EA016490B1 - Псевдоинфекционный флавивирус и его применение - Google Patents
Псевдоинфекционный флавивирус и его применение Download PDFInfo
- Publication number
- EA016490B1 EA016490B1 EA200870304A EA200870304A EA016490B1 EA 016490 B1 EA016490 B1 EA 016490B1 EA 200870304 A EA200870304 A EA 200870304A EA 200870304 A EA200870304 A EA 200870304A EA 016490 B1 EA016490 B1 EA 016490B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- virus
- protein
- family
- replication
- infectious
- Prior art date
Links
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 title abstract description 64
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 165
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 138
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 120
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 51
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims abstract description 39
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 31
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims abstract description 19
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 claims abstract 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 54
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 claims description 42
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 40
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 claims description 36
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 claims description 36
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 36
- 101100121991 Chlamydia pneumoniae glmM gene Proteins 0.000 claims description 26
- 101150049837 PGM gene Proteins 0.000 claims description 26
- 101150084612 gpmA gene Proteins 0.000 claims description 26
- 101150104722 gpmI gene Proteins 0.000 claims description 26
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 23
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 claims description 22
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 claims description 19
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 18
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 18
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 18
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 17
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 17
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims description 14
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 claims description 13
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 13
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 13
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 claims description 12
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 12
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 claims description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 9
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 claims description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 9
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 claims description 9
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 claims description 8
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 claims description 8
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 7
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 claims description 6
- 201000006449 West Nile encephalitis Diseases 0.000 claims description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 6
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims description 6
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 claims description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 5
- 206010057293 West Nile viral infection Diseases 0.000 claims description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 4
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 claims description 4
- 241000710777 Classical swine fever virus Species 0.000 claims description 4
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 claims description 4
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 claims description 4
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 claims description 4
- 241000710888 St. Louis encephalitis virus Species 0.000 claims description 4
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 4
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 claims description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 206010066919 Epidemic polyarthritis Diseases 0.000 claims description 3
- 201000007009 Ross river fever Diseases 0.000 claims description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 claims description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 241000710908 Murray Valley encephalitis virus Species 0.000 claims description 2
- 241001068295 Replication defective viruses Species 0.000 claims description 2
- 241000710959 Venezuelan equine encephalitis virus Species 0.000 claims description 2
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 claims description 2
- -1 rgM Proteins 0.000 claims description 2
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 claims description 2
- 102100036546 Salivary acidic proline-rich phosphoprotein 1/2 Human genes 0.000 claims 12
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims 2
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 claims 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims 2
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 claims 2
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 claims 2
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims 2
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 claims 2
- UGVTYCQVZPDYRZ-ZHACJKMWSA-N 4-[(E)-[hydroxymethyl(methyl)amino]diazenyl]-1H-imidazole-5-carboxamide Chemical compound CN(CO)\N=N\C1=C(N=CN1)C(N)=O UGVTYCQVZPDYRZ-ZHACJKMWSA-N 0.000 claims 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims 1
- 101000615941 Homo sapiens Mannosyl-oligosaccharide 1,2-alpha-mannosidase IC Proteins 0.000 claims 1
- 102100021770 Mannosyl-oligosaccharide 1,2-alpha-mannosidase IC Human genes 0.000 claims 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 45
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 18
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 18
- 230000002950 deficient Effects 0.000 abstract description 11
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 226
- 102400000827 Saposin-D Human genes 0.000 description 24
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 21
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 19
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 18
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 17
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 17
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 102100027723 Endogenous retrovirus group K member 6 Rec protein Human genes 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 238000011161 development Methods 0.000 description 12
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 10
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 10
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 10
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 9
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 9
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 9
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 8
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 8
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 8
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 8
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 230000034994 death Effects 0.000 description 7
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 7
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 5
- 229940022005 RNA vaccine Drugs 0.000 description 5
- 208000004006 Tick-borne encephalitis Diseases 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 108700021021 mRNA Vaccine Proteins 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 4
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 4
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 101150040459 RAS gene Proteins 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 3
- 108700042226 ras Genes Proteins 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 2
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 2
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 2
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 2
- 206010014596 Encephalitis Japanese B Diseases 0.000 description 2
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 2
- 206010054261 Flavivirus infection Diseases 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000820294 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase Yes Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 201000005807 Japanese encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 101100456571 Mus musculus Med12 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 2
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 2
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 2
- 102100021788 Tyrosine-protein kinase Yes Human genes 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000003152 Yellow Fever Diseases 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 229940116362 tragacanth Drugs 0.000 description 2
- 235000010487 tragacanth Nutrition 0.000 description 2
- 239000000196 tragacanth Substances 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 235000005749 Anthriscus sylvestris Nutrition 0.000 description 1
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282985 Cervus Species 0.000 description 1
- 206010057573 Chronic hepatic failure Diseases 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 208000010334 End Stage Liver Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 208000022120 Jeavons syndrome Diseases 0.000 description 1
- 231100000111 LD50 Toxicity 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241001495084 Phylo Species 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091006629 SLC13A2 Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005421 acetyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108020002494 acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 208000011444 chronic liver failure Diseases 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000008098 formaldehyde solution Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 210000003093 intracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 229940023832 live vector-vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000012107 replication analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 229910052594 sapphire Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010980 sapphire Substances 0.000 description 1
- 201000004409 schistosomiasis Diseases 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/08—RNA viruses
- C07K14/18—Togaviridae; Flaviviridae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24161—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2770/24162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
В настоящем изобретении описывается дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Flaviviridae, не содержащий ген капсида, где дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус размножается только в клетках, экспрессирующих капсид или капсид, prM и белок оболочки флавивируса. В настоящем изобретении также описывается способ широкомасштабного производства таких вирусов и использование таких псевдоинфекционных вирусов в качестве вакцин для профилактики заболеваний, вызванных инфекциями человека и животных вирусами, принадлежащими к этому семейству.
Description
Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и иммунологии. В общем, настоящее изобретение раскрывает конструирование дефектных по репликации вирусов семейства НауМпбае и их использование в качестве вакцин для профилактики заболеваний, вызываемых вирусами этого семейства. В частности, настоящее изобретение относится к дефектным по репликации флавивирусам или псевдоинфекционным флавивирусам (Ρίν или ЯерИУАХ) и к их применению в качестве профилактических вакцин против заболеваний, опосредованных флавивирусами.
Предшествующий уровень техники
Род ΕΊηνίνίπικ семейства ИауМпбае включает большое число важных патогенов человека и животных; его разделяют на четыре различных антигенных комплекса на основании разницы в реактивности в иммунологических тестах. Обычно флавивирусы циркулируют между амплифицирующими вирус хозяевами - птицами или млекопитающими и переносчиками - насекомыми или клещами.
Геном флавивируса представляет собой одноцепочечную кэпированную РНК положительной полярности без концевой поли(А)-последовательности на З'-конце. Геном кодирует единственный полипептид, который процессируется котрансляционно и посттрансляционно с получением структурных белков вируса С, ргМ/М и Е, образующих вирусные частицы, и неструктурных белков N81. Ν82Α, Ν82Β, N83, Ν84Β и N85, необходимых для репликации вирусного генома и его упаковки в инфекционные вирионы (СйатЬегк, 1990). Вирионы содержат единственную копию геномной РНК вируса, упакованную в нуклеокапсид, содержащий белок С, окруженный липидной оболочкой, содержащей гетеродимеры белков М и Е. В отличие от многих других оболочечных вирусов, взаимодействие между нуклеокапсидом и выступами оболочки не является специфическим, то есть оболочка, содержащая димеры М/Е может успешно образоваться вокруг нуклеокапсида, полученного из гетерологичного флавивируса, демонстрируя ограниченный уровень гомологии капсидной последовательности (йогеп/, 2002). С другой стороны, экспрессия ргМ и Е в отсутствие С может приводить к образованию субвирусных частиц (8νΡ), не содержащих РНК или белкок С (Макоп, 1991).
Кассеты ргМ/М-Е, продуцирующие субвирусные частицы, составляют основу нескольких вакцинкандидатов, известных из уровня техники. Эти вакцины-кандидаты включают субъединичные вакцины (КошкЫ, 1992; 2001; 2002; О1ао, 2004), ДНК-вакцины (Рй111ройк, 1996; Косйе1, 1997; 8сйтаЦойи, 1997; Со1отЬаде, 1998; АЬег1е, 1999; КошкЫ, 2000; КошкЫ, 2000; Косйе1, 2000; Иаущ, 2001) и живые векторные вакцины (Макоп, 1991; КоЫкЫ, 1992; Ртсик, 1992; Еопкеса, 1994; Ридасйеу, 1995; Со1отЬаде, 1998; Капека, 2000; Мтке, 2004). Однако у этих вакцин существует ряд серьезных недостатков. Например, субъединичные вакцины безопасны в употреблении, но их трудно получить в больших количествах; ДНК-вакцины слабоиммуногенны, а векторные вакцины недостаточно эффективны при наличии иммунитета к вектору.
Поэтому, несмотря на серьезную озабоченность заболеваниями, опосредованными флавивирусами, и продолжающимся распространением флавивирусов на новые территории, для этих инфекций пока не разработано средств противовирусной терапии, и на сегодняшний день создано очень ограниченное количество одобренных вакцин. Инактивированные вирусные вакцины (ΙΝν) были разрешены к применению для профилактики клещевого энцефалита (ΤΒΕν) и японского энцефалита (ΙΕν). Однако, как и другие инактивированные вирусные вакцины, эти вакцины имеют низкую эффективность и требуют повторных вакцинаций. Несмотря на эти недостатки, преимуществом ΙΝν против японского энцефалита и клещевого энцефалита являются хорошие показатели безопасности. Единственной разрешенной к применению живой аттенуированной вакциной (ЬАУ) против флавивируса является широкоиспользуемая живая аттенуированная вакцина на основе штамма 17Ό вируса желтой лихорадки (УЕУ), полученного путем многократных перевиваний дикого типа штамма Ак1Ь1 вируса желтой лихорадки в культуре тканей куриных эмбрионов. Несмотря на то, что эта вакцина считается высокоэффективной и безопасной, были описаны случаи заболевания желтой лихорадкой среди вакцинированных, включая недавний случай заболевания новобранца ВС США (ОетаЫтоп, 2005). Кроме того, эта вакцина не рекомендована к применению у новорожденных, беременных женщин или пациентов с ослабленным иммунитетом из-за побочных эффектов, включая энцефалит, опосредованный вакциной.
Однако развитие систем обратной генетики для флавивирусов привело к разработке и производству новых типов живой аттенуированной вакцины, основанных на рациональной аттенуации этих вирусов. Этот новый класс вакцин включает в себя химеры на основе штамма 17Ό вируса желтой лихорадки, в которых кассета, содержащая фрагмент генома вируса желтой лихорадки, кодирующий белки ргМ-Е, была заменена на кассету, кодирующую белки ргМ-Е, полученную из гетерологичных флавивирусов (СйатЬегк, 1999). Аналогичный подход, основанный на использовании химерных вирусов, был проведен с использованием материала лихорадки Денге или клещевого энцефалита (Р1е1пеу, 2002; Ниапд, 2003). В большинстве случаев химерные флавивирусы демонстрируют значительно ослабленный фенотип, сохраняя при этом способность вызывать эффективный защитный иммунный ответ и способность защищать против последующих инфекций вирусами, структурные белки которых экспрессируются химерами (Мопа1й, 2002). Показано, что существующий иммунитет к вектору не снижает эффективности вакци
- 1 016490 нации такими химерными вакцинами-кандидатами (МоиаШ, 2002), но снижает эффективность вирусных рекомбинантных вакцин на основе других вирусных векторов. Кроме того, несмотря на то, что химерные флавивирусы могут представлять собой достаточно универсальный подход для производства новых вакцин, существуют опасения, что химеры сами по себе могут оказаться патогенными (СйатЬега, 1999), по крайней мере, для пациентов с ослабленным иммунитетом, или что патогенные химеры могут возникнуть, поскольку в процессе распространения этих вирусов были выявлены случаи мутаций (Рцдаейеу,
2004) .
Еще одно многообещающее направление развития разработки вакцин основано на индукции в геноме флавивируса неисправимых делеций, при которых продуктивная репликация вируса в вакцинированном хозяине либо малоэффективна, либо невозможна. В последнем случае вирусный геном, полностью кодирующий белки, необходимые для репликации вируса, но не содержащий области, кодирующей, например, белок С, может быть предоставлен для иммунизации ίη νίνο в виде способной к саморепликации РНК, синтезированной ίη νίίτο (КоДет, 2004; АЬег1е, 2005) или, возможно, в виде ДНК (под контролем промоторов РНК-полимеразы II или в виде способной к саморепликации РНК, синтезированной ίη νίίτο (КоДет, 2004; АЬег1е, 2005). Было показано, что прямая иммунизация дефектными РНК-геномами, синтезированными ίη νίίτο, ведущая к производству 8УР в отсутствие полного цикла репликации вируса, является эффективным и безопасным методом стимуляции защитного иммунитета (КоДет, 2004; АЬег1е,
2005) . Однако для производства вакцины-кандидата, основанной на РНК, могут существовать серьезные препятствия из-за проблем, связанных с синтезом, стабильностью и доставкой вакцины.
Таким образом, в известном уровне техники отсутствует безопасный, сильный и эффективный вид вакцин, который может быть использован против заболеваний, вызываемых вирусами, принадлежащими семейству Е^Мпбае. Настоящее изобретение удовлетворяет давние потребности существующего уровня техники.
Сущность изобретения
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения описано получение дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства Пауцапбае. Такой псевдоинфекционный вирус содержит делецию в нуклеотидной последовательности, кодирующей белок капсида (С) , при этом делеция не нарушает последовательность РНК, необходимую для циклизации генома, сигнальную последовательность для белка ргМ, необходимую для правильного созревания белка ргМ/М, или их комбинацию, где дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус реплицируется только в клетках, экспрессирующих белок С или С, ргМ, белок оболочки, мутантный С, мутантный белок ргМ, мутантный белок оболочки или их комбинацию, принадлежащие вирусу семейства ЕЩМпбае.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения описано получение системы культуры клеток, экспрессирующих белок С или С, ргМ, белок оболочки, мутантный белок С, мутантный ргМ, мутантный белок оболочки или их комбинации, принадлежащие вирусу семейства ЕЩщшбае, делающие возможным размножение вышеописанного дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства Е^Мпбае в подходящих условиях.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения описан способ получения дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства Иа'утпбае, описанного выше. Такой способ включает получение дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства Е^Мпбае, содержащего делецию в нуклеотидной последовательности, кодирующей белок капсида, таким образом, что делеция не нарушает последовательность РНК, необходимую для циклизации генома, сигнальную последовательность для белка ргМ, необходимую для правильного созревания белка ргМ/М или их комбинацию; получение клеточной линии, экспрессирующей белок С или С, ргМ, белок оболочки, мутантный белок С, мутантный ргМ, мутантный белок оболочки или их комбинации, принадлежащие вирусу семейства ЕЩМпбае, где клеточная линия синтезирует высокий уровень белков Е1ау1У1Г1бае. необходимых для размножения дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства ЕЩМпбае; и инфицирование клеточной линии псевдоинфекционным вирусом семейства ЕЩМпбае, получая, таким образом, дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Е^Мпбае.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения описывается фармацевтическая композиция, содержащая дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства ЕЩМпбае, полученный способом, описанным в настоящей заявке.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения описан способ защиты пациента от инфекций, возникающих в результате контакта с вирусами семейства Пауцзпбае. Такой способ включает назначение пациенту иммунологически эффективного количества фармацевтической композиции, полученной по способу, описанному в настоящей заявке, которая индуцирует у пациента иммунный ответ против вирусов семейства ЕЩМпбае, защищая, таким образом, пациента от инфекций.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение репликации Ρΐν-флавивируса в клетках, продуцирующих С или все структурные белки вируса, обеспечивающие транс-комплементацию дефекта. Репликация Ρΐν в нормальных клетках ίη νί\Ό или ίη νίίΐΌ приводит к выходу 8Ρν, не содержащих нуклеокапсида.
- 2 016490
На фиг. 2А-2С показано, что клеточные линии, экспрессирующие белок С УВУ и белки С, ргМ и Е УВУ, могут комплементировать репликацию Р1У УВ. На фиг. 2А приведено схематическое изображение геномов УВУ и Р1У УВУ, экспрессирующего СВР. На фиг. 2В приведено схематическое изображение репликонов УЕЕУ, экспрессирующих гены Рас и С УВУ, а также сигнальный пептид для ргМ (заякоренный в мембране С; УЕЕгер/С1/Рас), или заякоренный в мембране С с 20 аминокислотными остатками ргМ (УЕЕгер/С2/Рас), или все структурные белки УВУ (УЕЕгер/С-ргМ-Е/Рас). На фиг. 2С показан выход Р1У УВ из клеточных линий, трансфицированных геномом Р1У, синтезированным ίη νίίτο. Культуральную среду меняли в указанные моменты времени и измеряли титры Р1У. В моменты времени, отмеченные стрелками, клетки пассировались с разведением 1:5.
На фиг. 3А-3В показаны кривые роста Р1У УВУ в пакующих клеточных линиях. Клетки ВНК-21, содержащие репликоны УЕЕгер/С2/Рас и УЕЕгер/С-ргМ-Е/Рас, инфицировали Р1У УВУ с множественностью инфекции (МО1), указанной в инфекционных единицах на клетку. В указанные моменты времени культуральная среда заменялась, и измерялись титры вышедших Р1У. В моменты времени, отмеченные стрелками, клетки пассировались с разведением 1:5. На фиг. ЗА показана кривая роста при множественности инфекции 10 инф. ед./кл, на фиг. ЗВ показана кривая роста при множественности инфекции 0,1 инф. ед./кл.
На фиг. 4А-4С показано, что клетки, экспрессирующие кодон-оптимизированный ген С, продуцировали Р1У УВ. На фиг. 4А показана нуклеотидная последовательность синтезированного гена. Введенные мутации обозначены строчными буквами (8ЕО ΙΌ N0: 1). На фиг. 4В приведены кривые роста Р1У УВ в пакующих клеточных линиях. Клетки ВНК-21, содержащие репликоны УЕЕгер/С2/Рас, УЕЕгер/СргМ-Е/Рас, УЕЕтер/С2ор1/Рас и УЕЕтер/СорЕртМ-Е/Рас, были инфицированы Р1У УВ при указанных значениях множественности инфекции в инфекционных единицах на клетку. В указанные моменты времени культуральная среда заменялась, и измерялись титры вышедших Р1У. На фиг. 4С показаны бляшки, образованные в пакующей клеточной линии, содержащей УЕЕтер/С2ор1/Рас УВУ и Р1У УВ через 4 дня инкубации при 37°С.
На фиг. 5А-5С показано, что Р1У ΧΥΝ вызывает распространение инфекции в пакующих клетках. На фиг. 5А приведено схематическое изображение генома Р1У ΧΥΝ и репликона УЕЕУ, экспрессирующего структурные гены вируса νΗΥ. На фиг. 5В показано, что Р1У ΧΥΝ вызывали образование фокусов клеток, позитивных на антиген νΗΥ (обнаружено с помощью антител к N81 после инфекции клеток ВНК (УЕЕгер/С*-Е*-Рас) через 70 ч инкубации). На фиг. 5С показано, что те же самые препараты Р1У \νΝ вызывали образование только единичных инфицированных клеток при инфицировании монослойных клеток Уего (выявлено через 70 ч после инфекции способом окрашивания с помощью трагаканта, аналогично фиг. 5В).
На фиг. 6А-6С показано обнаружение белка Е после выхода из клеток, инфицированных Р1У УВ и νΝ. На фиг. 6 А клетки ВНК-21 были инфицированы Р1У УВ при множественности инфекции 5 инф. ед. на клетку. Вышедшие 8УР собирались и очищались с помощью ультрацентрифугирования. Полученные образцы разделялись с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (8Ό8 РАСЕ), переносились на фильтры; белок Е детектировался с помощью моноклональных антител Э1-4С2. Дорожка 1 - культуральная среда, собранная с неинфицированных клеток, дорожка 2 - культуральная среда, собранная с клеток, инфицированных Р1У УВ, через 48 ч после инфекции; дорожка 3 - культуральная среда, собранная с клеток, инфицированных Р1У УВ, через 72 ч после инфекции, дорожка 4 - УВУ (2х107 бляшкообразующих единиц). На фиг. 6В клетки Уего были инфицированы νΝ УВ в течение 24 ч, затем порции осветленной культуральной жидкости (собранной до обнаружения лизиса клеток) разделялись с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, переносились на фильтры и к фильтрам добавлялись моноклональные антитела, специфичные к белку Е (7Н2, производство Вютейапсе). Добавление поликлональной сыворотки к этому образцу на выявило никаких неструктурных белков, ассоциированных с клетками (не показано), что подтверждает факт активной секреции белка Е. Дорожка 1 - образец VNУ, дорожка 2 культуральная среда, собранная с неинфицированных клеток, дорожка 3 - культуральная среда, собранная с клеток, инфицированных Р1У νΝ, через 48 ч после инфекции. На фиг. 6С приведены результаты Вестерн-блот-анализа, показывающие содержание белка Е во фракциях, полученных с помощью градиента сахарозы, полученных из 8УР, собранных с нормальных (не пакующих) клеток ВНК, в которые была введена РНК Р1У УВУ с помощью электропорации. Пик реактивности белка Е (32%) соответствует плотности 8УР и в соответствии с этим фактом мигрирует медленнее, чем УВУ (42%) при параллельном анализе.
На фиг. 7А-7В показано схематическое изображение плазмид, использовавшихся для выработки псевдоинфекционных вирусов (Р1У) желтой лихорадки (УВ), лихорадки Западного Нила (νΝ). На фиг. 7А показана рУВР1У, на фиг. 7В показана рVNРIУ, на фиг. 7С показана рУЕЕгер/С1/Рас, на фиг. 7Ό показана рУЕЕгер/С2/Рас, на фиг. 7Е показана рУЕЕгер/С3/Рас, на фиг. 7В показана рУЕЕгер/С*-Е*-Рас.
На фиг. 8А-8У приведены последовательности плазмид, использовавшихся в настоящей работе. На фиг. 8Α-8Ό приведена последовательность рУВР1У (8ЕО ΙΌ N0: 6), на фиг. 8Е-8Н приведена последовательность рУЕЕгер/С1/Рас (8Е0 ΙΌ N0: 7), на фиг. 81-8К приведена последовательность рУЕЕгер/С2/Рас (8Е0 ΙΌ N0: 8), на фиг. 8Ь-8О приведена последовательность рУЕЕгер/С-ргМ-Е/Рас (8Е0 ΙΌ N0: 9), на
- 3 016490 фиг. 8Р-8В приведена последовательность рУЕЕгер/С2ор1/Рас (8ЕО ΙΌ N0: 10), на фиг. 88-8У приведена последовательность рУЕЕгер/Сор!-ргМ-Е/Рас (8Е0 ΙΌ N0: 11).
На фиг. 9 показано схематическое изображение перекрывающихся областей КерНУАХ и репликона УЕЕ, использованного для транс-выработки белка С. 1В УЕЕгер/Рас-ИЫ-С* было введено тридцать шесть мутаций для уменьшения вероятности гомологической рекомбинации с фрагментом С, кодируемым геномом КерЕУАХ. 2Положения 5'- и З'-последовательностей циклизации в геноме ВерИУЛХ.
На фиг. 10 для сравнения показаны фокусы инфекции, образовавшиеся в клеточной линии, экспрессирующей белок С {ВНК(УЕЕгер/Рас-ЦЬ1-С*)}, под действием ВерИУЛХ νΝ на пассаже 0 (считая от электропорации) и пассаже 10 видно, что легко отбираются варианты, растущие лучше.
На фиг. 11 показаны результаты титрования Р1У ВерБУАХ, продуцированные клетками Уего, сертифицированными ВОЗ, содержащими кассету экспрессии С (УЕЕгер/Рас-ИЫ-С*). Несмотря на то, что получившийся титр Р1У немного ниже титра, полученного из клеток ВНК, клетки Уего позволяют многократно собрать Р1У с высоким титром, что невозможно при работе с клетками ВНК.
На фиг. 12А-12В показаны мутанты по циклизации. На фиг. 12 А показана репликация репликона \VNУ/IКΕ8-К.^ис с заменой одного основания, сопоставление мутаций последовательности циклизации показывает, что некоторые мутанты с заменой одного основания реплицируются на уровне дикого типа. На левой части фигуры показана схема экспериментального генома, и под ним - 5'- и З'последовательности циклизации. На правой части фигуры приведены уровни репликации, определенные с помощью репортера КБис, в процентном соотношении от уровня репликации дикого типа. Подчеркнутые основания обозначают мутированные основания. На фиг. 12В показана репликация репликона \VNУ/IКΕ8-К.^ис с соответствующими изменениями двух оснований (т17), полученного при комбинации т10 и т13 (раздел А) в сравнении с уровнями репликации мутантов, сочетающих мутантную последовательность циклизации с последовательностью циклизации дикого типа в любом возможном формате, а также мутант, продуцирующий неактивную полимеразу (отрицательный контроль). На левой части фигуры показана схема экспериментального генома, и под ним 5'- и З'-последовательности циклизации. На правой части фигуры приведены уровни репликации, определенные с помощью репортера КЕис, в процентном соотношении от уровня репликации дикого типа. Подчеркнутые основания обозначают мутированные основания. * Означает, что репликация не обнаружена.
Подробное описание изобретения
Безопасные и эффективные вакцины существуют лишь против некоторых заболеваний, вызываемых флавивирусами. С помощью классических способов получения инактивированной вирусной вакцины (ШУ) и живой аттенуированной вакцины (ЪАУ), использующихся для получения вакцин против ΥΕ, 1Е и ТВЕУ, до сих пор не удалось получить лицензированные продукты для профилактики заболеваний, вызванных другими флавивирусами, в частности лихорадки Денге и энцефалита Западного Нила (νΝΞ). Существуют проблемы безопасности существующих ЬАУ (остаточная вирулентность или реверсия вирулентности) и ШУ (реактогенность ввиду антигенной нагрузки и добавочных антигенов). К тому же для ШУ, как правило, требуется множественная вакцинация. Кроме того, для обоих типов вакцины существуют проблемы производства, включая необходимость избегать реверсии вирулентности во время размножения живой аттенуированной вакцины и принимая во внимание количество материала, необходимое для стимуляции сильного иммунного ответа на инактивированную вирусную вакцину, а также потребность в лабораториях с высокой степенью защиты для размножения вирулентных вирусов, необходимых для получения продуктов ШУ. Несмотря на существование перспективных кандидатов новых типов вакцин против флавивирусов, путь к их получению предусматривает необходимость решения всех этих проблем.
В целом, настоящее изобретение направлено на конструирование и использование дефектных по репликации псевдоинфекционных вирусов, принадлежащих семейству Е1аугушкае. В этой связи настоящее изобретение относится к разработке нового типа дефектных по репликации флавивирусов, также называемых КерйУАХ, сочетающих безопасность инактивированных вакцин, эффективность и масштабируемость производства живых аттенуированных вакцин. Эти флавивирусы, также называемые в настоящем изобретении псевдоинфекционными вирусами (Р1У), содержат генетически измененные геномы флавивирусов, несущие делецию большей части области, кодирующей капсид (С), таким образом, этот геном неспособен производить инфекционное потомство в нормальных клеточных линиях или вакцинированных животных. Однако эти псевдоинфекционные вирусы могут быть размножены в клетках, экспрессирующих кассеты С или С-ргМ-Е, в которых репликация вируса достигает высокого уровня. Таким образом, эти псевдоинфекционные флавивирусы неспособны индуцировать распространение инфекции в нормальных клетках ίη уйго или ίη νί\Ό по причине отсутствия транс-комплементации с белком С, следовательно, неспособны вызывать заболевание у животных.
В отличие от вакцин и способов получения этих вакцин, известных из уровня техники, настоящее изобретение относится к системе для производства псевдоинфекционных флавивирусов в промышленных масштабах, что позволит сделать такие вакцины более дешевыми и в то же время более эффективными, чем живые аттенуированные вакцины. В настоящем изобретении предлагается новый тип рекомбинантной вакцины, способной к единственному раунду репликации в иммунизированных животных
- 4 016490 или людях, ведущему к высвобождению субвирусных частиц (8ΥΡ), которые не содержат генетического материала, но могут служить эффективными иммуногенами.
В настоящем изобретении показано, что псевдоинфекционные флавивирусы могут быть получены для вируса желтой лихорадки (ΥΕν) или вируса лихорадки Западного Нила (ΥΝν). На этом основании в соответствии с настоящим изобретением было сделано предположение, что метод, описанный в настоящем изобретении, может широко использоваться для разработки вакцин против других флавивирусов. Кроме того, заражение нормальных клеток такими псевдоинфекционными флавивирусами приводило к выходу 8УР, не содержащих нуклеокапсида и генетического материала. Показано, что псевдоинфекционные флавивирусы, описанные в настоящем изобретении, не способны вызывать заболевания и, таким образом, являются безопасными. Кроме того, эти псевдоинфекционные флавивирусы оказались иммуногенными для мышей благодаря своей способности к единственному раунду репликации и высвобождению 8УР, несущих вирусные антигены. Также ΥΝ Ρίν оказались способными к профилактике смертельно опасного энцефалита у мышей при контрольном заражении ΥΝν.
Ρίν, описанные в настоящем изобретении, могут быть получены способами, обеспечивающими высокий уровень выхода продукта в клеточной культуре и неспособными вызывать заболевания у животных. Эти продукты могут вводиться в организм животных, где дефектный процесс репликации не допускает распространения инфекции и развития заболевания, но допускает продукцию 8УР, иммуногенных субъединиц флавивируса, для которых показана эффективность индукции эффективного иммунного ответа на заболевания, вызываемые некоторыми флавивирусами.
Настоящее изобретение также демонстрирует, что способ создания вакцины с применением псевдоинфекционных флавивирусов может быть использован в отношении двух флавивирусов с низкой степенью родства, переносимых комарами. Аналогичная технология может использоваться для РНК-вакцин к клещевому энцефалиту (КоДет, 2004), что указывает на то, что технология на основе Ρίν может использоваться для флавивирусов с более низкой степенью родства. Кроме того, результаты работы с РНКвакцинами против ТВЕУ показали, что кроме иммунного ответа антител на δνΡ (сходный с описанным в настоящем изобретении), введение репликационно активных геномов флавивируса в клетки вакцинированных хозяев также может вызвать Т-клеточный иммунный ответ (КоДет, 2004; АЬег1е, 2005) . Несмотря на то, что Т-клеточный иммунный ответ не анализировался в настоящей работе, было сделано предположение, что Ρίν способны вызывать Т-клеточный иммунный ответ, сходный с вызываемым вирусной инфекцией.
Несмотря на то, что вакцины, содержащие Ρίν, описанные в настоящем изобретении, основываются на той же стратегии, которая использовалась для получения РНК-вакцин против ΤΒΕν (КоДет, 2004; АЬег1е, 2005), для вакцин, содержащих Ρίν, не требуется использование генной пушки для доставки в организм животных, они легко растут в клеточных культурах и выдерживают процедуры стабилизации и хранения (лиофилизация) при тех же условиях, которые используют в настоящее время для коммерчески производимой вакцины ΥΕν 17Ό, давая, таким образом, масштабируемый и легко хранимый товарный продукт-вакцину. Предварительные исследования стабильности Κ^ρΙίνΑΧ ΥΝ показали, что хранение лиофилизированных препаратов в течение 30 дней при 4°С не оказывает заметного влияния на титр.
Для разработки оптимальных условий для быстрого роста, необходимого для эффективной транскомплементации (и, следовательно, высокого уровня выхода) псевдоинфекционных флавивирусов, в настоящем изобретении использовали клетки, экспрессирующие высокие уровни С (или С-ргМ-Е) с репликонов νΕΕν. Репликоны νΕΕν обладают меньшим цитопатическим эффектом, чем репликоны, полученные из других альфавирусов, так что в некоторых клеточных линиях позвоночных и насекомых устанавливается их постоянная репликация. Такая система подходит для получения псевдоинфекционных флавивирусов, поскольку: ί) репликоны νΕΕν высокоэффективны для синтеза гетерологичных белков, и в настоящем изобретении синтезировали С на уровне, необходимом для образования капсида вокруг генома флавивируса; ίί) не отмечено взаимодействия между репликонами νΕΕν и репликацей флавивируса (ТеЕакоуа. 2005). Кроме того, репликоны νΕΕ и геномы Ρίν ΥΕ могут реплицироваться вместе в клетках ВНК, не приводя к заметному цитопатогенному эффекту; ίίί) репликоны νΕΕν могут паковаться с высоким титром в вирионы νΕΕ, которые можно использовать для быстрого получения пакующих клеточных линий, производящих структурные белок (белки) флавивируса.
Кроме того, исследование влияния контекста экспрессии С на уровень выхода Ρίν показало, что пакующие клетки, экспрессирующие заякоренную в мембране форму С, содержащую 20 дополнительных аминокислотных остатков ргМ, производили большее количество частиц, чем клетки, экспрессирующие только С, что указывает на важность соблюдения правильной последовательности событий процессинга при сборке вириона. Неясно, почему конструкция, содержащая первые 20 аминокислот ргМ, пакуется более эффективно, однако это явление можно объяснить требованием к соблюдению специфического порядка расщепления по двум близкорасположенным сайтам расщепления (специфичных для Ν82Β/Ν83 и сигнальной пептидазы) (АапъйеЫкоу апй Сотрапк, 1994) и/или разницей в распределении и стабильности белковых продуктов гена С в двух разных контекстах. Кроме того, было показано, что коэкспрессия С с ргМ и Е (νΕΕκρ^-ρτΜ-Ε/Ραε) приводила лишь к небольшому повышению уровня выхода Ρίν по сравнению с νΕΕι^/ίν/Ραο, экспрессирующему заякоренный в мембране С, содержащий
- 5 016490 фрагмент ргМ.
При исследовании оптимизации кодонов генов С, кодируемых репликонами νΕΕν, с целью выяснения, может ли такое изменение последовательности гена С повышать уровень выхода Ρίν, не было обнаружено большой разницы в уровне выхода ΥΕ Ρίν по сравнению с клетками, не экспрессирующими кодон-оптимизированный ген С. Это наблюдение позволяет предположить, что репликоны νΕΕν, даже содержащие неоптимизированные кодоны, продуцируют С на уровне насыщения. Эти результаты подтверждаются результатами других работ, показывающими, что клеточные линии, экспрессирующие репликоны νΕΕν, кодирующие кассеты νΝν С-Е, продуцировали более высокий уровень Е, чем клетки, инфицированные νΝν. Несмотря на неспособность транс-экспрессируемого оптимизированного гена С к повышению уровня выхода ΥΕ Ρίν, в клетках, содержащих репликон νΕΕν, экспрессирующий Сор!, наблюдался цитопатический эффект и образование бляшек при инфекции ΥΕ Ρίν. Таким образом, инфекция Ρίν в клетках Сор! оказывается еще более сходной с инфекцией, вызываемой вирусом, способным к репликации. Дополнительным преимуществом использования репликонов νΕΕν, кодирующих ген Сор! ΥΕν, в производстве псевдоинфекционных флавивирусов является повышение уровня безопасности, поскольку изменение в кодонах снижает вероятность гомологичной рекомбинации с геномом псевдоинфекционного флавивируса. Кроме того, последовательность циклизации гена Сор! также подвергалась изменениям (в настоящем изобретении описано для области, кодирующей ген С νΝν в клетках ВНК (VΕΕр/С*-Ε*-Ρас)) для снижения вероятности рекомбинации, в результате которой может получиться реплицирующийся флавивирус, кодирующий С. На сегодняшний день ни одна из систем νΝ и ΥΕ Ρίν, описанных в настоящем изобретении, не продуцировала реплицирующихся флавивирусов, которые могут быть обнаружены в клеточной культуре или у высоковосприимчивых животных. Кроме того, эксперименты ίη у1уо показали, что как ΥΕ, так и νΝ Ρίν оказались безопасными и не вызывали заболевания даже после интрацеребральной инокуляции 3-4-дневных мышат самой высокой дозой Ρίν. Тем не менее, νΝ Ρίν были способны индуцировать высокий титр нейтрализующих антител и предохраняли мышей от инфекции способных к репликации νΝν.
Кроме того, гепатит С попадает наравне со СПИДом в категорию инфекций, являющихся причиной наибольшей заболеваемости и смертности, против которых на сегодняшний день не существует вакцин. В Японии и Корее вклад вируса гепатита С (НСУ) превышает вклад гепатита В в развитие гепатоцеллюлярной карциномы, одного из наиболее распространенных типов раковых заболеваний и распространенной причины смерти от заболевания печени. Это соотношение, скорее всего, будет распространяться шире по азиатским странам и другим развивающимся странам из-за возрастающего преобладания НСV одновременно с эффективной иммунизацией против гепатита В. В некоторых районах Египта и других стран гепатит С является чрезвычайно распространенной инфекцией, вероятно отчасти по причине традиционных практик здравоохранения и/или по причине внедрения опасных западных технологий в прошлом (таких как перенос вируса с кровью при использовании одной иглы во время публичных кампаний по охране здоровья, направленных на борьбу с шистосомиазом).
Во многих развивающихся странах, где частота заболеваний раком печени и циррозом высока, не существует эффективного контроля переноса гепатита С при переливании крови. Гепатит С также представляет собой большую проблему для здравоохранения в США, где проживают около 4 млн носителей НСV, многие из которых находятся в группе риска смерти по причине терминальной стадии заболевания печени или рака печени. На данный момент подсчитано, что в США ежегодно от гепатита С умирает 8000-10000 человек. В течение следующих 10-20 лет в отсутствие новых терапевтических или профилактических подходов, возможно, это число утроится, превзойдя количество смертей от СПИДа.
Однако не существует вакцины для профилактики этой инфекции, в то время как попытки (как национальные, так и международные) разработки вакцины сильно затруднены из-за очевидных технических затруднений, недостаточного интереса к разработке вакцин со стороны фармацевтических компаний, а также отсутствия интереса со стороны финансирующих организаций. Так же, как и в случае многих других инфекционных заболеваний, малоимущие слои населения оказываются в группе наибольшего риска развития серьезного заболевания печени или смертности по причине гепатита С.
На сегодняшний день попытки создания эффективной вакцины против инфекции НСV не привели к успеху. Однако в течение последних нескольких лет область НСУ начала быстро развиваться, в результате чего в настоящее время этот вирус реплицируется в культуре с достаточно высоким титром, достигающим 106 инф. ед./мл. Между геномом НСУ и геномами других флавивирусов, таких как ΥΕ, ΙΕν, ТВЕ и других, существует ряд очевидных сходных черт. Следовательно, стратегия разработки дефектных по репликации флавивирусов может быть применена к членам не только рода Е1ау1У1ги8, но также и рода Нерас1У1ги8, включая НСУ. Капсидный белок НСУ может быть получен с помощью рекомбинантного альфавирусного репликона (на основе 8ίΝν, νΕΕν, ΕΕΕν и других) в различных клеточных линиях, включая клетки Ний-7 и Ний-7.5, обладающие известной восприимчивостью к инфекции НСУ. Геномы НСУ, дефектные по репликации, не содержащие гена, кодирующего капсид, могут быть трансфицированы в клеточную линию, продуцирующую капсид, и упакованы в инфекционные частицы, содержащие капсид.
Последующие раунды инфицирования, необходимые для масштабного производства, также могут
- 6 016490 проводиться на этих клетках. Однако ίη νίνο в наивных гепатоцитах (а также, возможно, и в других типах клеток), геномы НСУ, не содержащие полного гена капсида или вообще не содержащие гена капсида, будут производить только неструктурные вирусные белки, а также гликопротеины Е1 и Е2. Эти белки будут презентироваться иммунной системе ί) после протеасомной деградации; ίί) на поверхности клеток; ίίί) в форме вирусоподобных частиц с оболочкой, содержащей Е1 и Е2. Отсутствие капсида будет препятствовать распространению вируса, таким образом, присутствие вируса будет ограничиваться клетками, получившими дозу вакцины.
Таким образом, в настоящем изобретении показано, что псевдоинфекционные флавивирусы, не содержащие капсида: ί) способны вызывать распространение инфекции в клеточных линиях, экспрессирующих капсид или все структурные гены флавивируса; ίί) Р1У оказались неспособными к распространению инфекции в нормальных клетках; ίίί) Р1У продуцировали 8УР, содержащие белок Е, при инфекции нормальных клеток; ίν) Р1У продемонстрировали высокий уровень безопасности для животных; ν) Р1У обеспечивали профилактику мышей от последующей флавивирусной инфекции. В целом, настоящее изобретение показывает, что флавивирусные Р1У могут представлять собой безопасную, мощную и эффективную основу для создания вакцин против инфекций, вызываемых флавивирусами, и инфекций, вызываемых вирусами, сходными с ΡΊανίνίπίδ.
Настоящее изобретение относится к разработке дефектных по репликации псевдоинфекционных Иацщшбае, включающих делецию в нуклеотидной последовательности, кодирующей капсидный белок (С) таким образом, что делеция не нарушает последовательность РНК, необходимую для циклизации генома, сигнальную последовательность для белка ргМ, необходимую для правильного созревания белка ргМ/М или их комбинацию, где Наубзпбае реплицируются исключительно в клетках, экспрессирующих принадлежащие вирусу семейства Е^Мпбае белок С или С, ргМ, белок оболочки, мутантный белок С, мутантный ргМ, мутантный белок оболочки или их комбинацию. Как правило, Наупзпбае включает вирус, принадлежащий к роду Εΐανίνίπίδ. НерасМтик или РейМтик, или химеры вышеупомянутых вирусов, полученные путем обмена кассет ргМ-Е других вирусов на кассеты ргМ-Е псевдоинфекционных Е1ацщш6ае. Список вирусов, принадлежащих к роду Е^Мтик, может включать в себя, но ими не ограничивается, вирус желтой лихорадки, вирус лихорадки Западного Нила, вирус Денге, вирус клещевого энцефалита, вирус энцефалита Сент-Луиса, вирус японского энцефалита, вирус энцефалита долины Мюррей. Кроме того, пример вирусов, принадлежащих к роду НерасМтик, включает, но им не ограничивается, вирус гепатита С, а примеры вирусов, принадлежащих к роду РейМтик, включают, но ими не ограничиваются, вирусную диарею коров, вирус свиной лихорадки или вирус холеры свиней.
В случае флавивируса, делетированная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок С флавивируса, может кодировать аминокислотные остатки 26-100 белка С или комбинацию аминокислотных остатков, находящихся в пределах аминокислотных остатков 26-100 белка С. Такие комбинации могут включать, но ими не ограничиваются, аминокислотные остатки 26-93, 31-100 или 31-93. Средний специалист в данной области может по такому принципу делетировать нуклеотидную последовательность белка С других вирусов, принадлежащих семейству Е^Мпбае, или других вирусов со сходной организацией генома. В общем и применительно ко всем вирусам, делетированный ген заменяют геном, кодирующим маркерный белок или антиген. Пример маркерного белка включает, но им не ограничивается, зеленый флуоресцентный белок.
Настоящее изобретение также относится к разработке системы культуры клеток, экспрессирующих белок С или С, ргМ, белок оболочки, мутантный белок С, мутантный ргМ, мутантный белок оболочки или их комбинацию, принадлежащие вирусу семейства Е^Мпбае, эффективно поддерживающих размножение вышеописанных дефектных по репликации Паубзпбае в соответствующих условиях. Для этой цели клетки, экспрессирующие белки дикого типа или мутантные белки Е1ацщшбае, могут быть получены с помощью репликонов, полученных из вирусных векторов генно-инженерными методами.
В общем, ген, кодирующий белок (белки) вируса семейства Е1ацщшбае, в репликоне заменяют на кодон-оптимизированный вариант гена, кодирующего белок или белки вируса семейства Е^Мпбае, таким образом, что эта замена уменьшает способность генов, кодируемых клеточной линией, рекомбинировать с геномом псевдоинфекционного вируса семейства Наубзпбае и/или увеличивает производство псевдоинфекционного вируса семейства Е1ацщшбае.
Например, такие репликоны могут экспрессировать белок С, содержащий мутации по крайней мере в 36 положениях нуклеотидов в гене, кодирующем белок С вируса семейства Е1ацщшбае. Репликон может экспрессировать белок С в репликоне, который содержит неприродную последовательность циклизации таким образом, что присутствие последовательностей циклизации снижает вероятность продуктивной рекомбинации дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса с природными вирусами. Кроме того, репликон может экспрессировать белки, содержащие измененные нуклеотидные последовательности, кодирующие укороченную область соединения С-ргМ таким образом, что присутствие таких измененных последовательностей повышает уровень выхода дефектных по репликации псевдоинфекционных вирусов, в клеточной культуре, уровень выхода 8УР, содержащих ргМ/Е, ίη νίνο или их комбинации.
Далее репликоны, экспрессирующие белки Е1ацщшбае, вводят в клетку путем трансфекции РНК
- 7 016490 репликона, синтезированной ίη νίίτο, путем трансфекции плазмидной ДНК, предназначенной для синтеза функциональных альфавирусных репликонов с промоторов, специфичных для клеточной РНКполимеразы II, или путем инфекции альфавирусными репликонами, упакованными в альфавирусные структурные белки. Вирусные векторы, используемые в настоящем изобретении, могут представлять собой альфавирусы. Типичные примеры таких альфавирусов могут включать, но ими не ограничиваются, вирус венесуэльского энцефалита лошадей (УЕЕУ), вирус Синдбис, вирус восточного энцефалита лошадей (ЕЕЕУ), вирус западного энцефалита лошадей (\УЕЕУ) или вирус лихорадки реки Росс (Κοββ ВКсг νίπιβ).
Настоящее изобретение также относится к способу получения дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства Е^Мпбае, включающему получение дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства Е^Мббае, содержащего делецию в гене капсида таким образом, что делеция не нарушает последовательность РНК, необходимую для циклизации генома, сигнальную последовательность для белка ргМ, необходимую для правильного созревания белка ргМ/М или их комбинацию; получение клеточной линии, экспрессирующей принадлежащие вирусу семейства Б1а\'бзпбае белок С или С, ргМ, белок оболочки, мутантный белок С, мутантный ргМ, мутантный белок оболочки или их комбинацию, где клеточная линия синтезирует высокий уровень белков, необходимых для размножения дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства Е^Мпбае; и инфицирования клеточной линии псевдоинфекционным вирусом семейства Ек-ινί νί Нбае, получая, таким образом, дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Б1а\'бзпбае. Все остальные аспекты, касающиеся типа вирусов, положения делеции в гене капсида, способа получения клеточной линии, экспрессирующей мутантные белки и белки дикого типа Е^Мпбае, типа репликона и мутаций внутри репликонов и модификаций генов, кодирующих мутантные белки и белки дикого типа Е^Мпбае, такие, как описано выше.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Е^Мпбае, полученный способом, описанным выше. Настоящее изобретение также относится к способу защиты индивида от инфекций, возникающих при контакте с Е^Мпбае, путем введения в организм индивида иммунологически эффективного количества фармацевтической композиции, описанной в настоящем изобретении, при этом композиция индуцирует в организме индивида иммунный ответ на Е^Мпбае, защищая таким образом индивида от инфекций. Эта композиция может доставляться в организм внутрибрюшинно, чрескожно, подкожно, внутримышечно, перорально или интраназально. Кроме того, индивидом, для которого введение такой композиции может быть эффективно, является человек или животное.
При использовании в настоящем описании единственного числа следует понимать, что его использование подразумевает и множественное число. При использовании в формуле изобретения в сочетании со словом содержащий единственное число также включает и множественное. При употреблении в настоящем описании слова другой оно может обозначать, по крайней мере, второй, тот же самый или отличный элемент пункта формулы изобретения или его компонентов. При употреблении в настоящем описании под термином Е^Мббае понимают род Ρΐηνίνίπιβ. НерасМтив и Рев1Мги5. Примеры вирусов, принадлежащих роду Е^Мтив, включают, но ими не ограничиваются, вирус желтой лихорадки, вирус лихорадки Западного Нила, вирус Денге, вирус клещевого энцефалита, вирус энцефалита СентЛуиса, вирус японского энцефалита или вирус энцефалита долины Мюррей. Также примеры вирусов, принадлежащих роду НерасМтив, включают, но ими не ограничиваются, вирус гепатита С, а примеры вирусов, принадлежащих роду Рев1Мги5, включают, но ими не ограничиваются, вирусную диарею коров, вирус свиной лихорадки или вирус холеры свиней.
Кроме того, несмотря на то, что в настоящем изобретении описано конструирование и применение дефектного по репликации псевдоинфекционного Е^Мпбае, средний специалист в данной области может, используя те же принципы, сконструировать химеры, содержащие другие вирусы семейства Е^Мпбае, или сконструировать химеры путем обмена кассет ргМ-Е между вирусами, принадлежащими к Е^Мпбае, или другими сходными вирусами и вирусами, принадлежащими к Б1а\з\зпбае.
Фармацевтические композиции, содержащие дефектные по репликации псевдоинфекционные вирусы семейства Е^Мпбае, описанные в настоящем изобретении, могут использоваться одновременно или последовательно в сочетании друг с другом или с другими фармацевтическими композициями. Эффект совместного приема таких композиций состоит в защите индивида от инфекций, вызванными такими вирусами, а также других заболеваний, лечение которых с помощью вакцин может быть эффективно. Композиция, описанная в настоящем изобретении, другая композиция или их комбинации может приниматься независимо друг от друга, системно или местно, любым способом, известным из уровня техники, как, например: подкожно, внутривенно, парентерально, внутрибрюшинно, чрескожно, внутримышечно, наружно, энтерально, ректально, назально, защечно, вагинально, путем ингаляции спрея, с помощью насоса, или содержаться в трансдермальном пластыре или импланте. Состав композиции, описанной в настоящем изобретении, может включать общепринятые нетоксичные, физиологически или фармацевтически приемлемые носители, подходящие для способа введения и хорошо известные среднему специалисту
- 8 016490 в данной области.
Композиция, описанная в настоящем изобретении, другая фармацевтическая композиция или их комбинации может вводиться независимо один или более раз с целью достижения, закрепления и улучшения терапевтического эффекта. Определение дозы, а также содержания подходящей дозы одной или обеих композиций в одной или нескольких дозах для приема находится в пределах компетенции специалиста. Подходящая доза рассчитывается исходя из состояния здоровья пациента, степени защиты пациента от флавивирусных инфекций, способа применения и используемой формулы.
Нижеследующие примеры приведены с целью иллюстрации различных вариантов осуществления изобретения и не предназначены для ограничения настоящего изобретения каким-либо образом. Специалисту в данной области будет понятно, что настоящее изобретение хорошо приспособлено для выполнения поставленных задач и достижения упомянутых в настоящем изобретении целей и преимуществ, а также подразумеваемых задач, целей и преимуществ. Специалист в данной области может принимать решения, связанные с изменениями и другими способами употребления, охватываемыми сущностью изобретения, определяемыми рамками формулы изобретения.
Пример 1. Культуры клеток.
Клетки ВНК-21 были предоставлены Полом Олайво (Раи1 Οΐίνο, АакЫпдЮп Ипуегайу, 81. Ьошк, Мо). Клетки растили в минимальной среде α (αΜΕΜ) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЕВ8) и витаминов. Клетки Уего, сертифицированные ВОЗ (АНО), были предоставлены д-ром Стивом Уайтхедом (Ότ. 81ете Аййейеаб, ΝΙΗ) . Клетки Уето растили в среде ΜΕΜ, содержащей 6% ЕВ8.
Пример 2. Плазмидные конструкции.
Для получения плазмидных конструкций использовались стандартные приемы работы с рекомбинантной ДНК. Схематическое изображение использовавшихся плазмид приведено на фиг. 7А-7Е. Карты и последовательности плазмид приведены на фиг. 8А-8Е. Родительская низкокопийная плазмида ρΑΟΝΚ/ΡΕΥΡ-17Όχ, содержащая инфекционную кДНК генома штамма 17Ό УЕУ, была описана ранее (ВтебепЬеек е! а1, 2003); плазмида была предоставлена д-ром Чарльзом М. Райсом (Ότ. Сйат1е8 М. Ктсе, Коске£е11ет Ипщегкйу, №\ν Уотк, Ν.Υ.). рУРР1У содержала дефектный геном УРУ (УЕ Р1У), в котором фрагмент, кодирующий аминокислотные остатки 26-93 гена капсида УЕ, был заменен на кодоноптимизированный ген СЕР, полученный из ρΕΟΕΡ-Ν1 (производство С1оШес11). Геном ΑΝ Р1У (ρΑΝΡΙΥ) был получен из инфекционной кДНК Техак 2002 (К.о881 е! а1., 2005) путем слияния кодона 30 гена С с кодоном 101 гена С (см. фиг. 5А). Плазмиды рУЕЕгер/С1/Рас, рУЕЕгер/С2/Рас и рУЕЕгер/СргМ-Е/Рас (фиг. 2А) кодировали двойные субгеномные репликоны УЕЕУ, в которых первый субгеномный промотер регулировал транскрипцию РНК, содержащей 5'-ИТК. УЕЕУ 268 РНК, за которой следовали последовательности, соответствующие нуклеотидам 119-481, 199-541 и 119-2452 генома УЕУ в указанном порядке. Второй субгеномный промотер регулировал экспрессию гена пуромицинацетилтрансферазы (Рас), продукт которого делает клетки резистентными к остановке трансляции, вызванной пуромицином (Риг). Нецитопатические репликоны УЕЕУ, экспрессирующие кассету С-ргМ-Е ΑΝΧ {полученные из репликона вируса Синдбис (8с1ю11е е! а1., 2004)}, слитую с геном Рас (обозначенную рУЕЕгер/С*-Е*-Рас), были получены из нецитопатического репликона УЕЕ (Ρеΐ^акονа е! а1., 2005); последовательность, кодирующая Е, была слита с геном Рас посредством линкера, состоящего из первых 9 кодонов N81 и последних 25 кодонов Ν82Β, за которыми следовали 2 кодона N83, слитых напрямую с ЕМОУ 2Α (см. фиг. 5А). Кодон-оптимизированная последовательность, кодирующая капсид УЕУ 17Ό и первые 20 аминокислотных остатков ргМ, была получена с использованием данных частот кодонов, описанных ранее (Наак е! а1., 1996). Этот ген был синтезирован с помощью полимеразной цепной реакции из перекрывающихся синтетических олигонуклеотидов.
Амплифицированный фрагмент секвенировали перед клонированием в кассеты экспрессии УЕЕтер/С2ор1/Рас и УЕЕтер/Сор1/ргМ-Е/Рас. Последние репликоны имели строение, сходное с рУЕЕгер/С2/Рас и рУЕЕгер/С-ргМ-Е/Рас, но содержали кодон-оптимизированную последовательность, представленную на фиг. 4А.
Кроме того, был получен химерный АХ-ВерПУАХ, экспрессирующий ргМ-Е 1ЕУ. Это было достигнуто путем замены генов ргМ и Е штамма Накаяма 1ЕУ в Α ВерНУАХ, кодирующем геном АNУ. Обмен генами производился путем прямого слияния последнего кодона процессированного белка С АNУ с первым кодоном последовательности, кодирующей ргМ 1ЕУ (штамм Накаяма). Эта же схема слияния была применена на 3'-конце кассеты, где последний кодон белка Е 1ЕУ сливался напрямую с первым кодоном Ν81 АNУ. Слияние производили на плазмиде ВАС, кодирующей полную последовательность кДНК ВерйУАХ ΑΝ, ограниченную промотором Т7 и рибозимом, и РНК, полученная с этой ДНК ВАС, была введена в клетки ВНК(УЕЕгер/Рас-иЬ1-С*). Полученный ВерНУАХ (обозначенный 1Е КерНУАХ) формировал фокусы распространения инфекции в ВНК(УЕЕгер/Рас-иЬ1-С*). Что касается ΑΝ К.ер11УАХ, фокусы, формирующиеся на этой клеточной линии, имели меньший размер, чем фокусы, продуцируемые полностью инфекционной химерой АХУ-1ЕУ. 1Е ВерНУАХ росли до значений титров, приблизительно в 10 раз ниже титров ΑΝ ВерНУАХ, титр в ВНК(УЕЕгер/Рас-иЬ1-С*) достигал 106 ед./мл. Как и ожидалось, 1Е ВерНУАХ связывается с моноклональными антителами, специфичными к !Е, и предполагается, что как и химерные флавивирусы 1Έ РерйУАХ будет индуцировать высокие титры
- 9 016490 антител, нейтрализующих 1ЕУ, и, как следствие, предохранять от 1Е.
Пример 3. Транскрипция РНК.
Плазмиды очищали путем центрифугирования в градиенте СзС1. Перед реакцией транскрипции плазмиды линеаризовали с помощью Х1юГ (для рУТР1У) или М1иГ (для репликона УЕЕ и плазмид, кодирующих хэлпер УЕЕ) или 8\ναΙ (для ОТЫРГУ). РНК синтезировали с помощью 8Р6 или Т7 РНКполимеразы в присутствии аналога кэпа. Выход и целостность транскриптов анализировали методом гель-электрофореза в неденатурирующих условиях. Аликвоты транскрипционной реакции использовали для электропорации без дополнительной очистки.
Пример 4. Трансфекции РНК и анализ репликации РГУ.
Электропорация клеток ВНК-21 проводили в условиях, описанных ранее (и1)с51гот с1 а1., 1991). Для получения пакующих клеточных культур в среду добавляли Риг в концентрации 10 г/мл через 24 ч после электропорации репликонов УЕЕУ. Трансфекцию синтезированного ίη νίΐτο генома УТ РГУ проводили 5 дней спустя, когда клетки, содержащие репликон, возобновляли результативный рост. Образцы собирали в моменты времени, указанные на чертежах, путем замены среды на такую же среду, содержащую Риг. Во многих экспериментах клетки, секретирующие РГУ, рассаживали по достижении конфлюэнтного монослоя.
Репликоны УЕЕУ упаковывали в инфекционные вирионы УЕЕУ путем коэлектропорации репликона, синтезированного ίη νίΐτο, и 2 РНК-хэлперов ^ο^ονα с1 а1., 2006) в клетки ВНК-21. Вирусные частицы, содержащие репликон, собирали через 24 ч после трансфекции и использовали для инфицирования наивных клеток ВНК-21 с последующей селекцией Риг. В случае ОТЫ РГУ, РНК РГУ, синтезированную ίη νίΐτο, трансфицировали в клетки ВНК, содержащие репликон УЕЕгер/С*-Е*-Рас, экспрессирующий ОТЫ С, ргМ и Е и Рас [клетки ВНК(УЕЕгер/С*-Е*-Рас)]. Схема генома УЕЕгер/С*-Е*-Рас представлена на фиг. 5А. Собранные РГУ пассировались на эти клетки с использованием стандартных способов (Κοβδί еΐ а1., 2005).
Пример 5. Измерение титров УТ РГУ.
Для измерения титра вышедших УТ РГУ, клетки ВНК-21 рассаживали в 6-луночные планшеты производства ί.'ο8ΐ3Γ в концентрации 5х105 клеток на лунку. Через 4 ч клетки инфицировали различными разведениями упакованных репликонов и через 1 ч инкубации при 37°С и 5% СО2 клетки покрывали 2 мл среды МЕМ, содержащей 10% ЕВ8. Количество инфицированных клеток определяли путем подсчета клеток, дающих положительную реакцию на СЕР под инвертированным УФ-микроскопом. Долю инфицированных клеток от исходного количества определяли путем подсчета флуоресцирующих клеток в определенной области поля зрения микроскопа. Подсчеты по 5 различным полям усредняли и пересчитывали для титра, соответствующего каждому последовательному разведению. В последующих экспериментах титры также измеряли с помощью анализа бляшек на монослойных клетках ВНК-21, несущих репликон УЕЕ^ер/Сοрΐ-р^М-Е/Рас, в условиях, описанных ранее (Ьетт еΐ а1., 1990), за исключением того, что клетки инкубировали под слоем агарозы в течение 5 дней для развития бляшек, затем фиксировали 2,5%-ным раствором формальдегида и окрашивали кристаллическим фиолетовым.
Пример 6. Пассирование ΥΕ РГУ.
Пакующие клеточные линии получали с помощью трансфекции синтезированной ίη νίΐτο РНК репликона УЕЕУ или инфекции клеток теми же репликонами, упакованными в структурные белки УЕЕУ, с множественностью инфекции (МОГ) 10 инф. ед. на клетку. После селекции Риг клетки инфицировали ΥΕ РГУ при различных МОГ. Образцы собирали в моменты времени, указанные на чертежах, путем смены среды.
Пример 7. Анализ продукции ΥΕ 8УР.
Клетки ВНК-21 рассаживали в концентрации 2х 106 клеток на 100-миллиметровую чашку. После 4 ч инкубации при 37°С клетки инфицировали ΥΕ РГУ с МОГ, равной 10 инф. ед. на клетку, и затем инкубировали в течение 24 ч в 10 мл МЕМ с добавлением 10% ЕВ8. Далее среду заменяли на 10 мл бессывороточной среды УР-8Е (производство ^Φο^η), которую меняли раз в 24 ч для анализа выхода 8УР. Собранные образцы УР-8Е очищали путем центрифугирования на низких скоростях (5000 об/мин, 10 мин, 4°С) и затем концентрировали путем ультрацентрифугирования через 2 мл 10%-ного раствора сахарозы в РВ8, в роторе 8ОТ-41 при 39000 об/мин, 4°С, в течение 6 ч. Осадочный материал растворяли в наносном буфере для δΌδ-полакриламидного гель-электрофореза в отсутствие β-меркаптоэтанола (чтобы сохранить сайт связывания с моноклональными антителами Ό1-4Ο2) и анализировали далее методом Вестернблоттинга. После переноса белков нитроцеллюлозные мембраны обрабатывали с моноклональными антителами Ό1-4Ο2 и вторыми антителами осла против мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена (НКР) (производство 8ао1а Стих В^οΐесйο1οду). Активность НКР определяли с использованием реагента Люминола для Вестерн-блотов согласно указаниям производителя (8ао1а Стих В^οΐесйηο1οду). Чтобы получить образцы, служащие положительным контролем, ΥТУ (2х108 бляшкообразующих единиц) центрифугировали сквозь 10%-ную сахарозную подушку, как описано ранее для 8УР.
Для анализа ΥТУ 8УР методом градиента сахарозы клетки ВНК-21 электропорировали синтезированной ίη νίΐτο геномной РНК ΥΕ РГУ. Через 24 ч после трансфекции полную среду МЕМ заменяли на
- 10 016490 среду УР-8Р, которую собирали через 24 ч. К этому времени более 95% клеток имели положительную реакцию на СРР и не проявляли никаких признаков цитопатического эффекта. Собранные образцы очищали центрифугированием на низких скоростях (5000 об/мин, 10 мин, 4°С) и затем концентрировали центрифугированием в течение ночи в роторе 8ν-28 при 25000 об/мин, 4°С. Полученный осадок суспендировали в буфере ΤΝ (10 нМ Тп5-НС1 (рН 7,5), 100 мМ ЫаС1, 0,1 % В8А) и проводили дальнейший анализ по описанной ранее методике (8ο1ι;·ι1ίο1ι е! а1., 1996).
Вкратце, образцы объемом 0,5 мл помещали в прерывистый сахарозный градиент (1,5 мл 50%, 1,5 мл 35% и 1,5 мл 10%-ного раствора сахарозы в буфере РВ8). Центрифугирование проводили в роторе 8\У-55 при 45000 об/мин и 4°С в течение 1 ч на ультрацентрифуге Орйша МАХ иИтасепйтРцде (производство Весктап). Осадки растворяли в буфере для нанесения на 8И8-полиакриламидный гель для проведения электрофореза без β-меркаптоэтанола (чтобы сохранить связывание с моноклональными антителами Ό1-4Ο2) и анализировали методом Вестерн-блоттинга. После переноса белков, нитроцеллюлозные мембраны обрабатывали с моноклональными антителами Ό1-4Ο2 и вторыми антителами осла против мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена (НИР), приобретенными у 8ап1а Сти/ Вю1ес11по1оду. Активность НИР определяли с помощью реагента люминола для Вестерн-блотов согласно рекомендациям производителя (8ап1аС’гих Вю1ес1шо1оду). Параллельный градиентный анализ проводили на УРУ (2х108 бляшкообразующих единиц, РРИ), подвергнутом процедурам, описанным выше для 8УР, полученных из УРУ-Р1У.
Пример 8. Анализ νΝ Р1У.
Титры νΝ Р1У определяли путем инфицирования монослойных клеток Уего последовательными разведениями вируса, фиксацией спустя 24 ч и иммуногистохимического окрашивания поликлональной гипериммунной мышиной асцитной жидкостью, специфичной к νΝν, как описано ранее (Ио551 е! а1., 2005). Инфицированные клетки подсчитывали и использовали для определения титра. Чтобы оценить способность νΝ Р1У к формированию фокусов на клетках Уего или ВНК(УЕЕгер/С*-Е*-Рас), монослойные культуры инфицировали разведениями νΝ Р1У, покрывали полутвердым трагакантом, инкубировали при 37°С, затем фиксировали и окрашивали моноклональными антителами, специфичными к νΝν N81 (предоставлены Е. КошкЫ, КоЬе, 1арап) как описано выше.
Пример 9. Исследования безопасности Р1У.
Безопасность Р1У исследовали путем инокуляции различных доз вируса (инфекционные кДНК, полученные из родительских инфекционных штаммов УРУ 17Ό или νΝν ТХ02) или Р1У мышам в возрасте 3-4 дней (аутбредные 8\νί55 VеЬ5ΐе^, Наг1ат) интракраниально (ΐ.ο) (объем 20 мл) или самкам мышей в возрасте 4-5 недель (аутбредные 8\νί55 VеЬ5ΐе^, Наг1ат) внутрибрюшинно (1.р.) (объем 100 мл). За признаками заболевания и смертностью мышей наблюдали в течение 14 дней, агонизирующих животных, которые очевидно не доживали до следующего дня, умерщвляли гуманным способом и засчитывали как мертвых на следующий день.
Пример 10. Исследования действенности и эффективности Р1У νΝ.
Выбранных животных, инокулированных νΝ Р1У, как описано выше, умерщвляли и спускали кровь через 21 день после инокуляции. У животных собирали сыворотку, смешивали и проверяли на способность ослаблять образование фокусов νΝν на монослойных клетках Уего, используя методы, описанные выше. Остальных животных инокулировали 1000 инф. ед. (определено с помощью теста на образование фокусов на клетках Уего), что соответствовало примерно 100 ЬП50 штамма ΝΏ99 νΝν (Х1ао е! а1., 2001), и животных наблюдали в течение 14 дней, как описано выше.
Пример 11. Кассеты, экспрессирующие как УРУ С, так и УРУ С-ргМ-Е, могут комплементировать репликацию УРУ Р1У.
Общая стратегия комплементации дефекта, вызванного делецией С в геноме флавивируса, приведена на фиг. 1. Эта стратегия основана на получении геномов с отсутствующим геном С и размножении этих псевдоинфекционных вирусных геномов (Р1У-геномы) в клетках, экспрессирующих С (или все вирусные структурные белки), но не в нормальных клетках. Репликация в последних клетках, продуцирующих невирусные структурные белки, необходимые для транс-комплементации дефекта генома Р1У, приводит к высвобождению 8УР, содержащих критический защитный иммуноген Е, но не содержащих нуклеокапсид, содержащий С и генетический материал.
Был создан рекомбинантный геном УРУ (геном УРУ Р1У), содержащий СРР вместо аминокислотных остатков 26-93 С, клонированный в той же рамке считывания, что и остальная часть полипептида (фиг. 2 А). Экспрессия СРР предоставляет удобный способ экспериментального определения титров Р1У, содержащих геном. Ожидалось, что делеция последовательности, кодирующей С, из этого генома Р1У ликвидирует способность С к образованию функционального нуклеокапсида, но не повлияет на продукцию функциональных форм ргМ и Е. Таким образом, клетки, экспрессирующие этот геном, продуцирующие флуоресценцию СРР, неспособны к высвобождению инфекционного вируса. Однако ожидалось, что пакующие клетки, экспрессирующие С на высоком уровне, будут производить инфекционное потомство.
Для быстрого получения клеточных линий для эффективной продукции Р1У использовали систему
- 11 016490 экспрессии, основанную на геноме вируса венесуэльского энцефалита лошадей (УЕЕУ) (репликоны) (Рейакоуа с1 а1., 2005). Репликоны УЕЕУ обладают меньшим цитопатическим эффектом, чем репликоны, полученные из других альфавирусов, и в некоторых клеточных линиях, полученных от позвоночных и насекомых, легко устанавливается их персистирующая репликация. Кассеты экспрессии были разработаны в виде двойных субгеномных конструкций (см. фиг. 2В), в которых один из субгеномных промоторов регулировал экспрессию Рас, предоставляя, таким образом, эффективный способ элиминации клеток, не содержащих репликона УЕЕУ, экспрессирующего Рас, из трансфицированных культур. Второй субгеномный промотор регулировал транскрипцию субгеномной РНК, кодирующей структурные белки УЕУ. Для определения наиболее эффективных пакующих кассет репликоны УЕЕУ, кодирующие ί) УЕУ С с сигнальным пептидом ргМ, также известный как заякоренный в мембране С (ЫибеиЬасй аиб К1се, 2001) (УЕЕгер/С1/Рас), или и) С с сигнальным пептидом и 20 аминокислотными остатками ргМ (УЕЕгер/С2/Рас), или ΐΐΐ) все структурные белки ΥΕΎ (УЕЕгер/С-ргМ-Е/Рас). Дизайн этих кассет основывался на сохранении в кассетах, кодирующих С, сигнального пептида, предположительно необходимого для направления С в надлежащий клеточный компартмент.
РНК репликонов УЕЕУ, синтезированные ίη νίίτο, трансфицировали в клетки ВНК-21, и стабильные клеточные линии, устойчивые к Риг, селектировались в течение 4-5 дней в среде, содержащей Риг. В течение первых 2-3 дней после трансфекции репликация полученной из РНК УЕЕУ приводила к остановке роста, затем, как было описано ранее (Реί^акονа еί а1., 2005), эффективность репликации снижалась, и клетки возобновляли рост. Полученные Риг-резистентные культуры трансфицировали синтезированными ίη νίίτο РНК репликонов ΥΕ Р1У и определяли титры вышедших инфекционных частиц, содержащих СЕР-экспрессирующие геномы, в различные моменты времени после инфекции (фиг. 2С). Как оказалось, присутствие двух различных реплицирующихся РНК (специфичных для ΥΕΎ и УЕЕУ) в клетках ВНК-21 не приводило к цитопатическому эффекту (СРЕ) и обуславливало как резистентность к Риг, так и высокий уровень экспрессии СЕР, что подтверждало репликацию обоих репликонов УЕЕУ и РНК ΥΕ Р1У. Как показано на фиг. 2С, культуры, экспрессирующие оба этих маркерных гена, были способны к росту и требовали пересадки (в разведении 1:5 каждые 4 дня), чтобы предотвратить образование конфлюэнтного монослоя. Результаты экспериментов, представленные на фиг. 2, показывают, что все три репликона УЕЕУ оказались способны продуцировать ΥΕΥ С на уровне, достаточном для образования инфекционных Р1У; наивные клетки ВНК-21, трансфицированные РНК ΥΕ Р1У в отсутствие репликонов УЕЕУ, не продуцировали инфекционных частиц (не показано). Однако клетки, экспрессирующие эти пакующие кассеты, различались по своей способности продуцировать Р1У. Конструкции, экспрессирующие С с сигнальным пептидом ргМ (заякоренный в мембране С; УЕЕгер/С1/Рас), продемонстрировали самый низкий уровень упаковки РНК ΥΕ Р1У по сравнению с кассетами, экспрессирующими более длинные белковые последовательности. Причина более низкой пакующей эффективности конструкции С1 остается неясной, но этот феномен может объясняться необходимостью в специфическом порядке расщепления по двум близлежащим сайтам расщепления (Ν82/Ν83 и сигнальной пептидазой) (УапъНсЫко!' апб Сошрапк, 1994) и/или разницей в распределении и стабильности белка С, продуцированного в двух разных контекстах стабильности этого белка. Таким образом, после проведения этих экспериментов УЕЕгер/С1/Рас был исключен из всех дальнейших экспериментов. Оба репликона УЕЕгер/С2/Рас и УЕЕгер/С-ргМ-Е/Рас упаковывали ΥΕ Р1У до сходных титров, достигавших более 107 инф.ед./мл. Кроме того, выход Р1У-частиц продолжался до окончания эксперимента, при этом каждая клетка высвобождала около 20 ΥΕ Р1У за период времени, равный 24 ч. Вероятно, что эти клетки высвобождали также 8УР, содержащие ргМ/Е и не содержащие нуклеокапсид и геном, но эта возможность далее не исследовалась.
Пример 12. ΥΕ Р1У с дефектным геномом могут производиться в больших масштабах.
В конечном счете, применимость Р1У в качестве вакцин-кандидатов зависит от возможности получения этих частиц в количестве, необходимом, например, для коммерческого производства. Уверенность в системе, основанной на транскомплементации РНК (репликоны УЕЕУ), для производства вакцин требует выработки дальнейших стандартов, поскольку существует возможность накопления мутаций в гетерологичных генах, клонированных в геномы РНК-вирусов. Использование клеточных линий ранних пассажей является одним из возможных вариантов решения этой проблемы. С другой стороны, аккумуляция мутаций в геномах УЕЕгер может быть сведена к минимуму с помощью повторных трансфекций репликона в наивные клетки или с помощью продукции упакованных репликонов УЕЕУ и последующей инфекции наивных клеток. Использование пакующих репликонов УЕЕ считалось самым простым и эффективным способом получения пакующих клеточных линий.
Для эффективной продукции Р1У использовали технологию получения культур клеток, экспрессирующих репликоны альфавируса, в предварительно упакованых репликонах УЕЕУ. Вкратце, репликоны УЕЕУ упаковывались в инфекционные вирионы УЕЕУ при помощи описанной ранее системы двух хэлперов (Уο1кονа еί а1., 2006), в препараты, содержащие титры, достигающие 109 инф. ед./мл. Клетки ВНК21, инфицированные этими частицами и селектированные в присутствии Риг, могли использоваться для получения клеточных культур, кодирующих структурные белки ΥΕΎ, через 3-5 дней. После получения клеточные линии, содержащие УЕЕгер/С2/Рас и УЕЕгер/С-ргМ-Е/Рас, инфицировали ранее полученными
- 12 016490 образцами ΥΡ Ρίν с высокой (10 инф.ед. на клетку) и низкой (0,1 инф. ед. на клетку) величиной ΜΟΙ. В всех случаях дефектные ΥΡν реплицировались продуктивно (см. фиг. 3) и инфицировали все клетки монослоев, производящих высокие титры Ρίν. Таким образом, получение пакующих клеточных линий путем инфекции клеток упакованными репликонами νΕΕν с последующей инфекцией Ρίν производит впечатление простой и эффективной системы, подходящей для широкомасштабного производства Ρίν с делетированной последовательностью С в геноме.
Пример 13. ΥΡ Ρίν, использующие репликоны νΕΕν, содержащие кодон-оптимизированную форму гена ΥΡν С.
Еще одна вероятная проблема, связанная с использованием пакующих систем для поддержки репликации дефектных вирусов, заключается в рекомбинации дефектного вирусного генома и РНК, кодирующей транс-комплементирующий ген (гены). Такая рекомбинация может привести к возникновению инфекционных вирусов. В экспериментах, описанных в настоящем изобретении, тест на образование бляшек ни разу не выявил инфекционных ΥΡν, но было необходимо исключить возможность появления живого вируса в этих клетках.
Кроме того, считается, что эволюция белков, кодируемых многими вирусами, переносимыми членистоногими, была направлена на использование трансляционного аппарата двух весьма различных хозяев. Следовательно, нельзя ожидать использования кодона, оптимального для экспрессии в одном из хозяев. Таким образом, последовательность, кодирующая С в кассетах экспрессии, была модифицирована для двух целей: ί) повысить уровень продукции С и ίί) понизить вероятность гомологичной рекомбинации между геномом ΥΡ Ρίν и последовательностью, кодирующей С, в составе субгеномной РНК репликонов νΕΕ. ΥΡν С синтезировали с использованием частот кодонов, обнаруженных в наиболее эффективно транслирующихся генах млекопитающих (фиг. 4А). Такие молчащие мутации также нарушали последовательность циклизации, необходимую для репликации генома флавивируса, таким образом, снижая вероятность образования способного к репликации ΥΡν в результате рекомбинации между геномом ΥΡ ΡΙν и РНК, кодирующей С, в составе репликона νΕΕν.
Ген Сор! клонировали в конструкции νΕΕτθρ, νΕΕτορ/ΕορΙ/Ραο и νΕΕτορ/ΕορΙ-ρΓΜ-Ε/Ραο, используя ту же стратегию, что при получении νΕΕΓορ/Ε2/Ρ;·ιο и νΕΕτορ/Ε-ρΓΜ-Ε/Ραο, и транскомплементирующие Ρи^-резистентные клеточные линии получали путем трансфекции РНК или инфекции клеток упакованными РНК. Трансфекция этих клеток синтезированной ίη νίίτο геномной РНК Ρίν позволяла получить ΡΙν с эффективностью, сравнимой с таковой у клеток, экспрессирующих репликоны νΕΕν, экспрессирующие неоптимизированный ген С (фиг. 4В). Однако клетки, экспрессирующие кодон-оптимизированный С, оказались удобным реагентом из-за своей склонности к развитию цитопатического эффекта и формированию хорошо заметных бляшек при инфекции ΥΡ ΡΙν и покрывании агарозой, содержащей среду с низкой концентрацией ЕВ8 (фиг. 4С). Таким образом, хотя кодон-оптимизация гена С ΥΡν не приводила к изменениям продукции ΡΙν этими клетками, клетки, экспрессирующие кодоноптимизированный ΥΡν С, представляют собой очень удобную систему для оценки ΥΡ ΡΙν, особенно не экспрессирующих флуоресцентные маркеры. В дополнительных экспериментах наблюдалась очень хорошая корреляция между титрами одних и тех же образцов, определенными с помощью анализа формирования бляшек и с помощью анализа фокусов клеток, положительных на ΟΕΡ.
Бляшки, образованные ΥΡ Ρίν, были меньшего размера, чем бляшки, образованные ΥΡν, показывая, что структурные белки, продуцируемые ίη С18, по всей вероятности, являются более эффективными для построения вирусных частиц. Каким образом достигается способность образовывать бляшки, до сих пор полностью не выяснено. Однако предполагается, что ΥΡν С обладает некоторым уровнем цитотоксичности, поскольку клеточные линии, содержащие репликоны νΕΕν, экспрессирующие кодоноптимизированную версию данного белка, имели более низкие показатели роста, чем аналогичные клетки с репликоном, содержащим природный ген С. Таким образом, репликация генома ΥΡ ΡΙν может приводить к дополнительным изменениям во внутриклеточном пространстве, достаточным для возникновения цитопатического эффекта.
Пример 14. ΡΙν могут быть получены из других флавивирусов.
Чтобы доказать, что Ρίν могут быть легко получены из других флавивирусов, стратегию, описанную выше, применяли к ΑΝν. Для этого был сконструирован геном ΑΝ Ρίν с белком С, состоящим из 35 аминокислотных остатков (фиг. 5А). Для упаковки этого генома ΑΝ Ρίν использовалась пакующая клеточная линия, полученная путем трансфекции клеток ВНК нецитопатическим репликоном νΕΕν, экспрессирующим ΑΝν С/ρτΜ/Ε и Рас |ΒΗΚ(νΕΕτορ/Ε*-Ε*-Ραο)|. Чтобы минимизировать вероятность того, что рекомбинация между геномами ΑΝ ΡΙν, реплицирующимися в этой клеточной линии, и белком С, кодируемым РНК νΕΕτθρ, может привести к возникновению инфекционного ΑΝν, ген, кодирующий С в составе репликона νΕΕν, был модифицирован так, чтобы он содержал кластеры молчащих мутаций в домене циклизации ΑΝν.
Среда, собранная с клеток ВНК (νΕΕΓθρ/Ε*-Ε*-Ρα^, трансфицированных синтетическим геномом ΑΝ ΡΙν, оказалась способна вызывать образование антиген-позитивных фокусов на пакующих клетках (фиг. 5В), что подтверждало продукцию инфекционных ΑΝ Ρίν. Однако после инфекции монослойных клеток Усго теми же образцами обнаруживались только антиген-позитивные клетки (фиг. 5С). Титр ΑΝ
- 13 016490
Ρίν в пакующих клетках достигал 1 х 108 инф. ед./мл, и, как и ожидалось, на этой клеточной линии Ρίν может быть многократно пассирован. Таким образом, при использовании полученной клеточной линии могут быть легко получены стоки ^Ν Ρίν с высоким титром с использованием такой же системы комплементации, как при работе с ΥΡν. Интересно, что в случае подходящей для ^Νν пакующей клеточной линии и ^Ν Ρίν было отмечено, что выход вируса достигал плато через некоторое время после инфекции одновременно с проявлением цитопатического эффекта (не показано), в то время как клетки, кореплицирующие геном ΥΡ Ρίν и репликоны νΕΕν продолжали продуцировать Ρίν в течение многих дней (фиг. 2).
Пример 15. Клетки, инфицированные ΥΡ или ^Ν Ρίν продуцируют 8νΡ.
Чтобы показать, что клетки, инфицированные Ρίν, продуцируют 8νΡ, клетки ВНК-21 трансфицировали синтезированной ίη νίΐτο РНК ΥΡ Ρίν или инфицировали ΥΡ Ρίν, продуцированными клетками, экспрессирующими С. Частицы, полученные из клеток ВНК-21, очищали с помощью ультрацентрифугирования и анализировали методом Вестерн-блоттинга с использованием мышиных моноклональных антител (МАВ), специфичных к Е (Ώ1-4Θ2) (ОепУгу е! а1., 1982). Как клетки, трансфицированные РНК, так и клетки, инфицированные Ρίν, продуцировали белок Е, осаждающийся из среды (фиг. 6А), что показывает, что он находился в корпускулярной форме. Поскольку эти клетки не проявляют признаков цитопатического эффекта, а образцы очищались путем центрифугирования на низких скоростях перед ультрацентрифугированием, маловероятно, чтобы белок Е, обнаруженный в осадке, представлял из себя клеточный дебрис. Сходным образом, Вестерн-блот-анализ показал, что клетки Vе^ο, инфицированные ^Ν Ρίν, продуцировали (до проявления цитопатического эффекта) внеклеточные формы Е, неотличимые по размеру от продуцированных клетками Vе^ο, инфицированными ^Νν (фиг. 6В).
Для дальнейшей оценки физической природы белка Е, высвобождаемого клетками, инфицированными Ρίν, среда, собранная с клеток, содержащих только реплицирующиеся геномы Ρίν, была проанализирована с помощью метода градиента плотности сахарозы в соответствии с опубликованными данными (8еЬа11еЕ е! а1., 1996). 8νΡ обнаруживались во фракции, содержащей 2% сахарозы (фиг. 6С). В том же самом эксперименте вирионы ΥΡν демонстрировали высокую плотность и обнаруживались во фракции, содержащей 42% сахарозы. Также в культурах, инфицированных ^Νν Ρίν, были обнаружены частицы, содержащие белок Е, мигрирующие на уровне размера ^Νν 8νΡ. Присутствие Е в среде клеток, инфицированных Ρίν, согласуется с продукцией 8νΡ клетками, экспрессирующими только ргМ/Е или ΤΒΕν РНК-вакцины, не содержащими функционального гена С.
Пример 16. Безопасность, мощность и эффективность Ρίν для животных.
Безопасность ^Ν и ΥΡ Ρίν определяли путем интрацеребральной инокуляции пометов 3-4дневных мышей. Эти исследования показали, что мыши, инокулированные ШТ ΥΡν или ^Νν, быстро погибали, и 50%-ная летальная доза этих вирусов (ΕΏ50) для этих животных составила приблизительно 1 ΡΡυ (табл. 1). Однако инокуляция мышат-сосунков ^Ν и ΥΡ Ρίν в дозировке 2х106 инф. ед. не приводила к смерти ни одного животного (табл. 1). Далее безопасность была подтверждена путем внутрибрюшинной инокуляции взрослым мышам вирусов дикого типа (\\1) и ^Ν Ρίν. Данные исследования показали, что ^Ν Ρίν оказались абсолютно безопасными для взрослых мышей (табл. 2). Кроме того, \\1 ШШТ привел к гибели значительной части взрослых мышей, его ΕΏ50 составила менее 1 ΡΡυ, в то время как дозы до 3х106 инф. ед. Ш^ Ρίν не вызывали гибели животных (табл. 2). Наиболее же интересным был тот факт, что Ш^ Ρίν оказались чрезвычайно мощными иммуногенами (титры нейтрализующих антител обнаруживались при инокуляции всего лишь 30000 инф. ед.), и 100% животных, вакцинированных 3х104, 3х105 или 3х106 инф. ед. при контрольном заражении 100 ΕΏ50 штамма ΝΥ99 Ί№Νν, оказались защищенными от вируса (табл. 2).
Таблица 1
Безопасность Ρίν для мышат-сосунков
| Инокулят* | Доза (инф. ед)ь | % выживаемости0 | Среднее время выживанияа |
| ΚΝ Ρίν | 2000000 | 100 (9/9) | ΝΑθ |
| ШУ ТХ02 | 0,2 | 56 (5/9) | 8,5 (+/-2,9) |
| «ΝΫ ТХ02 | 2 | 0 (0/9) | 5,4 (+/-0,5) |
| ИНУ ΤΧ02 | 20 | 0 (0/8) | 6 (+/-0) |
| ΠΝν ΤΧ02 | 200 | 0 (0/10) | 4,9 ( + /-0,3) |
| ΥΕ Ρίν | 2000000 | 100(10/10) | ΝΑθ |
| ΥΕν 17ϋ | 0,2 | 89 (8/9) | 8 (+/-0) |
| ΥΕν 17ϋ | 2 | 56 (5/9) | 7 (+/-0) |
| ΥΕν 17ϋ | 20 | 11 (1/9) | 6,9 (+/-2,4) |
| ΥΕν 17ϋ | 200 | 0 (0/12) | 6 (+/-0) |
а - инокулируемый препарат, разведенный в культуральной среде, содержащей 10% ΡΒ8,
- 14 016490
Ь - введенный внутрибрюшинно в объеме 20 мл/животное, с - выживаемость через 14 дней после инокуляции (живых/мертвых), ά - среднее время выживания животных, умерших от инфекции (стандартное отклонение), е - неприменимо.
Таблица 2 Безопасность, мощность и эффективность Ρίν для взрослых мышей
| Инокулят3 | Доза (инф ед)ь | % выживаемости0 | Среднее время выживания0 | Титр нейтрализующих антител6 | % защитыг |
| Нет (разбавитель) | 0 | 100 (8/8) | ΝΑ8 | <1/40ь | 14(1/7) |
| ΨΝΡΐν | 30000 | 100(10/10) | ΝΑ8 | 1:40 | 100 (8/8) |
| νΝΡΐν | 300000 | 100(10/10) | ΝΑ8 | 1:160 | 100 (8/8) |
| νΝΡΐν | 3000000 | 100(10/10) | ΝΑ8 | 1:160 | 100 (8/8) |
| νΝν ТХ02 | 1 | 40 (4/10) | 8,5 (+/-1,4) |
| νΝν ΤΧ02 | 10 | 30 (3/10) | 8 (+/-1,2) | ||
| νΝν ΤΧ02 | 100 | 10(1/10) | 7,8 (+/-1,4) |
а - инокулируемый препарат, разведенный в культуральной среде, содержащей 10% БВ8,
Ь - введенный внутрибрюшинно в объеме 100 мл/животное, с - выживаемость через 14 дней после инокуляции (живых/мертвых), ά - среднее время выживания животных, умерших от инфекции (стандартное отклонение), е - титр нейтрализующих антител в объединенной сыворотке крови 2 животных через 21 дней после инокуляции (приведенный титр - наибольшее разведение, дающее 80%-ное уменьшение образования фокусов νΝν), £ - защита от контрольного заражения 100ΤΌ50 штамма ΝΥ99 νΝν, проиллюстрированная количеством выживших животных через 14 дней после контрольного заражения; единственное выжившее животное из группы, инокулированной разбавителем, проявляло признаки заболевания (сгорбленная спина, взъерошенная шерсть, общее недомогание) в дни 8-14. Ни одно из животных, инокулированных Ρίν, не проявляло признаков заболевания в течение 14-дневного наблюдаемого периода после контрольного заражения, д- неприменимо, й - титры нейтрализующих антител в сыворотке крови неиммунизированных мышей при параллельном анализе с сывороткой крови мышей, инокулированных Ρίν.
Пример 17. Дальнейшие модификации с целью повышения выхода и безопасности ΡίV/Кер1^VАX.
В настоящем изобретении продемонстрировано, что многократное пассирование КерБ¥АХ не приводило к рекомбинации, но отбирались варианты, характеризующиеся более быстрым ростом: νΝν Кер11¥АХ многократно пассировали на клеточной линии, кодирующей белок С νΝν. Этот белок С был получен путем слияния копии гена С νΝν с геном Рас, регулируемым субгеномным промотором нецитопатического νΕΕι-ер (йеи'акота е! а1., 2005). В получившейся конструкции (VΕΕ^ер/Ρас-υЬ^-С*) ген убиквитина (ИЬ1) был вставлен перед геном С, а за геном С следовал стоп-кодон. В таком контексте слитый белок Ρас-υЬ^ будет продуцироваться вместе со зрелым белком С (не содержащим гидрофобного якоря, см. фиг. 9). Ген С в этом νΐ-Ттер (обозначенный С*) далее модифицировали путем вставки 36 мутаций, удаляющий сигнал последовательности циклизации, таким образом, этот регион, содержащий 11 нуклеотидов, превращался из ОИСААИАИОСи (8Ερ ίΌ ΝΟ: 2) в Ои^ААсАИОиИ 4ΕΟ ίΌ ΝΟ: 3), сохраняя при этом кодирующие способности С. Такое большое число мутаций резко снижает вероятность гомологичной рекомбинации и, кроме того, если рекомбинация между геномами все же имеет место, продукции генома, активного по репликации, не происходит из-за несовпадения кодирующих последовательностей РНК, что делает репликацию невозможной (фиг. 9).
Чтобы исследовать маловероятную возможность продуктивной репликации, из клеток линии ВНК21, экспрессирующих VΕΕ^ер/Ρас-υЬ^-С* {ВНК(VΕΕ^ер/Ρас-υЬ^-С*)}, была получена линия клеток клонального происхождения, и эту линию клеток использовали для десятикратного пассирования νΝ Кер11¥АХ (в каждом случае при уровне инфекции ΜΟί=0,01), и полученные Кер^АХ были детально охарактеризованы. Чтобы определить, содержала ли популяция пассажа 10 (р10) живые вирусы, монослойные клетки Ус'го инфицировали νΝ Кер^АХ 10 пассажа при множественности инфекции, равной 0,1, 1 и 10, и тщательно отмывали от внеклеточных Кер1^АХ. Эти монослойные культуры промывали еще раз спустя 24 ч и собирали среду спустя 2 дня. При переносе культуральной жидкости от этих культур на свежие культуры клеток Ус'го не обнаруживалось иммунопозитивных клеток при окраске высокочувствительными поликлональными антителами к νΝν, что показывало, что продуктивная рекомбинация Кер^АХ с белком С, кодируемым пакующей клеточной линией, не имела место.
- 15 016490
Интересно, что при сравнении р10 νΝ КерйУАХ с р0 КерйУАХ на клеточной линии ВНК(УЕЕгер/Рас-ИЫ-С*), р10 КерйУАХ вызывали образование полиморфных фокусов инфекции, многие из которых были значительно больше фокусов, продуцируемых р0 КерйУАХ (фиг. 10). Кроме того, р 10 КерйУАХ реплицируются в 10 раз больше чем р0 КерйУАХ в ранние моменты времени, и их конечный титр оказывается в два раза большим.
Анализ продуктов РСК, полученных из кДНК, продуцированной клетками Уего, инфицированными этими р10 КерйУАХ, показал, что среди них не присутствовало ни одного продукта, содержащего полноразмерную область, кодирующую С. Однако анализ последовательности соединения С-ргМ в продукте, содержащем эту область, показал возникновение двух мутаций в процессе пассирования. Как и ожидалось, исходя из гетерогенной природы фокусов, продуцируемых р10 КерйУАХ на пакующих клетках (фиг. 10), обе мутации присутствовали в виде смеси с исходной последовательностью КерйУАХ. Одна из мутаций, обнаруженная в половине популяции нуклеиновых кислот в этих реакциях секвенирования (секвенированных в обоих направлениях), представляла собой мутацию АСС>иСС (8>С) в положении Р4 перед сайтом расщепления сигнальной пептидазой (8 (с)УСА | УТБ8 (8ЕО ΙΌ N0: 4) в геноме КерйУАХ. Вторая мутация, присутствовавшая только в 30% амплифицированных последовательностей (опять в реакциях, завершенных в обоих направлениях), представляла собой ААС>АиС (К>М) в положении РЗ позади сайта расщепления Ν82Ε/Ν83 (ОККК | СОК (т)Т) (8Е0 ΙΌ N0: 5). Несмотря на то, что эти мутации находятся в положении делетированной 8Ь5, они не меняют предсказанных структур РНК. Быстрый отбор лучше растущих КерйУАХ (всего 10 циклов роста) вызывает исключительный интерес, поскольку указывает, что отбор вариантов, растущих лучше, является мощным методом усовершенствования КерйУАХ. Положения мутаций не являются неожиданными, поскольку известно, что изменение эффективности расщепления №2ВШ83 по отношению к расщеплению сигнальной пептидазой может повлиять на уровень выхода и инфекционность флавивирусных частиц (Кее1арапд е! а1., 2004; Бее е! а1., 2000; БоЬщв апк Бее, 2004; Уатвйсйкоу е! а1., 1997). Продолжаются исследования по отбору еще лучше растущих вариантов, и планируется вставка этих двух мутаций в конструкции КерйУАХ второго поколения, чтобы подтвердить их способность положительно действовать вместе (или по отдельности) на выход КерйУАХ и продукцию антигена. Тем не менее, данные, представленные в настоящей заявке, показывают, что при данных условиях пассирования: 1) рекомбинации не происходит; 2) может применяться положительный отбор для получения улучшенных КерйУАХ.
Слепой пассаж 1Е КерйУАХ также привел к получению лучше растущих вариантов с мутациями в тех же областях генома. Возможность слепого пассажа КерйУАХ для получения лучше растущих вариантов является ключевой особенностью настоящего изобретения и явным преимуществом по сравнению с традиционным методом БАУ, где получение лучше растущих вариантов всегда сопряжено с проблемой того, что эти лучше растущие варианты могут потерять свою аттенуацию по отношению к человеку.
Кроме того, мутированная, улучшенная кассета экспрессии С (УЕЕгер/Рас-ИЫ-С*), для которой была показана стабильность и отсутствие рекомбинации при использовании в клеточных линиях ВНК (не одобренных для получения человеческих вакцин), оказалась также стабильной и подходящей для размножения РЙУ при введении в клетки Уего (клеточная линия, одобренная для производства человеческих вакцин). В частности, РНК, соответствующую репликону УЕЕ, вводили в клетки Уего из сертифицированной затравочной культуры с использованием тех же методов, что и для клеток ВНК. После введения РНК в клетки Уего эти клетки велись в бессывороточной среде (важный момент для производства вакцины), содержащей пуромицин, и было показано, что такие клетки подходят для размножения РБУ Было показано, что в таких условиях размножения клетки продуцируют титры РЙУ немного ниже, чем клетки ВНК, полученные сходным образом, но клетки УЕЕгер/Рас-ИЫ-С*-Уего лучше выдерживают такие условия культивирования, что позволяет собирать материал многократно. На фиг. 11 проиллюстрирована возможность производства РЙУ этими клетками при многократном сборе материала в условиях бессывороточного культивирования.
В целом, размножение РкУ в клеточных линиях, экспрессирующих С (особенно кассеты экспрессии С, содержащие сигнальную последовательность ргМ или эту область плюс части генов ргМ и Е), теоретически может рекомбинировать с геномом РЙУ с получением живого вируса, способного вызывать заболевание, повышая риск способа получения вакцины. Для решения этой проблемы, в настоящем изобретении продемонстрировано, что клеточные линии, предназначенные для продуцирования VN РЙУ, могут быть получены с использованием белка С, который заканчивается точно на месте расщепления №2ВШ83, таким образом минимизируя вероятность рекомбинации в этой области генома РЙУ и давая преимущество перед другими методами размножения, в которых клеточные линии кодируют РНК, кодирующие часть якоря С (также известную как сигнальный пептид ргМ), которые также содержатся в РЙУ.
Чтобы далее повысить безопасность кассеты экспрессии С, в настоящем изобретении продемонстрировано, что в часть кассеты, используемой для получения кодируемого УЕЕгер С, который комплементирует с геномом РЙУ (т.е. первые 30 кодонов, кодирующие аминокислотную последовательность, необходимую для производства реплицирующегося генома РЙУ из-за элементов РНК, необходимых для репликации вируса), могут быть внесены специфические мутации для получения кассеты, отличающейся
- 16 016490 от генома Ρίν по 36 нуклеотидным позициям (введение которых не меняет белковый продукт), таким образом, вероятность рекомбинации получившегося гена С с геномом Ρίν резко снижается. (фиг. 9). Далее в этот мутантный ген были внесены три мутации в сигнале циклизации (С8), который должен быть комплементарен С8 в 3'υΤΚ генома Ρίν для успешной вирусной репликации, обеспечивая еще одну меликон УЕЕ вслед за селективным маркерным геном (рас) с использованием гена убиквитина к интактному продукту С полученного полипротеина (альтернативные последовательности саморасщепления, такие как автопротеиназа 2А или ЕМЭУ или другие родственные последовательности могут быть легко заменены на убиквитин). Создание такой кассеты, кодирующей единый полипротеин, дает преимущество за счет получения генетически более стабильного репликона УЕЕ, уменьшения вероятности рекомбинации в размножающих клеточных линиях, элиминации кассеты экспрессии С и уменьшения выхода Ρίν. Получившаяся конструкция (УΕΕ^ер/Ρас-υЬ^-С*, фиг. 9) была введена в клетки ВНК, и эти клетки использовали для получения клеточной линии клональной природы, экспрессирующей репликон УЕЕ, путем стандартных методик (ТаухиПп е1 а1., У1го1оду, 2006).
Была проанализирована одна клональная линия через 18 пассажей после клонирования из одной клетки, и анализ не выявил признаков какой-либо генетической делеции кассет С (методом ΚΤ-ΡΟΚ.), а также не было обнаружено никаких мутаций в кассете экспрессии С. Наиболее важно, что эта клеточная линия продемонстрировала сходные способности к размножению ^Νν Ρίν на уровне пассажа 41. И наконец, после 10 пассажей Ρίν на этой клеточной линии не было выявлено признаков рекомбинации, ведущей к появлению ΡΙν, способных к продуктивной репликации в клетках, не экспрессирующих кассету С (таких как клетки \УТ Уего), и не было выявлено признаков введений последовательностей, кодирующих С, в геном Ρίν с помощью ΚΤ-Ρί,’Κ.
Кроме того, чтобы решить проблему возможной рекомбинации ΡΙν с флавивирусами вакцин в момент вакцинации, ведущей к появлению новых вирулентных флавивирусов, в настоящем изобретении продемонстрировано, что возможно синтезировать геномы ^Νν, содержащие неприродные сигналы циклизации (С8), присутствующие во всех известных флавивирусах в естественной циркуляции, и эти геномы будут реплицироваться на высоком уровне. В нескольких лабораториях было показано, что две С8, обнаруженные на 5'- и З'-концах геномов всех флавивирусов, должны быть комплементарны на 100% для обеспечения продуктивной репликации вируса (Кйготусй е1 а1., 1. У1го1., 2001; Ьо е1 а1., 1. Упо1., 2003; АЬагех е1 а1., У1го1., 2003). Эти исследования также показали, что неприродные С8 могут продуцировать реплицирующиеся геномы, если эти С8 комплементарны на 100%. Однако исследователи указали, что у всех геномов с неприродными последовательностями С8 имелись дефекты репликации. Путем систематического анализа С8 в геномах ^Νν, в особенности анализа способности к обеспечению репликации на высоком уровне тщательно отобранных замен одного основания, были идентифицированы замены одного основания и последующие замены двух оснований, дающие геному возможность реплицироваться на высоком уровне (фиг. 12А). На фиг. 12В показано, что возможен высокий уровень репликации генома ^Νν с заменой двух оснований, и что геномы, в которые намеренно ввели несовпадающие последовательности С8 (такие как \УТ и мутант по двум основаниям), не являются репликационно активными. Таким образом, эта мутация и другие, подобные ей, могут быть использованы для получения Ρίν с повышенным уровнем безопасности, поскольку любой рекомбинантный вирус, полученный в результате одноточечной генетической рекомбинации между вакциной на основе ΡΙν с модифицированной С8 и вирусом, циркулирующим в областях, где население проходит вакцинацию, не будет репликационно активным и, следовательно, не сможет вызвать заболевания.
Пример 18. Клетки ВНК, экспрессирующие ген С ^Νν, сохраняют свой фенотип в течение многих пассажей.
Исследования клональной клеточной линии, экспрессирующей ^Νν С, полученной из клеток ВНК, трансфицированных УΕΕ^ер/Ρас-υЬ^-С*, продемонстрировали ее продолжительную стабильность, а также удобство для получения Кер11УАХ по нескольким причинам. Во-первых, эти клетки подходят для многократного пассирования КерИУАХ. Во-вторых, параллельный анализ образования фокусов на клетках двух разных уровней пассажей (пассажи 8 и 24 после клонирования из одной клетки) не показал заметных различий в титрах ЯерИУАХ \¥Ν и размерах фокусов. И, наконец, при прямом анализе последовательности кассеты, кодирующей С, в этих клетках на уровне 24 пассажа не обнаружилось никаких отличий от исходной последовательности УЕЕгер. В сумме эти данные указывают на то, что клетки, содержащие УЕЕгер, экспрессирующие С, являются достаточно стабильными для использования в общепринятом формате маточной серии клеток для производства человеческих вакцин. Кроме того, поскольку УЕЕгер уже использовали в испытаниях на людях, применение технологии УЕЕгер-клеток к клеткам Уего не должно встретить неожиданных препятствий при получении разрешения контролирующего органа.
Пример 19. Направление ^Νν УТЬ в лимфоидную ткань.
Как указано выше, ^Νν УБ-Ρ сходны с КерйУАХ за исключением того, что вместо белка флавивируса ргМ/Е, они могут кодировать репортерный ген, или могут просто содержать флавивирусный репликон без репортера. УБ-Ρ легко продуцируются в пакующих клетках, экспрессирующих все три структур
- 17 016490 ных белка ΥΝν, описано получение высоких титров УД-Ρ (Εανζιιΐίη е! а1., 2006). При инокуляции 107 единиц ΥΈΡ в мышей, через 24 ч после инокуляции в сыворотке крови животных содержалось 1000-1500 ед./мл интерферона ί типа (ίΕΝ). Как внутрибрюшинная, так и подкожная инъекция в подушечку лап вызывала ίΕΝ-ответ. Кроме того, подколенные лимфатические узлы, вскрытые через 24 ч после прививки в подушечку лап ΥΈΡ, экспрессирующими β-галактозидазу, содержали большое количество клеток, положительных по β-галактозидазе, что показывает, что ΥΈΡ, входящие в клетку таким же образом, как и КерДУАХ, направляются в важнейшие лимфатические органы. Этот результат хорошо согласуется со высоким уровнем ΙΕΝ, вызванным инфекцией ΥΈΡ, и предполагает, что подобное направление обеспечивает высокий потенциал и эффективность КерДУАХ.
Список процитированных источников.
АЬег1е, 1.Н. е! а1., 1999, I. 1ттипо1. 163, 6756-61.
АЬег1е, 1.Н. е! а1., 2005, I. УДо1. 79, 15107-13.
ВгейепЬеек, Ρ4. е! а1., 2003, I. Сеп. У1го1. 84, 1261-8.
СДатЬегк, ТД. е! а1., 1999, I. УДо1. 73, 3095-101.
С1уае апа Натк, 2006, I. УДо1. 80:2170-2182.
Со1отЬаде, С. е! а1., 1998, У1го1оду 250, 151-63.
ОатЬ, В.8.е! а1., 2001, 1оигиа1 о£ У1го1оду 75, 4040-4047.
Εауζи1^п е! а1., 2006, У1го1оду 351:196-209.
Е11ота!ог1 е! а1., 2006, Сепек Ьет. 20:2238-2249.
Еопкеса, В.А., е! а1.,1994, Уасс1пе 12, 279-85.
СепДу, М.К. е! а1., 1982, АтДТгор Меа. Нуд. 31, 548-55. Сегак1топ, С., апа Ьо^гу, К., 2005, 8ои!Д Меа I. 98, 653-6.
Наак, I., е! а1., 1996, Сигг Вю1, 6, 315-24.
На11, К.А., е! а1., 2003, 1’гос ЫаД Асаа 8ш И8А 100, 10460-10464.
Ниапд, С-Υ., е! а1., 2003, I. УДо1. 77, 11436-47.
Капека, Τ.Ν., е! а1., 2000, Уасс1пе 19, 483-491.
Кее1арапд е! а1., 2004, I. УДо1. 78: 2367-2381.
КосДе1, Т. е! а1., 1997, Уасс1пе, 15, 547-52.
КосДе1, ТД. е! а1., 2000, Уасс1пе, 18, 3166-3173.
КоДет, К.М., е! а1., 2004, 1’гос. ЫаЙ. Асаа. 8сЬ И8А 101, 1951-6.
КоЫкЫ, Ε., апа ЕиЩ, А., 2002, Уасс1пе 20, 1058-67.
КоЫкЫ, Ε. е! а1., 2001, 1оитпа1 о£ У1го1оду 75, 2204-2212.
КошкЫ, Ε. е! а1., 1992а, У1го1оду 190, 454-8.
КошкЫ, Ε. е! а1., 1992Ь, У1го1оду 188, 714-20.
КоЫкЫ, Ε. е! а1., 2000а, Уасс1пе. Ьт. 18, 1133-1139.
КоЫкЫ, Ε. е! а1., 2000Ь, У1го1оду 268, 49-55.
Ьее е! а1., 2000, I. У1го1., 74:24-32.
Ьешт, ТА. е! а1., 1990, I. У1го1. 64, 3001-11.
Ь1Г)ек!гот, Ρ. е! а1., 1991, I, У1го1. 65, 4107-13.
ЬоЫдк апа Ьее, 2004, I. УДо1. 78: 178-186.
ЬЫаепЬасД е! а1., 2001, Е1ау1ушаае: !Де уиикек апа !Де1г терДсаДоп КЫре е! а1., (Дак. 4'1' Εа. Е1е1ак У1го1оду, Уо1. 1, Ырршсой ^ДДатк апа ^Дкшк, ΡЫ1аае1ρЫа., рр. 991-1041 (2уо1к)).
Ьоте^, 1.С. е! а1., 2002, I. УДо1. 76, 5480-91.
Макоп, Ρ.Υ. е! а1., 1991, УДЫоду 180, 294-305.
Мшке, ЬМ. е! а1., 2004, АтсД У1го1 8ирр1, 221-30.
МЫшт ν.Ρ. е! а1., 2001, УДик КекеагсД 81, 113-123.
Мопа!Д, ТТ., 1991, Ат. I. Тгор. Меа. Нуд. 45, 1-43.
Мопа!Д, ТТ. е! а1., 2002, Уассше 20, 1004-18.
Ρеΐ^акоνа, О. е! а1., 2005, I. У1го1. 79, 7597-608. ΡЫ11ρоик. КД. е! а1., 1996, АгсД. УДо1. 141, 743-9. Ριμ^, 8., е! а1., 1992, У1го1оду, 187, 290-7.
Ρ^!^ν е! а1., 2002, Ριτκ. Nа!^опа1 Асааету о£ 8с1епсек И8А 99, 3036-3041.
ΡидасДеν, К.У. е! а1., 2004, I. УДо1. 78, 1032-8.
ΡидасДеν, К.У. е! а1., 1995, У1го1оду, 212, 587-94.
Р1ао, М. е! а1., 2004, I. 1Ыес!. О1к. 190, 2104-8.
Кокк1, 8.Ь. е! а1., 2005, УДо1оду, 331, 457-70.
8сДаДсД е! а1., 1996, УДо1оду, 70:4549-4557.
8сДта1^оДи, С. е! а1., 1997, I. У1го1. 71, 9563-9.
8сДо11е, Ε. е! а1., 2004, I. У1го1. 78, 11605-14.
УоДом-т Ε. е! а1., 2006, УДо1оду, 344, 315-27.
Х1ао, 8.Υ. е! а1., 2001, Ειικι^ίι^ ШесДоик ОЬеакек Ы1 Аид 7, 714-721.
- 18 016490
УаткксЫкоу, ν.Κ, аиб Сотращ, К.А., 1994, 1. Мго1. 68, 5765-71.
УаткНсЫкот е1 а1., 1997, 1. Мго1, 71:4364-4371.
2икег, 2003, Хискчс Ас1б Кек 31: 3406-3415.
Все патенты или публикации, упомянутые в настоящем описании, указывают на уровень специалистов в области, к которой относится настоящее изобретение. Кроме того, эти патенты и публикации являются включенными в настоящее изобретение путем ссылки в той же степени, как если бы было указано, что каждая отдельная публикация включена путем ссылки.
Claims (34)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства И^Мпбае, содержащий делецию в нуклеотидной последовательности, кодирующей белок капсида (С) таким образом, что делеция не нарушает последовательность РНК, необходимую для циклизации генома, сигнальную последовательность для белка ргМ, необходимую для правильного созревания ргМ/М, или их комбинацию, где указанный дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус реплицируется только в клетках, экспрессирующих белок С или С, ргМ, белок оболочки, мутантный белок С, мутантный ргМ, мутантный белок оболочки или их комбинацию вируса семейства Е^Мпбае.
- 2. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства ЕЩМпбае по п.1, где указанный вирус представляет собой ЕПуМгик, НерасМгик или РекЦИгик или другую химеру указанных вирусов, полученную путем обмена кассеты ргМ-Е других вирусов с кассетой ргМ-Е псевдоинфекционного вируса.
- 3. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства ЕЩМпбае по п.2, где указанный ЕПуМгик является вирусом желтой лихорадки, вирусом лихорадки западного Нила, вирусом Денге, вирусом клещевого энцефалита, вирусом энцефалита Сент-Луиса, вирусом японского энцефалита или вирусом энцефалита долины Мюррей.
- 4. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Иа'утпбае по п.3, где делетированная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок С указанного ЕПуМгик, кодирует аминокислотные остатки 26-100 или комбинацию аминокислотных остатков в пределах аминокислотных остатков 26-100 белка С.
- 5. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства ЕЩМпбае по п.2, где указанный НерасМгик является вирусом гепатита С.
- 6. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства ЕЩМпбае по п.2, где указанный РекНуйик является вирусом диареи коров, вирусом свиной лихорадки или вирус холеры свиней.
- 7. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства ЕЩМпбае по п.1, где указанный делетированный ген заменен на ген, кодирующий маркерный белок или антиген.
- 8. Дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства ΠηνίνίιΜι^ по п.7, где маркерный белок является зеленым флуоресцентным белком.
- 9. Популяция клеток, экспрессирующих белок С или С, ргМ, белок оболочки, мутантный белок С, мутантный ргМ, мутантный белок оболочки или их комбинацию вируса семейства Е1аν^ν^^^бае, эффективно поддерживающая размножение дефектного по репликации вируса по п.1 в подходящих условиях, где ген, кодирующий белок (белки) вируса семейства ЕЩМпбае в составе репликона, заменен на кодоноптимизированную версию гена, кодирующую белок (белки) указанного вируса, так что эта замена снижает способность генов, кодируемых клеточной линией, рекомбинировать с геномом псевдоинфекционного вируса семейства Па\'П'1пбае и/или увеличивает продукцию псевдоинфекционного вируса семейства Е1аν^ν^^^бае.
- 10. Популяция клеток по п.9, где клетки, экспрессирующие белки дикого типа или мутантные белки вируса получены с применением репликонов, полученных из вирусных векторов генно-инженерными методами.
- 11. Популяция клеток по п.10, где указанный репликон экспрессирует белок С, содержащий мутации по крайней мере в 36 положениях нуклеотидов в гене, кодирующем белок С вируса семейства ЕЩщшбае.
- 12. Популяция клеток по п.10, где репликон экспрессирует белок С в составе репликона, который содержит неприродные последовательности циклизации таким образом, что присутствие указанных последовательностей циклизации уменьшает вероятность продуктивной рекомбинации псевдоинфекционного вируса с природными вирусами.
- 13. Популяция клеток по п.10, где указанный репликон экспрессирует белки, содержащие измененные нуклеотидные последовательности, кодирующие укороченную область соединения С-ргМ таким образом, что присутствие таких измененных последовательностей повышает уровень выхода дефектных по репликации псевдоинфекционных вирусов в клеточной культуре, уровень выхода δνΡ, содержащих ргМ/Е, ίη νί\Ό или их комбинацию.
- 14. Популяция клеток по п.10, где репликоны, экспрессирующие белки дикого типа или мутантные белки вируса семейства ЕЩщшбае, вводят в клетку путем трансфекции синтезированных ίη ν 11го РНК- 19 016490 репликонов, трансфекции плазмидной ДНК, предназначенной для синтеза функциональных альфавирусных репликонов с промоторов, специфичных для клеточной РНК-полимеразы ΙΙ, или путем инфекции альфавирусными репликонами, упакованными в альфавирусные структурные белки.
- 15. Популяция клеток по п.10, где вирусные векторы представляют собой альфавирусы.
- 16. Популяция клеток по п.15, где альфавирус представляет собой вирус венесуэльского энцефалита лошадей (УЕЕУ), вирус Синдбис, вирус восточного энцефалита лошадей (ЕЕЕУ), вирус западного энцефалита лошадей ^ЕЕУ) или вирус лихорадки реки Росс.
- 17. Способ получения дефектного по репликации псевдоинфекционного вируса семейства Вклмпбае, включающий инфицирование популяции клеток по п.9 дефектным по репликации псевдоинфекционным вирусом семейства В1а\'Етпбае. который содержит делецию в капсидном гене таким образом, что эта делеция не нарушает последовательность РНК, необходимую для циклизации генома, сигнальную последовательность для белка ргМ, необходимую для правильного созревания ргМ/М, или их комбинацию, получая таким образом дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства Вкллтбае.
- 18. Способ по п.17, где указанный вирус представляет собой В^Мтик, НерасМтик или РекШиик или другую химеру указанных вирусов, полученную путем обмена кассеты ргМ-Е других вирусов с кассетой ргМ-Е псевдоинфекционного вируса.
- 19. Способ по п.18, где указанный ВЩМтик является вирусом желтой лихорадки, вирусом лихорадки западного Нила, вирусом Денге, вирусом клещевого энцефалита, вирусом энцефалита Сент-Луиса, вирусом японского энцефалита или вирусом энцефалита долины Мюррей.
- 20. Способ по п.19, где делетированная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок С указанного ВЩМтик, кодирует аминокислотные остатки 26-100 или комбинацию аминокислотных остатков в пределах аминокислотных остатков 26-100 белка С.
- 21. Способ по п.18, где указанный НерасМтик является вирусом гепатита С.
- 22. Способ по п.18, где указанный РейМтик является вирусом диареи коров, вирусом свиной лихорадки или вирус холеры свиней.
- 23. Способ по п.17, где клетки, экспрессирующие белки дикого типа или мутантные белки вируса, получены с применением репликонов, полученных из вирусных векторов генно-инженерными методами.
- 24. Способ по п.23, где ген, кодирующий мутантный белок (белки) вируса семейства ВЩМпбае в составе репликона, заменен на кодон-оптимизированный вариант гена, кодирующего белок (белки) указанного вируса, так что эта замена понижает способность генов, кодируемых клеточной линией, рекомбинировать с геномом псевдоинфекционного вируса семейства В^Мпбае и/или увеличивает продукцию псевдоинфекционного вируса семейства В^Мпбае.
- 25. Способ по п.24, где указанный репликон экспрессирует белок С, содержащий мутации по крайней мере в 36 положениях нуклеотидов в гене, кодирующем белок С вируса семейства ВЩМпбае.
- 26. Способ по п.24, где репликон экспрессирует белок С в составе репликона, который содержит неприродные последовательности циклизации таким образом, что присутствие указанных последовательностей циклизации уменьшает вероятность продуктивной репликации псевдоинфекционного вируса с природными вирусами.
- 27. Способ по п.24, где указанный репликон экспрессирует белки, содержащие измененные нуклеотидные последовательности, кодирующие укороченную область соединения С-ргМ таким образом, что присутствие таких измененных последовательностей повышает уровень выхода дефектных по репликации псевдоинфекционных вирусов в клеточной культуре, уровень выхода 8УР, содержащих ргМ/Е, ίη νί\Ό или их комбинацию.
- 28. Способ по п.23, где репликоны, экспрессирующие белки дикого типа или мутантные белки вируса семейства В^Мпбае, вводят в клетку путем трансфекции синтезированных ίη νίΙΐΌ РНК репликонов, трансфекции плазмидной ДНК, предназначенной для синтеза функциональных альфавирусных репликонов с промоторов, специфичных для клеточной РНК-полимеразы ΙΙ, или путем инфекции альфавирусными репликонами, упакованными в альфавирусные структурные белки.
- 29. Способ по п.23, где вирусные векторы представляют собой альфавирусы.
- 30. Способ по п.29, где альфавирус представляет собой вирус венесуэльского энцефалита лошадей (УЕЕУ), вирус Синдбис, вирус восточного энцефалита лошадей (ЕЕЕУ), вирус западного энцефалита лошадей ^ЕЕУ) или вирус лихорадки реки Росс.
- 31. Фармацевтическая композиция, содержащая дефектный по репликации псевдоинфекционный вирус семейства ВЩМпбае, полученный способом по п.17.
- 32. Способ защиты индивидуума от инфекций, возникающих в результате контакта с В^Мпбае, включающий введение в организм индивидуума иммунологогически эффективного количества фармацевтической композиции по п.31, которая индуцирует у индивидуума иммунный ответ против Вк-ινίνιπбае, защищая таким образом индивидуума от инфекций.
- 33. Способ по п.32, где указанное введение производится внутрибрюшинно, чрескожно, подкожно, внутримышечно, перорально или интраназально.
- 34. Способ по п.32, где индивидуумом является человек или животное.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US77718906P | 2006-02-27 | 2006-02-27 | |
| PCT/US2007/004957 WO2007098267A2 (en) | 2006-02-27 | 2007-02-27 | Pseudoinfectious flavivirus and uses thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200870304A1 EA200870304A1 (ru) | 2009-02-27 |
| EA016490B1 true EA016490B1 (ru) | 2012-05-30 |
Family
ID=38438014
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200870304A EA016490B1 (ru) | 2006-02-27 | 2007-02-27 | Псевдоинфекционный флавивирус и его применение |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US8252574B2 (ru) |
| EP (1) | EP1991709B1 (ru) |
| JP (2) | JP5538729B2 (ru) |
| KR (1) | KR101499750B1 (ru) |
| CN (1) | CN101454022B (ru) |
| AP (1) | AP2008004629A0 (ru) |
| AU (1) | AU2007217352B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0708332A2 (ru) |
| CA (1) | CA2643819C (ru) |
| CO (1) | CO6141481A2 (ru) |
| CR (1) | CR10323A (ru) |
| EA (1) | EA016490B1 (ru) |
| HN (1) | HN2008001324A (ru) |
| IL (1) | IL193522A (ru) |
| MY (1) | MY151062A (ru) |
| NZ (1) | NZ570881A (ru) |
| SG (1) | SG172642A1 (ru) |
| UA (1) | UA101597C2 (ru) |
| WO (1) | WO2007098267A2 (ru) |
| ZA (1) | ZA200807544B (ru) |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008505656A (ja) * | 2004-07-12 | 2008-02-28 | テンジェン バイオメディカル カンパニー | フラビウイルスワクチン |
| CN101454022B (zh) | 2006-02-27 | 2013-09-04 | 得克萨斯系统大学评议会 | 假性感染性黄病毒及其用途 |
| BRPI0908936A2 (pt) * | 2008-03-14 | 2017-03-28 | Sanofi Pasteur Biologics Co | vacinas de flavivírus de replicação defeituosa e vetores de vacina |
| WO2010107847A1 (en) * | 2009-03-16 | 2010-09-23 | Sanofi Pasteur Biologics Co. | Replication-defective flavivirus vaccine vectors against respiratory syncytial virus |
| WO2010138885A2 (en) | 2009-05-28 | 2010-12-02 | The United States Of America, S.A., As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Antigenic chimeric tick-borne encephalitis virus/dengue virus type 4 recombinant viruses |
| BRPI0914507A2 (pt) * | 2009-12-23 | 2012-04-10 | Fundacao Oswaldo Cruz | vacina para lentivìrus baseada em vìrus recombinante vacinal da febre amarela |
| WO2012027473A2 (en) * | 2010-08-24 | 2012-03-01 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Immunogenic compositions comprising alphavirus vectored dengue virus e protein antigens |
| WO2012106403A2 (en) * | 2011-02-01 | 2012-08-09 | Uab Research Foundation | Methods and compositions for pseudoinfectious alphaviruses |
| SG10201510800PA (en) | 2012-01-09 | 2016-01-28 | Sanofi Pasteur Biologics Llc | Purification of flaviviruses |
| WO2013138776A1 (en) | 2012-03-16 | 2013-09-19 | Merial Limited | Novel methods for providing long-term protective immunity against rabies in animals, based upon administration of replication-deficient flavivirus expressing rabies g |
| US8961995B2 (en) | 2012-09-20 | 2015-02-24 | Uab Research Foundation | Methods and compositions for alphavirus replicons |
| US10407667B2 (en) * | 2014-06-20 | 2019-09-10 | Université D'aix-Marseille | Method for rapid generation of an infectious RNA virus |
| EP3031923A1 (en) * | 2014-12-11 | 2016-06-15 | Institut Pasteur | Lentiviral vector-based japanese encephalitis immunogenic composition |
| US11149255B2 (en) * | 2016-09-06 | 2021-10-19 | Bioventures, Llc | Compositions and methods for generating reversion free attenuated and/or replication incompetent vaccine vectors |
| US10590171B2 (en) | 2016-10-28 | 2020-03-17 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Exosomes and methods of making and using the same |
| WO2018152158A1 (en) * | 2017-02-14 | 2018-08-23 | Shi Pei Yong | Live attenuated zika virus with 3'utr deletion, vaccine containing and use thereof |
| TW202333779A (zh) | 2017-05-08 | 2023-09-01 | 美商磨石生物公司 | 阿爾法病毒新抗原載體 |
| CN111818943B (zh) | 2018-01-04 | 2024-09-03 | 伊科尼克治疗公司 | 抗组织因子抗体、抗体-药物缀合物及相关方法 |
| BR122024002387A2 (pt) | 2019-05-30 | 2024-03-12 | Gritstone Bio, Inc. | Vetores de adenovírus, composição farmacêutica, sequência de nucleotídeo isolada, célula isolada, vetor, kit, usos de um vetor, método para fabricar o vetor, métodos para produzir um vírus e vetor viral |
| CN116196405A (zh) | 2019-12-31 | 2023-06-02 | 伊利克斯根治疗公司 | 核酸和蛋白质向细胞和组织的基于温度的瞬时递送 |
| CA3171219A1 (en) | 2020-03-09 | 2021-09-16 | Arcturus Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for inducing immune responses |
| IL300026A (en) | 2020-08-06 | 2023-03-01 | Gritstone Bio Inc | Multiepitope vaccine cassettes |
| WO2022036170A1 (en) | 2020-08-14 | 2022-02-17 | Arcturus Therapeutics, Inc. | Method of lyophilizing lipid nanoparticles |
| CN117751183A (zh) * | 2021-05-27 | 2024-03-22 | 迈凯恩技术有限公司 | 使用假病毒的抗体依赖性感染增强反应的评价方法 |
| CA3232658A1 (en) | 2021-09-22 | 2023-03-30 | Steven Gregory REED | Rna vaccines against infectious diseases |
| WO2023049753A2 (en) * | 2021-09-22 | 2023-03-30 | Hdt Bio Corp. | Compositions and methods for enhanced antigen binding proteins |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ504725A (en) | 1997-11-28 | 2003-02-28 | Crown In The Right Of The Quee | Flavivirus expression and delivery system |
| AU774045B2 (en) | 1998-09-02 | 2004-06-17 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Dengue viruses that are replication defective in mosquitos for use as vaccines |
| JP2002538842A (ja) * | 1999-03-16 | 2002-11-19 | デイナ−ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド | 大量のスクリーニングのためのレンチウイルスベクター系 |
| AT410634B (de) | 2001-02-21 | 2003-06-25 | Franz X Dr Heinz | Attenuierte lebendimpfstoffe |
| WO2002072803A2 (en) | 2001-03-09 | 2002-09-19 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Subgenomic replicons of the flavivirus dengue |
| CN100392087C (zh) * | 2001-11-26 | 2008-06-04 | 昆士兰大学 | 黄病毒疫苗输送系统 |
| BR0313113A (pt) * | 2002-08-13 | 2005-06-28 | Akzo Nobel Nv | Replicon de um pestivìrus partìcula viral infecciosa de pestivìrus, método para a produção da mesma, e, vacina |
| EP1534847B1 (en) | 2002-09-03 | 2015-10-28 | Oxford Biomedica (UK) Limited | Retroviral vector and stable packaging cell lines |
| EP1558276B1 (en) * | 2002-11-08 | 2012-07-25 | The Administrators of the Tulane Educational Fund | Flaviviris fusion inhibitors |
| US6943015B2 (en) | 2002-12-12 | 2005-09-13 | Ilya Frolov | Large scale production of packaged alphavirus replicons |
| WO2004072274A1 (fr) | 2003-01-30 | 2004-08-26 | Shanghai Tengen Biomedical Co., Ltd. | Vaccin a base de pseudoparticules virales ayant comme support un replicon de recombinaison du virus de la dengue |
| MXPA05010429A (es) * | 2003-03-31 | 2005-11-04 | Hoffmann La Roche | Composiciones y metodos para detectar ciertos flavivirus que incluyen miembros del serogrupo del virus de la encefalitis japonesa. |
| AU2003902842A0 (en) | 2003-06-06 | 2003-06-26 | The University Of Queensland | Flavivirus replicon packaging system |
| JP2008505656A (ja) | 2004-07-12 | 2008-02-28 | テンジェン バイオメディカル カンパニー | フラビウイルスワクチン |
| CN101454022B (zh) | 2006-02-27 | 2013-09-04 | 得克萨斯系统大学评议会 | 假性感染性黄病毒及其用途 |
-
2007
- 2007-02-27 CN CN2007800150079A patent/CN101454022B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2007-02-27 AP AP2008004629A patent/AP2008004629A0/xx unknown
- 2007-02-27 EP EP07751696.1A patent/EP1991709B1/en active Active
- 2007-02-27 JP JP2008556467A patent/JP5538729B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2007-02-27 AU AU2007217352A patent/AU2007217352B2/en not_active Ceased
- 2007-02-27 NZ NZ570881A patent/NZ570881A/en not_active IP Right Cessation
- 2007-02-27 SG SG2011038668A patent/SG172642A1/en unknown
- 2007-02-27 UA UAA200811510A patent/UA101597C2/ru unknown
- 2007-02-27 CA CA2643819A patent/CA2643819C/en active Active
- 2007-02-27 ZA ZA200807544A patent/ZA200807544B/xx unknown
- 2007-02-27 EA EA200870304A patent/EA016490B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2007-02-27 MY MYPI20083286 patent/MY151062A/en unknown
- 2007-02-27 US US11/711,532 patent/US8252574B2/en active Active
- 2007-02-27 WO PCT/US2007/004957 patent/WO2007098267A2/en active Application Filing
- 2007-02-27 BR BRPI0708332-7A patent/BRPI0708332A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2007-02-27 KR KR1020087023511A patent/KR101499750B1/ko not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-08-18 IL IL193522A patent/IL193522A/en not_active IP Right Cessation
- 2008-08-27 HN HN2008001324A patent/HN2008001324A/es unknown
- 2008-09-25 CR CR10323A patent/CR10323A/es unknown
- 2008-09-26 CO CO08102799A patent/CO6141481A2/es unknown
-
2012
- 2012-07-28 US US13/561,002 patent/US9273288B2/en active Active
-
2013
- 2013-12-24 JP JP2013264813A patent/JP2014121324A/ja not_active Ceased
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HARVEY, T.J. et al. Tetracycline-Inducible Packaging Cell Line for Production of Flavivirus Replicon Particles, Journal of Virology, January 2004, vol. 78, Ôäû 1, pages 531-538, see abstract and page 532 * |
| MANDL, S. Flavivirus Immunization with Capsid-Deletion Mutants: Basics, Benefits, and Barriers, Viral Immunology, 2004, vol. 17, Ôäû 4, pages 461-472, see Figure A * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20130023031A1 (en) | 2013-01-24 |
| US20090155301A1 (en) | 2009-06-18 |
| JP2014121324A (ja) | 2014-07-03 |
| JP2009528032A (ja) | 2009-08-06 |
| AU2007217352A1 (en) | 2007-08-30 |
| JP5538729B2 (ja) | 2014-07-02 |
| CR10323A (es) | 2009-01-29 |
| MY151062A (en) | 2014-03-31 |
| BRPI0708332A2 (pt) | 2011-05-24 |
| EP1991709A4 (en) | 2009-10-21 |
| CN101454022A (zh) | 2009-06-10 |
| EP1991709A2 (en) | 2008-11-19 |
| WO2007098267A3 (en) | 2008-11-20 |
| AP2008004629A0 (en) | 2008-10-31 |
| NZ570881A (en) | 2011-09-30 |
| HN2008001324A (es) | 2010-10-29 |
| SG172642A1 (en) | 2011-07-28 |
| WO2007098267A2 (en) | 2007-08-30 |
| CA2643819C (en) | 2018-11-27 |
| US8252574B2 (en) | 2012-08-28 |
| KR20090008193A (ko) | 2009-01-21 |
| KR101499750B1 (ko) | 2015-03-06 |
| UA101597C2 (ru) | 2013-04-25 |
| CO6141481A2 (es) | 2010-03-19 |
| EP1991709B1 (en) | 2017-01-25 |
| CN101454022B (zh) | 2013-09-04 |
| US9273288B2 (en) | 2016-03-01 |
| ZA200807544B (en) | 2009-11-25 |
| CA2643819A1 (en) | 2007-08-30 |
| IL193522A (en) | 2014-05-28 |
| AU2007217352B2 (en) | 2013-09-26 |
| IL193522A0 (en) | 2009-05-04 |
| EA200870304A1 (ru) | 2009-02-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA016490B1 (ru) | Псевдоинфекционный флавивирус и его применение | |
| Wu et al. | Protection against lethal enterovirus 71 infection in newborn mice by passive immunization with subunit VP1 vaccines and inactivated virus | |
| RU2209082C2 (ru) | Химерные флавивирусные вакцины | |
| Baxt et al. | Foot-and-mouth disease virus undergoes restricted replication in macrophage cell cultures following Fc receptor-mediated adsorption | |
| US10533186B2 (en) | Attenuated recombinant alphaviruses incapable of replicating in mosquitoes and uses thereof | |
| US8716013B2 (en) | Recombinant lentiviral vector for expression of a flaviviridae protein and applications thereof as a vaccine | |
| US8748591B2 (en) | Chimeric sindbis-western equine encephalitis virus and uses thereof | |
| BR112020003470A2 (pt) | método de produção de composições farmacêuticas compreendendo o vírus imunogênico de chikungunya chikv-delta5nsp3 | |
| CA3091508A1 (en) | Attenuated flaviviruses | |
| BRPI0916186B1 (pt) | vetor de plasmídeo e seu uso, vacina para febre amarela e para vírus de rna infeccioso e vírus atenuado vivo clonalmente purificado homogêneo e seu uso | |
| CN111961654B (zh) | 耐热表型稳定遗传、携带负标记的重组口蹄疫病毒无毒株及o/a型口蹄疫二价灭活疫苗 | |
| JP2008505656A (ja) | フラビウイルスワクチン | |
| US20140065178A1 (en) | Methods and Compositions for Pseudoinfectious Alphaviruses | |
| US7037508B2 (en) | Pestivirus mutants and vaccines containing the same | |
| ES2869575T3 (es) | Composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención de la hepatitis C | |
| US20100247565A1 (en) | Chimeric sindbis-eastern equine encephalitis virus and uses thereof | |
| AU2016228199B2 (en) | Attentuated recombinant alphaviruses incapable of replicating in mosquitoes and uses thereof | |
| Butler | Structural and biological basis for the selection of cytotoxic lymphocyte escape variant viruses in mice infected with a coronavirus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |