа!ик, А. шдег или С. ]арошсик.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления сырье представляет собой маннанксилан-обогащенное сырье, и фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих маннозу, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собойма,ннозу, и фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов и ферментативных систем, высвобождающих ксилозу, согласно табл. 1, и определенный раствори
- 15 016528 мый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой ксилозу. Более того, в данном варианте осуществления, предпочтительно, фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а), выбирают из группы: эндо-маннаназы из А. шдег, В. зиЫШз, Т. тагШта или из Т. геезе1; экзо-маннозидазы из С. йт1, и фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии а), выбирают из группы: эндоксиланазы из А. шдег или Т. геезе1 или С. 111егтосе11ит; ксилозидазы из А. шдег или Т. геезе1.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления сырье представляет собой маннанцеллюлоза-обогащенное сырье, и фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих маннозу, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой маннозу, и фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы, состоящей из ферментов или ферментативных систем, высвобождающих глюкозу, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой глюкозу. Более того, в данном варианте осуществления, предпочтительно, фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а), выбирают из группы: эндо-маннаназы из А. шдег, В. зиЫШз, Т. тапйта или из Т. геезе1; экзо-маннозидазы из С. йт1, и фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии а), выбирают из группы: бета-глюкозидазы из А. шдег или из Т. геезе1; целлобиогидролазы Ι-ΙΙ из Т. гезее1; эндо-бета-1-4-Э-глюканазы Ι-ν из Т. гезее!
Ниже приведены дополнительные предпочтительные варианты осуществления изобретения, указывающие последовательность стадий ферментативной обработки в зависимости от природы или состава используемого необработанного полимерного сырья.
1. Для сырья, богатого ксиланом/целлюлозой (например, соломы), т.е. сырья с >10 мас.% ксилана, >10 мас.% целлюлозы и <15 мас.% арабинана, предпочтительно используется следующая последовательность стадий ферментативной обработки:
1) деполимеризация/расщепление ксилана;
2) деполимеризация/расщепление целлюлозы.
2. Для сырья, богатого арабинаном/пектином (например, свеклы), т.е. сырья с >15 мас.% арабинана, >10 мас.% пектина, <10 мас.% целлюлозы и <10 мас.% ксилана, предпочтительно используется следующая последовательность стадий ферментативной обработки:
1) деполимеризация/расщепление арабинана,
2) деполимеризация/расщепление пектина.
3. Для сырья, богатого арабинаном/пектином/целлюлозой, т.е. сырья с >15 мас.% арабинана, >10 мас.% пектина, >10 мас.% целлюлозы и <10 мас.% ксилана, предпочтительно используется следующая последовательность стадий ферментативной обработки:
1) деполимеризация/расщепление арабинана,
2) деполимеризация/расщепление целлюлозы,
3) деполимеризация/расщепление пектина.
4. Для сырья, богатого арабинаном/ксиланом/пектином/целлюлозой, т.е. сырья с >15 мас.% арабинана, > 10 мас.% ксилана, >10 мас.% пектина и >10 мас.% целлюлозы, предпочтительно используется следующая последовательность стадий ферментативной обработки:
1) деполимеризация/расщепление арабинана,
2) деполимеризация/расщепление ксилана,
3) деполимеризация/расщепление целлюлозы,
4) деполимеризация/расщепление пектина.
5. Для сырья, богатого галактаном/пектином (т.е. картофельный пектиновый галактан), т.е. сырья с >10 мас.% галактана, >10 мас.% пектина, <15 мас.% арабинана и <10 мас.% ксилана, предпочтительно используется следующая последовательность стадий ферментативной обработки:
1) деполимеризация/расщепление галактана,
2) деполимеризация/расщепление пектина.
6. Для сырья, богатого маннаном/ксиланом, т.е. сырья с > 15 мас.% маннана, > 10 мас.% ксилана, <15 мас.% арабинана и <10% целлюлозы предпочтительно используется следующая последовательность стадий ферментативной обработки:
1) деполимеризация/расщепление ксилана;
2) деполимеризация/расщепление маннана.
7. Для сырья, богатого маннаном/ксиланом/арабинаном (например, кожуры кофейных зерен), т.е. сырья с >15 мас.% маннана, >10 мас.% ксилана, >15 мас.% арабинана и <10 мас.% целлюлоза, предпочтительно используется следующая последовательность стадий ферментативной обработки:
1) арабинан,
2) деполимеризация/расщепление ксилана,
3) деполимеризация/расщепление маннана.
8. Для сырья, богатого галактаном (например, лиственничного арабиногалактана; гуарового галак
- 16 016528 томаннана), т.е. сырья с >10 мас.% галактана, <10мас.% пектина и <10 мас.% ксилана, предпочтительно используется следующая последовательность стадий ферментативной обработки:
1) деполимеризация/расщепление галактана,
2) ксилан или арабинан в зависимости от состава сырья,
3) деполимеризация/расщепление маннана.
9. Для сырья, богатого маннаном/целлюлозой (например Кощак глюкоманнана), т.е. сырья с >15 мас.% маннана, >10 мас.% целлюлозы, <10 мас.% ксилана, <10 мас.% галактана и <15 мас.% арабинана, предпочтительно используется следующая последовательность стадий ферментативной обработки:
1) деполимеризация/расщепление маннана,
2) деполимеризация/расщепление целлюлозы.
В предпочтительном случае указанные применяемые смеси ферментов должны быть, по существу, чисты от специфических ферментативных активностей, которые будут приводить к загрязнению получаемого потока продукции.
В другом конкретном случае, где глюкоза представляет собой целевой продукт, и необработанное полимерное сырье содержит целлюлозу в качестве полимерных субстратов (например, пшеничная солома), используют смесь ферментов целлюлаз. Пригодные смеси ферментов перечислены в табл. 1. Такие смеси целлюлаз можно использовать в комбинации с бета-гликозидазами, гликогидролазами и альфаили бета-амилазами, как указано в табл. 1, для превращения целлюлозной фракции необработанного полимерного сырья в мономерные глюкозные блоки. Для того чтобы получить чистый поток продукции глюкозы, смесь ферментов, применяемая к целлюлозной фракции, должна быть чиста от любых гемицеллюлазных активностей, которые охватывают, но не ограничиваясь ими, ферментативные активности арабинофуранозидазы, арабиназы, галактозидазы, маннаназы, маннанозидазы, ксиланазы и ксилозидазы. В данном ферментативном процессе полимерная целлюлоза будет превращена в растворимые глюкозные блоки, которые могут быть физически отделены от нерастворимого сырья, как описано выше. Оставшийся нерастворимый материал может быть обработан для дальнейшего производства различных пентозных сахаров из гемицеллюлозной фракции.
В другом конкретном случае, где арабиноза и ксилоза представляют собой целевые продукты, и необработанное полимерное сырье содержит полимерные субстраты, содержащие гетерогенные гемицеллюлозные полимеры, такие как арабиноксилан, сначала используют смесь ферментов, перечисленных в таблице 1, для превращения и мобилизации разветвленных арабинозных блоков. Затем растворимые арабинозные блоки отделяют от оставшегося нерастворимого сырья перед использованием второй смеси ферментов, перечисленных в табл. 1, для мобилизации ксилозных блоков, содержащихся в ксилановых полимерах. Затем растворимые ксилозные блоки также отделяют от оставшегося нерастворимого сырья.
Ферментативные стадии способа могут быть объединены с одной или несколькими стадиями предварительной обработки. На такой стадии(ях) предварительной обработки можно неизбирательно экстрагировать компоненты с низкой коммерческой ценностью, которые иначе будут загрязнять ценные потоки продукции из процесса. Таким образом, согласно одному из вариантов осуществления, одну или несколько стадий предварительной обработки используют для экстрагирования или иного удаления определенных компонентов. Альтернативно, можно использовать одну или несколько избирательных стадий предварительной обработки, что обеспечит сравнимую избирательность для ферментативных стадий способа при растворении отдельных химических компонентов необработанных полимерных субстратов. Таким образом, согласно одному из вариантов осуществления, одну или несколько стадий предварительной обработки используют для увеличения избирательности последующих стадий ферментативной обработки. Примеры таких стадий способа будут представлять собой растворение фракции лигнина из ЬСВ в органических растворителях, таких как этанол или глицерин (Йок е1 а1., 2003; ОетйЬак. А., 1998). Такая отдельная предварительная стадия обработки и условия известны специалисту в данной области. При дополнительной альтернативе, указанные неизбирательные стадии предварительной обработки применяют к нерастворимым остаткам, которые были очищены от загрязнителей на предыдущих избирательных стадиях способа. Пример такой стадии обработки представляет собой полный гидролиз белковой фракции посредством обработки кислотой после избирательного растворения гемицеллюлозной, целлюлозной и лигниновой фракции из ЬСВ посредством вышеуказанных избирательных стадий способа.
Другой частный пример для варианта осуществления изобретения приведен на чертеже. Таким образом, на чертеже показана технологическая цепочка для последовательной ферментативной обработки ЬСВ.
На данной иллюстрации обработки субстрата, богатого целлюлозой, гемицеллюлозой и лигнинами, и с низкими количествами белков и липидов, такого как пшеничная солома, солома зерновых или мягкая древесина, растворение различных центозных компонентов, содержащихся в гемицеллюлозной фракции достигается за счет последовательной обработки ферментами ксиланазой, арабиназой и маннаназой, которые специфически высвобождают ксилозные, арабинозные и маннозные сахара, соответственно. Подходящие ферменты и условия для обеспечения оптимальных условий процесса для ферментов известны специалисту в данной области. Растворимую фракцию удаляют после каждой стадии обработки, и нерастворимые частицы контактируют с последующим ферментом. После обработки пентозной фракции, до
- 17 016528 бавляют сходную стадию обработки для превращения целлюлозы в глюкозу с использованием смеси экзо- и эндоцеллюлаз, необязательно в комбинации с целлобиазой или бета-глюкозидазой для высвобождения глюкозы и целлобиозы из целлюлозной фракции субстрата ЬСВ. Полученные растворимые продукты реакции удаляют из реакционной смеси с супернатантом. Сходным образом, лигниновую фракцию, остающуюся в нерастворимой фазе, превращают в ее различные фенольные строительные блоки с использованием специфических ферментативных систем, таких как лакказы и лигнинпероксидазы. Затем фенольные и олигофенольные соединения экстрагируют из реакционной смеси с супернатантом или экстракцией растворителем. Условия процесса для выполнения данной стадии обработки известны специалисту в данной области. Каждый из отдельных продуктов, образующихся в результате ферментативного превращения гемицеллюлозы, целлюлозы, лигнина или других компонентов ЬСВ, могут быть выделены после каждого последующего цикла применения фермента (см. чертеж). Полученные, по существу, чистые химические строительные блоки фенольных, пентозных или гексозных сахаров затем могут быть дополнительно переработаны в ценные коммерческие продукты (см. чертеж). В основном, согласно одному из вариантов осуществления, определенные мономерные или олигомерные строительные блоки, высвобожденные из необработанного или обработанного полимерного сырья, очищают и необязательно дополнительно обрабатывают.
На другой иллюстрации сельскохозяйственные отходы, богатые белком и липидами, такие как отходы от производства масла из рапсового семени, подсолнечника или оливок, могут быть последовательно подвергнуты контактированию с указанными выше гемицеллюлазами и целлюлазами, и необязательно пектиназами, с последующим контактированием остатков указанных стадий способа с неспецифичной протеазой. Такие неспецифичные протеазы известны специалисту в данной области и могут быть получены в большом масштабе. Обработка протеазой растворяет аминокислоты и пептиды из полимерного сырья. Впоследствии эти аминокислоты и пептиды могут быть использованы в виде смеси или разделены на отдельные субстанции методами, известными специалисту в данной области.
В одном случае целевые продукты представляют собой арабинозу, ксилозу, глюкозу, олигофенилпропаноиды, монолигнолы, и/или монофенолы. и указанные продукты образуются путем превращения необработанной полимерной сырьевой пшеничной соломы в ее составные части посредством последовательного ферментативного превращения.
На первичной стадии такого последовательного процесса хорошо перемолотую пшеничную солому (масса 1 кг, 0,2 мкм) с приблизительным содержанием влаги 5% мас./мас. помещают в стальной контейнер. Добавляют минимальное количество воды, равное 2 л, и смешивают с сырьем. Полученную суспензию оставляют намокать в течение 4 ч при комнатной температуре. Избыток жидкости удаляют, оставляя приблизительно 200 мл раствора. Контейнер герметизируют и нагревают в течение 1 ч до 121°С при давлении 10 бар в традиционной стерилизующей автоклавирующей системе (Рш8 с1 а1., 1985; Нагтк, 1989; Рообу с1 а1., 1998). Давление в сосуде быстро стравливают и содержимому дают возможность остыть до комнатной температуры. В таких условиях степень полимеризации компонентов сырья снижена, но только минимальная фракция его компонентов высвобождается в растворимой форме. Полученную жидкую фазу (содержащая соли и незначительные количества различных растворимых компонентов) и нерастворимую фазу (содержащая нерастворимые полимерные субстраты, такие как целлюлоза, гемицеллюлоза и лигнин) разделяют фильтрованием, просеиванием или центрифугированием, и нерастворимую фазу дополнительно обрабатывают.
На следующей стадии, для того чтобы мобилизовать арабинозные компоненты, содержащиеся в нерастворимой гемицеллюлозной фракции, используют смесь альфа-Ь-арабинофуранозидаз. Все приведенные ниже реакции осуществляют минимум при 400°С в течение 24 ч в 50 мМ фосфатном буфере, имеющем рН 5-7. 0,08-1 г ОН51 альфа-Ь-арабинофуранозидазы из С1о51пбшт 111сгтоес11ит/кг сырья добавляют для гидролиза альфа-1,2/1,3-арабинофуранозиловых блоков арабинана и ксилана (Тау1ог с1 а1., 2006). Впоследствии, 0,08-1 г ОН43 альфа-Ь-арабинофуранозидазы из Нит1ео1а 1П8о1еи8/кт сырья добавляют для гидролиза альфа-1,5-арабинофуранозиловых единиц (Зотеикеи е! а1., 2006). Из-за специфичности смеси ферментов, полученная жидкая фаза содержит, в основном, арабинозу. Высвобожденные и растворимые арабинозные блоки отделяют от нерастворимой пульпы фильтрованием или центрифугированием. Оставшуюся нерастворимую фракцию сохраняют для дальнейшей обработки.
На следующей стадии, для того чтобы превратить нерастворимые ксилановые компоненты в растворимые ксилозные блоки, используют смесь ксиланаз и ксилозидаз. Все реакции осуществляют минимум при 40°С в течение 24 ч в 50 мМ фосфатном буфере, имеющем рН 5-7, 0,08-1 г эндо-1,4-бетаксиланазы (ОН10 или 11) из Нит1ео1а 1П8о1еи8/кг сырья и 0,08-1 г бета-ксилозидазу (ОН3) из Тпейобегта геекеЬкг сырья добавляют для высвобождения ксило-олигосахаридов и ксиланозных блоков, соответственно. Из-за специфичности смеси ферментов, полученная жидкая фаза в основном содержит ксилозу. Растворимую ксилозу отделяют от нерастворимых остатков сырья фильтрованием или центрифугированием.
На следующей стадии, для того чтобы мобилизовать гексозные сахара, оставшиеся в гемицеллюлозной и целлюлозной фракциях, соответствующие нерастворимые частицы подвергают взаимодействию с оптимизированной смесью ферментов, содержащих эндо- и экзоцеллюлазы. Все реакции осущест
- 18 016528 вляют минимум при 50°С в течение 16 ч в 50 мМ буфере из ацетата натрия (рН 5-6). Смеси каждой 0,0051 г 1,4-бета-эндоглюканазы (Се15А, Се17В, Се112А, Се161А) и 1,4-бета-целлобиогидролазы (Се17А, Се1бА) из ТпсНобегта геезеРкг нерастворимого сырья добавляли для мобилизации гексозных сахаров ([Γ^νίη е! а1., 1993, К1т е! а1., 1998). Эффективность и кинетика превращения целлюлозы в мономерные сахарные блоки необязательно увеличиваются при добавлении 0,0005-0,01 г целлобиозадегидрогеназы из РНапегосае!е сйтузозротшт в комбинации с 0,05-1 г ферроцианида и 0,0005-0,1 г бета-гликозидазы (10% масс. ферментативная смесь) из АзретдШиз шдет/кг сырья (1датазЫ е! а1., 1998, Роздаагб е! а1., 2006). В силу специфичности смеси ферментов полученная жидкая фаза содержит в основном гексозы, преимущественно состоящие из глюкозы. Их дополнительно отделяют фильтрованием или центрифугированием от мелких макрочастиц из остатков сырья.
На следующей стадии нерастворимые остатки лигнина после предыдущих ферментативных обработок превращают в их компоненты при последующем взаимодействии с лигнинпероксидазной и лакказной ферментативными системами. Реакции с лигнинпероксидазой осуществляют минимум при 50 мМ тартрата натрия (рН 3,5) и при максимальной температуре 32°С. Высокополимерные нерастворимые частицы лигнина окислительно расщепляют при взаимодействии с каждой 0,5-1 г лигнинпероксидазы (ЫР) из РНапегосае!е сйтузозротшт/кг сырья (Уагб е! а1., 2003). Для предотвращения каталитической инактивации ЫР (состав соединения III, ХУапЫп апб Со1б 1990) из-за присутствия избытка Н2О2 в реакционной смеси, растворимую ферментативную Н2О2-генерирующую систему используют для обеспечения контролируемых и непрерывных условий образования Н2О2. Может быть использована Н2О2-генерирующая мощность глиоксалевой оксидазы (СЬОХ) естественного вспомогательного фермента, работающего в синергизме с лигнинпероксидазами (Кегз!еп 1990). Реакция с СЬОХ требует одинакового рН, ионной силы и температурного профиля, как описано для ЫР. Образование Н2О2 вызывают добавлением 0,05-1 г СЬОХ и 0,1-1 г субстрата для СЬОХ метилглиоксаля/кг сырья. Чтобы индуцировать и усилить окислительное расщепление полимерного лигнина с помощью ЫР, добавляют окислительновосстановительный посредник вератриловый спирт (3,4-диметоксибензиловый спирт), что приводит к завершению реакции (Еетароп!оуа е! а1., 2006). Более эффективное расщепление нерастворимого лигнина может быть достигнуто добавлением 2 г вератрилового спирта/кг сырья (Вагг е! а1., 1993). Основные продукты реакции окислительного расщепления нерастворимого лигнина, катализируемого ЫР, представляют собой олигофенилпропаноиды, тогда как монолигнолы являются только минорными компонентами смеси продуктов.
Для увеличения количества монофенолов в смеси продуктов, дополнительно осуществляют взаимодействие смеси продуктов, полученных с помощью ЫР, с лакказой (б'Асипхо е! а1., 2002). Реакцию проводят минимум при 40°С в течение 6 ч в 100 мМ фосфатном буфере, имеющем рН 5-6. 0,0004 г лакказы из Ттате!езуегзюо1ог и 0,0005 г 2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-илокси (ТЕМРО) добавляют в качестве окислительно-восстановительного посредника/кг сырья (Апаз е! а1., 2003) для окисления олигофенолов до монофеноловых лигниновых блоков. В силу специфичности смеси ферментов, полученная жидкая фаза в основном содержит монофеноловые лигниновые блоки. Полученную смесь продуктов отделяют от оставшейся пульпы мембранным фильтрованием и простым центрифугированием.
Следующие примеры показывают влияние последовательности стадий ферментативной обработки различного лигниноцеллюлозного сырья. В данном описании примеры предназначены для дополнительной иллюстрации изобретения, но в любом случае не должны рассматриваться в качестве ограничения объема изобретения.
Получение субстрата
Предварительно обработанная пшеничная солома: сухую пшеничную солому размалывали на мельнице до 120 мкм. Затем 2 г размолотой соломы суспендировали в 39,6 мл д. д. воды и 0,4 мл 12н. Н2§О4 (1% об./об.). Суспензию автоклавировали при 135°С в течение 30 минут. Смесь охладили до кт и центрифугировали при 10000 д в течение 15 мин. Полученный супернатант отбрасывали. Оставшийся осадок обрабатывали тремя промежуточными циклами промывка/центрифугирование (10000 д/15 мин) с использованием 50 мМ буфера из ацетата натрия (рН 5). После стадии последнего центрифугирования твердое вещество ресуспендировали в 35 мл 50 мМ ацетата натрия (рН 5), что давало 5% мас./мас. (всего 40 г) основной раствор субстрата.
Необработанная пшеничная солома, пульпа сахарной свеклы, ксилан из овса и спельты, ржаной арабиноксилан: сухие образцы пшеничной соломы (местные сельскохозяйственные продукты), пульпу сахарной свеклы (кормовая добавка для животных), ксилан из овса и спельты (§1дта, ХУеПНеип. Сегтапу. № по каталогу: Х0627) размалывали на мельнице до 120 мкм. Для получения отдельных основных растворов субстратов по 2 г каждого размолотого материала помещали в пробирку Иасоп. Затем пробирку наполняли 50 мМ буфером из ацетата натрия (рН 5) до отметки 40 г, что давало 5% (мас./мас.) конечную суспензию субстрата.
Ржаной арабиноксилан (Медахутез, 1ге1апб, № по каталогу: Р-РАХУ) был доставлен в виде мелкого белого порошка. Для получения основного раствора субстрата взвешивали 0,2 г и переносили в пробирку Иасоп (15 мл) . Затем пробирку наполняли 50 мМ буфером из ацетата натрия до отметки 4 г, что давало 5% (масс./масс.) конечный основной раствор.
- 19 016528
Получение ферментов
Арабиназа (Ага, источник: А.шдег, Кат.: Ε-ЕАКАВ), арабинофукозидаза (АгаГик, источник: А.шдег, Кат.:Е-АРАЗЕ), целлобиогидролаза I (СВН I, источник: Тгк1ю4егта кр., Кат.: Е-СВН1), эндо-β-Όглюканаза (Е6П, источник: Ттккодетта кр., Кат.: Е-СЕЬТВ), эндо-β-маннаназа (Мап, источник: А.шдег, Кат: Е-ΒΜΛΝΝ), ксиланаза (Ху1 1, источник: Т. ушде; Кат. Е-ХУТШ), полигалактуроназа (Ро1у, источник: А.аси1еа1ик, Кат. Е-РСАЬиЗР) были поставлены из Медахутек 1пс., 1ге1апд в виде сульфатаммониевых осадков (общий объем: 1 мл). Полученные препараты ферментов распечатывали и концентрировали с 45 мл буфера из ацетата натрия (50 мМ, рН 5) с использованием 50 мл устройств для центробежной ультрафильтрации Аткоп (граница 10 кДа; М1Шроге, МаккЮпе, ИК).
Коммерческая смесь целлюлаз (\Уог111. Се1., Кат: Се1; 108 ЕД/мг Э\У) , содержащая целлобиогидролазную (СВН I и СВН II), эндоцеллюлазную (ЕС I, ЕС II), β-гликозидазную (ВСЬ) и эндоксиланазную активности, была поставлена из \Уог11ипд1оп Вюскетка1 Согр. (N1., ИЗА) в виде сухого белого порошка. Основные растворы препарата целлюлазы (0,5 мг/мл) дополняли 10 мл буфера из ацетата натрия, (50 мМ, рН 5).
Пектиназа (Рес, активности: пектатлиазная, полигалактуроназная; Кат: Ресйпех ЬИта ЗР-Ь) из А. аси1еа1ик и β-глюкозидаза из А. шдег (ВСЬ, Кат: №хо 188) была поставлена в виде концентрированного раствора, готового для использования, из ^хо/утек, Эептагк.
Дополнительную эндоксиланазную активность (Ху1 2, ссылка на ВЬАЗТ: АА25б956/д1:71917054;
1Шр://\\лх\у.псЫ.п11п.ш11.дох/кЦек/еп1гех) из штамма ΥΧ ТкегтоЬШда Гикса рекомбинантно экспрессировали в З.сегехЫае. Ферментативную активность получали из очищенного и концентрированного ферментационного бульона с использованием устройств для центробежной ультрафильтрации Аткоп (М1Шроге, Майкопе, ИК).
Концентрации белка определяли способом Брэдфорда (ВгадГогд, М., 1976).
Получение гидролизного лигнина
Пшеничную солому (300 г) предварительно обрабатывали с использованием традиционного способа парового взрыва (пар 25 бар/5 мин при внезапном сбросе давления) в присутствии 1% (мас./об.) 12н. Н2ЗО4. Полученную суспензию центрифугировали при 10000 д (15 мин) и супернатант декантировали. Оставшееся твердое вещество промывали/нейтрализовали три раза 40 мл буфера из ацетата натрия (50 мМ, рН 5), затем сушили в вакууме и затем размалывали на мельнице до 120 мкм, что давало мелкий порошок. Полученную 5% (мас./мас.) суспензию, 2 г порошка соломы смешивали с 35 мл буфера из ацетата натрия (50 мМ, рН5), что давало общий объем 40 мл. 40 мл суспензии соломы смешивали с 4% (масс./масс. субстрата) целлюлазной смесью \Уог11ипд1оп и 0,5% (мас./мас.) β-гликозидазной активности из АкрегдШик шдег (№хо 188, Шхохутек). Полученную смесь инкубировали при 45°С (250 об./мин) в течение 48 ч в роторном миксере ЕррепдогГ. После начального инкубационного периода суспензию центрифугировали при 12000 д (15 мин) и полученный супернатант декантировали. Оставшееся твердое вещество дважды промыли д.д. водой при центрифугировании (12000 д/15 мин) и ресуспендировали в буфере из ацетата натрия (50 мМ, рН 5), что давало конечный объем 40 мл. Суспензию снова смешивали с 4% (мас./мас. субстрата) целлюлазной смесью \Уог11ипд1оп и 0,5% (мас./мас.) β-гликозидазы из АкрегдП1ик шдег (№хо 188, Шуо/утек), затем инкубировали ее в течение дополнительного 24-часового периода при 45°С. После второго инкубационного периода твердое вещество отделяли центрифугированием, как описано выше. Твердое вещество снова дважды промывали д. д. водой и затем центрифугировали (10000 д/15 мин) для разделения жидкой и твердой фаз. Затем полученное твердое вещество сушили в вакууме в течение 24 ч, что приводило к гидролизу лигниновой фракции (374 мг), используемой для следующих экспериментальных партий. Для того чтобы убедиться, что полученный данным способом лигнин не сохранил остаточные сахара, 50 мг полученного твердого вещества подвергали полному гидролизу, катализируемому кислотой, согласно опубликованным ХКЕЬ протоколам (5). Присутствие возможных компонентов сахаров проверяли с помощью анализа, основанного на высокоэффективной анионообменной хроматографии, объединенной с импульсным амперометрическим определением (НРАЕ-РАЭ) (Экпех, Са., ИЗА, 6). Хотя данная методика является более чувствительной (~1000 раз), чем стандартные ВЭЖХ протоколы, не было обнаружено остаточных сахаров в полученных в данном случае остатках гидролиза лигнина.
Эксперименты с последовательным ферментативным гидролизом
Все реакции проводили в конечном объеме 0,5 мл с буферной системой с ацетатом натрия (50 мМ, рН 5). Положительные контроли состояли из одной стадии ферментативного гидролиза для каждого субстрата (2,5% мас./об.=25 мг/мл) целлюлазной смеси \Уог11ипд1оп (1% мас./мас. субстрата=0,25 мг/мл). Следующие последовательные реакции гидролиза различных субстратов проводили двумя независимыми стадиями.
Начальная концентрация субстрата для первичной реакции гидролиза составляла 2,5% (мас./об.), тогда как общая концентрация фермента, составлявшая 1% (мас./мас. субстрата), сохранялась постоянной в каждой реакции. Распределение масс сахарных компонентов в отдельном субстрате наглядно приведено в таблице 1А. Каждую ферментативную реакцию инкубировали при 45°С/250 об/мин в течение 48
- 20 016528 ч в роторном миксере ЕррепбогР. После первичного гидролиза, суспензию центрифугировали при 10000 § в течение 15 мин. Супернатант декантировали, фильтровали (0,2 мкм) и подвергали НРЛЕ-ΡΆΏ анализу (Оюпех, Са., И8А, 6) для определения сахаров и уроновой кислоты, входящих в его состав.
Осадок, оставшийся после первичного гидролиза, ресуспендировали в 1 мл воды и центрифугировали (10000 §/15 мин). После центрифугирования промывные воды декантировали и осадок (объем ~100 мл) использовали для экспериментов по вторичному гидролизу. Концентрация фермента, добавленного при постановке вторичного гидролиза, составляла 1% мас./мас. (0,25 мг/мл) по отношению к начальной концентрации субстрата. После добавления фермента, объем реакции дополняли 0,5 мл буфера из ацетата натрия. Для вторичной стадии гидролиза использовали ферментативные активности, отличные от тех, что использовали на стадии первичной реакции. Однако в случаях, когда используются промышленные смеси ферментов, может допускаться незначительная ферментативная активность, которая была эквивалентна реакции первичной стадия. После 48-часового инкубационного периода гидролизную суспензию центрифугировали при 10000 § в течение 15 мин. Супернатант обрабатывали, как описано выше, и подвергали НРЛЕ-ΡΆΏ анализу (Оюпех, Са., И8А, б) для определения сахаров и уроновой кислоты, входящих в его состав.
Точные комбинации ферментов и субстратов, использованных для первичной и вторичной стадии гидролиза для каждого субстрата, приведены в таблице 2А.
Следующий список содержит концентрации/комбинации ферментов для отдельных реакций:
1) арабиназа (Ага: 0,2 мг/мл)+арабинофукозидаза (АгаРиз: 0,05 мг/мл),
2) СВН I (0,175 мг/мл )+ЕО II (0,005)+В0Ь (0,025 мг/мл),
3) маннаназа (Мап: 0,25 мг/мл),
4) полигалактуроназа (Поли: 0,25 мг/мл),
5) пектиназа (Рес: 0,25 мг/мл),
6) ксиланаза (Ху1 1 или Ху1 2: 0,25 мг/мл),
7) ксиланаза (Ху1 1 или Ху1 2: 0,2 мг/мл )+в-гликозидаза (ВОЬ: 0,05 мг/мл),
8) ШоПКппЩоп (0,25 мг/мл).
Для реакций, осуществляемых с предварительно обработанными соломой и свекловичной пульпой, соответствующие ксиланазные стадии первичного или вторичного гидролиза осуществляют исключительно с Ху1 1, полученной из ТпсНобегта уигбе.
Для сравнения все другие стадии ксиланазного гидролиза проводили только с Ху1 2, полученной из штамма УХ ТНегтоЫР1ба Ризса.
Таблица 1А. Распределение (мас.%) компонентов субстрата, определенное после количественного кислотного гидролиза (1-4)
- 21 016528
Таблица 2 А. Стадии последовательного гидролиза, осуществляемые с различными субстратами
Необработанная солома Относительное распределение анализируемого вещества (%)
Экспериментальная серия Глюкоза Ксилоза Арабиноза Галактоза Олигосахариды Уроновая кислота
1.1.1 Ага+Ага£из 0, 766 1,278 93,888 0, 000 1, 066 3,002
1.1.2 СВН 1+ЕС 11+ВСЬ 95,031 1,589 0,067 1,064 0,294 1,954
1.2.1 СВН 1+ЕС 11+ВСЬ 74,930 14,601 10,507 0,469 0,047 0,063
1.2.2 Ага+Ага£из 8,213 4, 710 85,583 0, 000 1,095 0, 399
Положительный контроль 83,855 12,193 0,118 1,044 1,588 1,201
Ржаной арабиноксилан Относительное распределение анализируемого вещества (%)
Экспериментальная серия Глюкоза Ксилоза Арабиноза Галактоза Олигосахариды Уроновая кислота
2.1.1 Ага+АгаТиз 0,000 20,476 79,524 0,000 0, 000 0,000
2.1.2 Ху1 2 0, 000 92,973 2,341 0,000 0,403 4,279
2.2.1 Ху1 2 1, 670 70,141 26,330 0, 609 1,189 0,053
2.2.2 Ага+АгаТиз 0,000 20,476 79,524 0, 000 0,000 0,000
Положительный контроль 0, 000 54,305 30,022 0,000 0, 414 15,259
Образцы свеклы Относительное распределение анализируемого вещества (%)
Экспериментальная серия Арабиноза Галактоза Глюкоза Ксилоза Манноза Олигосахариды
3.1.1 Ага+АгаТиз 76, 956 1,000 1,044 0,000 0,000 19,660
3.1.2 СВН 1+ЕС 11+ВСЬ 1, 604 1,354 83,458 3,772 8,050 0,517
3.2.1 Ага+Ага£из 3.2.2 Целлюлазная смесь ИогТЬ 76,956 1,725 1,000 0,967 1,044 89,233 0,000 3,783 0,000 2, 977 19,640 0, 357
3.3.1 СВН 1+ЕС 11+ВСЬ 3,886 2,094 61,191 32,108 0,406 0,006
3.3.2 Ага+Ага£из 61,827 0, 000 34,127 1,457 0, 000 0, 135
Положительный 2,347 0,000 85,252 4,229 0,160 1,310
контроль
Предварительно обработанные образцы Относительное распределение анализируемого вещества (5)
соломы
Экспериментальная Арабиноза Галактоза Глюкоза Ксилоза Манноза Олигосахариды
серия 4.1.1 Ху1 1 0,735 1, 907 6, 842 87,328 0, 000 3,120
4.1.2 СВН 1+ЕС 11+ВСЬ 0,000 0,364 95,398 3,076 0,439 0,721
4.2.1 Ху1 1 0,735 1,907 6,842 87,328 0,000 3,150
4.2.2 Пектиназа 0,000 1,700 93,490 1, 991 2,508 0,310
4.3.1 Ху1 1 0,735 1,907 6, 842 87,328 0, 000 3,110
4.3.2 Ага+Ага£из 0,000 0,000 94,849 5,153 0,000 0,000
4.4.1 СВН 1+ЕС 11+ВСЬ 0,500 0,435 74,398 16,676 1,339 6, 042
4.2.1 Ху1 1 0,040 0,364 22,398 73,076 0,439 3,721
Положительный 0,000 0,000 89,136 3,684 0,000 5,452
контроль
В качестве положительного контроля: использовали ИогбЫпдбоп (ИогЫ1. цел.).
При сравнении данных из табл. 2А становится очевидно, что при выборе правильной комбинации ферментативных стадий, чистые потоки сахарной продукции, превышающие 80% (мас./мас.), могут быть получены при гидролизе лигниноцеллюлозных субстратов.
Также очевидно, что последовательность ферментативных активностей, применяемых для специфического гидролиза субстрата, обладает сильным влиянием на состав и чистоту получаемых потоков продукции.
В дополнительной серии экспериментов исследовали влияние присутствия лигнина в сырье на стадии ферментативной обработки:
Избирательный ферментативный гидролиз в отсутствии/присутствии гидролизного лигнина.
- 22 016528
Все реакции проводили в конечном объеме 0,5 мл с буферной системой с ацетатом натрия (50 мМ, рН 5) в 1 мл пробирках ЕррсийогГ. Суспензии, содержащие 2,5% (мас./об.) необработанной пшеничной соломы (25 мг/мл) или ржаного арабиноксилана (0,25 мг/мл), гидролизовали с помощью 1% (мас./мас. субстрата=0,25 мг/мл) или эндоарабиназы (Ага), или эндополигалактуроназы (Ро1у), или эндоксиланазы (Ху1 2). Каждую реакцию проводили или в отсутствие, или в присутствии 2,5% (25 мг/мл) дополнительного гидролизного лигнина. Поэтому отношение субстрата к лигнину в соответствующих реакциях было 1:1. Все реакции инкубировали в течение 48 ч при 45°С (250 об./мин) в роторном миксере ЕррсийогГ. После инкубационного периода, образцы центрифугировали при 10000 д в течение 15 мин. Полученный супернатант удаляли пипетитированием для определения сахаров и уроновой кислоты, входящих в его состав, с использованием способа НРАЕ-РАО (6). Результаты, приведенные в табл. 3, сосредоточены только на изменениях в профилях гидролиза значительных мономерных сахарных компонентов.
Таблица 3
Избирательный гидролиз арабиноксилана и необработанной соломы в отсутствии/присутствии дополнительного лигнина а.) Результаты, полученные для арабиноксилана
Экспериментальная серия относительное распределение (%)
Глюкоза Ксилоза Арабиноза
Ху1 2+лигнин 0,12 95, 63 4,27
Ху1 2-лигнин 0, 28 78,09 21, 65
Ь.) Результаты, полученные для необработанной соломы
Экспериментальная серия относительное распределение (%)
Глюкоза Ксилоза Арабиноза
Ху1 2+лигнин 0,19 97,50 2, 16
Ху1 2-лигнин 4,31 84,50 12, 10
Ржаной арабиноксилан (эндогенное содержание лигнина <0,2% мас./мас.) и необработанная пшеничная солома (эндогенное содержание лигнина ~17% мас./мас.) были выбраны в качестве субстратов для гидролиза для изучения эффектов добавления экзогенного лигнина, так как указанные субстраты значительно различаются по их эндогенному содержанию лигнина.
В присутствии экзогенного лигнина гидролиз арабиноксилана и необработанной пшеницы эндоксиланазой 2 (Ху1 2) привел к значительному увеличению избирательности продукта. Для обоих субстратов побочная эндо-арабиназная активность Ху1 2 была снижена в присутствии лигнина.
Ссылки
1) 1!!р://ототот.ссгс.сисгду.доу/Ьютакк/ргодк/ксагсй2.сд174669.
2) М1сйс1, Г. с! а1. (2006), 1. оГ !1с 8с1сисс оГ Гоой аий Адпси1!игс 42 (1), рр.77-85.
3) 1!!р://кссигс.тсда7утс.сош/Пуиат1с.акрх?сои!го1=С8У1сотРгойис!&с а!сдо пХ'атс = Ро1укассйаг1йс8&ргойис!1й=Р-КАХ¥.
4) ототот.к1дта.сот.
5) й!!р://ототот.η^с1.доν/Ь^отакк/рйГк/42618.рйГ.
6) й!!р://ототот.й^оисx.сот.сп/!ссЬи^с/Ай1ск/АN92.Ρ^Ε
Литература
Наткси, О. с! а1. (1989) Ргосскк Гог !гса!тси! оГ Ьютакк \νίΐ1ι к!сат, ргойис! !1сгсЬу оЫатсй аий ΐ!δ икс аий гсас!ог. ЕР 0187422А2.
С1си, №.Р., Ма!кио, М., Уакш, Т. (1986) Адпс. Вю1.Сйс,. 50, рр. 1183-1194.
Апак, М.Е., Агсиак, М., Кос1пдисх, 1., 8о1у1усг1, 1., Ва11, А.8., Нсгиаийс/.М. (2003) КгаГ! ри1р ЬюЫсасЫид аий тсй1а!сй охМайои оГ а иои-рйсиойс киЬк!га!с Ьу 1ассакс Ггот 8!гср!отусск суаисик СЕСТ 3335. Арр1.Еиуп.М1сгоЬю1. 69, рр. 1953-1958.
П'Асии/о, Г. ОаШ, С, Макс1, В. (2002) ОхМайои оГ р1сио1к Ьу 1ассакс аий 1ассакс-тсй1а!ог кук!стк. 8о1иЬ111!у аий к!спс Екиск. Еиг.ЕЬюсйст. 269, рр. 5330-5335.
Вагг, Ώ., 8йа, М.М., Аик!, 8Ώ. (1993) Усга!гу1а1сойо1-йсрсийси! ргойисйои оГ то1сси1аг охудси Ьу Й1дши рсгохМакс. ЕВю1.Сйст. 268, рр. 241-244.
Ситс, Н.А., Рсггу, СС. (2006) Кско1ийои оГ сотр1сх тоиокассйапйс т1х!игск Ггот р1аи! сс11 ота11 1ко1а!ск Ьу 1ыд11 рН аиюи схсйаидс сйгота!одгарйу. 3. СЬгота!одгарйу. 1128 (1-2), рр. 90-96.
ПстиЬак, А. (1998) Адисоик д1уссго1 йсйдтйсайои оГ отоой сЫрк аий дгоиий отоой. Вюгскоигсс Тсс1ио1. 63 (2), рр. 179-185.
1готт, О.С., 8рс/ю, М., Уа1ксг, Й.Р., УПкои, О.В. (1993).
Вю!ссй. Вюсидтссг. 42, рр. 1002-1013.
Ио11, Н., \Гас1а, М., Ноийа, Υ., Киотайага, М., Уа1аиаЬс, Т. (2003) Вюогдаиоко1ус ргс!гса!тси!к Гог к1ти1!аисоик кассйапйсайои аий Гсгтси!айои оГ Ьсссй отоой Ьу с!1аио1ук1к аий МЕс го! Гиидт ЕВю!ссЬио1.
- 23 016528
103, рр. 273-280.
[дагакЫ К., Батсцта. М. Ебкккоп, К.-Ь. (1998) СебоЫоке беЬубгодепаке епЬапсек РЬапегосае!е сЬгукокропит се11оЬюЬубго1аке I аскбу Ьу гебе^бщ ргобис! ббиЫбоп. Еиг.ЕВюсЬет. 253, рр. 101-106.
Еегароп^а, Е.Е., Сакб11о, 1., СогГоп, Ь. (2006) Вюе1ес!госа!а1убс ргорегбек оГ бдшп регох1баке Ггрт РНапегосае1е сЬгукокропит ш геасбопк \νί6ι рЬепо1к, са!есЬо1к апб бдшп-тобе1 сотроипбк. ВюсЬет.ВюрЬук.Ас!а 1760 (9), рр. 1343-54.
Еообу, В. е! а1. (1998) Ргеобработка ргосекк Гог Ле согкегкюп оГ се11и1оке !о Гие1 еГЬапо1. И8 6,090,595.
Катт, В., бгиЬег, Р.К., Катт, М. (2006) Ыбик!па1 ргосеккек апб ргобис!к.
8!а!ик с.|ио апб Ги1иге биесбоп. Вюгейпепек 1, рр. 1-39.
Катйзшр, Н., ^аГапаЬе, Т., Нопба, Υ,, КитеаЬага, М. (2005) Эбес! ох1бабоп оГ ро1утепс киЬкба!ек Ьу ти1бГипсбопа1 тапдапеке регох1баке боепхуте Ггот Р1еиго!ик ок!геа!ик тебЬои! гебох теб1а!огк. ВюсЬет. 1. 386, рр. 387-393.
КаксЬетека!, 1. К1оке, М. (1985) Тгеппипд бег Котропеп!еп еб1ек Е1и881дкеЙ8дет18сЬе8. ΌΕ 3410155С1.
Кегк!еп.Р.Е (1990) 61уоха1 ох1баке оГ РЬапегосае!е сЬгукокропит: 11к сНагас1еп/абоп апб ас!кабоп Ьу Ыдшпрегох1баке Ргос.№б.Асаб.8сГ 87, рр. 2936-2940.
К1т, Е., 1гош, Э.С., ^а1кег, Ь.О., ^бкоп, Э.В. (1998) Еас!опа1 орбт1кабоп оГ а К1х-се11и1аке Ш1х!иге. В1о!есЬ. Вюепдтеег. 58(5), рр. 494-501.
К1п1еу, МТ, КгоЬп, В. Вютакк соптегкюп !о а1соЬо1 иктд ибгакошс епегду. И8 200570136520А1.
Ьа^Гогб, Н.6., Коиккеаи, ΕΌ. (2003) Се11и1ок1с Гие1 еГЬапо1. Арр1. ВюсЬет апб Вю!есЬпоЕ 105, рр. 457-469.
Ьа^Гогб, Н.6., Коиккеаи, ΕΌ. (2003) Се11и1ок1с Гие1.
е!Ьапо1. А1!ета!Ке ЕегтепГабоп ргосекк беыдпк \νί6ι \\'Пб-1уре апб гесотЫпап! 2утотопак тоЫбк. Арр1. ВюсЬет. Вю!есЬпо1. 105, рр. 457-469.
Ьупб, Ь.К., νап 2у1, ^.Н/ν., МсВпбе, ЕЕ., Ьакег, М (2005) Сопкобба!еб Ьюргосекктд о Г се11и1ок1с Ыотакк: ап ирба!е. Сигг. Орт. Вю!есЬпо1. 16, рр. 577-583.
Маттект Р. (2001) РЬепобск т ке1ес!еб Еигореап Ьагбтеооб креаек Ьу 1к.|шб сЬгота!одгарЬуе1ес!гокргау юшхабоп такк крес!готе!гу. Апа1ук! 126(9), рр. 1535-1538.
Ра11а, 6. (1981) С18 ге^'егкеб-рЬаке Нци1б сЬгота!одгарЬу бе1егтб1абоп оГ бкеб кидаг, кисгоке апб гаГПпоке. Апа1.СЬет. 53, рр. 1966-1967.
Ршк, 1., Рои!апеп, К., Когпег, Н.-И., νίίΙτπΓί, Ь. (1985) В1о!есЬпо1од1са1 ибК/абоп оГ \\иоб сагЬоЬубга!ек айег к1еаиипд ргебеа!теп!. Арр1. МкгоЫоЕ Вю!есЬпо1. 22, рр. 416-423.
Каток, Ь.Р., 8ί1νΗ, Т.А., Магбпк, Ь.Е., 8аГуапагауапа, К.6. (2005) Сот'егкюп о Г 11дпосе11и1ок1ск !о Ги1ек, сЬенисаб апб епν^^опшепίа11у-Г^^епб1у та!епа1к. Ме!а1к апб Ргосеккек 117, рр. 299-318.
Кокдаагб, Ь., Ре!егкоп, 8., СЬеггу, ЕК., Натк, Р., Меуег, А.8. (2006) ЕГПаепсу оГ пе\у Гипда1 се11и1оке кук!етк т Ьоокбпд епхутабс бедгабабоп оГЬаг1еу к!гате бдпосе11и1оке. Вю!есЬпо1. Ргод. 22(2), рр. 493-498.
8аЬа, В.С., Епхутек ак ЫосаГа1ук!к Гог согкегкюп оГбдпосе11и1окю Ыотакк !о ГегтегИаЫе кидагк (2005) т НапбЬоок оГ тбик!па1 ЫосаГа1ук1к, еб. СЫпд Т. Нои, СКС Ргекк, СЬар!ег 24, рр. 1-12.
8т^^поν, 8.А., Коге^ек-т Ο.ν., Са^тИо^'а, ν.₽., Ве^а, А.В., К1уасЬко, N.6. (2001) ЬасГакек Гог Ьак1ботусек: РЫкюосЬет^б сЬагас!епкбск апб киЬк!га!е кресШсбу 1о\\'агбк теГЬохурЬепобс сотроипбк. ВюсЬет. (Моксоте) 66(7), рр. 774-779.
Богепкеп, Н., Ребегкоп, 8., ^ккое-№е1кеп, А. е! а1. (2006) Нубго1ук1к оГ агаЫпоху1ап. \УО 2006114095А1 Тау1ог, Е. 8тбЬ, Ν., ТигкепЬигд, 1. е! а1. (2006).
8!гис!ига1 Ык1дЬ!к т!о !Ье Кдапб кресШсбу оГ а !ЬегтокГаЬ1е Гатбу 51 агаЫпоГигапок1баке, АгаГ51, Ггот С1ок!пбшт !Ьегтосе11ит. ВюсЬет. 1. 395, рр. 31-37.
^агб, 6., Набаг, Υ., Вбк1к, I., Эокоге!/, С (2003) МесЬаткбс ГеаШгек оГ бдшп регох1баке-са!а1укеб ох1бабоп оГ киЬкб!и!еб рЬепо1к апб 1,2-б1те!Ьохуагепек. ЕВю1.СЬет. 278, рр. 39726-39734.
ХУагикЫ Н., 6о1б, М.Н. (1990) Ыдшп Регох1баке Сотроипб III. МесЬашкт оГ Еогтабоп апб бесотрокбюп. ЕВю1.СЬет. 265, рр. 2070-2077.
^ооб, Т.М. апб ВаЬ!, К.М., МеГЬобк Гог теакиппд се11и1оке асбν^бек. МеГЬобк т Епхуто1оду. 160, рр. 87-112.
- 24 016528
Таблица 1. Ферментативные системы
Продукт Полимерный субстрат Ферментативная активность Номер смеси ферментов
1-ацилглицерофосфохолин Фосфатидилхолин Фосфолипаза 1
1,5-ангидро-О-фруктоза+О-глюкоза Альфа-глюкан Экзо-альфа-1,4-ϋглюканлиаза · 1
Спирт+ацетат Ксилоглюкан Ацетилэстераза 1
Рамногалактуронан
Аминокислоты Белки Протеаза 1
Арабиноза Арабинан Арабиноксилан Ксилоглюкан Ацетиловые эфиры Холиновые эфиры Арабинофуранозидаза 2, 5
Эндо-альфа-1,3-Ьарабинаназа 1, 3, 4
Эндо-альфа-1,5-Ъарабинаназа 1
Экзо-альфа-1,3-Ьарабинаназа 1, 2, 3
Экзо-альфа-1,5-Ьарабинаназа 1, 2, 5
Холин Ацетилхолинэстераза 1, 2
Холинэстераза 1, з
Ό-ксилонат Ксилоно-1,4-лактон Ксилоно-1,4лактоназа 1
Диацилглицерол Триглицериновые эфиры Триацилглицероловая липаза 1
Фукоза Ксилоглюкан Пектин Эндо-альфа-1,2-Цфукозидаза 1, 2
Экзо-альфа-1,2-Ьфукозидаза 1, 2, 3, 4
Пектиназа 1, з
Галактоза Галактан Галактоманнан Ксилоглюкан Эндо-бета-1,4-0галактозидаза 1
Экзо-бета-1, 4-ϋгалактозидаза 1, 2
Галлат Дигаллат Ацилглицероллипаза 1, 3
Глицероловые моноэфиры длинноцепочечных жирных кислот Танназа 1, 2
Глюкоза Целлюлоза Глюкоманнан Глюкороноксилан Ксилоглюкан Целлюлаза 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
Альфа-амилаза 1, 2, 3, 4, 6
Бета-амилаза 1, 2, 3, 5, 6
Бета-глюкозидаза 1, 2, 3, 4, 6
Целлобиогидролаза I 1, з, 4, б, 7
Целлобиогидролаза II 2, 3, 4, 6, 8
Эндо-бета-1,4-ϋ- глюканаза 1, 2, 3, 4, 5, 6
Эндоглюканаза I 1, 2, 4, б
Эндоглюканаза II 1, 2, 4, 5, б
Эндоглюканаза III 1, 2, 3, 5, б
Эндоглюканаза IV 1, 2, 3, 5, б
Эндоглюканаза V 1, 3, 4, б
Эндоглюканаза VI 1, 3, 4, б
Эндоглюканаза VII 1, з, 4, б
Экзо-бета-1,4-0- глюканаза 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
Глюкогидролаза 1, 2, 3, 4, б
Глюкоза Крахмал Альфа-амилаза 1, 2
Бета-амилаза 1, з
Глицерофосфохолин 2-лизофосфатидилхолин Лизофосфолипаза 1
Π-арабинонат Ь-арабиноно-1,4-лактон Ь-арабинонолактоназа 1
- 25 016528
Ацилэтиловыи эфир жирной кислоты с
Ацилэтиловыи эфир жирном кислоты
Олигопептиды Белки Аминопептидаза 1, 2, 8
Карбоксипептидаза 1, 3, 8
Карбоксилпротеиназа 1, 4
Эндопептидаза 1, 4, 5, 6, 7
Экзопептидаза 1, 2, 3, 8
Металлопротеиназа 1, 5
Сериновая протеиназа 1, 6
Тиоловая протеиназа 1, 7
Олигосахариды с концевыми 4деокси-альфа-Б-галакт-4енуронозиловыми группами Альфа-1,4-ϋгалактуронан Пектатлиаза (альфа1,4-0эндополигалактуронов ая кислая лиаза) 1
Фитол Хлорофилл Хлорофиллаза 1
Рибонуклеотиды РНК Эндорибонуклеаза 1, 2, 3
Экзорибонуклеаза 1, 2, 4, 5
Рибонуклеаза 1, 3, 4, 5
Стерол Стериловый эфир Стеролэстераза 1, 2
Тритерпенолэстераза 1, 3
Уроновые кислоты Пектин Полигалактуриназа 1
Пектинлиаза 1, 2
Ксилоза Арабиноксилан Глюкороноксилан Ксилан Ксилоглюкан Эндо-бета-1,3-Э- ксиланаза 1, 3, 6
Эндо-альфа-1, 6-0— ксилозидаза 1, 2
Эндо-бета-1,4-ϋ- ксиланаза 1, 2, 3
Экзо-альфа-1,6-0ксиланаза 1, 2, 7
Экзо-бета-1,3-ϋ- ксиланаза 1, 3, 5, 6
Экзо-бета-1,4-0- ксиланаза 1, 2, 3, 4
| | Ксилозидаза | 1, 2, 3
- 26 016528
Таблица 2
Субстрат Номер по каталогу 3±дта
Целлюлоза С6288
Целлодекстрины С4642
β- метилумбеллиферилолигосахариды М6018
р-нитрофенололигосахариды N0145
СМС С9481
Ανίοθΐ РН-101 11365
4-нитрофенил-β-Οцеллобиозид N5759
Ксилан Х4252
4-нитрофенил-β-ϋксилопиранозид N2132
Маннан из дрожжей М7504
ϋ-галакто-В-маннан из СегаЬопаа зШдиа 48230
4-нитрофенил а-Ъарабинофуранозид N3641
2,3- диметоксибензиловый спирт (вератриловый спирт) 38700
Лигнин, гидролитический 371076
Лигнин, огдапозоЬч 371017
2,2' -азидо-бис (3этилбензотиазолин6-сульфокислота (АВТ5) А1227
2,2' -азидо-бис(3этилбензотиазолинб-сульфокислота (ΑΒΤ5) А1227
Хлорид марганца (МпС12) 416479
Фермент Продукт
Эндо-целлюлаза, экзо-целлюлаза, β-гликозидаза Глюкоза
Эндо-целлюлаза, экзо-целлюлаза, β-глико зида за Глюкоза
Эндо-целлюлаза, экзо-целлюлаза, β-гликозидаза Глюкоза
Эндо-целлюлаза, экзо-целлюлаза, β-гликозидаза Глюкоза
Эндоцеллюлаза Олигосахариды
Экзоцеллюлаза Глюкоза
Глюкоза и ρΝΡ
Ксиланаза, ксиланозидаза Ксилоза
Целлюлаза Ксилоза и ρΝΡ
Маннаназа Маннанозид и манноза
Галактаза и маннаназа Галактоза и манноза
Арабинофукозидаза Арабиноза и ρΝΡ
Лигнинпероксидаза (ЫР) Радикал-катион вератрилового спирта
Лигнинпероксидаза (ЫР) Фенилпропаноиды
Лигнинпероксидаза (ЫР) Фенилпропаноиды
Лигнинпероксидаза (ЫР) ΑΒΤ5 радикал- катион
Лакказа ΑΒΤ5 радикалкатион
Марганцевая пероксидаза (МпР) Ион Мп3+
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (38)

1. Способ ферментативной обработки необработанного полимерного сырья, включающий следующие стадии:
а) обработку нерастворимого необработанного полимерного сырья ферментативной системой для высвобождения растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков из необработанного полимерного сырья;
Ь) отделение растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков, полученных на стадии а), от остатков нерастворимого необработанного полимерного сырья, где необработанное полимерное сырье содержит по меньшей мере 3 мас.% лигнина, где стадии а) и Ь) повторяют один или несколько раз с различными ферментативными системами для высвобождения из остатков необработанного полимерного сырья или обработанного полимерного сырья других растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков и где не проводят лигнинолитическую стадию ферментативной обработки.
2. Способ по п.1, где необработанное полимерное сырье содержит по меньшей мере 5 мас.% лигнина, предпочтительно 10 мас.% лигнина, более предпочтительно по меньшей мере 20 мас.% лигнина.
3. Способ по любому из предшествующих пунктов, где стадии а) и Ь) или их повторения осуществляют таким образом, что содержание лигнина в полимерном сырье, вычисленное в виде мас.% от общего состава полимерного сырья, не снижается.
4. Способ по п.1 или 2, где перед стадией а) растворимые компоненты отделяют от необработанного полимерного сырья.
- 27 016528
5. Способ по п.4, где отделение растворимых компонентов от необработанного полимерного сырья выполняют с использованием одной или нескольких стадий(и) промывки и/или одной или нескольких стадий(и) физико-химической обработки.
6. Способ по любому из предшествующих пунктов, где на стадии а) используют ферментативную систему, обладающую не более чем 50%, предпочтительно не более чем 20%, более предпочтительно не более чем 10%, более предпочтительно не более чем 5%, более предпочтительно не более чем 2%, более предпочтительно не более чем 1% других ферментативных активностей, помимо ферментативной активности, приводящей к высвобождению указанных растворимых мономерных или олигомерных строительных блоков из нерастворимого необработанного полимерного сырья согласно стадии а).
7. Способ по п.1 или 2, где перед повторением стадии а) отделение растворимых компонентов от обработанного полимерного сырья выполняют с использованием одной или нескольких стадий предварительной обработки, предпочтительно одной или нескольких стадий промывки.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, где ферментативную обработку осуществляют в водной среде, причем указанные мономерные или олигомерные строительные блоки, высвобожденные из необработанного или обработанного полимерного сырья, растворимы в водной среде, и отделение согласно стадии Ь) осуществляют жидкостным-твердотельным отделением растворимых строительных блоков в водной среде от остатков нерастворимого необработанного или обработанного полимерного сырья.
9. Способ по любому из предшествующих пунктов, где мономерные или олигомерные строительные блоки согласно стадии а) выбирают из одного из группы, состоящей из глюкозы, ксилозы, арабинозы, галактозы, маннозы, аминокислот или фенольных соединений или других продуктов, перечисленных в табл. 1.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где сырье представляет собой целлюлозаксилан-обогащенное сырье, и где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих глюкозу, согласно табл. 1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой глюкозу, и где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих ксилозу, согласно табл. 1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой ксилозу.
11. Способ по п.10, где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а), выбирают из группы: бета-глюкозидазы из А. шдет или из Т. геезе1; целлобиогидролазы Ι-ΙΙ из Т. геезе1; эндо-бета-1-4-О-глюканазы Ι-ν из Т. геезе1 и где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии а), выбирают из группы: эндоксиланазы из А. шдет, или Т. геезе1, или С. 111егтосе11ит; ксилозидазы из А. шдег или Т. геезет
12. Способ по любому из предшествующих пунктов, где сырье представляет собой целлюлозаксилан-обогащенное сырье, и где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих ксилозу, согласно табл.1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой ксилозу, и где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих глюкозу, согласно табл.1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой глюкозу.
13. Способ по п.12, где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а), выбирают из группы: эндоксиланазы из А. шдет., или Т. геезе1, или С. Шеттосе11ит; ксилозидазы из А. шдег или Т. геезе1 и где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии а), выбирают из группы: бета-глюкозидазы из А. шдет или из Т. геезе1; целлобиогидролазы Ι-ΙΙ из Т. геезе1; эндо-бета-1-4-Э-глюканазы Ι-ν из Т. геезе1.
14. Способ по любому из предшествующих пунктов, где сырье представляет собой арабинанпектин-обогащенное сырье, и где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих арабинозу, согласно табл. 1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой арабинозу, и где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих уроновую кислоту, согласно табл. 1, и определенный растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой уроновую кислоту.
15. Способ по п.14, где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а), выбирают из группы: эндоарабиназы из А. шдет; арабинофукозидазы из А. шдет и где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии а), выбирают из группы: пектиназы (пектатлиаза, полигалактуроназа) из А. аси1еаШз, А. шдет или С. )арошсиз.
16. Способ по любому из предшествующих пунктов, где сырье представляет собой арабинанпектин-целлюлоза-обогащенное сырье, и где фермент или ферментативную систему, используемую на
- 28 016528 первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих арабинозу, согласно табл. 1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой арабинозу, где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих глюкозу, согласно табл. 1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой глюкозу, и где фермент или ферментативную систему, используемую на третьей стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих уроновую кислоту, согласно табл. 1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой уроновую кислоту.
17. Способ по п.16, где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а), выбирают из группы: эндоарабиназы из А. шдег; арабинофукозидазы из А. шдег, где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии а), выбирают из группы: бета-глюкозидазы из А. шдег или из Т. гееке1; целлобиогидролазы Ι-ΙΙ из Т. гееке1; эндо-бета-1-4-Э-глюканазы Ι-У из Т. гееке1 и где фермент или ферментативную систему, используемую на третьей стадии а), выбирают из группы: пектиназы (пектатлиаза, полигалактуроназа) из А. аси1еа1и8, А. шдег или С. )арошсик.
18. Способ по любому из предшествующих пунктов, где сырье представляет собой галактанпектин-обогащенное сырье, и где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих галактозу, согласно табл. 1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой галактозу, и где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих уроновую кислоту, согласно табл. 1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой уроновую кислоту.
19. Способ по п.18, где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а), выбирают из группы: эндогалактоназы из А. шдег или из С. 1йегтосе11ит; бета-галактозидазы из А. шдег или К. ГгадПЕ и где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии а), выбирают из группы: пектиназы (пектатлиаза, полигалактуроназа) из А. аси1еа1и8, А. шдег или С. )арошси8.
20. Способ по любому из предшествующих пунктов, где сырье представляет собой маннан-ксиланобогащенное сырье, и где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих маннозу, согласно табл. 1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой маннозу, и где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих ксилозу, согласно табл. 1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой ксилозу.
21. Способ по п.20 где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а), выбирают из группы: эндоманнаназы из А. шдег, В. киЬИйк, Т. тапбта или из Т. гееке1; экзоманнозидазы из С. Дт1, и где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии а), выбирают из группы: эндоксиланазы из А. шдег или Т. гееке1 или С. 111егтосе11ит; ксилозидазы из А. шдег или Т. геекек
22. Способ по любому из предшествующих пунктов, где сырье представляет собой маннанцеллюлоза-обогащенное сырье, и где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих маннозу, согласно табл. 1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой маннозу, и где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии ферментативной обработки а), выбирают из группы ферментов или ферментативных систем, высвобождающих глюкозу, согласно табл. 1, и растворимый мономерный или олигомерный строительный блок представляет собой глюкозу.
23. Способ по п.22, где фермент или ферментативную систему, используемую на первой стадии а), выбирают из группы: эндоманнаназы из А. шдег, В. киЬИйк, Т. тапбта или из Т. гееке1; экзоманнозидазы из С. Р1т1 и где фермент или ферментативную систему, используемую на второй стадии а), выбирают из группы: бета-глюкозидазы из А. шдег или из Т. гееке1; целлобиогидролазы Ι-ΙΙ из Т. геекек эндо-бета-1-4Ό-глюканазы Ι-У из Т. геекек
24. Способ по любому из предшествующих пунктов, где ферментативная система, используемая на конкретной стадии ферментативной обработки, обладает не более чем 50%, предпочтительно не более чем 20%, более предпочтительно не более чем 10%, более предпочтительно не более чем 5%, более предпочтительно не более чем 2%, более предпочтительно не более чем 1% загрязняющих ферментативных активностей, которые не были использованы на предыдущих стадиях ферментативной обработки, использующей другую ферментативную систему, или которые могут вызывать высвобождение других мономерных или олигомерных строительных блоков, которые не были высвобождены на предыдущей стадии ферментативной обработки, или которые только могут вызывать высвобождение продуктов из полимерных субстратов, которые изначально, по существу, отсутствовали в полимерном сырье.
- 29 016528
25. Способ по любому из предшествующих пунктов, где необработанное полимерное сырье содержит целлюлозу и гемицеллюлозу в качестве полимерных субстратов и ферментативная система, используемая на конкретной стадии ферментативной обработки, обладает целлюлазной активностью и необязательно бета-гликозидазной, глюкогидролазной и/или альфа- или бета-амилазной активностью, но, по существу, свободна от гемицеллюлазной активности.
26. Способ по любому из предшествующих пунктов, где ферментативная система, используемая на конкретной стадии ферментативной обработки, обладает в качестве загрязняющих ферментативных активностей одной или несколькими такими ферментативными активностями, которые применялись на предыдущей стадии ферментативной обработки, использующей другую ферментативную систему, или которые только могут вызывать высвобождение других мономерных или олигомерных строительных блоков из полимерных субстратов, которые изначально, по существу, отсутствовали в необработанном полимерном сырье.
27. Способ по любому из предшествующих пунктов, где ферментативная система, используемая на конкретной стадии ферментативной обработки, обладает первой ферментативной активностью и имеет по меньшей мере одну дополнительную ферментативную активность, которая ведет к такому же мономерному или олигомерному строительному блоку(ам) из необработанного или обработанного полимерного сырья, что и первая ферментативная активность ферментативной системы, в частности, из другого полимерного субстрата, присутствующего в необработанном полимерном сырье.
28. Способ по любому из предшествующих пунктов, где нерастворимое необработанное или обработанное полимерное сырье подвергают стадии избирательной или неизбирательной физико-химической обработки перед стадией а) или перед повторением стадии а) по п.1.
29. Способ по п.28, где стадия физико-химической обработки состоит из обработки водными растворителями, органическими растворителями или любыми их комбинациями или смесями, предпочтительно с этанолом или глицерином.
30. Способ по любому из предшествующих пунктов, где ферментативную систему, дающую самую высокую чистоту мономерных или олигомерных строительных блоков после обработки необработанного полимерного сырья ферментативной системой и отделения мономерных или олигомерных строительных блоков от остатков необработанного полимерного сырья (обработанного полимерного сырья), выбирают для первой стадии ферментативной обработки согласно стадии а) по п.1.
31. Способ по п.30, где вторая ферментативная система, выбранная для второй стадии ферментативной обработки согласно стадии а) по п.1, представляет собой ферментативную систему, дающую самую высокую чистоту мономерных или олигомерных строительных блоков после обработки обработанного полимерного сырья, полученного по п.28, ферментативной системой и отделения мономерных или олигомерных строительных блоков от необработанного полимерного сырья.
32. Способ по п.30 или 31, где любую последующую стадию ферментативной обработки осуществляют в порядке уменьшения чистоты мономерных или олигомерных строительных блоков, полученных после обработки обработанного полимерного сырья, полученного на предыдущей стадии ферментативной обработки соответствующей ферментативной системой, и отделения мономерных или олигомерных строительных блоков от обработанного полимерного сырья.
33. Способ по любому из предшествующих пунктов, где ферментативные системы, подлежащие использованию, и последовательность их использования определяют предварительным анализом необработанного полимерного сырья.
34. Способ по п.33, где для определения ферментативных систем, подлежащих использованию, и их последовательности нерастворимое необработанное полимерное сырье:
a) сначала обрабатывают раздельными ферментативными обработками каждой из множества ферментативных систем (смесей), например, перечисленных в табл. 1;
b) для каждой ферментативной обработки мономерные или олигомерные строительные блоки, высвобожденные из необработанного полимерного сырья, анализируют на чистоту мономерных или олигомерных строительных блоков после отделения мономерных или олигомерных строительных блоков от необработанного полимерного сырья;
c) ферментативную систему, дающую самую высокую чистоту, выбирают для первой стадии ферментативной обработки согласно стадии а) по п.1;
б) последовательность стадий а)-с) повторяют с остатками необработанного или обработанного полимерного сырья для определения ферментативной системы, подлежащей использованию на последующей стадии ферментативной обработки.
35. Способ по п.33, где для определения ферментативных систем, подлежащих использованию, и их последовательности, нерастворимое необработанное полимерное сырье
a) сначала обрабатывают раздельными ферментативными обработками каждой из множества ферментативных систем (смесей), например, перечисленных в табл. 1, для определения мономерных или олигомерных строительных блоков, имеющих самое большое массовое отношение в необработанном полимерном сырье;
b) мономерные или олигомерные строительные блоки, имеющие наибольшее массовое отношение в
- 30 016528 необработанном полимерном сырье, анализируют на чистоту после отделения от необработанного полимерного сырья;
с) если определяемая чистота составляет более чем 75 мас.%, предпочтительно более чем 90 мас.%, более предпочтительно более чем 95 мас.%, более предпочтительно более чем 99 мас.% от общего содержания твердого вещества, состоящего из мономерных или олигомерных строительных блоков, соответствующую ферментативную систему выбирают для первой стадии ферментативной обработки согласно стадии а) по п.1;
б) если чистота, определяемая согласно стадии Ь), меньше требуемой согласно стадии с), мономерные или олигомерные строительные блоки, имеющие следующее самое большое массовое отношение в необработанном полимерном сырье, анализируют на чистоту после отделения от необработанного полимерного сырья до тех пор, пока чистота не будет удовлетворять требованиям согласно стадии с), и соответствующую ферментативную систему выбирают для первой стадии ферментативной обработки согласно стадии а) по п.1;
е) необязательно последовательность стадий а)-б) повторяют с остатками необработанного или обработанного полимерного сырья для определения ферментативной системы, подлежащей использованию на последующей стадии ферментативной обработки.
36. Способ по п.33, где для определения подлежащих использованию ферментативных систем и их последовательности необработанное полимерное сырье:
a) сначала обрабатывают раздельными ферментативными обработками каждой из множества ферментативных систем (смесей), например, перечисленных в табл. 1, для определения ферментативной обработки, которая ведет к самому высокому выходу мономерных или олигомерных строительных блоков, содержащихся в необработанном полимерном сырье;
b) выбирают такие ферментативные обработки, которые дают мономерный или олигомерный продукт с чистотой более чем 75 мас.%, предпочтительно более чем 90 мас.%, более предпочтительно более чем 95 мас.%, более предпочтительно более чем 99 мас.% от общего содержания твердого вещества;
c) среди оставшихся ферментативных обработок определяют обработку с самым высоким выходом мономерного или олигомерного продукта;
б) необязательную последовательность стадий а)-с) повторяют с остатками необработанного или обработанного полимерного сырья для определения ферментативной системы, подлежащей использованию на последующей стадии ферментативной обработки.
37. Способ по любому из пп.1-29, где ферментативные системы, используемые на стадии ферментативной обработки, используют в последовательности в соответствии с последовательностью, полученной по любому из пп.33-36.
38. Способ по любому из пп.33-37, где ферментативные системы содержат или состоят из ферментов, высвобождающих растворимые мономерные или олигомерные сахаридные строительные блоки из (необработанного) полимерного сырья.
EA200970866A 2007-03-19 2008-03-19 Создание химических строительных блоков из растительной биомассы посредством избирательной деполимеризации EA016528B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE200710013047 DE102007013047A1 (de) 2007-03-19 2007-03-19 Herstellung chemischer Bausteine aus pflanzlicher Biomasse durch selektive Depolymerisierung
EP07011507A EP2017349A1 (en) 2007-06-12 2007-06-12 Generation of chemical building blocks from plant biomass by selective depolymerization
PCT/EP2008/002223 WO2008113585A1 (en) 2007-03-19 2008-03-19 Generation of chemical building blocks from plant biomass by selective depolymerization

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200970866A1 EA200970866A1 (ru) 2010-04-30
EA016528B1 true EA016528B1 (ru) 2012-05-30

Family

ID=39458681

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200970866A EA016528B1 (ru) 2007-03-19 2008-03-19 Создание химических строительных блоков из растительной биомассы посредством избирательной деполимеризации

Country Status (11)

Country Link
US (1) US8524471B2 (ru)
EP (1) EP2134850B1 (ru)
CN (1) CN101680010A (ru)
BR (1) BRPI0809289A2 (ru)
CA (1) CA2681265A1 (ru)
DK (1) DK2134850T3 (ru)
EA (1) EA016528B1 (ru)
ES (1) ES2459291T3 (ru)
MX (1) MX2009009970A (ru)
MY (1) MY161723A (ru)
WO (1) WO2008113585A1 (ru)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8367195B2 (en) * 2008-09-04 2013-02-05 Frank Santoro Products made from recycled cardboard
EP2256208A1 (en) * 2009-05-25 2010-12-01 Süd-Chemie Ag Liquefied biomass
CA2763588C (en) 2009-05-26 2018-05-22 Arvind Mallinath Lali Method for production of fermentable sugars from biomass
DE202010011902U1 (de) 2010-08-27 2010-10-28 Technische Universität München Rührorgan für Flüssigkeiten
WO2012047430A1 (en) * 2010-10-07 2012-04-12 Danisco Us Inc. Processing of palm kernel waste using mannanase and pectinase
US10233471B2 (en) * 2013-05-16 2019-03-19 Novozyme A/S Methods of preconditioning pretreated cellulosic material
EP3167112B1 (en) 2014-07-10 2021-05-26 Leaf Sciences Pty Ltd Methods for hydrolysing lignocellulosic material
EP2982703A1 (en) 2014-08-06 2016-02-10 Clariant International Ltd. Energy-efficient and environmentally friendly process for the production of target chemical compounds from cellulosic material
CN104894087A (zh) * 2015-05-22 2015-09-09 江南大学 一种高效水解农林生物质原料纤维素酶制剂的复配定制方法
BR112018015184B1 (pt) 2016-02-19 2022-09-06 Intercontinental Great Brands Llc Processos para criar múltiplas correntes de valor a partir de fontes de biomassa
CA3059588A1 (en) * 2017-04-17 2018-10-25 Board Of Trustees Of Michigan State University Methods for lignin depolymerization using thiols
WO2019006448A1 (en) * 2017-06-30 2019-01-03 Danisco Us Inc COMPOSITION AND METHOD FOR DETERMINING THE QUANTITY OF GLUCOSE DERIVED FROM CELLULOSIC CONSTITUENTS OF A FEED CHARGE
CN111118084A (zh) * 2019-12-27 2020-05-08 苏州司克瑞特生物科技有限公司 魔芋甘露寡糖的制备方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2444823A (en) * 1944-03-31 1948-07-06 Masonite Corp Recovery of pentoses and hexosans from wood liquors
US4089745A (en) * 1976-12-27 1978-05-16 Standard Brands Incorporated Process for enzymatically converting cellulose derived from corn hulls to glucose
EP0062027A2 (de) * 1981-03-25 1982-10-06 STEYRERMÜHL Papierfabriks- und Verlags-Aktiengesellschaft Verfahren zur Gewinnung von Monosacchariden sowie Anlage zur Durchführung des Verfahrens
EP0406617A2 (en) * 1989-06-22 1991-01-09 International Paper Company Enzymatic delignification of lignocellulosic material
EP0884391A1 (en) * 1997-06-09 1998-12-16 Iogen Corporation Improved pretreatment process for conversion of cellulose to fuel ethanol
WO1999011672A1 (en) * 1997-09-01 1999-03-11 E.I. Du Pont De Nemours And Company Fractionation of hemicellulosic materials
US20020195213A1 (en) * 1999-03-23 2002-12-26 Yoshiya Izumi Process for producing xylooligosaccharide from lignocellulose pulp
US6586212B1 (en) * 1999-02-10 2003-07-01 Eastman Chemical Company Corn fiber for the production of advanced chemicals and materials: derivatizable cellulose and cellulose derivatives made therefrom
WO2003093420A2 (en) * 2002-04-30 2003-11-13 Athenix Corporation Methods for enzymatic hydrolysis of lignocellulose

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3410455A1 (de) 1984-03-22 1985-10-03 Ruhrkohle Ag, 4300 Essen Verfahren zur herstellung eines vergaserkraftstoffes aus kohleleichtoel
EP0187422A3 (en) 1985-01-08 1988-07-13 Shell Internationale Researchmaatschappij B.V. Process for the treatment of biomass with steam, product thereby obtained and its use and reactor
US5865898A (en) * 1992-08-06 1999-02-02 The Texas A&M University System Methods of biomass pretreatment
FR2705352B1 (fr) 1993-05-19 1995-08-04 Cray Valley Sa Procédé de dégradation de déchets de polyesters insaturés en vue de leur recyclage.
JPH10248595A (ja) 1997-03-12 1998-09-22 Fujitsu Ltd プラスチック分解菌の分離方法及びプラスチックの生分解評価方法
JP4140804B2 (ja) 2000-06-30 2008-08-27 学校法人慶應義塾 ジカプロラクトンおよびカプロラクトン重合体の製造方法
JP2002173828A (ja) 2000-12-04 2002-06-21 Ecolog Recycling Japan:Kk ポリエステル綿混用繊維製品リサイクル方法
JP3578138B2 (ja) 2001-01-12 2004-10-20 昭和電工株式会社 親水性ポリマーの分解方法
US6692578B2 (en) * 2001-02-23 2004-02-17 Battelle Memorial Institute Hydrolysis of biomass material
US20030051836A1 (en) * 2001-05-21 2003-03-20 Novozymes A/S Enzymatic hydrolysis of a polymer comprising vinyl acetate monomer
JP4171823B2 (ja) 2001-07-05 2008-10-29 学校法人慶應義塾 超臨界二酸化炭素を用いるポリエステルの解重合法および解重合生成物からのポリエステルの製造方法
JP4359718B2 (ja) 2002-08-05 2009-11-04 学校法人慶應義塾 ポリ乳酸の酵素解重合法、及び解重合生成物を用いるポリ乳酸の製造方法
US20040231060A1 (en) * 2003-03-07 2004-11-25 Athenix Corporation Methods to enhance the activity of lignocellulose-degrading enzymes
GB0306992D0 (en) 2003-03-27 2003-04-30 Horner Julia Biodegradable material
JP2005082710A (ja) 2003-09-09 2005-03-31 Keio Gijuku 超臨界流体を用いるポリエステル、ポリカーボネート又はポリ乳酸の連続解重合方法、及び連続解重合装置
US7504245B2 (en) * 2003-10-03 2009-03-17 Fcstone Carbon, Llc Biomass conversion to alcohol using ultrasonic energy
ES2810026T3 (es) * 2004-03-25 2021-03-08 Novozymes Inc Métodos para la degradación o la conversión de polisacáridos de la pared celular vegetal
DK1877568T4 (da) 2005-04-26 2021-01-11 Novozymes As Hydrolysering af arabinoxylan
CN1840674A (zh) 2006-01-19 2006-10-04 江南大学 一种酶解小麦麸皮制备低聚木糖的方法

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2444823A (en) * 1944-03-31 1948-07-06 Masonite Corp Recovery of pentoses and hexosans from wood liquors
US4089745A (en) * 1976-12-27 1978-05-16 Standard Brands Incorporated Process for enzymatically converting cellulose derived from corn hulls to glucose
EP0062027A2 (de) * 1981-03-25 1982-10-06 STEYRERMÜHL Papierfabriks- und Verlags-Aktiengesellschaft Verfahren zur Gewinnung von Monosacchariden sowie Anlage zur Durchführung des Verfahrens
EP0406617A2 (en) * 1989-06-22 1991-01-09 International Paper Company Enzymatic delignification of lignocellulosic material
EP0884391A1 (en) * 1997-06-09 1998-12-16 Iogen Corporation Improved pretreatment process for conversion of cellulose to fuel ethanol
WO1999011672A1 (en) * 1997-09-01 1999-03-11 E.I. Du Pont De Nemours And Company Fractionation of hemicellulosic materials
US6586212B1 (en) * 1999-02-10 2003-07-01 Eastman Chemical Company Corn fiber for the production of advanced chemicals and materials: derivatizable cellulose and cellulose derivatives made therefrom
US20020195213A1 (en) * 1999-03-23 2002-12-26 Yoshiya Izumi Process for producing xylooligosaccharide from lignocellulose pulp
WO2003093420A2 (en) * 2002-04-30 2003-11-13 Athenix Corporation Methods for enzymatic hydrolysis of lignocellulose

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SORENSEN ET AL.: "Synergistic enzyme mechanisms and effects of sequential enzyme additions on degradation of water insoluble wheat arabinoxylan" ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY, STONEHAM, MA, US, vol. 40, no. 4, 16 February 2007 (2007-02-16), pages 908-918, XP005892515 ISSN: 0141-0229 the whole document *
YOON ET AL.: "Enzymatic production of pentoses from the hemicellulose fraction of corn residues" LEBENSMITTEL WISSENSCHAFT UND TECHNOLOGY, ACADEMIC PRESS, LONDON, GB, vol. 39, no. 4, 1 May 2006 (2006-05-01), pages 388-392, XP005234767 ISSN: 0023-6438 the whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2134850B1 (en) 2014-01-29
EA200970866A1 (ru) 2010-04-30
MX2009009970A (es) 2010-01-20
MY161723A (en) 2017-05-15
US8524471B2 (en) 2013-09-03
CA2681265A1 (en) 2008-09-25
WO2008113585A1 (en) 2008-09-25
DK2134850T3 (en) 2014-03-10
ES2459291T3 (es) 2014-05-08
EP2134850A1 (en) 2009-12-23
US20090004697A1 (en) 2009-01-01
CN101680010A (zh) 2010-03-24
BRPI0809289A2 (pt) 2014-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA016528B1 (ru) Создание химических строительных блоков из растительной биомассы посредством избирательной деполимеризации
CN112553266B (zh) 酶促水解木质纤维素材料和发酵糖的方法
DK2606131T3 (en) Use of proteins from glycoside hydrolase 61 family for cellulose processing
US8877474B2 (en) GH61 glycoside hydrolase protein variants and cofactors that enhance GH61 activity
CN103189516A (zh) 用于产生可发酵糖类的组合物和方法
US9260705B2 (en) Cellobiohydrolase variants
US9476077B2 (en) Fungal beta-xylosidase variants
KR20150082277A (ko) 리그노셀룰로스 물질을 효소적으로 가수분해하고 당을 발효시키는 방법
US20120276594A1 (en) Cellobiohydrolase variants
EP2825644A1 (en) Cbh1a variants
EP2017349A1 (en) Generation of chemical building blocks from plant biomass by selective depolymerization
EP4320258A1 (en) Enzyme composition
WO2022214457A1 (en) Enzyme composition
EP2794871A1 (en) Endoglucanase 1b (eg1b) variants
US20140356914A1 (en) Endoglucanase 1b
EP4320252A1 (en) Enzyme composition
US20240182936A1 (en) Enzyme composition
JP2012115209A (ja) セロオリゴ糖の製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
PC4A Registration of transfer of a eurasian patent by assignment
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU