EA015991B1 - Закрепленные на матрице пептидомиметики - Google Patents

Закрепленные на матрице пептидомиметики Download PDF

Info

Publication number
EA015991B1
EA015991B1 EA200801710A EA200801710A EA015991B1 EA 015991 B1 EA015991 B1 EA 015991B1 EA 200801710 A EA200801710 A EA 200801710A EA 200801710 A EA200801710 A EA 200801710A EA 015991 B1 EA015991 B1 EA 015991B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
tgr
amino acid
rgo
diseases
rto
Prior art date
Application number
EA200801710A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200801710A1 (ru
Inventor
Франк Гомберт
Даниэль Обрехт
Вим Врейблуд
Рикардо Диас
Стив Дж. Димарко
Джон Энтони Робинсон
Нитьякальяни Сринивас
Original Assignee
Полифор Лтд.
Универзитет Цюрих
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Полифор Лтд., Универзитет Цюрих filed Critical Полифор Лтд.
Publication of EA200801710A1 publication Critical patent/EA200801710A1/ru
Publication of EA015991B1 publication Critical patent/EA015991B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/34—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • A01N43/36—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom five-membered rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/10—Peptides having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/10—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using coupling agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)

Abstract

Закрепленные на матрице β-шпилечные пептидомиметики общей формулыгдепредставляет собойPro-Pro илиPro-Pro; и Z является цепочкой из 12 α-аминокислотных остатков, причем положения упомянутых аминокислотных остатков в упомянутой цепи отсчитаны, начиная с N-концевой аминокислоты, при этом данные аминокислотные остатки в положениях Р1-Р12 цепи представляют собойи их соли обладают свойством селективно ингибировать рост или убивать микроорганизмы, такие как Pseudomonas aeruginosa. Они могут использоваться как дезинфицирующие вещества для продуктов питания, косметических средств, медикаментов или других материалов, содержащих питательные вещества, или как медикаменты для лечения или профилактики инфекций. Эти β-шпилечные пептидомиметики могут быть получены способами, которые основаны на смешанной твердофазной и жидкофазной стратегии синтеза.

Description

Данное изобретение описывает закрепленные на матрице пептидомиметики β-шпилечной структуры, включающие закрепленную на матрице цепочку из двенадцати α-аминокислотных остатков, как определено здесь и в формуле изобретенния. Эти закрепленные на матрице пептидомиметики в форме βшпильки имеют избирательную противомикробную активность. Кроме того, раскрываются эффективные синтетические процессы, посредством которых эти соединения могут быть получены, при желании, в параллельном формате библиотеки. Эти пептидомиметики в форме β-шпильки показывают улучшенную эффективность, биодоступность, время полураспада и, что самое главное, значительно увеличенное соотношение между противобактериальной активностью, с одной стороны, и гемолизом красных кровяных телец, с другой.
Растущая проблема микробиологической устойчивости к установленным антибиотикам вызвала повышенный интерес к развитию новых противомикробных агентов с новыми принципами действия (Н. Вгеййаир!, №11. Вю1есйпо1. 1999, 17, 1165-1169). Один новый класс антибиотиков основывается на катионных пептидах, встречающихся в природе (Т. Сап/. В. I. Ьейгег, Мо1. Мебюше Тобау 1999, 5, 292-297; В. М. Ерапб, Η. 1. Уоде1, ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а 1999, 1462, 11-28). Они включают пептиды в форме βшпильки и β-цепи с дисульфидными мостиками (такие, как протегрины [V. N.. М.; О. V. 8йатоуа, Η. А. Котеуа, В. I. Ьейгег, ЕЕВ8 ЬеИ. 1993, 327, 231-236], тахиплезины [Т. Nакати^а, Η. Еигипака, Т. М1уа!а, Е. Токипада, Т. Ми!а, 8. Ьуапада, М. №\уа, Т. Такао, Υ. 8ЫтоЫкЫ, Υ. 1. Вю1. Сйет. 1988, 263, 16709-16713], и дефензины [В. I. Ьейгег, А. К. Ь1сЫепк1ет, Т. Сап/, Аппи. Веу. 1ттипо1. 1993, 11, 105-128], амфипатические α-спиральные пептиды (напр, цекропины, дермасептины, магаинины, и меллитины [А. Токкг Ь. 8апбгг А. О1апда8рего, Вюро1утегк 2000, 55, 4-30]), а также и другие линейные и ос-спиральные пептиды. Хотя механизмы действия противомикробных катионных пептидов пока не до конца изучены, их первичным местом взаимодействия является микробная клеточная мембрана (Н. Ниапд, Вюсйеткйу 2000, 39, 8347-8352). Под воздействием этих агентов клеточная мембрана становится проницаемой, что приводит к быстрой клеточной смерти. Тем не менее, наиболее сложные механизмы действия, например, включающие опосредованную рецептором передачу сигнала, в настоящее время не могут быть исключены (М. №и, Е. Ма1ег, В. Вен/, В. Е. Напсоск, Вюсйе1Ык1гу 1999, 38, 7235-7242).
Противомикробные активности многих из этих катионных пептидов обычно соотносятся с их предпочтительной второй структурой, наблюдаемой либо в водном растворе, либо в мембрано-подобных условиях (Ν. 8йагат, В. №дага_), ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а 1999, 1462, 29-54). Изучения структуры при помощи спектроскопии ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) показали, что катионные пептиды, такие как протегрин 1 (А. Аите1ак, М. Маидош, С. Воитекйпб, Ь. СЫсйе, Е. Иекраих, С. Сгакку, В. Са1ак, А. Сйауашеи, А. Еиг. 1. Вюсйет. 1996, 237, 575-583; В. Ь. ЕаЫпег, Т. Ихесктапп, 8. 8. Ь. Нагге1д, В. I. Ьейгег, И. ЕкепЬегд, 1. Ее1доп, 1. Сйет. Вю1. 1996, 3, 543-550) и тахиплезин (К. Катеапо, Т. Υопеуа, Т. М1уа!а, К. УокЫка\уа. Е. Токипада, Υ. Тегаба, 8. 1. Щапада, 8. 1. Вю1. Сйет. 1990, 265, 15365-15367), принимают четко выраженные конформации β-шпильки, благодаря сдерживающему эффекту двух дисульфидных мостиков. В аналогах протегрина, которым недостает одного или двух дисульфидных связей, устойчивость конформации β-шпильки уменьшается и понижается противомикробная активность (1. Сйеп, Т. 1. Еа11а, Η. 1. Ьш, М. А. Нигк1, С. А. ЕиЩ, И. А. Мокса, 1. В. ЕтЬгее И. 1. Ьоигу, Р. А. Вабе1, С. С. Сйапд, Ь. Си, 1. С. Е1ббек, Вюро1утегк 2000, 55, 88-98; 8. Ь. ΒηΓ^Γίβ, А. ХУаппд, Η. 1. Уинд, Υ. Сйо, Ь. Тап, В. I. Ьейгег, В. 1. Еиг. 1. Вюсйет. 1996, 240, 352-357; М. Е. Мапдош, А. Аите1ак, Р. Сйате!, С. Воитекйпб, Ь. СЫсйе, Е. Иекраих, С. Сгакку, В. Са1ак, А. СйауаЫеи, ЕЕВ8 ЬеИ. 1996, 383, 93-98; Η. Тататига, Т. Мигакат1, 8. ШписЫ К. 8ид1йага, А. О!ака, ^. Такаба, Т. Шика, М. ^ак1, Ν. Татато!о, Ν. ЕиЩ, Сйет. Рйагт. Ви11. 1995, 43, 853-858). Похожие наблюдения были сделаны в аналогах тахиплезина I (Η. Тататига, В. Шота, М. №\уа, 8. ЕипакокЫ, Т. Мигакатц Ν. ЕиЩ, Сйет. Рйагт. Ви11. 1993, 41, 978-980) и в миметиках с элементами шпилька-петля дефензина кролика ЫР-2 (8. Тйеииа^аки, В. №дага_), Вюсйет. Вюрйук. Век. Сотт. 1999, 254, 281-283). Эти результаты показывают, что структура β-шпильки играет важную роль в противомикробной активности и устойчивости этих протегрин-подобных пептидов. В случае катионных пептидов, отдающим предпочтение структуре ос-спирали, амфифильная структура спирали, повидимому, играет ключевую роль в определении противомикробной активности (А. Токк1, Ь. 8апбг1, А. С1апдакрего, А. Вюро1утегк 2000, 55, 4-30). Грамицидин С является пептидом с циклической главной цепью и четко выраженной Р-шпилечной структурой. (8.Е. Ηυ11, В. Каг1ккоп, Р. Мат, М. М. ^оо1£коп, Е. 1. Иобкоп, №1Шге 1978, 275, 206-275), что дает сильную противомикробную активность против грамположительных и грамотрицательных бактерий (Ь. Η. Копбс)е\уккг 8. ^. Еагтег, И. 8. ХУкйагТ В. Е. Иапсоск, В. 8. Иобдек, Ы!. 1. Рерйбе Рго!. Век. 1996, 47, 460-466). Высокая гемолитическая активность грамицидина 8, тем не менее, помешала его широкому использованию в качестве антибиотика. Недавние структурные изучения методом ЯМР обнаружили, что высокая гемолитическая активность, очевидно, коррелирует с крайне амфипатической природой циклической β-шпилька-подобной молекулы, но зависимость между противомикробной и гемолитической активностью, возможно, разорвать при помощи модуляции конформации и амфифильности (Ь. Н. 1<опбе)е\уккг М. 1е1окйаЫ-№агак1, 8. ^. Еагтег, В. Ь1х, М. Кау, В. И. 8укек, В. Е. Ηаисоск, В. 8. ^бдек, 1. Вю1. Сйет. 1999, 274, 13181-13192; С. МсШ^кЬ. Η. Копбе]етекк1, В. 8. ^бдек, В. И. 8укек, 1. ВЫ. Сйет. 2000, 275, 14287-14294).
- 1 015991
Недавно был описан новый циклический противомикробный пептид ВТЭ-1 из лейкоцитов приматов (У.-β. Таид, 1. Уиаи, С. Окарау, К. Окарау, Ό. Тгап, С. 1. МШет, А. 1. Ос11с11с. Μ. Е. 8е1к1еб, 8с1еисе 1999, 286, 498-502). Этот пептид содержит три дисульфидных мостика, удерживающие циклическую пептидную главную цепь пептида в шпилечной геометрии. Отщепление трех дисульфидных связей приводит к значительной потере противомикробной активности. Аналоги протегринов (1. Р. Тат, С. ^и, 1.Ь. Уаид, Еиг. 1. Вюсйет. 2000, 267, 3289-3300) и тахиплезинов (1.-Р. Тат, У.-А. Ьи, 1.-Ь. Уаид, Вюсйетщ1гу 2000, 39, 7159-7169; N. 8йагат, В. №1дагащ Вюсйет. Вюрйук. Век. Сотт. 2000, 267, 783-790), содержащие циклическую пептидную главную цепь, также как и множественные дисульфидные мостики для усиления амфифильной шпилечной структуры, также были описаны. В этих случаях, удаление всех цистеиновых ограничительных условий не всегда приводит к большой потере противомикробной активности, но действительно модулирует мембранолитическую избирательность (1. Р. Тат, С. ^и, 1.-Ь. Уаид, Еиг. 1. Вюсйет. 2000, 267, 3289-3300).
Основной проблемой в разработке новых селективных катионных противомикробных пептидов является биодоступность, устойчивость и уменьшенная гемолитическая активность. Встречающиеся в природе протегрины и тахиплезины проявляют значительную гемолитическую активность против человеческих эритроцитов. Это также касается аналогов протегрина, таких как 1В367 (1. Сйеи, Т. 1. Ра11а, Η. 1. Ьш, М. А. Нитк1, С. А. Рищ, Ό. А. Мокса, 1. В. ЕтЬтее, Ό. 1. Ьошу, Р. А. Вабе1, С. С. Сйаид, Ь. Си, 1. С. Р1ббек, Вюро1ушетк 2000, 55, 88-98; С Сйаид, Ь. Си, 1. Сйеи, и8-Ра1: 5,916,872, 1999). Эта высокая гемолитическая активность фактически сводит на нет его использование ш у1уо и представляет серьезный недостаток в клиническом применении. Также антибиотическая активность аналогов часто значительно падает с увеличением концентрации соли, так, в условиях ш у1уо (приблизительно 100-150 мМ №1С1) противомикробная активность может быть несколько уменьшена.
Протегрин 1 проявляет схожую сильную активность против грам-положительных и грамотрицательных бактерий, также как против грибков в экспериментах как с низким, так и с высоким содержанием соли. Эта противомикробная активность широкого спектра действия вместе с быстрым механизмом действия и способностью убивать бактерии, нечувствительные к другим классам антибиотиков, делает протегрины 1 интересными объектами для развития клинически полезных антибиотиков. Активность против грам-положительных бактерий, как правило, выше, чем против грам-отрицательных. Тем не менее, протегрин 1 также проявляет высокую гемолитическую активность против человеческих эритроцитов, и, следовательно, низкую избирательность по отношению к клеткам микробов. Ориентированные С’Э эксперименты (XV. Т. Не11ег, А. 1. ^апид, В. I. Ьейтет, Н. V. Ниаид, Вюсйеткйу 1998, 37, 1733117338) показывают, что протегрин 1 может существовать в двух различных состояниях в зависимости от его взаимодействия с мембранами и на эти состояния сильно влияет липидный состав. Изучения циклических аналогов протегрина (Р-Р. Тат, С. νυ, Р-Ь. Уаид, Еиг. 1. Вюсйет. 2000, 267, 3289-3300) обнаружили, что возрастание в конформационной жесткости, вытекающей из циклизации основной цепи и множественных дисульфидных мостиков, может придавать мембранолитическую избирательность, что разобщает противомикробную активность с гемолитической, по крайней мере, в группе изученных соединений.
Протегрин 1 является линейным пептидом из 18 остатков с амидированным С-концом и двумя дисульфидными мостиками. Тахиплезин I содержит 17 остатков, также имеет амидированный С-конец и содержит два дисульфидных мостика. Недавно описанные протегрин с циклической основной цепью и аналоги тахиплезина содержат, как правило, 18 остатков, а количество дисульфидных мостиков увеличено до трех (1. Р. Тат, С. νυ, Р-Ь. Уаид, Еиг. 1. Вюсйет. 2000, 267, 3289-3300; 1. Р. Тат, У.-А. Ьи, Р-Ь. Уаид, Вюсйетщйу 2000, 39, 7159-7169; N. 8йагат, В. №дагау, Вюсйет. Вюрйук. Век. Сотт. 2000, 267, 783-790).
Кателицидин, линейный спиральный катионный пептид, состоящий из 37 остатков, и его аналоги в настоящее время находятся на стадии исследования в качестве ингаляционного терапевтического агента для лечения кистозного фиброза (КФ) легких (Ъ. 8а1таи, 8. ТаЬ1Ь1, Т. Ό. 81агаег, Р. 8аи СаЬпе1, Р. Ь. ^иокит, Н. Р. Ла, Р. В. МсСгау, 1т., В. Р. Таск, АиЛт1сгоЬ. АдеШк и СЛетоЛег. 2001, 45, 2838-2844; В. Е. V. Наисоск, В. Лсйтст, Ттеибк Вю1ес1то1. 1998, 16, 82-88). Свыше 80% пациентов с КФ становятся хронически инфицированными ркеиботоиак аетидтока (С. А. Эетко, Р. 1. В1агб, Р. В. Эаукк, 1. С11и. Ер1бетю1. 1995, 48, 1041-1049; Е. М. Кегет, В. Со1б, Н. Летткои, 1. РеШаЛ. 1990, 116, 714-719). Другие противомикробные пептиды против Ркепбошоиабк (У.Н. Уаи, В. Но, N.8. Таи, М.Ь. ^, РЬ. Отд, АпЦписгоЬ. Адейк и СЛетоЛег. 2001, 45, 28202825 и здесь использованные ссылки), как РАЕЬ-39, 8МАР-29 и цекропин лепидоптеры, проявляют несколько желательных признаков, таких, как эффективная противомикробная активность в широком интервале рН, быстрое время цитолиза и низкая гемолитическая активность.
В соединениях, описанных ниже использована новая стратегия для стабилизации конформации βшпильки в катионных пептидомиметиках с циклической основной цепью, проявляющих избирательную противомикробную активность. Она включает трансплантацию катионных и гидрофобных шпилечных последовательностей на матрицу, чья функция заключается в удерживании пептидной петли основной цепи в шпилечной геометрии.
Закрепленные на матрице шпилечные пептидомиметики были описаны в литературе (О, ОЬтесЙ, М.
- 2 015991
АИогТег, 1. А. КоЫикои, Αάν. Меб. Сйет. 1999, 4, 1-68; 1. А. Койткои, 8уи. Ьей. 2000, 4, 429-441) и в настоящий момент установлена возможность получения β-шпилечных пептидомиметиков, используя методы комбинаторного и параллельного синтеза (Ь. Лайд, К. Моей1е, В. ЭйапараР Ό. ОЬтесЫ, 1. А. КоЫикои, Не1т. СЫт. Ас1а. 2000, 83, 3097-3112). Противобактериальные закрепленные на матрице пептидомиметики и способы их синтеза были описаны в Международных заявках на патент \УО 02/070547 А1 и \УО 2004/018503 А1, но эти молекулы не проявляют устойчивую в плазме избирательность и особенно высокую эффективность.
Методы, описанные здесь, позволяют провести синтез и скрининг больших шпилечных библиотек миметиков, которые, в свою очередь, значительно способствуют изучению структуры и активности, и, следовательно, открытию новых молекул с потенциальной селективной противомикробной и очень низкой гемолитической активностью по отношению к эритроцитам человека. Данная стратегия позволяет синтезировать р-шпилечные пептидомиметики с новыми видами избирательности по отношению к различным мультирезистентным ркеиботоиак-штаммам.
β-Шпилечными пептидомиметиками данного изобретения являются соединения общей формулы где
представляет собой сРто-ьРто или ъРто-сРто, и Ζ является цепочкой из 12 α-аминокислотных остатков, причем положения упомянутых аминокислотных остатков в упомянутой цепи отсчитаны, начиная с Ν-концевой аминокислоты, при этом данные аминокислотные остатки в положениях Р1-Р12 цепи представляют собой
и их фармацевтически приемлемые соли
Эти β-шпилечные пептидомиметики могут быть получены с помощью процесса, который включает (a) связывание соответствующим образом функционализированного твердого носителя с соответствующим образом Ν-защищенным производным той аминокислоты, которая в целевом продукте находится в положении 5, 6 или 7, причем любая функциональная группа, которая может присутствовать в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;
(b) удаление Ν-защитной группы из полученного таким образом продукта;
(c) связывание полученного продукта с соответствующим образом Ν-защищенным производным той аминокислоты, которая в целевом продукте находится на одно положение ближе к Ν-концевому аминокислотному остатку, причем любая функциональная группа, которая может присутствовать в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;
(б) удаление Ν-защитной группы из полученного таким образом продукта;
(е) повторение этапов (с) и (б) до тех пор, пока не будет введен Ν-концевой аминокислотный оста ток;
(ί) связывание полученного таким образом продукта с соединением общей формулы %-°Н X
Матрица >
- 3 015991 где
Матрица ! такой, как описано выше, и X означает Ν-защитную группу, (д) удаление Ν-защитной группы из продукта, полученного на этапе (Г) или (Ге):
(11) связывание продукта, полученного таким образом, с ответствующим образом Ν-защищенным производным той аминокислоты, которая в целевом продукте находится в положении 12, причем любая функциональная группа, которая может присутствовать в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;
(ΐ) удаление Ν-защитной группы из продукта, полученного таким образом;
(ί) связывание продукта, полученного таким образом, с соответствующим образом Ν-защищенным производным той аминокислоты, которая в целевом продукте на одно положение дальше от положения 12, причем любая функциональная группа, которая может присутствовать в указанном Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;
(k) удаление Ν-защитной группы из продукта, полученного таким образом;
(l) повторение этапов (|) и (к), пока не будут введены все аминокислотные остатки;
(т) при желании, избирательное снятие защиты с одной или нескольких защищенных функциональных групп, присутствующих в молекуле и соответствующее замещение реакционноспособных групп, освобожденных таким образом;
(о) отщепление полученного таким образом продукта с твердого носителя; (р) циклизация продукта, отщепленного с твердого носителя;
(с.|) при желании, образование одной или двух межцепочечных связей между боковыми цепями соответствующих аминокислотных остатков при противоположных положениях области β-цепи;
(г) удаление любых защитных групп, присутствующих на функциональных группах любых членов аминокислотных остатков и, при желании, любых защитных групп, которые могут, дополнительно, при сутствовать в молекуле; и (§) при желании, преобразование полученного таким образом продукта в фармацевтически приемлемую соль или преобразование фармацевтически приемлемой или неприемлемой соли, полученной таким образом, в соответствующее свободное соединение формулы I или в другую фармацевтически приемлемую соль.
Альтернативно, пептидомиметики данного изобретения могут быть получены следующим способом:
(а') связывание соответствующим образом функционализированного твердого носителя с соединением общей формулы где
такой, как описано выше, и X означает Ν-защитную группу, (Ь') удаление Ν-защитной группы из продукта, полученного на этапе (а');
(с') связывание полученного таким образом продукта с соответствующим образом Ν-защищенным производным той аминокислоты, которая в целевом продукте находится в положении 12, причем любая функциональная группа, которая может присутствовать в упомянутом Ν-защищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;
(с') удаление Ν-защитной группу из полученного таким образом продукта;
(с') связывание полученного таким образом продукта с соответствующим образом Ν-защищенным производным той аминокислоты, которая в целевом продукте находится на одно положение дальше от положения 12, причем любая функциональная группа, которая может присутствовать в указанном Νзащищенном производном аминокислоты, также соответствующим образом защищена;
(Г) удаление Ν-защитной группы из полученного таким образом продукта;
(д') повторение этапов (е') и (Г), пока не будут введены все аминокислотные остатки;
(1') при желании, избирательное снятие одной или нескольких защитных функциональных групп, присутствующих в молекуле и соответствующее замещение реакционноспособных групп, освобожденных таким образом;
(ί') отщепление полученного таким образом продукта с твердого носителя; (ί') циклизация продукта,
- 4 015991 отщепленного с твердого носителя;
(к') при желании, образование одной или двух межцепочечных связей между боковыми цепями подходящих аминокислотных остатков в противоположных положениях области р-цепи;
(1') удаление любых защитных групп, присутствующих на функциональных группах любых членов аминокислотной цепи и, при желании, любых защитных групп, которые могут, дополнительно, присутствовать в молекуле; и (т') при желании, преобразование полученного таким образом продукта в фармацевтически приемлемую соль или преобразование фармацевтически приемлемой или неприемлемой соли, полученной таким образом, в соответствующее свободное соединение формулы I или в другую фармацевтически приемлемую соль.
Пептидомиметики данного изобретения также могут быть энантиомерами соединений формулы I. Эти энантиомеры могут быть получены модификацией приведенных выше процессов, в которых используются энантиомеры всех исходных хиральных соединений.
β-Шпилечная конформация в высокой степени соотносится с антибактериальной активностью βшпилечных миметиков данного изобретения, β-шпилечные стабилизирующие конформационные свойства матриц играют ключевую роль не только для селективной антибактериальной активности, но также для синтетических процессов, описанных здесь выше, поскольку введение матриц в начале или около середины линейных защищенных пептидных предшественников значительно увеличивает выход цикли зации.
Аббревиатуры, используемые обычно в данной области, а также в формуле изобретения для аминокислотных остатков и аналогов, представляют собой:
А1а Ь-Аланин
Ат8 Ь-Аргинин
Азп Ь-Аспарагин
Суз Ь-Цистеин
О1п Ь-Глутамин
О1у Глицин
ΗΪ8 Ь-Гиетидин
Не Ь-Изолейцин
Ьеи Ь-Лейцип
Ьуз Ь-Лизин
Мег Ь-Метионин
РЬе Ь-Фенилаланин
Рго Ь-Пролин
Рго(5КРЬе) (28,5К)-5-фенилпиррот
8ег Ь-Серин
[-2-карбоциклическая кислота
- 5 015991
ТЬг Ь-Треонин
Тгр Ь-Триптофан
Туг Ь-Тирозин
Уа1 Ь-Валин
СП Ь- Цитруллин
От Ь-Орнптин
1ВиА Ь-т-Бутилаланин
Баг Саркозин
1-ВиС Ь-трет-Бутилглицин
4АтРЬе Ь-пара-Аминофенилаланин
ЗАтРЬе Ь-мета-Аминофенил аланин
2АтРЬе Ь-орто-Аминофенилаланин
РЬе(тС(КН2)=МН) Ь-мета-Амидинофенилаланин
ΡΗβ(ρΟ(ΝΗ2>ΝΗ) Ь-пара- Амидинофенилаланин
РЬе(т№С (ΝΗ2)=ΝΗ) Ь-мета-Г уанидинофенилаланин
ΡΗβ(ρΝΗΟ (ΝΗ2)=ΝΗ) Ь-пара- Гуанидинофенилаланин
РЬё Ь-Фенилглицин
СЬа Ь-Циклогексил аланин
Сда1 Ь-З-Циклобутилаланин
С5а1 Ь-З-Циклопентилаланин
Я1е Ь-Норлейцин
2-ΝαΙ Ь-2-Нафтилаланин
1-Να1 Ь-1 -Нафтилаланин
4С1-РЬе Ь-4-Хлорофенилаланин
ЗС1-РЬе Ь-3 -Хлорофенилаланин
2С1-Рке Ь-2-Хлорофенилаланин
3,4С12_РЬе Ь-3,4-Дихлорофенилаланин
4Р-РЬе Ь-4-Фторофенилаланин
ЗР-РЬе Ь-3 -Фторофенилаланин
2Р-РЬе Ь-2-Фторофенилаланин
Τΐο Ь-1,2,3,4-Тетрагидроизохинолин-3-карбоновая кислота
ТЫ Ь-Р-2-Тиенилаланин
Тга Ь-2-Тиазолилаланин
Мзо Ь-Метионин сульфоксид
АсЬуз Ь-Ы-Ацетиллизин
ϋρτ Ь-2,3-Диаминопропановая кислота
А2Ви Ь-2,4-Диаминомасляная кислота
ϋόιι (8)-2,3-Диаминомаслянйя кислота
АЪи γ-Аминомасляная кислота (ГАМК)
Айа ε-Аминогексановая кислота
А1Ъ а-Аминоизомасляная кислота
Υ(Βζ!) Ь-О-Бензилтирозин
Βΐρ Ь-Бифенилаланин
8(Βζ1) Ь-О-Бензилсерин
Τ(ΒζΙ) Ь-О-Бензилтреонин
11Сйа Ь-Г омо-циклогексилаланин
ЬСуз Ь-Гомо-цистеин
Ь8ег Ь-Гомо-серин
кАгд Ь-Гомо-аргинин
11Рйе Ь-Г омо-фенилаланин
Вра Ь-4-Бензоилфенилаланин
Ρίρ Ь- пиперидин-И-карбоновая кислотг
ΟαΟ Ь-Октилглицин
МеРЬе Ь-Н-Метилфенилаланин
МеЪПе Ε-Ν-Метилнорлейцин
МеА1а Ь-К-Метилаланин
Ме11е Ь-М-Метилизолейцин
МеУа1 Ь-Ы-Метилвалин
МеЬеи Ь-К-Метиллейцин
- 6 015991
Положениями для возможных межцепочечных связей являются положения Р4 и Р9 и/или Р2 и Р11, взятые вместе. Такие межцепочечные связи, как известно, стабилизируют конформации β-шпильки и, таким образом, представляют важный структурный элемент в дизайне β-шпилечных миметиков.
Наиболее предпочтительные аминокислотные остатки в цепи Ζ те, которые происходят из природных ос-аминокислот. Далее следует список из аминокислот которые, или их остатков, которые соответствуют целям данного изобретения, причем сокращения соответствуют повсеместно принятой привычной практике:
Трехбуквенный код
Однобуквенный код
А1а Ь-Аланин А
Аг§ Ь-Аргинин К
Азп Ь-Аспарагин N
Азр Ь-Аспарагиновая кислота ϋ
Суз Ь-Цистеин С
О1и Ь-Глутаминовая кислота Е
О1п Ь-Глутамин <3
СНу Глицин с
Ηίδ Ь-Гистидин н
Не Ь-Изолейцин I
Ьеи Ь-Лейцин ь
Ьуз Ь-Лизин к
Ме1 Ь-Метионин м
РЬе Ь-Фенил аланин Р
Рго Ь-Пролин Р
°Рго О-Пролин Др
Зег Ь-Серин 8
ТЬг Ь-Треонин т
Тгр Е-Тридтофан V/
Туг Ь-Тирозин Υ
Уа! Ь-Валин V
Другие α-аминокислоты, или их остатки, которые подходят для целей данного изобретения, включают:
Сй Ь-Цитруллин
От Ь-Орнитин ®иА Ь-1-Бутилаланин
8аг Саркозин
Реп Ь-Пенидилламин
- 7 015991
1-ВиО Ь-трет-Бутилглицин
4АшРЬе Ь-пара-Аминофенилаланин
ЗАшРке Ь-мета-Аминофенилаланин
2АтР11е Ь-орто-Аминофенилаланин
Ρ1ιβ(πι<ΧΝΗ2)=ΝΗ) Ь-мета-Амидинофенилаланин
ΡΗβ(ρϋ(ΝΗ2)=ΝΗ) Ь-пара-Амидивофенилалапин
Рйе(тЫНС (ΝΗ2)=ΝΗ) Ь-мета-Гуанидинофенилаланин
РКефЫНС (ΝΗ2)=ΝΗ) Ь-пара-Гуанидинофенилаланин
рьв Ь-Фенилглицин
СЬа Ь-Циклогексилаланин
С4а1 Ь-З-Циклобутилаланин
С5а1 Ь-3 -Циклопентилаланин
N16 Ь-Норлейцин
2-Ыа1 Ь-2-Нафтилаланин
1-Ν31 Ь-1 -Нафтилаланин
4С1-РЬе Ь-4-Хлорофенилаланин
ЗС1-Р11С Ь-3 -Хлорофенилаланин
2С1-РЬе Ь-2-Хлорофенилаланин
3,4С12-РЬе Ь-3,4-Дихлорофенилаланин
4Р-Р11е Ь-4-Фторофенилаланин
ЗР-РЬе Ь-3 -Фторофенилаланин
2Г-РЬе Ь-2-Фторофенилаланин
Τΐο 1,2,3,4-Тетрагидроизохинолин-3 -карбоновая кислота
ТЫ Ь-р-2-Тиенилаланин
Тха Ь-2-Тиазолиланапин
Мао Ь-Метионин сульфоксид
АсЬуз Ν-Ацетиллизин
Г)рг 2,3-Диаминопропановая кислота
А2Ви 2,4-Диаминомасляная кислота
ОЪи (8)-2,3-Диаминомасляная кислота
АЬи γ-Аминомасляная кислота (ГАМК)
Айа ε-Аминогексановая кислота
А1Ь а—Аминоизомасляная кислота
- 8 015991
Υ(Βζ1) Б-О-Бензилтирозин
Βίρ Б-(4-фенил)фенилаланин
8(Βζ1) Б-О-Бензилсерин
Τ(Βζ1) Е-О-Бензилтреонин
ЬСЬа Б-Гомо-циклогекси лаланин
ЬСуз Е-Гомо-дистеин
Ь8ег Е-Гомо-серин
ЬАг§ Б-Гомо-аргинин
ЬРЬе Б-Гомо-фенилаланин
Вра Ε-4-Бензоилфенилаланин
4-АтРугг1 (28,48)-4-Амино-пирролидиы-Е-карбоновая кислота
4-АтРугг2 (28,4К)-Амино-пирролидин-Ь-карбоновая кислота
4-РЬеРугг1 (2845К)-4-Фенил-пирролидин-Ь-карбоновая кислота
4-РЬеРугг2 (28,58)-4-Фенил-пирролидин-Ь-карбоновая кислота
5-РЬеРугг1 (28,5К.)-5-Фенил-пирролидин-Е-карбоновая кислота
5-РЬеРугг2 (28,58)-5-Фенил-пирролидин-Ь-карбоновая кислота
Рго(4-ОН)1 (48)-Е-Г идроксипролин
Рго(4-ОН)2 (4К)-Ь-Гидроксипролин
Ρίρ Е-Пиперидин-Н-карбоновая кислота
°Ρίρ Р-Пиперидин-И-карбоновая кислота
ОсЮ Е-Октилглицин
ΝΟΙγ Ν-Метилглицин
МсРЬс Ε-Ν-Метилфенилаланин
МеМе Б-К-Метилнорлейшш
МеА1а Ь-М-Метилаланин
МеПе Ε-Ν-Метилизолейцин
МеУа1 Б-Н-Метилвалин
МеЬеи Б-К-Метиллейцин
ϋπηΚ Ь-(Ы' ,Ν' Диметил)-лизин
Ьргр Б-Пиперазиновая кислота
ϋρζρ ϋ-Пиперазиновая кислота
кот Б-(ЪГ ,БГ-диизобутил)-орнитин
Р1рА1а Ь-2-(4'-пиперидинил)-аланин
Р1ггА1а Ь-2-(3'-пирролидинил)-аланин
Атрс 4-Амино-пиперидин-4-карбоновая кислота
ΝΜεΚ Б-Ν -Метиларгинин
ΝΜβΚ Ι,-Ν-Метиллизин
ИМсРЬс Б-Х-Метилфенилаланин
1Ре§К Б-2 -Амино- 6- {2 -[2-(2-метокси- этокси)этокси]ацетиламино} -гексановая кислота
8Ре§К Ь-2-Амино-6-[2-(2-метокси-этокси)-ацетиламино]гексановая кислота
ОаЬ 1,-2,4-Диамт1Номасляная кислота
1Ре§ОаЬ Б-2-Амино-4{2-[2-(2-метокси-этокси)-этокси]- ацетиламино}-масляная кислота
8Ре§ОаЬ Ь-2-Амино-4[2-(2-метокси-этокси)-ацетиламино] масляная кислота
4-РугА1а Ь-2-(4'Пиридил)-аланин
ОтРуг Б-2-Амино-5-[(2'карбонил1шразин)]амино- пентановая кислота
ВпО Ν-Бензилглицин
А11оТ Алло-Треонин
Аос 2-(8)-Аминооктановая кислота
Сра Б-Цикло-Пропилаланин
- 9 015991
Обычно, пептидная цепь Ζ в β-шпилечных миметиках согласно изобретению включает 12 аминокислотных остатков. Положения с Р1 по Р12 каждого аминокислотного остатка в цепи Ζ однозначно определены следующим образом: Р1 представляет собой первую аминокислоту в цепи Ζ, то есть связана своим Ν-концом с С-концом матриц.
Наиболее предпочтительны в положениях от 1 до 12 α-аминокислотные остатки:
- Р1: А1а, Сй, ТЬг, Азр, О1и;
- Р2: Тгр, Туг;
- РЗ: Не, Уа1, №е, СИ®, Ска;
- Р4: ОаЬ, Ьуз, СИп;
- Р5: Ьуз, ОаЬ, От;
- Р6: ОаЬ, °ОаЬ; Ьуз;
- Р7: Из, Ьуз, СНп, ОаЬ;
- Р8: Туг, Τιρ, 8ег;
- Р9 ОаЬ, Ьуз;
- РЮ: ОаЬ, Ьуз;
- Р11: А1а, АЬи.ТЪг, С1у, Рго, Нзе, Не, Ννη, °А1а, °Уа1, Л1Ь, Ы1е,
Οψ, СЬа, О1п, Азр, СНи, Сра, ΐ-ВиСт, Ьеи, Уа1, Азп;
- Р12: ОаЬ, Ьуз, СИп, Зег;
- в положениях Р6, РЮ и Р11 возможны ϋ-изомеры.
Особенно предпочтительные β-шпилечные пептидомиметики изобретения включают те, которые описаны в примерах 1, 2, 6, 16, 19, 22, 24, 25, 28, 29, 32, 35, 40, 41, 49, 50.
Процессы получения β-шпилечных пептидомиметиков по изобретению могут быть преимущественно проведены как параллельные матричные синтезы, для получения библиотек закрепленных на матрице β-шпилечных пептидомиметиков упомянутой выше общей формулы I. Такие параллельные синтезы позволяют получить наборы многочисленных (в норме от 24 до 192, обычно - 96) соединения общей формулы I с высоким выходом и определенной чистотой, минимизируя образование димерных и полимерных побочных продуктов. Правильный выбор функционализированного твердого носителя (т. е. твердый носитель плюс молекула линкера), матриц и мест циклизации в связи с этим играет ключевую роль.
Функционализированный твердый носитель удобно получают из поперечносшитого полистирола с дивинилбензолом (предпочтительно 1-5%); полистирола, покрытого спейсерами полиэтилегликоля (Теп1аде1К); и полиакриламидных смол (также смотрите ОЬгесйЬ Ό.; У111а1догбо, Т-М. 8оНб- 8ирройеб СотЬша1ойа1 аиб Рага11е1 8уп1йез1з οί 8та11-Мо1еси1аг-ЭДе1дй1 Сошроипб ЫЬтайез, Тейайебгоп Отдашс Сйеткйу 8епез, Уо1. 17, Регдашоп, Е1зеу1ет 8с1епсе, 1998).
Твердый носитель функционализирован при помощи линкера, т. е. бифункциональной спейсерной молекулы, которая содержат с одного конца якорную группу для присоединения к твердому носителю и с другого конца избирательно отщепляемую функциональную группу, используемую для последующих химических трансформаций и процессов отщепления. В целях данного изобретения используются два типа линкеров.
Линкеры типа 1 предназначены высвобождать амидную группу в кислых условиях (Клик Н, Те1гайебтоп Ьей. 1987, 28, 3783-3790). Линкеры этого вида образуют амиды карбоксильной группы аминокислот; примеры смол, функционализированных такими линкерными структурами являются 4-[(((2,4диметоксифенил)Ешос-аминометил)феноксиацетамидо)аминометил] Р8 смола, 4-[(((2,4-диметоксифенил)Ешос-аминометил)феноксиацетамидо)аминометил]-4-метилбензгидриламин Р8 смола (амидная полистироловая МВНА смола Ринка) и 4-[(((2,4-диметоксифенил)Ешос-аминометил)феноксиацетамидо)аминометил] бензгидриламин Р8-смола (амидная полистироловая МВНА смола Ринка). Предпочтительно, чтобы носитель был получен из полистирола поперечно сшитого с дивинилбензолом (наиболее предпочтительно 1-5%) и функционализирован при помощи 4-(((2,4-диметоксифенил)Ешосаминометил)феноксиацетамидо) линкера.
Линкеры типа 2 предназначены, в конечном счете, высвобождать карбоксильную группу в кислых условиях. Линкеры этого вида образуют кислотно-лабильные сложные эфиры с карбоксильной группой аминокислот, обычно - лабильны в кислых условиях бензил, бензгидрил и тритил сложные эфиры; примеры таких линкерных структур включают 2-метокси-4-гидроксиметилфенокси (8азйпК Пикет), 4-(2,4диметоксифенилгидроксиметил)фенокси (линкер Ринка), 4-(4-гидроксиметил-3-метоксифенокси) масляная кислота (линкер НМРВ), тритил и 2-хлоротритил. Предпочтительно, чтобы носитель был получен из полистирола поперечно сшитого с дивинилбензолом (наиболее предпочтительно 1-5%) и функционализирован при помощи 2-хлоротритил линкера.
При проведении параллельного матричного синтеза процессы получения β-шпилечных пептидомиметиков согласно настоящему изобретению могут быть проведены успешно так, как это описано здесь ниже, но специалисту в данной области техники будет понятно, каким образом эти методики должны будут модифицироваться в случае, если необходимо синтезировать одно соединение указанной выше
- 10 015991 формулы I.
В ряд реакционных сосудов (в норме от 24 до 192, обычно 96), число которых равно суммарному числу соединений, которые дожны быть синтезированы параллельным методом, загружают от 25 до 1000 мг, предпочтительно 100 мг, подходящего функционализированного твердого носителя, предпочтительно 1-3%, поперечно сшитого полистирола или смолы ТсШадс1.
Используемый растворитель, должен привести к набуханию смолы и включает, но не ограничиваясь, дихлорометан (ИСМ), диметилформамид (ΌΜΕ), Ν-метилпирролидон (ΝΜΡ), диоксан, толуол, тетрагидрофуран (ТНЕ), этанол (ЕЮН), трифтороэтанол (ТЕЕ), изопропиловый спирт и им подобные. Смеси растворителей, содержащие по крайней мере один полярный растворитель (т.е. 20% ТЕЕ/ИСМ, 35% ТНЕ/ΝΜΡ) полезны для обеспечения высокой реакционной способности и сольватации полимерсвязанных пептидных цепей (Е1е1бк, С. В., Е1е1бк, С. С., 1. Ат. Сйет. 8ос. 1991,113, 4202-4207).
С разработкой различных линкеров, которые высвобождают С-концевую карбоксильную группу в мягких кислых условиях, не воздействующих на кислотно-лабильные группы, которые защищают функциональные группы бововых цепей, был сделан значительный прогресс в синтезе защищенных пептидных фрагментов. Линкер - производное 2-метокси-4-гидроксибензилового спирта (линкер 8а8ппк, Мегд1ег е! а1., Те!гайебгоп Ьей. 1988, 29 4005-4008) - отщепляется разбавленной трифторуксусной кислотой (0.5-1% ТЕА в ЭСМ) и устойчив в условиях снятия защиты Етос в течение пептидного синтеза, причем дополнительные защитные группы на основе Вос/!Ви совместимы с этой схемой защиты. Другие линкеры, которые подходят для процесса согласно изобретению, включают суперкислотно-лабильный 4-(2,4диметоксифенил-гидроксиметил)-фенокси линкер (К1пк йикег, Шпк, Н. Тейайейгоп Ьей. 1987, 28, 37873790), когда удаление пептида требует 10% уксусную кислоту в ЭСМ или 0.2% трифторуксусную кислоту в ЭСМ; линкер-производное 4-(4-гидроксиметил-3-метоксифенокси)масляной кислоты (НМРВлинкер, Е1огкйе1тег & Н1П1кег, Рерйбек 1991,1990 131), который также отщепляется 1% ТЕА/ОСМ, давая пептидный фрагмент, содержащий все кисло-лабильные защитные группы боковой цепи; и, особенно, 2хлоротритилхлорид линкер (Ваг1ок е! а1., Те!гайебгоп Ьей. 1989, 30, 3943-3946), который обеспечивает отщепление пептида, используя смесь ледяная уксусная кислота/трифторуксная кислота/ДХМ (1:2:7), в течение 30 мин.
Подходящими защитными группами для аминокислот и, соответственно, для их остатков являются, например:
для аминогруппы, которая,например, также присутствует в боковой цепи лизина)
СЬ/ бензилоксикарбонил;
Вос трет-бутилоксикарбонил;
Етос 9-фторенилметоксикарбонил;
А11ос аллилоксикарбонил;
Теос триметилсилилэтоксикарбонил;
Тсс трихлороэтоксикарбонил;
Νρκ о-нитрофенилсульфонил;
Тг! трифенилметил или тритил;
для карбоксильной группы, которая например, также присутствует в боковой цепи аспарагиновой и глутаминовой кислоты путем перевода в сложные эфиры со спиртовыми компонентами:
!Ви трет-бутил;
Вп бензил;
Ме метил;
Рй фенил;
Рас фенацил;
аллил;
Тке триметилсилилэтил;
Тсе трихлороэтил;
для гуанидиногруппы, которая, например, также присутствует в боковой цепи аргинина)
Ртс 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил;
Тк тозил (т.е. п-толуолсульфонил);
СЬ/ бензилоксикарбонил;
Рй£ пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил;
для гидроксигруппы, которая, например, также присутствует в боковой цепи треонина и серина) !Ви трет-бутил;
Вп бензил;
Тг! тритил;
и для меркаптогруппы, которая, например, присутствует в боковой цепи цистеина)
Аст ацетамидометил;
!Ви трет-бутил;
Вп бензил;
Тг! тритил;
- 11 015991
М1г 4-метокситритил.
9-Фторенилметоксикарбонил-(Ртос)-защищенные производные аминокислот предпочтительно используются в качестве составных элементов для конструирования закрепленных на матрицее βшпилечных петлевидных миметиков формулы I. Для снятия защиты, т.е. отщепления Ртос-группы, могут быть использованы 20% пиперидин в ИМР или 2% ЭЬи/2% пиперидин в ИМР.
Количество реагентов, т.е. производного аминокислоты, составляет обычно от 1 до 20 эквивалентов, по отношению к миллиэквивалентам в грамме (тец/д) загрузки функционализированного твердого носителя (обычно от 0.1 до 2.85 тес.|/д для полистирольных полимеров), первоначально взвешенный в реакционной пробирке. Дополнительные эквиваленты реагентов могут быть использованы при желании для того, чтобы довести реакцию до конца в приемлемое время. Реакционные пробирки вместе с блоком держателя и трубопроводом помещают в резервуарный блок и собирают аппарат. Через трубопровод подают газ, который обеспечивает регулирование среды, например, азот, аргон, воздух и т.п. Поток газа перед подачей в трубопровод может быть нагретым или охлажденным. Нагрев или охлаждение реакционных сосудов достигается нагреванием реакционного блока или внешним охлаждением смесью изопропанол/сухой лед и тому подобным, осуществляя необходимые синтетические реакции. Перемешивание достигается встряхиванием или магнитной мешалкой (внутри реакционной пробирки). Предпочтительные рабочие станции (впрочем, не ограничиваясь ими) ЬаЬкоитсе'к СотЫ-сйет к1айоп и МиШкуп Тесй'к-8уго куп111ек1/ег.
Образование амидной связи требует активации α-карбоксильной группы на этапе ацилирования. Когда такую активацию проводят посредством обычно используемых карбодиимидов, таких как дициклогексилкарбодиимид (ОСС, 811ее11ап & Некк, 1. Ат. Сйет. 8ос. 1955, 77, 1067-1068) или диизопропилкарбодиимид ОС, 8агап!ак1к е! а1 Вюсйет. Вюрйук. Век. Соттип.1976, 73, 336-342), полученные в результате дициклогексилмочевина и диизопропилмочевина являются нерастворимыми и, соответственно, растворимыми в обычно используемых растворителях. В разновидности карбодиимидного метода 1гидроксибензотриазол (НОВ!, Кошд & Ое1дег, Сйет. Вег 1970, 103, 788-798) включен в качестве добавки к взаимодействующей смеси. НОВ! предотвращает дегидрирование, подавляет рацемизацию активированных аминокислот и действует в качестве катализатора для ускорения медленных реакций присоединения. Определенные фосфониевые реагенты были использованы как основные связывающие реагенты, такие как бензотриазол-1-ил-окси-трис-(диметиламино)-фосфония гексафторофосфат (ВОР, Сак!го е! а1., Тейайебгоп Ьей. 1975, 14, 1219-1222; 8уп!йек1к, 1976, 751-752), или бензотриазол-1-ил-окси-триспирролидинофосфония гексафторофосфат (Ру-ВОР, Сок!е е! а1., Тейайебгоп Ьей. 1990, 31, 205-208), или 2-(1Н-бензотриазол-1-ил-)1,1,3,3-тетраметилурана тетрафтороборат (ТВТИ), или гексафторофосфат (НВТи, Кпогг е! а1., ТейайеФоп ЬеП. 1989, 30, 1927-1930), или 1-бензотриазол-1-[бис(диметиламино)метилен]-5-хлоро-гексафторофосфат-1,3-оксид (НСТИ); эти фосфониевые реагенты также подходят для образования ш кйн сложных эфиров НОВ! с защищенными производными аминокислот. Совсем недавно также были использованы как связывающие реагенты дифеноксифосфорила азид (ΌΡΡΑ) или О-(7-азабензотриазол-1-ил)-Н,Х,Х',Х'-тетраметилуарана тетрафтороборат (ТАТИ) или О-(7-аза-бензотриазол-1ил)-Н,Х,Х',Х'-тетраметилурана гексафторофосфат (НАТИ)/7-аза-1-гидроксибезотриазол (НОА!, Сатрто е! а1., Тейайебгоп ЬеП. 1994, 35,2279-2281).
Из-за того факта, что существенным является почти количественное протекание реакции, желательно получить экспериментальное доказательство завершения реакций. Тест с использованием нингидрина (Ка1кег е! а1., Апа1. ВюсйетМгу 1970, 34, 595), при котором положительный колориметрический ответ на аликвоту связанного со смолой пептида указывает качественно на присутствие первичного амина, легко и просто может быть осуществлен после каждого этапа присоединения. Химия Ртос позволяет провести спектрофотометрическую определение хромофора Ртос, когда он высвобождается с основанием (Ме1еп1юГег е! а1., 1п!. 1. Рерйбе Рто!еш Век 1979,13, 35-42).
Связанное со смолой промежуточное вещество каждой реакционной пробирки отмывается от избытка оставшихся реагентов или растворителей, и побочных продуктов путем повторной обработкой чистым растворителем одним или двумя следующими методами:
1) реакционные сосуды заполняют растворителем (предпочтительно, 5 мл), реакционные пробирки вместе с блоком держателя и трубопроводом погружаются и перемешиваются в течение 5-300 мин, предпочтительно 15 мин, после чего растворителю дают стечь, а затем остатки удаляют под действием давления газа, подаваемого через входной вентиль трубопровода (при закрытом выходном);
2) трубопровод удаляется из блока держателя, аликвоты растворителя (предпочтительно 5 мл) вносят через верх реакционных пробирок и дают ему стечь через фильтр в принимающий сосуд, такой как пробирка или склянка.
Обе из упомянутых выше методик промывки повторяются до 50 раз (предпочтительно, около 10 раз), при этом контролируется удаление реагентов, растворителей и побочных продуктов такими методами, как ТСХ (тонкослойная хроматография), ГХ (газовая хроматография), или исследованием промывных вод.
Выше описанная методика реакции связанного со смолой соединения с реагентами внутри реакци
- 12 015991 онных сосудов, с последующим удалением избытка реагентов, побочных продуктов и растворителей, повторяется с каждым последующим превращением, до тех пор, пока не будет получен конечный связанный со смолой полностью защищенный линейный пептид.
До того как этот полностью защищенный линейный пептид будет удален с твердого носителя, возможно, при желании, избирательно снять защиту с одной или нескольких защищенных функциональных групп, присутствующих в молекуле и соответствующим образом заместить реакционноспособные группы, освобожденные таким образом. С этой целью рассматриваемые функциональные группы (а) должны быть изначально защищены защитными группами, которые могут быть избирательно удалены без воздействия на оставшиеся присутствующие защитные группы. А11ос (аллилоксикарбонил) является примером такой аминозащитной группы, которая может быть избирательно удалена, например, при помощи Рб° (палладиевый катализатор) и фенилсилана в СН2С12 (дихлорметан) без воздействия на оставшиеся защитные группы, присутствующие молекулы, такие как Ртос. Реакционноспособные группы, освобождаемые таким образом, затем могут быть обработаны агентом, подходящим для введения желаемого заместителя. Таким образом, например, аминогруппа может быть ацилирована при помощи ацилирующего агента, соответствующего вводимому ацильному заместителю. Для образования пегилированных аминокислот, таких как 1РедК, ог 8РедК, предпочтительно применяется раствор 5 эквивалентов НАТи (Ν[(диметиламино)-1Н-1,2,3-триазоло[4,5-Ь]пиридин-1-илметилен]-Ы-метилметанамина гексафторофосфат Ν-оксид) в сухом ΌΜΡ и раствор 10 эквивалентов О1РЕА (Диизопропила этиламин) в сухом ΌΜΡ и 5 эквивалентов 2-[2-(2-метоксиэтокси)этокси]уксусная кислота (1Ред) и, соответственно, 2-(2метоксиэтокси)уксусная кислота (кРед), с высвобождением аминогруппы соответствующей аминокислотной боковой цепи за 3 часа. Методика после этого повторяется за следующие 3 ч со свежим раствором реагентов после фильтрации и промывки полимера.
Перед отщеплением этого полностью защищенного линейного пептида с твердого носителя, также возможно, при желании, образовать межцепочечную связь(и) между боковыми цепочками соответствующих аминокислотных остатков при противоположных положениях области β-цепи.
Межцепочечные связи и их образование обсуждались выше в связи с толкованиями, данными для рассматриваемых групп типа Н, которые могут быть, например, дисульфидными мостиками, образованными цистеиновыми и гомоцистеиновыми остатками при противоположных положениях β-цепи; или лактамными мостиками, образованными остатками глутаминовой и аспарагиновой кислот, связанными с остатками орнитина и, соответственно, лизина, либо остатками глутаминовой кислоты, связаннымис остатками 2,4-диаминомасляной кислоты, расположенные в противоположных положениях β-цепи при помощи образования амидной связи. Образование таких межцепочечных связей может быть осуществлено с использованием хорошо известных методов.
Для образования дисульфидных мостиков предпочтительно используют раствор 10 эквивалентов раствора йода в ΌΜΡ или в смеси СН2С12 /МеОН в течение 1,5 ч, потом этот процесс повторяется в течение 3 ч со свежим раствором йода после фильтрации раствора йода, или в смеси ΌΜ8Ο и уксусной кислоты, где при помощи 5% №1НС.'О3, создана рН 5-6, в течение 4 ч, или в воде после того, как рН доведется до 8, перемешиванием в течение 24 ч с раствором гидроксида аммония или буфером ацетата аммония с рН, доведенным до 8, в присутствии воздуха, или в растворе ΝΜΓ и три-н-бутилфосфина (предпочтительно 50 экв.).
Открепление полностью защищенного линейного пептида с твердого носителя достигается погружением реакционных пробирок вместе с блоком держателя и трубопроводом в реакционные сосуды, содержащие раствор отщепляющего реагента (предпочтительно от 3 до 5 мл). Поток газа, температурный контроль, перемешивание и мониторинг реакции осуществляются так, как описано выше, и как требуется для достижения эффекта реакции отщепления. Реакционные пробирки вместе с блоком держателя и трубопроводом вынимаются из резервуарного блока и поднимаются выше уровня раствора, но ниже верхнего края реакционных отсеков, подается поток газа через входной вентиль коллектора (при закрытом выходном), для эффективного вытеснения раствора конечного продукта в резервуарные отсеки. Смолу, оставшуюся в реакционных пробирках, затем промывают от 2 до 5 раз, как описано выше, 3-5 мл подходящего растворителя, для выделения (отмывания) как можно больше отщепленного продукта. Растворы продукта, полученные таким образом, объединяются, избегая смешения. Независимые растворы/экстракты затем обрабатываются таким образом, чтобы выделить конечные соединения. Типичные процедуры включают, без ограничений, выпаривание, концентрирование, экстракция жидкость/жидкость, окисление, подщелачивание, нейтрализация или дополнительные реакции в растворе.
Растворы, содержащие полностью защищенные производные линейного пептида, которые были отщеплены с твердого носителя и нейтрализуются основанием и выпариваются. Затем осуществляется циклизация в растворе с такими растворителями, как ЦСМ, ΌΜΡ, диоксан, ТНР и другими. Для циклизации можно использовать различные агенты присоединения, указанные выше. Циклизация проходит в течение 6-48 часов, предпочтительно примерно 16 часов. За реакцией наблюдают, например, методом КР-НРЬС (обращено-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография). Затем растворитель удаляется выпариванием, а полностью защищенное циклическое пептидное производное растворяется в рас
- 13 015991 творителе, который не смешивается с водой, таким как ЭСМ. и раствор экстрагируется водой или смесью смешиваемых с водой растворителей, для того чтобы удалить любой избыток к. связывающего реагента.
Наконец, полностью защищенное пептидное производное обрабатывается 95% ТРА, 2.5% Н2О, 2.5% Т18 или другим сочетанием реагентов, осуществляя отщепление защитных групп. Время реакции отщепления обычно от 30 мин до 12 ч, предпочтительно 2,5 ч. Летучие компоненты выпариваются досуха, и необработанный пептид растворяется в 20% АсОН (уксусной кислоте) в воде и экстрагируется изопропиловым эфиром или другими растворителями, которые подходят для этого. Водный слой собирается и выпаривается досуха и циклическое пептидное производное формулы I с полностью снятой защитой получается в качестве конечного продукта. В зависимости от его чистоты пептидное производное может быть использовано для биологических тестов, или должен быть очищен дальше, например при помощи препаративной ВЭЖХ (Высоко-Эффективной Жидкостной Хроматографии).
В качестве варианта открепления с твердого носителя циклизация и полное снятие защиты полностью защищенного пептида может быть достигнуто вручную в стеклянном сосуде.
Как указывалось выше, затем возможно, при желании, превратить полученный таким образом продукт формулы I с полностью снятой защитой в фармацевтически приемлемую соль или превратить фармацевтически приемлемую или неприемлемую соль, полученную таким образом, в соответствующее свободное соединение формулы I или в другую фармацевтически приемлемую соль. Любая из этих процедур может быть проведена хорошо известными в этой области методами.
Матричные исходные соединения формулы II, используемые в процессах настоящего изобретения, предварительные исходные соединения и получение этих исходных и предварительных соединений описано в Международной заявке РСТ/ЕР02/01711, опубликованной как \УО 02/070547 А1.
β-шпилечные пептидомиметики изобретения могут быть использованы в широком диапазоне, в соответствии с их способностью подавлять рост или убивать микроорганизмы. В частности, они могут использоваться, чтобы избирательно ингибировать рост или убивать микроорганизмы, такие как Ркеийотопак аегидтока.
Они могут быть использованы, например, как дезинфицирующие вещества или как антисептики для таких материалов, как продукты питания, косметика, медикаменты и другие материалы, содержащие питательные вещества. β-шпилечные пептидомиметики настоящего изобретения могут быть также использованы для лечения или профилактики болезни, вызванной микробными инфекциями растений и животных.
Для того чтобы использоваться как дезинфицирующие вещества или антисептики, β-шпилечные пептидомиметики могут быть отдельно добавлены к желаемому материалу, как смеси нескольких βшпилечных пептидомиметиков или вместе с другими противомикробными агентами. β-шпилечные пептидомиметики могут применяться в чистом виде или могут быть применены в форме подходящей композиции с носителем, разбавителем или вспомогательными веществами, хорошо известными в данной области.
При использовании для лечения или профилактики инфекций или заболеваний, связанных с этими инфекциями, особенно инфекций, связанных с респираторными заболеваниями, такими как кистозный фиброз, эмфизема и астма; инфекций, связанных с заболеваниями кожи или мягких тканей, таких как послеоперационные раны, травматические раны и ожоговые раны; инфекций, связанных с желудочнокишечными заболеваниями, такими как эпидемическая диарея, некротический энтероколит и тифлит; инфекций, связанных с глазными заболеваниями, такими как кератит и эндофтальмит; инфекций, связанных с ушными заболеваниями, такими как отит; инфекций, связанных с заболеваниями ЦНС, такими как абсцесс головного мозга и менингит; инфекций, связанных с костными заболеваниями, такими как остеохондроз и остеомиелит; инфекций, связанных с сердечно-сосудистыми заболеваниями, такими как эндокардит и перикардит; инфекций, связанных с мочеполовыми болезнями, такими как эпидидимит, простатит и уретрит; β-шпилечные пептидомиметики могут применяться отдельно, как смеси нескольких β-шпилечных пептидомиметиков, вместе с другими противомикробными агентами или антибиотиками, или противоопухолевые агенты, или антивирусные (например, анти-ВИЧ) агенты, или вместе с другими фармацевтически активными агентами. β-шпилечные пептидомиметики могут применяться в чистом виде или как фармацевтические композиции.
Фармацевтические композиции, содержащие β-шпилечные пептидомиметики согласно изобретению могут быть изготовлены при помощи стандартного смешивания, растворения, гранулирования, получения покрытых оболочкой таблеток, растирания в порошок, эмульгирования, инкапсулирования, включения (еШгарртд) или лиофилизации. Фармацевтические композиции можно составить традиционным способом, при использовании одного или более физиологически применимых носителей, растворителей, наполнителей или вспомогательных веществ или оборудование, которые облегчают технологию изготовления β-шпилечных пептидомиметиков в производстве, которое может быть использовано фармацевтически. Правильная технология приготовления зависит от выбранного метода введения.
Для местного введения р-шпилечные пептидомиметики настоящего изобретения могут быть полу
- 14 015991 чены в виде растворов, гелей, мазей, кремов, суспензий, и в других хорошо известных формах.
Составы для системного введения включают те, которые предназначены для введения с помощью инъекции, например, подкожные, внутривенные, внутримышечные, интратекальные и внутрибрюшные инъекции, а также те составы, которые предназначены для трансдермального, трансмукозального, перорального или пульмонального введения.
Для инъекций β-шпилечные пептидомиметики настоящего изобретения можно вводить в растворах требуемого качества, предпочтительно в физиологически сочетаемых буферах, таких как раствор Хинка, раствор Рингера, или физиологический соляной раствор. Раствор может содержать суспендирующие, стабилизирующие и/или агенты, способствующие распределению. Альтернативно, β-шпилечные пептидомиметики настоящего изобретения могут быть в форме порошка в сочетании с подходящим носителем, например, стерильной апирогенной водой.
Для трансмукозального введения, в составе используют вещества, способствующие проникновению через соответствующий барьер, хорошо известные в данной области техники.
Для перорального введения, соединения могут быть легко получены объединением активных βшпилечных пептидомиметиков согласно изобретению с фармацевтически приемлемыми носителями, хорошо известными в этой области. Такие носители обеспечивают получение β-шпилечных пептидомиметиков согласно изобретению в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т.д., для перорального приема внутрь пациента, который подвергается лечению. Для пероральных составов, таких как, например, порошки, капсулы и таблетки, подходящие вспомогательные вещества включают наполнители, такие как сахара (такие как лактоза, сахароза, маннит и сорбит); целлюлозные препараты (кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, томатный крахмал, желатин, трагантовая камедь, метил целлюлоза, гидроксипропилметил целлюлоза, натрия карбоксиметилцеллюлоза и/или поливинилпирролидон (РУР); гранулирующие вещества; и связывающие вещества. При желании могут быть добавлены дезинтегрирующие вещества, такие как поперечно сшитые поливинилпирролидоны, агар, или альгиновая кислота либо ее соль, такая как альгинат натрия. При желании твердые лекарственные формы могут быть покрыты сахаром или кишечно-растворимым покрытием, используя стандартные методы.
Для пероральных препаратов в виде жидкостей, таких как, например, суспензии, эликсиры и растворы, подходящие носители, вспомогательные вещества или разбавители включают воду, гликоли, масла, спирты и т.д. Вдобавок могут быть добавлены ароматизаторы, консерванты, красители и другие подобные вещества.
Для трансбуккального введения состав может быть в форме таблеток, пастилок и т.д. с обычно применимой в таких случаях рецептурой.
Для применения в виде ингаляций р-пшилечные пептидомиметики согласно изобретению обычно производят в форме аэрозольного спрея, находящегося в упаковках под давлением или небулайзере, с использованием подходящих пропеллентов, например, дихлородифторометана, трихлорофторометана, углекислого газа или другого подходящего газа. В случае аэрозоля, находящегося под давлением, единица дозы может быть определена путем обеспечения клапана, выпускающего дозированное количество. Капсулы и картриджи (например, с желатином) для применения в ингаляторах и инсуффляторах могут быть созданы с содержанием порошковой смеси β-шпилечных пептидомиметиков изобретения и подходящей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал.
Соединения могут быть также созданы в формах, предназначенных для ректального или вагинального применения, таких как суппозитории вместе с подходящей основой, такой как какао-масло или другие глицериды.
Вдобавок к лекарственным формам, описанным выше, β-шпилечные пептидомиметики согласно изобретению могут быть также созданы в форме препаратов пролонгированного действия. Такие долго действующие препараты могут быть введены при помощи имплантации (например, подкожно или внутримышечно) или при помощи внутримышечной инъекции. Для производства таких препаратов пролонгированного действия β-шпилечные пептидомиметики согласно изобретению могут быть скомбинированы с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, как эмульсия в приемлемом масле) или ионообменными смолами, или как умеренно растворимые соли.
Вдобавок, могут быть применены другие фармацевтические системы доставки, такие как липосомы и эмульсии, хорошо известные в этой области. Также могут быть применены определенные органические растворители, такие как диметилсульфоксид. Дополнительно, β-шпилечные пептидомиметики согласно изобретению можно вводить, используя систему с замедленным высвобождением, такую как полупроницаемая матрица твердых полимеров, содержащих терапевтический средство. Различные материалы замедленного высвобождения были разработаны и хорошо известны специалистам в этой области. Капсулы замедледленного высвобождения, в зависимости от их химической природы, могут высвобождать вещества в течение нескольких недель, вплоть до 100 дней. В зависимости от химической природы и биологической устойчивости терапевтического средства, могут быть применены дополнительные методики по стабилизации белка.
- 15 015991
Так как β-шпилечные пептидомиметики согласно изобретению могут содержать заряженные остатки, они, как таковые или их фармацевтически приемлемые соли, могут быть включены в любые формы описанных выше лекарственных форм. Фармацевтически приемлемые формы имеют тенденцию к большей растворимости в водных и других протонных растворителях, чем соответствующие свободные формы.
β-Шпилечные пептидомиметики согласно изобретению или их композиции в основном используются в эффективном, для достижения намеченной цели, количестве. Должно быть ясно, что используемое количество будет зависеть от конкретного применения.
Например, для использования в качестве дезинфицирующего средства или консерванта применяется или добавляется к дезинфицируемому или защищаемому материалу эффективное против микробов количество β-шпилечных пептидомиметиков изобретения или их композиций. Под эффективным противомикробным количеством подразумевается количество β-шпилечных пептидомиметиков настоящего изобретения или их композиций, которое ингибирует рост или приводит к смерти популяции микробов. Наряду с тем, что эффективное противомикробное количество будет зависеть от области применения, для использования в качестве дезинфицирующих средств или консервантов β-шпилечные пептидомиметики изобретения или их композиции обычно применяются или добавляются к дезинфицируемому или защищаемому материалу в относительно малых количествах. Обычно β-шпилечные пептидомиметики настоящего изобретения включают менее 5 вес.% дезинфицирующего раствора или консервируемого материала, предпочтительно меньше 1 вес.% и еще предпочтительнее менее 0.1 вес.%. Специалист в этой области техники сможет определить эффективное противомикробное количество специфических βшпилечных пептидомиметиков изобретения для специфического применения без проведения неуместных экспериментов, используя, например, ίη νίίτο образцы, представленные в примерах.
β-Шпилечные пептидомиметики настоящего изобретения или их композиции для лечения или профилактики микробных инфекций или болезней, связанных с ними, вводят или применяют в терапевтически эффективном количестве. Под терапевтически эффективным количеством подразумевается количество, эффективное для улучшения симптомов или для улучшения, лечения либо профилактики микробных инфекций или болезней, связанных с этими инфекциями. Определение терапевтически эффективного количества хорошо известно специалистам в данной области, особенно, принимая во внимание данное здесь подробное описание.
Как и в случае дезинфицирующих средств и консервантов, для локального применения для лечения или профилактики бактериальной инфекции терапевтически эффективное количество может быть определено, используя, например, ίη νίίτο образцы, представленные в примерах. Лечение может быть назначено тогда, когда заболевание очевидно, или, как часто случается, когда обычный специалист в этой области может определить терапевтически эффективное количество для лечения локальных инфекций без проведения неуместных экспериментов.
Для системного применения терапевтически эффективная доза может быть оценена изначально по образцам ίη νίίτο. Например, дозировка может быть разработана на моделях животных, чтобы достигнуть постоянно циркулирующего интервала концентрации β-шпилечных пептидомиметиков, который включает 1С50, которая определена в клеточной культуре (т.е. концентрация контрольного соединения, которая летальна для 50% клеточной культуры), М1С (минимальная доза ингибитора), которая определена в клеточной культуре (т.е. концентрация контрольного соединения, которая летальна для 100% клеточной культуры). Такая информация может быть использована для того, чтобы точно определить пригодные для человека дозы.
Первичные дозировки также могут быть определены из данных ίη νίνο, например, на моделях животных, используя методики, которые хорошо известны в данной области техники. Любой специалист, обладающий обычными знаниями в данной области, может легкооптимизировать применение лекарственного препарата у человека, на основании данных, полученных на животном.
Дозировка для применения в качестве противомикробного средства может быть подобрана индивидуально, чтобы обеспечить уровень β-шпилечных пептидомиметиков настоящего изобретения в плазме, достаточный для поддержания терапевтического эффекта. Терапевтически эффективный уровень в сыворотке может быть достигнут введением многократных доз каждый день.
В случаях локального применения или избирательного поглощения эффективная локальная концентрация β-шпилечных пептидомиметиков настоящего изобретения может быть несвязанной с концентрацией в плазме. Любой специалист в этой области сможет оптимизировать терапевтически эффективные локальные дозировки без проведения неуместных экспериментов.
Введенное количество β-шпилечных пептидомиметиков будет, конечно, зависеть от конкретного пациента, от его веса, серьезности заболевания, способа введения и мнения лечащего врача.
Противомикробная терапия может периодически повторяться, пока инфекция определяется или даже если она не определяется. Данная терапия может проводиться самостоятельно или в сочетании с другими препаратами, например, антибиотиками или другими противомикробными средствами.
Обычно терапевтически эффективная доза β-шпилечных пептидомиметиков, описанных здесь,
- 16 015991 обеспечивает терапевтический эффект, не вызывая существенной токсичности.
Гемолиз эритроцитов часто применяется для оценки токсичности родственных соединений, таких как протегрин или тахиплезин. Значения даны как процент лизиса эритроцитов, наблюдаемое при концентрации 100 мкг/мл. Типичные значения, наблюдаемые для катионных пептидов, таких как протегрин и тахиплезин, находятся в пределах 30-40% со средним М1С-значением 1-5 мкг/мл в широком диапазоне патогенов. Обычно β-шпилечные пептидомиметики изобретения показывают гемолиз в районе 0.5-5%, часто в районе 1-5%, при уровне активности, сравнимом с указанным выше для протегрина и тахиплезина. Таким образом, предпочтительные соединения показывают низкие М1С-значения и низкий процент гемолиза эритроцитов, наблюдаемом при концентрации 100 мкг/мл.
Токсичность β-шпилечных пептидомиметиков настоящего изобретения здесь может быть определена при помощи стандартных фармацевтических методов в клеточных культурах или на экспериментальных животных, например, путем определения ЬО50 (доза, летальная для 50% популяции) или ЬО100 (доза, летальная для 100% популяции). Соотношение дозы между токсичным и терапевтическим эффектом называется терапевтическим индексом. Предпочтительны соединения, которые показывают высокие терапевтические индексы. Данные, полученные на основе образцов этих клеточных культур и изучениях на животных, могут быть использованы для расчета диапазона дозировок, не токсичных при использовании на человеке. Дозировка β-шпилечных пептидомиметиков изобретения предпочтительно колеблется в районе постоянно циркулирующих концентраций, который включает эффективную дозу с маленькой токсичностью или вообще нетоксичную. Дозировка может варьироваться внутри интервала, зависящего от дозировки использованной формы и применяемого пути введения. Точная рецептура, путь введения и доза могут быть определены личным лечащим врачом, принимая во внимание состояние пациента (смотрите, например, Ешд1 е! а1. 1975, Ιη: Тйе Рйагтасо1од1са1 Ва818 οί Тйегареийсб, Сй.1, р.1).
Следующие примеры наиболее детально иллюстрируют изобретение, но никоим образом не ограничивают его. В этих примерах используются следующие сокращения:
НВТИ: 1-бензотриазол-1-ил-тетраметилурана гексафторофосфат (Кпогг е! а1. Те!гайебгоп йей. 1989, 30, 1927-1930); НСТИ: 1-бензотриазол 1-[бис(диметиламино)метилен] -5-хлоро-гексафторофосфат-1,3оксид НОВ!: 1-гидроксибензотриазол; ΌΙΕΑ: диизопропилэтиламин; НО АТ: 7-аза-1-гидроксибензотриазол; НАТИ: О-(7-аза-бензотриазол-1-ил)-П,НП',П'-тетраметилурана гексафторофосфат (Сагрто е! а1. Те!гайебгоп Ьей. 1994, 55, 2279-2281).
Примеры
1. Пептидный синтез.
Связывание первого защищенного аминокислотного остатка со смолой В сухую колбу вносят 0.5 г 2-хлоротритилхлоридной смолы (Ваг1оз е! а1. Те!гайебгоп Ьей. 1989, 30, 3943-3946) (0.83 мМоль/г, 0.415 ммоль). Смолу суспендируют в СН2С12 (2.5 мл) и оставляют набухать при комнатной температуре при постоянном перемешивании в течение 30 мин. Смола была обработана 0.415 мМоль (1экв) первого соответствующим образом защищенного аминокислотного остатка (смотри ниже) и 284 мкл (4экв) диизопропилэтиламина (ΌΙΕΑ) в СН2С12 (2.5 мл), смесь встряхивали при 25°С в течение 4 ч. Смолу встряхивали (СН2С12/МеОН/Э1ЕА : 17/2/1), 30 мл в течение 30 мин; затем в следующем порядке промыли с СН2С12 (1х), ЭМЕ (1х), СН2С12 (1х), МеОН (1х), СН2С12(1х), МеОН (1х), СН2С12 (2х), Е!2О (2х) и высушивали под вакуумом в течение 6 часов. Загрузка обычно составляет 0.6-0.7 мМоль/г.
Предварительно была получена следующая смола: Етос-Рго-2-хлоротритиловая смола.
Синтез полностью защищенного пептидного фрагмента.
Синтез проводят на пептидном синтезаторе 8уго (МиЙ18уп!есй), используя от 24 до 96 реакционных сосудов. В каждый сосуд было помещено 60 мг (вес смолы до загрузки) упомянутой выше резины. Следующие циклы реакции были запрограммированы и проведены:
Реагент
СН2СЬ, промывка и набухание (вручную)
ΌΜΡ, промывка и набухание % пиперидин/ΌΜΡ
ΌΜΚ, промывка экв. Ртос аминокислота/ОМР + 5 экв. нети + 5 экв. ΌΙΕΑ
ОМР, промывка
СНгСЕ, промывка (в конце синтеза)
Этап
Время х 1 мин. 1x5 мин. 2x5 мин. 5x2 мин.
х 60 мин.
4x2 мин.
3x2 мин.
Этапы с 3 до 6 повторяются для добавления каждой последующей аминокислоты.
После того как будет закончен синтез полностью защищенного пептидного фрагмента, последовательно применили для получения пептидов процедуры отщепления, циклизации и обработки, как описано здесь ниже.
Аналитические методы:
- 17 015991
Метод 1. Было определено время удерживания на аналитической ВЭЖХ (ВУ, в минутах), используя 1ирйег Рго1ео колонку (90А, 150 х 2.0 тт, соб. 00Б4396-В0 - РБепотепех) со следующими растворителями А (Н2О + 0.1% ТЕА) и В (СН;С\ + 0.1% ТБЛ) и градиент: 0 мин.: 95%А, 5%В; 20 мин: 40%А 60%В; 21-23 мин: 0%А, 100%В; 23.1-30 мин: 95% А, 5%В.
Ме11юб 2. Было определено время удерживания на аналитической ВЭЖХ (ВУ, в минутах), используя АццЦу ИРЬС ВЕН С18 колонку (1.7 цт, 100x2.1 тт, соб. 186002352 - \Уа1ег5) со следующими растворителями А (Н2О + 0.1% ТЕЛ) и В (СН3СИ + 0.085% ТЕЛ) и градиент: 0 мин.: 95%А, 5%В; 0.2 мин.: 95%А 5%В; 4 мин.: 35%А, 65%В; 4.2 мин.: 5% А, 95%В; 4.25 мин.: 95%А, 5%В; 4.9 мин.: 95%А, 5%В.
Процедура: отщепление, циклизации и обработки пептидов с циклизованной основной цепью.
Отщепление, циклизация основной цепи и очистка пептида.
После сборки линейных пептидов смола была суспендирована в 1 мл (0.39 мМоль) 1% ТЕА в СН2С12 (ν/ν) в течение 3 мин и отфильтрована, фильтрат был нейтрализован 1мл (1.17 мМоль, 3экв.) 20% ΌΙΕΑ в СН2С12 (ν/ν). Эту процедуру повторили дважды, добиваясь завершения отщепления. Смола была промыта 2 мл СН2С12. Слой СН2С12 выпарили досуха.
Полностью защищенный линейный пептид растворили в 8 мл сухого ΌΜΡ. Затем к пептиду добавили 2 экв. НАТИ в сухом ΌΜΡ (1 мл) и 4 экв. Э1РЕА в сухом ΌΜΡ (1 мл), затем перемешивание в течение 16 ч. Летучие компоненты выпаривались досуха. Необработанный циклический пептид растворили в 7 мл СН2С12 и экстрагировали 10% ацетонитрилом в воде (4.5 мл) три раза. Слой СН2С12 выпаривали досуха. Чтобы полностью снять защиту с пептида, добавили 3 мл расщепляющей смеси ТЕА:Т1Б:Н2О (95:2.5:2.5) и полученная смесь перемешивалась в течение 2.5 ч. Летучие компоненты были выпарены досуха и необработанный пептид растворили 20% АсОН в воде (7 мл) и экстрагировали диизопропиловым эфиром (4 мл) три раза. Водный слой был собран и выпарен досуха, а остаток очистили препаративной обращено-фазовой ЬС-Μδ (сочетание жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией).
После лиофилизации были получены продукты в виде белого порошка и анализировались при помощи аналитических методов ВЭЖХ-ΕδΙ-Μδ (сочетание высокоэффективной жидкостной хроматографии с ионизацией электрораспылением и масс-спектрометрией), как описано выше. Аналитические данные, включающие чистоту после препаративной НРЬС и ΕδΙ-Μδ, показаны в табл. 1.
Примеры 1-50, показаны в табл. 1. Пептиды синтезировались, исходя из аминокислоты Ь-Рго, которая была привита к смоле. Исходная была Етос-Рго-2-хлоротритил смола, которая была получена так, как описано выше. Линейные пептиды синтезировались на твердом носителе согласно методике, описанной выше, в следующем порядке: Смола-Рго-сРго-Р12-Р11-Р10-Р9-Р8-Р7-Р6-Р5-Р4-Р3-Р2-Р1. Примеры 150, отщепленные со смолы, циклизовали, снимали защиту и очищали, как указано, при помощи препаративной обратно-фазовой ЬС-Μδ.
После лиофилизации были получены продукты в виде белой пудры и проанализированы методами ВЭЖХ-ΕδΙ-Μδ так, как описано выше.
Время удерживания на ВЭЖХ (минуты) определяли, используя аналитические методы так, как описано выше. Для примеров 1-39 анализ проводили с помощью метода 1, а для примеров 40-50 использовали метод 2:
Пр. 1 (8.87), Пр. 2 (9.26), Пр. 3 (9.34), Пр. 4 (9.45), Пр. 5 (9.48), Пр. 6 (9.44), Пр. 7 (10.11), Пр. 8 (9.99), Пр. 9 (10.22), Пр. 10 (9.76), Пр. И (10.56), Пр. 12 (11.37), Пр.
(9.13), Пр. 14 (9.34), Пр. 15 (8.80), Пр. 1« (9.23); Пр. 17 (9.65), Пр. 18 (9.18), Пр.
(8.37), Пр. 20 (8.86), Пр.21 (8.78), Пр.22 (9.32), Пр. 23 (9.58), Пр.24 (9.27), Пр. 25 (9.31), Пр. 26 (9.24), Пр. 27 (9.23), Пр. 28 (9.34), Пр.29 (9.66), Пр. 30 (9.88), Пр. 31 (9.62), Пр. 32(8.86), Пр.ЗЗ (9.73), Пр. 34 (10.46), Пр. 35 (9.21), Пр. 36 (9.80), Пр. 37 (9.73), Пр. 38 (9.20), Пр. 39 (9.53), Пр, 40 (2.07), Пр. 41 (1.77), Пр. 42 (1.66), Пр. 43 (1.67), Пр. 44 (1.81), Пр. 45 (1.87), Пр. 46 (1.81), Пр. 47 (1.83), Пр. 48 (1.79), Пр. 49 (1.88), Пр. 50 (2.17).
- 18 015991
Таблица 1. Примеры
Пример Послед. Р1 Р2 РЗ Р4 Р5 Рб Р7 Р8 Р9 РЮ Р11 Р12 Матрица /Чистота*?^ /[М+2Н]/2
1 8Ε9ΙΟΝΟ:1 1кг Тгр Не ОаЬ Ьуз ОаЬ ЦаЬ Тгр ЦаЬ ОаЬ А1а ОаЬ “Рго'Рто 95 790.9
2 8Е<3 ГО N0:2 ТЬг Тгр Не Г>аЬ Ьуз ОаЬ ОаЬ Тгр ОаЬ ОаЬ С1у ОаЬ “Рго'Рго 95 783.9
3 8Εζ) ГО ΝΟ 3 ТЬг Тгр Не ИаЬ Ьуз ОаЬ ОаЬ Тгр ОаЬ ЭаЬ °Л1а ОаЬ “Рго'Рто 95 791.1
4 δΕΓ) Ιϋ N0 4 ТЬг Тгр 11е ОаЬ Ьуз ОаЬ ОаЬ Тгр ЦаЬ ОаЬ %а1 ОаЬ “Рго'Рто 95 805.2
5 8ΕφΠ)ΝΟ:5 ТЬг Тф Не ЦаЬ Ьуз ОаЬ ЦаЬ Тгр ЦаЬ ОаЬ А1Ь ОаЬ “Рго'Рто 86 798.0
6 8ΕΟΠ)ΝΟ:6 ТЬг Тф Не ОаЬ Ьуз ОаЬ ЦаЬ Тгр ПаЬ ОаЬ АЬи ОаЬ “Рго'Рто 86 797.9
7 8Е<5 ГО N0:7 ТЬг Тф Не ОаЬ Ьуз ОаЬ ЦаЬ Тгр ОаЬ ОаЬ Ьеи ОаЬ “Рго'Рто 95 812.5
8 8ΕρΐΟΝΟ:8 ТЬг Тф Не ОаЬ Ьуз ОаЬ ПаЬ Тгр ПаЬ ОаЬ Пе ОаЬ “Рго'Рто 89 812.6
9 8Е(?ГОМ>.9 ТЬг Тф Не ОаЬ Ьуз ОаЬ ПаЬ Тгр ОаЬ ОаЬ Νίβ ОаЬ “Рго'Рто 39 812.3
10 8Ε(}ΙΟΝΟ:10 ТЬг Тф Не ОаЬ Ьуз ОаЪ ОаЬ Тгр ОаЬ ОаЬ Ννβ ОаЬ “Рго'Рто 87 805.1
11 8ΕςΐϋΝΟ:11 ТЬг Тф Не ОаЬ Ьуз ОаЬ ПаЬ Ттр ПаЬ ОаЬ СЬё ОаЬ “Рго'Рто 82 825.7
12 8ΕρΐΟΝΟ:12 ТЬг Тф Не ОаЪ Ьуз ОаЬ ПаЬ Тгр ОаЬ ОаЬ СЬа ОаЪ “Рго'Рто 95 831.9
13 8Ε(2ΙΟΝΟ:13 ТЬг Тгр Не ОаЬ Ьуз ОаЬ ЦаЬ Тгр ПаЬ ОаЬ О1п ОаЬ “Рго'Рто 87 819.6
14 8ΕΟΙΟΝΟ:14 ТЬг ТФ Не ОаЬ Ьуз ОаЬ ЦаЬ Тгр ОаЬ ОаЬ Азр ОаЬ “Рго'Рто 80 813.5
15 8ΕρΠ3ΝΟ:15 ТЬг Тгр Не ОаЬ Ьуз ОаЬ ПаЬ Тгр ОаЬ ОаЬ О1и БаЬ “Рго'Рто 83 820.1
16 8Ε0ΙΟΝΟ:16 ТНг Тгр Не ОаЬ Ьуз ОаЪ ЦаЬ Тгр ОаЬ ОаЪ ТЬг ОаЬ “Рго'Рто 95 806.1
17 8ΕςΐΌΝ0:17 ТЬг Тф Не ОаЬ Ьуз ОаЪ ЦаЬ Тф ОаЬ ОаЬ Рго ОаЬ “Рго'Рто 85 804.0
18 8ΕΟΠ)ΝΟ:18 Сй Тф Не ОаЬ Ьуз ОаЪ ПаЬ Тгр ИаЬ ОаЬ А 1а йаЬ “Рго'Рто 95 819.6
19 8ΕΟΙΌΝΟ:19 ТЬг Туг Не БаЬ Ьуз ОаЪ ЦаЬ Тгр ОаЬ ОаЬ А1а ОаЬ “Рго'Рто 95 779.9
20 8ΕρΐϋΝΟ:20 ТЬг Тф Не ОаЬ Ьуз ОаЬ ПаЬ Туг ОаЬ ОаЬ А1а ОаЬ “Рго'Рто 95 779.5
21 8ΕΟΙΟΝΟ:21 ТЬг Тф Не ОаЬ Ьуз ОаЪ ΗΪ3 Тф ОаЬ ОаЬ А 1а ОаЬ “Рго'Рто 95 810.0
22 8ЕЦ ГО N0:22 А 1а Тф Не ОаЬ Ьуз ОаЪ ПаЬ Тгр ОаЬ ОаЬ А 1а ОаЬ “Рго'Рто 95 776.2
23 ЗЕр ГО N0:23 А1а Тф Не ОаЬ ЭаЬ ОаЪ ЦаЬ Тгр ОаЬ ОаЬ Уа! ОаЬ “Рго'Рто 95 776.4
24 8Εζ) ГО N0:24 ТЬг Тф Не Ьуз Ьуз ОаЪ ЦаЬ Тф ОаЬ ОаЬ А 1а ОаЬ “Рго'Рто 87 805.1
25 8ЕС? ГО N0:25 ТЬг Тф Не ОаЬ Ьуз Ьуз ЦаЬ Тф ОаЬ ОаЬ А1а ОаЬ “Рго'Рто 95 805.0
26 8Е0 ГО N0:26 ТЬг Тф Не ОаЬ Ьуз ОаЪ Ьуз Тф ОаЬ ОаЬ А1а ОаЬ “Рго'Рто 87 805.2
27 Ж? ГО N0:27 ТЬг Тф Не ОаЬ Ьуз ОаЪ ЦаЬ Тф Ьуз ОаЬ А1а ОаЬ “Рго'Рто 95 805.1
28 8ΕΡΙΟΝΟ:28 ТЬг Тф Не ОаЬ Ьуз ОаЪ ПаЬ Тф ОаЬ ОаЬ А1а Ьуз “Рго'Рто 95 805.0
29 ГО N0:29 ТЬг Тф Не 01п Ьуз ОаЪ ПаЬ Тф ОаЬ ОаЬ А1а ОаЬ “Рго'Рто 86 805.2
30 8Ε(2ΙϋΝΟ:30 ТЬг Тф Не С1п Ьуз ОаЬ ПаЬ Тф ЦаЬ ОаЬ Уа1 ОаЬ “Рго'Рто 88 819.1
31 8Ер ГО N0:31 ТЬг Тгр Ме ОаЬ Ьуз ОаЬ ОаЬ Тгр ОаЪ ОаЬ А1а ОаЬ “Рго'Рто 95 791.1
32 8Εζ)Π)ΝΟ:32 ТЬг Тгр Уа! ОаЬ Ьуз ОаЬ ОаЬ Тгр ЦаЬ ОаЬ А1а ОаЬ “Рго'Рто 95 784.0
33 8ΕΟΠ>ΝΟ:33 ТЬг Тгр СЬ8 ОаЬ Ьуз ОаЬ ОаЬ Τιρ ОаЪ ОаЬ А1а ОаЪ “Рго'Рто 95 804.4
34 8Е<2 ГО N0:34 ТЬг Τιρ СЬа ОаЬ Ьуз ОаЬ ОаЬ Тгр ОаЬ ОаЬ А1а ОаЬ “Рго'Рто 95 811.5
35 8Е0 ГО N0:35 ТЬг Тгр Не ОаЬ Ьуз ОаЬ ОаЬ Тгр ОаЬ ОаЬ Нзе ОаЬ “Рго'Рто 95 806.4
36 8Εζ> ГО N0:36 ТЬг Тгр Не ОаЬ Ьуз ОаЪ ЦаЬ Тгр ОаЪ ОаЬ 1-ВиСг ОаЬ “Рго'Рто 95 812.5
37 8Е<}ГОЫО:37 ТЬг Тгр Не ОаЬ Ьуз ОаЬ ОаЪ Тф ОаЬ ОаЬ Сра ОаЬ “Рго'Рто 89 811.3
38 8ΕζΗΟΝΟ:38 ТЬг Тгр Не ОаЬ Ьуз ОаЬ ОаЬ Тгр ОаЬ ОаЬ Азп ОаЬ “Рго'Рто 95 813.1
39 8ЕУ> !Т> N0:39 ТЬг Тгр Не ОаЬ Ьуз ОаЬ ОЬ1 Тгр ОаЬ ОаЬ А1а ОаЬ “Рго'Рто 95 805.2
40 5Е0 ГО N0:40 ТЬг Тгр Пе 01п Ьуз ОаЬ ЦаЬ Тгр ОаЬ ОаЬ А1а О1п “Рго'Рто 95 819.6
41 8Е(_) ГО N0:41 ТЬг Тгр Не ОаЬ Ьуз “ОаЪ ЦаЬ Тгр ОаЪ ОаЬ А1а ОаЬ “Рго'Рто 91 791.2
42 8Ер ГО N0:42 Азр Тут Пе ОаЬ Ьуз “ОаЬ ОаЪ Тгр ОаЬ ОаЬ А1а ОаЬ “Рго'Рто 85 786.6
43 8ЕС} ГО N0:43 Азр Туг 11е ОаЬ От “ОаЪ ОаЬ Тгр ОаЪ ОаЬ А1а ОаЬ “Рго'Рто 85 779.6
44 8Εζ·ΙΟΝΟ:44 Οΐιι Тгр Пе ОаЬ Ьуз “ОаЪ ОаЪ Тгр ОаЬ ОаЬ А1а ОаЬ “Рго'Рто 78 805.1
45 8Ер ГО N0:45 61 и Тгр Не ОаЬ Ьуз “ОаЪ ЦаЬ Тгр ОаЬ ОаЬ А1а О1п “Рго'Рто 82 819.2
46 8Е0 ГО N0:46 О1и Тгр Пе ОаЬ Ьуз “ОаЬ ЦаЬ Тгр ОаЬ ОаЬ А1а Оар “Рго'Рто 83 798.0
47 8Ер 1Е» N0:47 01и Τιρ Пе ОаЬ От “ОаЪ ОаЬ Тгр ОаЬ ОаЬ А1а ОаЬ “Рго'Рто 85 798.3
48 8Е(} ГО N0:48 ТЬг Тгр Пе ОаЬ От “ОаЬ ЦаЬ Тгр ОаЬ ОаЬ А1а ОаЬ “Рго'Рто 86 784.1
49 8Ε(}ΙΟΝΟ:49 ТЬг Τιρ 11е ОаЬ От “ОаЪ ОаЬ Тгр ОаЬ ОаЬ А1а 8ег “Рго'Рто 91 777.7
50 8Ер ГО N0:50 О1и Тгр 11е С1п Ьуз ЦаЬ ОаЬ 8ег ОаЬ ОаЬ А1а Зег “Рго'Рто 95 805.8
а) %-чистота соединения после препаративной ВЭЖХ.
2. Биологические методы.
2.1. Приготовление пептидных образцов.
Лиофилизированные пептиды были взвешены на М1сгоЬа1алсе (Мей1ег МТ5) и растворены в стерильной воде до конечной концентрации 1 мг/мл, если не оговаривается иное. Стоковые растворы держали при +4°С, слегка защищенные.
2.2. Противомикробная активность пептидов.
Избирательные противомикробные активности пептидов определялись в 96-ячеечных планшетах (№.1пс1оп ро1ук!угепе) стандартным методом ЫССБЗ (Национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам) микроразбавления питательной среды (смотрите ссылку 1 ниже) с легкими изменениями. Посевной материал микроорганизмов развели в МиеПег-ΗίπΙοη (МН) питательной среде + 0.02% ВЗА (бычий сывороточный альбумин) и сравнили с 0.5 Мс£аг1аиб стандартом, который дает приблизительно 10 колоние-образующих единиц (СБИ)/мл. Аликвоты (50 мкл) посевного материала добавили к 50 мкл МН питательной среды +0.02% ВЗА, содержащие пептид в последовательном двукратном разбавлении. Для определения антибиотической селективности пептидов использовали следующие микроорганизмы: ЕксНепсЫа со11 (АТСС 25922), Ркеиботопак аегцдшока (Р. аегцдтока АТСС 27853, Р8191900, Р1021903, Р1021913, 1МР 1 Ыуегтоге 3140). Противомикробные активности пептидов выражены как минимальная концентрация ингибитора (М1С) в мкг/мл, при которой не происходит никакого видимого роста после 120 часов инкубации при 37°С.
2.3. Анализ цитотоксичности.
Цитотоксичность пептидов к клеткам НЕБА (Асс57) и клеткам СОЗ-7 (СКБ-1651) определяли при помощи теста восстановления МТТ ((3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромид) [см. ссылки 2 и 3 ниже]. Вкратце тест провели таким образом: клетки НЕБА и СОЗ-7 были высеяны с концентрацией 7.0х103 и, соответственно, 4.5х103 клеток на лунку и выращивали в 96-луночных титра- 19 015991 ционных микропланшетах в течение 24 ч при 37°С в 5% СО2. На данной стадии было определено время отсчета (Τζ) при помощи восстановления МТТ (смотрите ниже). Супернатант в оставшихся лунок был удален и в лунки были загружены свежая среда и пептиды в последовательном разбавлении 12.5,25 и 50 мкМ. Каждый пептид был исследован в трех экземплярах. Инкубация клеток продолжалась в течение 48 ч при 37°С в 5% СО2. Лунки затем промыли однократно фосфатно-солевым буферным раствором (РВ8) и последовательно добавили в лунках 100 мкл МТТ реагентом (0.5 мг/мл в среде КРМ11640 и, соответственно, ΌΜΕΜ). Инкубировали при 37°С в течение 2 ч и последовательно из лунок аспирировали среду и добавили по 100 мкл изопропанола в каждую лунку. Измерили поглощение при 595 нм солюбилизированного продукта (ОИ595рерйбе). Для каждой концентрации вычисляли среднее значение, исходя из трех значений. Процент роста был вычислен таким образом: (ОО999рерйбе-ОО99^-ОО599Етр1у ^е11)/(Ο^595Τζ-Ο^595Εтрίу \ге11) х 100% и нанесен на график для каждой концентрации пептида.
Значения ЬС 50 (Ье1йа1 Соисеийайои - летальная концентрация, т.е. концентрация, которая убивает 50% клеток) были определены для каждого пептида, используя экстраполяциию в ЕХСЕЬ (Мкгокой ОГГке 2000) для концентраций (50, 25,12.5 и 0 мкМ), соответствующих процентов роста и величины -50 (=ТКЕИВ(С50:С0,%50:%0,-50)). Концентрации 61 50 (6го\\111 тИыЬйки - подавление роста) были вычислены для каждого пептида, используя функцию экстраполяции (50, 25, 12.5 и 0 мкг/мл), соответствующих процентов и значения 50 (=ΤΚΕΝΏ (С50:С0,%50:%0,50).
2.4. Гемолиз.
Пептиды тестировали на их гемолитическую активность по отношению к эритроцитам человека (йКВС). Свежие йКВС были промыты три раза фосфатно-солевым буферным раствором (РВ8) центрифугированием в течение 10 мин при 2000 х д. Пептиды при концентрации 100 мкМ инкубировались 20% ν/ν йКВС в течение 1 ч при 37°С. Конечная концентрация эритроцитов была приблизительно 0.9х109 клеток на мл. Значение 0% и относительно 100% лизиса клеток определяли при помощи инкубации йКВС в присутствии только РВ8 и, соответственно, 0.1% Тритон Х-100 в Н2О. Образцы центрифугировали, супернатант был 20-кратно разбавлен в буфере РВ8 и была измерена оптическая плотность (орйса1 беикйу (ОИ)) образца при 540 нм. Значение при 100% лизисе (ОИ540Н2О) дает ОИ540 приблизительно равное 1.3-1.8. Процент гемолиза был вычислен таким образом: (ОО940рерйбе/ОО9.41Н2О)х 100%.
2.5. Устойчивость в плазме.
405 мкл раствора плазма/альбумин загрузили в полипропиленовую (РР) кювету и смешан с 45 мкл соединения из 100 мМ раствора В, полученного из 135 мкл РВ8 и 15 мкл 1 мМ пептида в РВ8, рН 7.4. Были отобраны аликвоты по 150 мкл в индивидуальные лунки 10 кДа фильтрующего планшета (М1Шроге МАРРВ 1010 Вктах тетЬгаие). Для контроля в 0 мин: 270 мкл РВ8 поместили в РР кювету и добавили 30 мкл стокового раствора и перемешали. 150 мкл контрольного раствора поместили в одну лунку фильтрующего планшета и обозначили как фильтрованный контроль.
Далее 150 мкл контрольного раствора поместили прямо в приемную лунку (предназначенную для фильтрата) и обозначили как нефильтрованный контроль. Полный планшет, включающий крышку, предохраняющую от испарения, инкубировался в течение 60 мин при 37°С. Образцы плазмы (плазма крысы: Наг1аи 8ега 1аЬ ИК, плазма человека: В1иΐкреибеζеиΐ^ит Ζίίι%1ι) центрифугировали по крайней мере в течение 2 ч при 4300 грт (3500 д) и 15°С, с тем чтобы получить 100 мкл фильтрата. Для образцов сывороточного альбумина (свежее приготовленный альбумин человека: А-4327, альбумин крысы: 81дта А-6272, все при концентрации 40 мг/мл в РВ8) было достаточно приблизительно 1 ч центрифугирования. Фильтраты в приемном РР планшете были проанализированы при помощи ЛС/М8 (сочетание жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией) таким образом: Колонка: 1ирйег С18 (Рйеиотеиех), подвижные фазы: (А) 0.1% муравьиной кислоты в воде и (В) ацетонитрил, градиент: 5%-100% (В) за 2 мин, ионизация электрораспылением, детекция МКМ (тройной квадруполь). Определялись площади пиков и усредняли значения трех измерений. Связывание было выражено в процентах от (фильтрованный и нефильтрованный контроль в 0 мин) контроля 1 и 2 таким образом: 100-(100 х Т60/Т0). Затем вычисляли среднее из этих значений.
2.6. Фармакокинетическое исследование (РК).
Фармакокинетическое исследование после однократного внутривенного, подкожного и интраперитонеального введения в мышей.
Провели фармакокинетическое исследование после однократного внутривенного (тй^еиоик (ί.ν.)) и подкожного (киЬскаиеоик (к.с.)) введения для соединения пробы 1 (Пр. 1). Для изучения были использованы мыши СИ-1 (20-25 г). Физиологический солевой раствор был использован как среда. Объем составлял 2 мл/кг ί.ν. и 5 мл/кг к.с; пептид Пр. 1 вводили для получения конечной внутривенной дозы - 1 мг/кг, а подкожной - 5 мг/кг. Приблизительно 200-250 мкл крови удаляли под легкой анестезией фторированным простым эфиром при помощи пункции сердца в заданных интервалах времени (0, 5, 15, 30 мин и 1, 2, 3, 4 и 5 ч для ί.ν. исследования и 0, 15, 30 мин и 1, 2, 4, 6, 8 и 10 ч для к.с. исследования) и добавляли в гепаринизированные пробирки. Плазму из осажденных клеток удаляли центрифугированием и замораживали при -80°С перед анализом НРЬС-Μδ (сочетание высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией).
- 20 015991
Приготовление образцов для калибровки плазмы.
Использовали нулевую плазму мыши, к которой не применялось лечение. К аликвотам плазмы по 0.2 мл каждая добавили 50 нг пропранолола (!п1егпа1 81апйагй, Σδ), (приготовление образцов проводили твердо-фазной экстракцией на ОА8!8® НБВ картриджах (^а1ег8)) и известные количества соединения Пр. 1, для того чтобы получить 9 образцов для калибровки плазмы в диапазоне 10-5000 нм. ОА8!8® НБВ картриджи уравновешивали 1 мл метанола, а затем 1 мл 1% ΝΗ3 в воде. Далее образцы разбавляли 700 мкл 1% ΝΗ3 в воде и наносили. Картридж промывали 1 мл смеси метанол/1% ΝΗ3 в воде в соотношении 5/95. Элюирование проводили 1 мл 0.1% ТРА в метаноле.
Сосуд, содержащий элюат, была введен в концентратор и высушен досуха. Остатки растворили в 100 мкл смеси 0.1% муравьиная кислота/ацетонитрил в соотношении 95/5 (ν/ν) и анализировали при помощи НРБС/М8 на обращено-фазовой аналитической колонке (Лир11ег С18, 50 х 2.0 тт, 5 цт, РЬепотепех), используя градиент элюата (подвижные фазы А: 0.1% муравьиной кислоты в воде, В: ацетонитрил; от 5% В до 100% В в течение 2 мин).
Приготовление образцов плазмы.
Образцы, взятые от животных, прошедших лечение, были объединены, чтобы получить необходимый объем для экстракции. Если полный объем получался менее 0.2 мл, добавляли необходимое количество нулевой плазмы мыши, чтобы матрикси был идентичен калибровочной кривой. Образцы затем скрепляли Т8 и обрабатывали так, как описано для калибровочной кривой.
Оценка фармакокинетики
Фармакокинетический анализ осуществляли на основе обобщенных данных (в основном, п=2 или 3), используя программное обеспечение νίη Νοηΐίη (Р11аг81д111). Площадь под кривой АИС вычисляли с помощью линейного правила трапеций. Элиминационный период полувыведения вычисляли с помощью линейной регрессии, по крайней мере, трех точек, взятых в фазе элюации. Интервалы времени, выбранные для определения периода полувыведения, были оценены при помощи коэффициента корреляции (г2), который должен быть, по крайней мере, выше 0.85, а наиболее оптимально, выше 0.96. В случае ί.ν. введения начальная концентрация при ΐζεΓ0 оценивалась экстраполяцией кривой через первые две точки. Наконец, биодоступность после 1.р. введения вычисляли из нормализованного АиСшГ_П_оЬ8 отношение после 8.с. против ί.ν. введения.
2.7. Πι νίνο анализ септицемии.
Были использованы клетки 6 СО-1 (Сг1.), взятые от самцов мышей весом 24±2 г. Мыши были заражены внутривенно (IV) ΕΌ90-100 Ркеийотопак аегидтока (АТСС 27853) (9х 106 СРИ/0.5т1/мышь) в бульоне с сердечно-мозговым экстрактом без 5% муцина. Подкожно (8С) было введено соединение в дозировке 5, 2.5, 1, 0.5, 0.25 и 0.1 мг/кг и среда (0.9% №С1, 10 мл/кг), для того чтобы тестировать животных по прошествии 1 ч после бактериальной инокуляции. Также, дополнительная группа была обработана дважды соединением с дозировкой 5 мг/кг по прошествии 1 и 6 ч после бактериальной инокуляции. Смертность регистрировалась один раз в день в течение 7 дней после бактериальной инокуляции и увеличение выживаемости животных на 50% или более (50%) после бактериальной инокуляции, по отношению к контрольной среде, указывает на значительный противомикробный эффект. ΜΕΌ (тш1та1 еГГесйуе йоке - минимальная эффективная доза) определяли методом нелинейной регрессии, используя ОгарЬРай Рг18т (ОгарЬ Рай 8оР1геаге, И8А).
2.8. Результаты.
Результаты экспериментов, описанных выше в пп. 2.2, 2.3 и 2.4, показаны в табл. 2 ниже.
Таблица 2. Минимальные концентрации ингибитора (М!С, мкг/мл) в Мие11ег-Нт1:оп бульоне, цитотоксичность и процент гемолиза при концентрации пептида 100 мкг/мл
Пр. Р. аеги§1поза АТСС 27853 Р. аеги§1поза Р8191900 Р. аеги§1поза Р1021903 Р. аепцрпоза Р1021913 Р. аеги§1по8а1МР1 ЬХеппоге 3140 Среднее значение М1С Цитотоксичность С150 Не!а сеПз Гемолиз при 100 мкг/мл
1 0.03 0.07 0.07 0.13 0.18 0.10 30 0.5
2 0.04 0.10 0.16 0.18 0.24 0.15 50 0.3
3 0.09 0.30 0.30 0.31 2.0 0.6 34 0.6
4 0.75 1.50 1.50 2.50 >2.0 >1 40 0.6
5 0.08 0.30 0.21 0.21 0.75 0.31 50 0.6
6 0.05 0.10 0.09 0.16 0.24 0.13 50 0.2
7 0.13 0.50 1.50 0.65 >2 >1 13 0.8
8 0.05 0.18 0.18 0.31 0.43 0.23 50 0
9 0.21 0.75 1.50 0.75 >2 >1 50 0.7
10 0.05 0.18 0.13 0.37 0.43 0.23 50 0
11 0.30 1.00 2.00 0.75 >2 >1 50 0.5
12 0.40 1.00 2.00 0.75 >2 >1 50 0.7
13 0.21 0.30 0.40 0.31 0.75 0.40 50 0.4
14 0.21 0.40 0.31 0.65 >2 >1 12 0.3
15 0.50 2.50 1.25 2.25 >2 >1 50 0.3
16 0.05 0.09 0.05 0.10 0.24 0.11 50 0.1
17 0.75 1.50 2.00 1.25 >2 >1 29 0.5
18 0.06 0.10 0.10 0.81 0.30 0.28 50 0.4
19 0.03 0.05 0.03 0.10 0.10 0.06 50 0.2
20 0.21 0.40 0.21 0.31 1.25 0.48 50 0.2
21 0.09 0.40 0.21 0.31 1.00 0.40 50 0.4
- 21 015991
22 0.02 0.09 0.09 0.16 0.24 0.12 50 0.2
23 1.00 1.00 1.50 1.25 >2 >1 13 0.5
24 0.05 0.16 0.08 0.16 0.24 0.14 50 0.1
25 0.05 0.10 0.05 0.13 0.24 0.11 50 0.1
26 0.08 0.30 0.13 0.18 0.40 0.22 50 0.8
27 0.09 0.30 0.30 0.21 0.50 0.28 50 0.6
28 0.04 0.10 0.07 0.16 0.24 0.12 50 0.1
29 0.09 0.13 0.13 0.21 0.40 0.19 50 0.5
30 0.09 0.13 0.30 0.50 2.00 0.60 46 0.5
31 0.03 0.16 0.40 0.16 0.24 0.20 50 0.5
32 0.02 0.05 0.05 0.10 0.22 0.09 50 0
33 0.05 0.18 0.29 0.31 0.43 0.25 50 0.1
34 0.05 0.24 0.29 0.48 0.60 0.33 50 0
35 0.05 0.22 0.10 0.24 0.31 0.18 48 0.2
36 0.06 0.18 0.18 0.24 0.43 0.22 50 0.1
37 0.06 0.18 0.31 0.37 1.17 0.42 50 0.5
38 0.09 0.17 0.17 0.27 1.06 0.35 50 0.5
39 0.13 0.21 0.31 0.31 0.75 0.34 50 0.4
40 0.25 0.50 0.50 0.50 1.00 0.55 50 0.7
41 0.02 0.05 0.03 0.25 0.25 0.12 50 0.2
42 0.25 0.06 0.125 0.50 0.50 0.29 50 0.2
43 0.13 0.50 0.125 2.00 2.00 0.95 50 0.5
45 0.25 0.50 0.50 1.00 1.00 0.65 50 0.2
46 0.06 0.25 0.25 0.50 0.50 0.31 50 0.3
47 0.09 0.13 0.13 0.50 0.75 0.32 50 0.2
48 0.02 0.03 0.02 0.13 0.19 0.08 50 0.2
49 0.03 0.06 0.03 0.25 0.50 0.17 50 0.1
50 0.09 0.13 0.06 0.50 2.00 0.56 50 п.б.
п.б. = не определяли
Результаты эксперимента, описанного выше в пп. 2.5, указаны в табл. 3 ниже. Таблица 3
Результаты эксперимента, описанного выше в п. 2.6 (РК), указаны в табл. 4 ниже. Таблица 4
После внутривенного введения соединения Пр. 1 с дозировкой 1 мг/кг веса тела, соединение Пр. 1 применяли для исследования внутривенных кинетических характеристикх. После РК анализа, соединения Пр. 1 показал экстраполированную С1ш41а1 =2174 нг/мл и наблюдаемую Стах =1268 пд/т1 за 5 мин. Уровни содержания в плазме быстро снизились до 575 и 177 нг/мл за 5 мин и 1 час соответственно. За 0.5-2 ч уровни содержания в плазме уменьшались с элиминационным периодом полувыведения с 0.53 до 10.6 нг/мл за 3 ч. АИСЮТ_оЬк составило 679.5 нг*ч/мл.
После подкожного введения соединения Пр. 1 при дозировке 5 мг/кг веса тела уровни содержания в плазме его повысились за первые 0.5-1 ч и показали С,пах=2333 нг/мл. За 0.5-8 часов уровни содержания соединения Пр. 1 в плазме снизились до 7.3 нг/мл (в 8 ч) с периодом полувыведения 0.95 ч. АИСГ№_оЬк
- 22 015991 составило 4016.5 нг*ч/мл.
По сравнению с нормированным АИС значение после ί.ν. введения (поглощенный на 100%, 679 нг*ч/мл) Ех 1, поглощение после к.с. введения составило 118% (803 нг*ч/мл). Значение выше 100% может частично отражать сниженную достоверность, вызванную ограниченным количеством точек или является результатом нелинейности дозы.
Результаты эксперимента, описанные выше в 2.7 (Анализ септицемии)указаны в табл.5-7 ниже.
Септицемийный эксперимент в мышах: ΕΌ90-100 о£ Ркеиботопак аегцдтока (АТСС 27853) (9 х 106 СЕИ/0.5 мл/мышь IV и по прошествии 1 ч после к.с. введения соединения Пр. 1
Таблица 5
Соединение/ доза Мертвые Выжившие
Отрицательный контроль 5 1
Гентамицин, 1 мг/кг 0 б
Соединение Ех. 1 в следующих дозах (мг/кг)
10(2x5) 0 6
5 0 6
2.5 0 6
1 1 5
0.5 2 4
0.25 5 1
0.1 5 1
Септицемийный эксперимент в мышах: ЬИ90-100 о£ Ркеиботопак аегцдтока (АТСС 27853) (9 х 106 СЕИ/0.5 мл/мышь IV), и по прошествии 1 ч и 5 ч после к.с. введения соединения пр. 40.
Таблица 6
Соединение / доза Мертвые Выжившие
Отрицательный контроль 6 0
Гентамицин, 2x1 мг/кг 1 5
Соединение Ех.40 в следующих дозах (мг/кг)
2x10 0 6
2x3 0 6
2x1 2 4
2x0.3 б 0
2x0.1 6 0
Септицемийный эксперимент в мышах: ЬИ90-100 о£ Ркеиботопак аегцдтока (АТСС 27853) (9 х 106 СЕИ/0.5 мл/мышь IV), и по прошествии 1 ч и 5 ч после к.с. введения соединения пр. 50.
Таблица 7
Соединение / доза Мертвые Выжившие
Отрицательный контроль 5 1
Гентамицин, 2x1 мг/кг 1 5
Соединение Ех. 50 в следующих дозах (мг/кг)
2х 10 0 б
2x3 3 3
2 х 1 5 1
2x0.3 6 0
2x0.1 6 0
- 23 015991
Ссылки:
1. Ν;Πίοη;·ι1 СоттШсс ίοτ С11шса1 ΒηόοπΠοίΎ 31анбагб5. 1993. Ме11юб8 (ог άίΐπίίοη ηη(ίιη^Γοόίο1 8И8серПЫШу ίе8ί8 ίο г Ьас1епа 1На( дго\у аегоЫса11у, 3гб еб. Арргоьеб Чанбагб М7-А3. Ναΐίοηαΐ Сотт Шее 1ог С11Н1са11αόοηΙοΐΎ Уанбагбу УШагюуа. Ра.
2. Мο88таη Т. ί Iттиηο1 Ме111 1983, 65, 55-63.
3. Вегпбде М.У., Таи А.8. Агсйгуез οί ВюсйетгзБу & ВюрЬ.у81с8 1993, 303, 474-482.

Claims (10)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Соединения общей формулы где представляет собой сРго-ъРго или ьРго-сРго и Ζ является цепочкой из 12 α-аминокислотных остатков, причем положения упомянутых аминокислотных остатков в упомянутой цепи отсчитаны, начиная с Ν-концевой аминокислоты, при этом данные аминокислотные остатки в положениях Р1-Р12 цепи представляют собой
    - Р1: А1а, Сй, ТЬг, Азр, 61и;
    Р2: Тгр, Туг; РЗ: Пе, Уа1, Ы1е, СЬё, СЬа; Р4: РаЬ, Ьуз, О1п; Р5: Ьуз, РаЬ, От; Р6: РаЬ, Г)РаЬ; Ьуз; Р7: ΗΪ3, Ьуз, <31п, РаЬ; Р8: Туг, Тгр, 8ег; Р9 РаЬ, Ьуз; РЮ: РаЬ, Ьуз; Р11: А1а, АЪи, ТЬг, <31 у, Рго, Нзе, 11е, Νν-а, ^ЛВ, Е'Уа1, АЛ, Ме,
    СЬи, СЬа, С1п, Азр, СНи, Сра, 1-ВиО, Ьеи, Уа1, Азп; и Р12: РаЬ, Ьуз, О1п, 8ег;
    и их энантиомеры и фармацевтически приемлемые соли.
  2. 2. Соединение по п.1, где матрица представляет собой сРго-ьРго и аминокислотные остатки в положениях 1-12 представляют собой
    Р1: ТЬг, А1а, СНи; Р2: Тгр, Туг; РЗ: Пе, Уа1; Р4: РаЬ, Ьуз, СИп; Р5: Ьуз, От; Р6: РаЬ, Ьуз, ЭЗаЬ; Р7: РаЬ; Р8: Тгр, 8ег; Р9 РаЬ; РЮ: РаЬ; Р11: А1а, С1у, АЬи, ТЬг, Нзе; и Р12: РаЬ, Ьуз, СИп, Зег.
  3. 3. Энантиомеры соединений формулы I, как определено в п.1.
  4. 4. Соединения по любому из пп.1-3, для применения в качестве терапевтически активных веществ.
  5. 5. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из пп.1-3 и фармацевтически инертный носитель.
  6. 6. Композиции по п.5 в форме, пригодной для перорального, местного, трансдермального, инъекци
    - 24 015991 онного, трансбуккального, трансмукозального, пульмонального или ингаляционного введения.
  7. 7. Композиции по п.5 или 6 в форме таблеток, драже, капсул, растворов, жидкостей, гелей, пластыря, кремов, мазей, сиропа, взвесей, суспензий, спрея, небулайзера или суппозиториев.
  8. 8. Применение соединений по любому из пп.1-3 для производства медикаментов для лечения или профилактики инфекций или заболеваний, вызванных этими инфекциями.
  9. 9. Применение по п.8, где указанные инфекции связаны с дыхательными заболеваниями, такими как кистозный фиброз, эмфизема и астма; связаны с заболеваниями кожи или мягких тканей, такими как послеоперационные раны, травматические раны или ожоговые раны; связаны с желудочно-кишечными заболеваниями, такими как эпидемическая диарея, некротический энтероколит или тифлит; связаны с глазными заболеваниями, такими как кератит или эндофтальмит; связаны с ушными заболеваниями, такими как отит; связаны с заболеваниями ЦНС, такими как абсцесс головного мозга или менингит; связаны с костными заболеваниями, такими как остеохондроз или остеомиелит; связаны с сердечнососудистыми заболеваниями, такими как эндокардит или перикардит; связаны с мочеполовыми болезнями, такими как эпидидимит, простатит или уретрит; связаны с раком или связаны с ВИЧ.
  10. 10. Применение соединений по любому из пп.1-3 в качестве дезинфицирующих средств или консервантов для продуктов питания, косметики, медикаментов и других материалов, содержащих питательные вещества.
EA200801710A 2006-01-16 2007-01-15 Закрепленные на матрице пептидомиметики EA015991B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CH2006/000036 WO2007079597A1 (en) 2006-01-16 2006-01-16 Template - fixed peptidomimetics with antimicrobial activity
PCT/CH2007/000017 WO2007079605A2 (en) 2006-01-16 2007-01-15 Template-fixed peptidomimetics with antimicrobial activity

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200801710A1 EA200801710A1 (ru) 2009-02-27
EA015991B1 true EA015991B1 (ru) 2012-01-30

Family

ID=36992526

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200801710A EA015991B1 (ru) 2006-01-16 2007-01-15 Закрепленные на матрице пептидомиметики

Country Status (21)

Country Link
US (5) US8685922B2 (ru)
EP (1) EP1979374B1 (ru)
JP (1) JP5237826B2 (ru)
KR (1) KR101352829B1 (ru)
CN (2) CN102796179B (ru)
AT (1) ATE538131T1 (ru)
AU (1) AU2007204547B2 (ru)
CA (1) CA2637377C (ru)
CY (1) CY1117252T1 (ru)
DK (1) DK1979374T3 (ru)
EA (1) EA015991B1 (ru)
ES (1) ES2381846T3 (ru)
HK (2) HK1127957A1 (ru)
IL (1) IL192816A (ru)
NO (1) NO341875B1 (ru)
NZ (1) NZ570245A (ru)
PL (1) PL1979374T3 (ru)
PT (1) PT1979374E (ru)
SI (1) SI1979374T1 (ru)
WO (2) WO2007079597A1 (ru)
ZA (1) ZA200806564B (ru)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101420198B1 (ko) * 2005-02-17 2014-08-13 폴리포 리미티드 프로테아제 저해 활성을 가지는 주형-고정된 β-헤어핀 구조의 펩티드모방체
WO2007079597A1 (en) 2006-01-16 2007-07-19 Polyphor Ltd. Template - fixed peptidomimetics with antimicrobial activity
US8633163B2 (en) 2007-01-29 2014-01-21 Polyphor Ltd. Template-fixed peptidomimetics
AU2007348171B2 (en) 2007-02-28 2012-09-06 Polyphor Ltd. Template-fixed peptidomimetics
CA2733117C (en) * 2008-08-08 2016-03-22 Polyphor Ag Template-fixed peptidomimetics
US8895499B2 (en) 2010-08-05 2014-11-25 Polyphor Ag β-hairpin peptidomimetics
US8541556B1 (en) 2012-03-02 2013-09-24 Empire Technology Development Llc Lignin derivatives and uses thereof
US9095142B2 (en) 2012-06-28 2015-08-04 Empire Technology Development Llc Lignin derivatives having polycations and uses thereof
CA2887388C (en) * 2012-08-08 2021-02-16 Polyphor Ag Combinations with a backbone-cyclized peptide
PL2882770T3 (pl) 2012-08-08 2018-01-31 Polyphor Ag Kombinacje z cyklicznym peptydem
CN104903342B (zh) * 2012-11-08 2020-03-27 菲药物股份有限公司 C4s蛋白聚糖特异性转运载体分子
SG11201507977UA (en) 2013-03-30 2015-10-29 Polyphor Ag Beta-hairpin peptidomimetics
NZ712739A (en) * 2013-03-30 2021-07-30 Polyphor Ag Beta-hairpin peptidomimetics
CN104478993B (zh) * 2013-06-20 2017-10-10 重庆理工大学 一种非蛋白氨基酸抗菌肽及其应用
CN103319568B (zh) * 2013-06-20 2015-01-21 重庆理工大学 一种非蛋白氨基酸抗菌肽及其应用
CN104371002B (zh) * 2013-06-20 2017-10-10 重庆理工大学 一种非蛋白氨基酸抗菌肽及其应用
WO2016050360A1 (en) * 2014-09-30 2016-04-07 Polyphor Ag Beta-hairpin peptidomimetics
WO2016050361A1 (en) * 2014-09-30 2016-04-07 Polyphor Ag Beta-hairpin peptidomimetics
CA2979437A1 (en) 2015-03-23 2016-09-29 Polyphor Ag Beta-hairpin peptidomimetics
US11629171B2 (en) 2017-11-10 2023-04-18 Spexis Ag Beta-hairpin peptidomimetics
CN112457314A (zh) * 2020-11-19 2021-03-09 烟台大学 手性吲哚并吲哚里西啶类化合物及其制备方法
MX2023005982A (es) 2020-11-23 2023-08-15 Spexis Ag Composiciones de un peptidomimetico de horquilla beta y formas de dosificacion en aerosol del mismo.
CN112876537B (zh) * 2021-01-29 2022-01-04 西南科技大学 一种从纵条纹炭角菌中富集纯化环肽Xylastriamide A的方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002070547A1 (en) * 2001-02-23 2002-09-12 Polyphor Ltd. Template-fixed peptidomimetics with antimicrobial activity
WO2003054000A1 (en) * 2001-12-11 2003-07-03 Polyphor Ltd. Template-fixed peptidomimeticsas inhibitors of serine proteases
WO2004018503A1 (en) * 2002-08-20 2004-03-04 Polyphor Ltd. Template-fixed peptidomimetics with antibacterial activity
WO2004033489A1 (en) * 2002-10-02 2004-04-22 Polyphor Ltd. Template-fixed peptidomimetics with antimicrobial activity
WO2004096839A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-11 Polyphor Ag Template-fixed beta-hairpin peptidomimetics with cxcr4 antagonizing activity
WO2004096838A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-11 Polyphor Ag Template-fixed peptidomimetics as medicaments against hiv and cancer
WO2005047503A1 (en) * 2003-11-15 2005-05-26 Polyphor Ltd. Template fixed βετα-hairpin loop mimetics and their use in phage display
WO2006087001A1 (en) * 2005-02-17 2006-08-24 Polyphor Ltd. Template-fixed beta-hairpin peptidomimetics with protease inhibitory activity

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4698327A (en) * 1985-04-25 1987-10-06 Eli Lilly And Company Novel glycopeptide derivatives
US5916872A (en) 1996-07-24 1999-06-29 Intrabiotics Pharmaceuticals, Inc. Cyclic peptides having broad spectrum antimicrobial activity
AU5856699A (en) 1999-08-30 2001-03-26 Polyphor Ag Synthesis of template-fixed beta-hairpin loop mimetics
US7855179B2 (en) 2002-10-02 2010-12-21 Polyphor Ltd. Template-fixed peptidomimetics with antimicrobial activity
WO2006117011A1 (en) 2005-05-02 2006-11-09 Polyphor Ltd. Dye conjugates of template-fixed peptidomimetics
WO2007079597A1 (en) 2006-01-16 2007-07-19 Polyphor Ltd. Template - fixed peptidomimetics with antimicrobial activity
US8633163B2 (en) 2007-01-29 2014-01-21 Polyphor Ltd. Template-fixed peptidomimetics
AU2007348171B2 (en) 2007-02-28 2012-09-06 Polyphor Ltd. Template-fixed peptidomimetics
CA2733117C (en) 2008-08-08 2016-03-22 Polyphor Ag Template-fixed peptidomimetics
US8883720B2 (en) 2008-11-26 2014-11-11 Polyphor Ag Template-fixed beta-hairpin peptidomimetics with CXCR4 antagonizing activity
US8865656B2 (en) 2009-05-07 2014-10-21 Polyphor Ag Beta-hairpin peptidomimetics having CXCR4 antagonizing activity
ES2530519T3 (es) 2009-08-05 2015-03-03 Polyphor Ag Compuestos macrocíclicos completamente sintéticos, con conformación restringida
WO2011060832A1 (en) 2009-11-20 2011-05-26 Polyphor Ag Template-fixed peptidomimetics with ccr10 antagonistic activity
WO2011066869A1 (en) 2009-12-04 2011-06-09 Polyphor Ag Beta-hairpin peptidomimetics
EP2531204B1 (en) 2010-02-05 2016-02-03 Polyphor AG Template - fixed peptidomimetics with cxcr7 modulating activity
WO2011095218A1 (en) 2010-02-05 2011-08-11 Polyphor Ag Template-fixed pep tidomime tics with cxcr7 modulating activity
US8895499B2 (en) 2010-08-05 2014-11-25 Polyphor Ag β-hairpin peptidomimetics
KR102091456B1 (ko) 2011-06-07 2020-03-23 폴리포 리미티드 CXC4 길항제로서의 β-헤어핀 펩타이드 모방체

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002070547A1 (en) * 2001-02-23 2002-09-12 Polyphor Ltd. Template-fixed peptidomimetics with antimicrobial activity
WO2003054000A1 (en) * 2001-12-11 2003-07-03 Polyphor Ltd. Template-fixed peptidomimeticsas inhibitors of serine proteases
WO2004018503A1 (en) * 2002-08-20 2004-03-04 Polyphor Ltd. Template-fixed peptidomimetics with antibacterial activity
WO2004033489A1 (en) * 2002-10-02 2004-04-22 Polyphor Ltd. Template-fixed peptidomimetics with antimicrobial activity
WO2004096839A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-11 Polyphor Ag Template-fixed beta-hairpin peptidomimetics with cxcr4 antagonizing activity
WO2004096840A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-11 Polyphor Ag Template- fixed beta-hairpin peptidomimetics with cxcr4 antagonizing activity
WO2004096838A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-11 Polyphor Ag Template-fixed peptidomimetics as medicaments against hiv and cancer
WO2005047503A1 (en) * 2003-11-15 2005-05-26 Polyphor Ltd. Template fixed βετα-hairpin loop mimetics and their use in phage display
WO2006087001A1 (en) * 2005-02-17 2006-08-24 Polyphor Ltd. Template-fixed beta-hairpin peptidomimetics with protease inhibitory activity

Also Published As

Publication number Publication date
ZA200806564B (en) 2010-05-26
ES2381846T3 (es) 2012-06-01
DK1979374T3 (da) 2012-04-10
US8685922B2 (en) 2014-04-01
PL1979374T3 (pl) 2012-07-31
AU2007204547B2 (en) 2012-09-20
US9538752B2 (en) 2017-01-10
NO20083485L (no) 2008-10-14
CN101395173A (zh) 2009-03-25
CN102796179B (zh) 2015-09-02
SI1979374T1 (sl) 2012-06-29
JP5237826B2 (ja) 2013-07-17
KR20090010022A (ko) 2009-01-28
JP2009523713A (ja) 2009-06-25
EP1979374A2 (en) 2008-10-15
US20140187472A1 (en) 2014-07-03
CA2637377A1 (en) 2007-07-19
NZ570245A (en) 2011-02-25
CA2637377C (en) 2016-03-22
EA200801710A1 (ru) 2009-02-27
AU2007204547A1 (en) 2007-07-19
CY1117252T1 (el) 2017-04-26
IL192816A0 (en) 2009-02-11
NO341875B1 (no) 2018-02-12
US20140187471A1 (en) 2014-07-03
CN101395173B (zh) 2013-03-13
US9596852B2 (en) 2017-03-21
ATE538131T1 (de) 2012-01-15
KR101352829B1 (ko) 2014-02-17
BRPI0707144A2 (pt) 2011-04-19
WO2007079605A3 (en) 2007-08-30
US9521846B2 (en) 2016-12-20
US20140087994A1 (en) 2014-03-27
IL192816A (en) 2013-06-27
PT1979374E (pt) 2012-03-29
HK1175478A1 (en) 2013-07-05
US10730912B2 (en) 2020-08-04
US20100240592A1 (en) 2010-09-23
HK1127957A1 (en) 2009-10-09
EP1979374B1 (en) 2011-12-21
US20170107259A1 (en) 2017-04-20
WO2007079597A1 (en) 2007-07-19
WO2007079605A2 (en) 2007-07-19
CN102796179A (zh) 2012-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA015991B1 (ru) Закрепленные на матрице пептидомиметики
US7253146B2 (en) Template-fixed peptidomimetics with antimicrobial activity
US7582604B2 (en) Template-fixed peptidomimetics with antibacterial activity
NO20131086A1 (no) Templatfikserte beta-hårnål peptidhermere med CXCR4 antagonistisk aktivitet
US8895499B2 (en) β-hairpin peptidomimetics
EP2978771B1 (en) Beta-hairpin peptidomimetics
US7855179B2 (en) Template-fixed peptidomimetics with antimicrobial activity
EP1549670B1 (en) Template-fixed peptidomimetics with antimicrobial activity
EP3201219B1 (en) Beta-hairpin peptidomimetics
EP3201218B1 (en) Beta-hairpin peptidomimetics