CN104903342B - C4s蛋白聚糖特异性转运载体分子 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特定的共有序列或结构的分离的分子、肽和多肽，涉及包含或由此类分子、肽和多肽所构成的化合物，其可以作为特异性识别蛋白聚糖、特别是软骨素‑4‑硫酸酯(C4S)的转运蛋白分子起作用。所述分离的分子、肽、多肽以及本发明化合物可以与生物活性部分(BAM)缀合或连接。因此，该BAM缀合物允许BAM的特异性的靶向和递送，其可以例如在体外或体内试验中将肽类、化学实体或核酸递送到表达C4S的细胞的细胞质和/或细胞核内。

Description

C4S蛋白聚糖特异性转运载体分子
1.发明领域
本发明涉及特定的共有序列或结构的分离的分子、肽类和多肽，并涉及包含或由此类分子、肽类和多肽所构成的化合物，其可以作为特异性识别蛋白聚糖(特别是软骨素-4-硫酸酯(C4S))的转运蛋白分子起作用。所述分离的分子、肽类、多肽以及本发明化合物可以与生物活性部分(BAM)缀合或另外连接。因此，所述BAM缀合物在体外或体内试验中使BAM(其可以是例如肽类、化学实体或核酸)特异性的靶向和递送到表达C4S的细胞的细胞质和/或细胞核内。
2.发明背景
细胞膜通常对于大分子(包括蛋白质和核酸)而言是不能渗透的。此外，即使较小的分子也仅以非常低的比率且在高的、潜在有毒的细胞外浓度存在下才可以进入活的细胞中。缺少将所需化合物特异性地靶向和递送至特定细胞或组织的方法已经成为具有细胞内作用位点的潜在的大量生物活性分子在治疗、预防和诊断或试验应用中的障碍。
在过去十年间，已经研究了用于化合物的细胞内递送的多种方法，以尝试促进将所需物质从外部介质有效地转移入组织或细胞内。最常见的递送构建体已经基于抗体(或抗体片段)或基于发现具有膜结合和转运活性的病毒和细菌肽类。例如，已研究过的转运蛋白构建体基于疱疹病毒VP22蛋白；多肽类，包括人免疫缺陷病毒(HIV)TAT蛋白，和肽类，包括控制触角的基因的蛋白(Antp HD)的同源结构域，以及其功能片段和修饰。
在递送构建体中研究的主要病毒和细菌的肽类(也称作细胞渗透性肽类(CPP))包括富含碱性残基例如赖氨酸和/或精氨酸的阳离子肽类，或者包含增强α-螺旋的氨基酸的肽类。CPP已经用于在某些试验动物模型中体外 转染细胞，但在临床试验中很少证实成功。已经假设，在临床中缺少成功可能源于其对于任何特定的细胞类型或组织缺乏特异性，以及这些肽类在体内的固有的不稳定性(通常表现出几分钟的半寿期)。为了避免体内稳定性的缺乏，研发了几种稳定化的CPP，其已经化学改良或者其包含非天然氨基酸，包括“D”氨基酸。例如，原型“TAT”肽的全“D”-逆-反(retro-inverso)形式(“D-TAT”)已经达到临床2期，但是该肽的潜在的非常长的持久性限制了其局部施用的用途，例如用于耳部或者用于眼内以治疗眼睛炎症。此类稳定化的肽的全身性施用由于其潜在的毒性而被禁止。
通过使用L-氨基酸来替换“D-TAT”肽中的特定位点，所得到的肽类具有中等的半寿期，潜在地更加适用于临床研发。在申请WO 2010/072406、WO 2010/072228或WO2010/072275中公开的转运蛋白构建体包含具有L-和D-氨基酸的氨基酸，其足够稳定以防止在将所运载的部分转运至其目标位点前被蛋白酶降解。此外，这些转运蛋白构建体显示不会长久地留存于细胞内，且在某种程度上易受蛋白酶降解。然而，尽管显示了有效的跨膜转运活性，已经发现其通过摄取发生，但是货物-转运蛋白构建体的货物部分(cargo moiety)不容易从转运蛋白部分裂解，而这通常是所述货物部分具有生物学活性的先决条件。此外，已经发现货物-转运蛋白构建体的降解是缓慢的，因此其表现出在目标细胞中蓄积的趋势。因此，即使所连接的货物部分最终释放或代谢，该转运蛋白构建体可能在细胞内留存较长时间，并参与其它细胞间和细胞内过程，从而导致未知的和不期望的副作用。因此，需要研发用于细胞内递送所需货物部分的改良的化合物。
3.发明简述
发明人已经惊讶地发现，分离的肽类和/或多肽的特定共有序列能够引起与蛋白聚糖C4S的特异性结合，其相对于其它蛋白聚糖(例如肝素、皮肤素、keritan)而言对C4S是选择性的，这进一步表现出相对于类似大小的肽类而言改善的体内稳定性，并且能够用作与其缀合(例如通过化学缀合或重组融合)的分子的细胞和细胞内递送的改进的载体肽类。具有所述多肽 的肽类和或多肽类具有如(i)或(ii)所述的共有序列或其反向序列(reverses)：
(i)Arg1-X2-X3-X4-Arg5-X6-X7-X8-Arg9-(LD10)n-(XD11)m，或
(ii)(XD-2)m-(LD-1)n-Arg1-X2-X3-X4-Arg5-X6-X7-X8-Arg9
其中
(a)Arg1、Arg5和Arg9代表L-精氨酸；LD10或LD-1代表任何L-或D-氨基酸，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；且n具有0-10的值；其中XD11或XD-2代表任何D-氨基酸，但D-精氨酸或D-赖氨酸除外，且m具有0或1的值；且其中剩余氨基酸X2至X4以及X6至X8可以是任何的L-或D-氨基酸，但L-赖氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或D-精氨酸除外，条件是X3或X7代表但不是二者都代表L-赖氨酸或L-精氨酸；
或其中，
(b)Arg1、Arg5和Arg9代表D-精氨酸；LD10或LD-1代表任何L-或D-氨基酸，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；且n具有0-10的值；其中XD11或XD-2代表任何D-氨基酸，但D-精氨酸或D-赖氨酸除外，且m具有0或1的值；且其中剩余氨基酸X2至X4和X6至X8可以是任何L-或D-氨基酸，但L-赖氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或D-精氨酸除外，条件是X3或X7代表但不是二者都代表D-赖氨酸或D-精氨酸。
上述共有序列(i)，具有条件(a)的是SEQ ID NO:17，具有条件(b)的是SEQ ID NO:19。上述共有序列(ii)，具有条件(a)的是SEQ ID NO:18，具有条件(b)的是SEQ ID NO:20。
如上文共有规则所反映，发明人还进一步公开了在2、4、6、8和3位(其中7位如规则(b)所定义/选择)或7位(其中3位如规则(b)所定义/选择)的氨基酸残基不对所述肽的结合活性发挥作用。因此，对于由共有序列(关于在1、5、9以及3或7位侧链在3D空间的呈现)所涵盖的全部可能的肽类而言，上述肽类的靶向部分(由Arg1-X2-X3-X4-Arg5-X6-X7-X8-Arg9代表，条件是3位或7位(但不都是)是赖氨酸或精氨酸)可以视为是相同的。事实上，在1、5和9位的精氨酸残基以及在3或7位(但不都是)的赖氨酸或精氨酸的3D线性排列和/或3D构型确定了靶向部分序列的结合活性，并且 促成了相对于其它蛋白聚糖类的对C4S的结合特异性和选择性。剩余的氨基酸残基(即2、4、6、8和3位(其中7位如规则(b)所定义/选择)或7位(其中3位如规则(b)所定义/选择))首先作为结构骨架来起作用，以保持靶向部分的1、5和9位的精氨酸与3或7位(但不都是)的赖氨酸或精氨酸之间的适当距离和相对构型。因此，如果这些残基的3D空间定向、特别是氨基酸残基侧链的3D呈现维持不变，本发明的肽和/或组合物将表现出对蛋白聚糖、特别是C4S的特异性和选择性结合。
因此，一般而言，本发明涉及包含上文所述(i)或(ii)的共有序列或由上文所述(i)或(ii)的共有序列所构成的分离的肽类和多肽，或者涉及包含或由此类肽和多肽所构成的化合物，以及涉及与所述肽类和/或共有序列(i)和(ii)的靶向部分等同的具有3个精氨酸残基(即Arg1、Arg5和Arg9)和1个精氨酸或赖氨酸(即Arg/Lys3或Arg/Lys7，但不都是)的3D呈现的氨基酸残基构建体(或包含其的化合物)。因此，一般而言，本发明包含在共有序列(i)和(ii)的靶向部分中可自由选择的位点(即，2、4、6、8和3(其中7位如上文规则(b)所定义/选择，为D-或L-赖氨酸或者D-或L-精氨酸)或7位(其中3位如上文规则(b)所定义/选择，为D-或L-赖氨酸或者D-或L-精氨酸))中氨基酸残基的应用，以及用任何适合于维持3个精氨酸残基(即Arg1、Arg5和Arg9)和1个精氨酸或赖氨酸(即Arg/Lys3或Arg/Lys7，但不都是)的等价间隔和相对3D定向/呈现的合适的化学连接体或化学间隔物替换一个或多个这些残基。本发明涵盖了包含氨基酸残基或由氨基酸残基组成的分子，并且还涵盖了同时包含氨基酸残基和化学连接体/间隔物二者的分子，使得所述分子表现出与共有序列(i)和(ii)的靶向部分中1、5和9位的精氨酸和3或7位(但不都是)的赖氨酸或精氨酸相同或等价的相对三维构象的3个精氨酸和1个赖氨酸或精氨酸。如本文全文中所用，包含用化学连接体/间隔物替代一个或多个氨基酸残基的分子被称为残基-间隔物构建体。
为了本文使用方便，在残基-间隔物构建体中与共有序列(i)和(ii)的1、5和9位的精氨酸相对应的精氨酸将分别用Arg1、Arg5和Arg9表示。类似地，在残基-间隔物构建体中与本发明所述肽类和化合物的共有序列(i) 和(ii)的3或7位(但不都是)的精氨酸或赖氨酸相对应的精氨酸或赖氨酸将分别用Arg/Lys3或Arg/Lys7表示。
根据上述，本发明一般而言涉及分子，其中Arg1与Arg5通过一个或多个化学连接体(其可以仅由一个或多个氨基酸残基构成或者可以既包含氨基酸残基又包含化学间隔物/连接体)连接，其中当所述分子/构建体处于伸展构象时，Arg1和Arg5之间的距离是
Figure BDA0000755574230000051
Arg5进一步通过一个或多个化学连接体(其可以仅由一个或多个氨基酸残基构成或者可以既包含氨基酸残基又包含化学间隔物/连接体)与Arg9连接，其中当所述分子/构建体处于伸展构象时，Arg5和Arg9之间的距离是
Figure BDA0000755574230000052
必须选择连接体使得最终的分子Arg1-Arg5-Arg9在处于伸展构象时是直链分子。本发明的分子进一步包含(1)在Ar1和Arg5之间的一种或多种化学连接体中的Arg/Lys3，其中当该分子处于伸展构象时Arg1和Arg/Lys3之间的距离是约
Figure BDA0000755574230000053
或者(2)在Ar5和Arg9之间的一种或多种化学连接体中的Arg/Lys7，其中当该分子处于伸展构象时Arg9和Arg/Lys7之间的距离是约
Figure BDA0000755574230000054
必须注意，当按照本文所述方法用化学连接体替代一个或多个残基时，使Arg1、Arg5、Ang9和Arg/Lys3或Arg/Lys7的侧链保持与共有序列(i)和(ii)的肽和多肽中其对应的侧链相同或类似的3D呈现。因此，当所述分子/构建体处于伸展构象时，处于残基-间隔物构建体内的Arg1、Arg5、Ang9和Arg/Lys3或Arg/Lys7的侧链应当在3D空间中呈现线性或近乎线性的排布。因此，当所述分子/构建体处于伸展构象时，Arg1和Arg9将被分隔
Figure BDA0000755574230000055
在优选的实施方案中，Arg1、Arg5、Ang9和Arg/Lys3或Arg/Lys7各自是(i)L-氨基酸残基或(ii)D-氨基酸残基。
一般而言，本发明涉及至少一种包含所述分子或由所述分子构成的分离的分子或化合物，其中该分子具有(iii)-(vi)中任一所述的共有结构，或其反向序列:
(iii)Arg1-(SPA)-Arg5-(SPB)-X-(SPC)-Arg9-(LD10)n-(XD11)m；
(iv)Arg1-(SPC)-X-(SPB)-Arg5-(SPA)-Arg9-(LD10)n-(XD11)m；
(v)(XD-2)m-(LD-1)n-Arg1-(SPA)Arg5-(SPB)-X-(SPC)-Arg9；或
(vi)(XD-2)m-(LD-1)n-Arg1-(SPC)-X-(SPB)-Arg5-(SPA)-Arg9
其中，LD10或LD-1代表任何L-或D-氨基酸，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；且n具有0-10的值；其中XD11或XD-2代表任何D-氨基酸，但D-精氨酸或D-赖氨酸除外，且m具有0或1的值；
其中
(a)Arg1、Arg5和Arg9代表L-精氨酸；且X代表L-赖氨酸或L-精氨酸，或
(b)Arg1、Arg5和Arg9代表D-精氨酸；且X代表D-赖氨酸或D-精氨酸；
其中(SPA)代表化学连接体，其
(a)由3个氨基酸残基的肽链构成，其中各个残基可以独立地选自任何氨基酸残基，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；或
(b)将相邻的氨基酸残基分隔
Figure BDA0000755574230000061
其中(SPC)代表化学连接体，其
(a)由单个氨基酸残基构成，其可以是任何氨基酸残基，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；或
(b)当该分子处于伸展构象时，将相邻的氨基酸残基分隔
Figure BDA0000755574230000063
且其中(SPB)-X-(SPC)或其反向序列(SPC)-X-(SPB)代表化学连接体
(a)其中SPB和SPC各自代表单个氨基酸残基，其可以独立地选自任何氨基酸残基，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；或
(b)当该构建体处于伸展构象时，其将相邻氨基酸残基Arg1和Arg5或Arg5和Arg9分隔
Figure BDA0000755574230000062
当在共有序列(i)或(ii)中用化学间隔物/连接体代替一个或多个氨基酸残基时(即形成按照共有序列(iii)-(vi)的一个或多个分子)，必须注意地是，Arg1、Arg5、Arg9和Arg/Lys3或Arg/Lys7的侧链保持与其在肽和多肽共有序列(i)和/或(ii)中对应侧链相同或近似的3D呈现。因此，当所述分子和/或构建体处于伸展构象时，按照本发明方法的处于残基-间隔物构建体 内的Arg1、Arg5、Ang9和Arg/Lys3或Arg/Lys7的侧链应当在3D空间中呈现线性或近乎线性的排布。
在某些实施方案中，本发明分子的共有结构(iii)-(vi)不包含任何化学间隔物/连接体，但仅包含氨基酸残基。在这些实施方案中，本发明可以定义为涉及至少一种分离的肽或多肽，和/或涉及包含或由至少一种分离的肽或多肽所构成的化合物，所述肽或多肽具有如下共有序列(i)或(ii)或其反向序列所述的氨基酸序列，
(i)Arg1-X2-X3-X4-Arg5-X6-X7-X8-Arg9-(LD10)n-(XD11)m，或
(ii)(XD-2)m-(LD-1)n-Arg1-X2-X3-X4-Arg5-X6-X7-X8-Arg9
其中，
(a)Arg1、Arg5和Arg9代表L-精氨酸；LD10或LD-1代表任何L-或D-氨基酸，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；且n具有0-10的值；其中XD11或XD-2代表任何D-氨基酸，但D-精氨酸或D-赖氨酸除外，且m具有0或1的值；且其中剩余氨基酸X2至X4和X6至X8可以是任何L-或D-氨基酸，但L-赖氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或D-精氨酸除外，条件是X3或X7代表但不是二者都代表L-赖氨酸或L-精氨酸；
或者其中，
(b)Arg1、Arg5和Arg9代表D-精氨酸；LD10或LD-1代表任何L-或D-氨基酸，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；且n具有0-10的值；其中XD11或XD-2代表任何D-氨基酸，但D-精氨酸或D-赖氨酸除外，且m具有0或1的值；且其中剩余氨基酸X2至X4和X6至X8可以是任何L-或D-氨基酸，但L-赖氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或D-精氨酸除外，条件是X3或X7代表但不是二者都代表D-赖氨酸或D-精氨酸。
上述共有序列(i)，具有条件(a)的是SEQ ID NO:17，具有条件(b)的是SEQ ID NO:19。上述共有序列(ii)，具有条件(a)的是SEQ ID NO:18，具有条件(b)的是SEQ ID NO:20。
在某些实施方案中，本发明分子的共有结构(iii)-(vi)包含SPA、SPB和SPC的化学连接体/间隔物，其不是且不包含氨基酸残基。在这些实施方案 中，本发明可以定义为涉及至少一种残基-间隔物构建体，或者包含其或由其构成的化合物，其中所述构建体具有(vii)-(x)中任一所述的共有结构或其反向序列：
(vii)Arg1-(CLA)-Arg5-(CLB)-X-(CLC)-Arg9-(LD10)n-(XD11)m；
(viii)Arg1-(CLC)-X-(CLB)-Arg5-(CLA)-Arg9-(LD10)n-(XD11)m；
(ix)(XD-2)m-(LD-1)n-Arg1-(CLA)Arg5-(CLB)-X-(CLC)-Arg9；或
(x)(XD-2)m-(LD-1)n-Arg1-(CLC)-X-(CLB)-Arg5-(CLA)-Arg9
其中，LD10或LD-1代表任何L-或D-氨基酸，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；且n具有0-10的值；其中XD11或XD-2代表任何D-氨基酸，但D-精氨酸或D-赖氨酸除外，且m具有0或1的值；
其中
(a)Arg1、Arg5和Arg9代表L-精氨酸；且X代表L-赖氨酸或L-精氨酸，或
(b)Arg1、Arg5和Arg9代表D-精氨酸；且X代表D-赖氨酸或D-精氨酸；
其中(SPA)代表化学连接体，其将相邻的氨基酸残基分隔
Figure BDA0000755574230000081
其中(SPC)代表化学连接体，当分子处于伸展构象时，其将相邻的氨基酸残基分隔
Figure BDA0000755574230000082
且其中(SPB)-X-(SPC)或其反向序列(SPC)-X-(SPB)代表化学连接体，当构建体处于伸展构象时，其将相邻的氨基酸残基Arg1和Arg5或Arg5和Arg9分隔
Figure BDA0000755574230000083
当本发明的分子或化合物包含一个或多个化学间隔物/连接体(其不是仅由氨基酸残基构成)时，必须注意地是，Arg1、Arg5、Ang9和Arg/Lys3或Arg/Lys7的侧链保持与共有序列(i)和(ii)的肽和/或多肽中其对应的侧链相同或类似的3D呈现。因此，当所述分子和/或构建体处于伸展构象时，根据本发明方法的处于残基-间隔物构建体内的Arg1、Arg5、Ang9和Arg/Lys3或Arg/Lys7的侧链将在3D空间中呈现线性或近乎线性的排布。
按照共有序列(iii)-(vi)的如上文所述的分子和化合物(包括仅包含如共 有序列(i)和(ii)所述的氨基酸残基和/或包含如共有结构(vii)-(x)所述的化学连接体和氨基酸残基的某些实施方案)发现了作为本文所述分子和化合物中的转运和/或靶向部分的特定用途，尤其是识别和/或结合蛋白聚糖(例如在细胞表面上所表达的)，特别是相对于其它蛋白聚糖而言选择性地结合蛋白聚糖C4S。用作与C4S蛋白聚糖特异性相互作用的靶向部分的上述共有序列(iii)-(vi)的部分由以下代表：Arg1-(SPA)-Arg5-(SPB)-X-(SPC)-Arg9或Arg1-(SPC)-X-(SPB)-Arg5-(SPA)-Arg9(包括具有靶向部分共有序列或结构Arg1-X2-X3-X4-Arg5-X6-X7-X8-Arg9(SEQ ID NO:21，其中片段SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18；SEQ ID NO:22，其中片段SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20)、Arg1-(CLA)-Arg5-(CLB)-X-(CLC)-Arg9和Arg1-(CLC)-X-(CLB)-Arg5-(CLA)-Arg9)的具体实施方案)，其是在Arg1、Arg5、Arg 9和Arg/Lys3或Arg/Lys7以及特别是这些残基的侧链的3D呈现方面相同的分子。因此，按照共有序列(iii)-(vi)的包含3个精氨酸残基和1个赖氨酸残基的任何分子都可以开发为依据以下规则的靶向部分：
(1)Arg1、Arg5和Arg9的各个残基必须是相同的精氨酸旋光异构体，即各自必须是L-精氨酸或各自必须是D-精氨酸。
(2)Arg1必须使用一个或多个化学间隔物(其可以仅由一个或多个氨基酸残基构成或者可以同时包含氨基酸残基和化学间隔物/连接体)与Arg5连接，使得当该分子处于伸展构象时它们间隔
Figure BDA0000755574230000091
Arg 5必须进一步使用一个或多个化学间隔物(其可以仅由一个或多个氨基酸残基构成或者可以同时包含氨基酸残基和化学间隔物/连接体)与Arg 9连接，使得当该分子处于伸展构象时它们也间隔
Figure BDA0000755574230000092
(3)该靶向部分在Arg1和Arg5之间或Arg5和Arg9之间的连接(但不是二者都是)中还必须包含一个赖氨酸或精氨酸残基，其具有与Arg1、Arg5和Arg9(该残基对应于在共有序列(i)和(ii)中3或7位(但不同时都是)的残基以及共有序列(iii)-(x)中残基“X”)相同的手性。换言之，当Arg1、Agr5和Agr9是L-精氨酸时，所述赖氨酸/精氨酸必须是L-赖氨酸或L-精氨酸；且当Arg1、Arg5和Arg9是D-精氨酸时，所述赖氨酸/精氨酸必须 是D-精氨酸或D-赖氨酸。
(4)当所述赖氨酸/精氨酸位于Arg1和Arg5之间的连接体时，其与Arg1分隔
Figure BDA0000755574230000101
当所述赖氨酸/精氨酸位于Arg5和Arg9之间的连接体时，其与Arg9分隔
Figure BDA0000755574230000102
(5)剩余连接体可包含任何本领域已知和/或本文所述的化学间隔物或连接体(其可以仅由一个或多个氨基酸残基构成或者可以同时包含氨基酸残基和化学间隔物/连接体)，其适合于保持Arg1、Arg5、Arg9和X的所需间隔，并且也适于保持氨基酸及其侧链与共有序列(i)和(ii)中对应残基类似或者相同的3D定向和/或3/D呈现。Arg1、Arg5、Arg9和X之间的连接体应当优选地不带有正电荷。当Arg1、Arg5、Arg9和X之间的连接体是氨基酸残基或者包含氨基酸残基时，所述残基可以是任何D-或L-氨基酸，但D-或L-精氨酸或者D-或L-赖氨酸除外。
当本发明的共有结构由氨基酸构成或仅包含氨基酸时，如上文刚刚所述的靶向部分可以按照如下方法设计。共有结构(iii)-(vi)中靶向部分的序列(其中所述结构由氨基酸构成或仅包含氨基酸残基)是由Arg1-X2-X3-X4-Arg5-X6-X7-X8-Arg9(参见例如共有序列(i)和(ii))代表。该结构满足上述规则(2)。即，当其所分隔的分子处于伸展构象时，以
Figure BDA0000755574230000103
Figure BDA0000755574230000104
分隔Arg1和Arg5以及分隔Arg5和Arg9的连接体是由3个氨基酸残基构成的肽。进一步应用于所述肽共有序列的上文所述的规则是：
(P1)Arg1、Arg5和Arg9的各个残基必须是相同的精氨酸旋光异构体，即各个都必须是L-精氨酸，或各个都必须是D-精氨酸(对应上文规则(1))。
(P2)残基X3或X7(但不都是)是与Arg1、Arg5和Arg9相同手性的赖氨酸或精氨酸。即，当Arg1、Agr5和Agr9是L-精氨酸时，X3或X7(但不都是)必须是L-赖氨酸或L-精氨酸；且当Arg1、Agr5和Agr9是D-精氨酸时，X3或X7(但不都是)必须是D-赖氨酸或D-精氨酸(对应于上文规则3和4)。
(P3)剩余残基，即X2、X4、X6、X8和X3(其中X7是按照如上文刚刚所述的规则P2选择)或X7(其中X3是按照如上文刚刚所述的规则P2选择) 可以是任何氨基酸，但L-或D-精氨酸或L-或D-赖氨酸除外。
对于全部本发明的分子和化合物，即包含任何共有序列(iii)-(vi)的分子和化合物(包括实施方案(i)、(ii)和(vii)-(x))，进一步优选(但不是必需)LD-10或LD-1代表L-或D-氨基酸，但L-或D-精氨酸或者L-或D-赖氨酸除外，且进一步优选(但不是必需)XD-11或XD-2代表D-氨基酸，但D-精氨酸或D-赖氨酸除外。最优选地，LD-10或LD-1代表L-或D-组氨酸，且XD-11或XD-2代表D-组氨酸。
当本发明的共有结构由氨基酸构成或仅包含氨基酸时，优选(但不是必需)D-氨基酸是位于4位或6位，即X4或X6。在其它优选的实施方案中，“可自由选择的位点”，即2、4、6、8和3位(其中7位是按照上文规则(b)定义/选择，如D-或L-赖氨酸或者D-或L-精氨酸)或7位(其中3位是按照上文规则(b)定义/选择，如D-或L-赖氨酸或者D-或L-精氨酸)各自独立地选自氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸和亮氨酸。还优选地是，不超过三个可自由选择的位点是丙氨酸残基。此外，优选地，可自由选择的位点都不是脯氨酸残基。
可以按照本文所公开方法使用的肽类以及特别是如上文所定义的肽类的非限定性实例在表1中提供。
表1
本发明的示例性肽*
RSTqRYRVRh(SEQ ID NO：1)
RYFvRIKYRh(SEQ ID NO：2)
RYFvRIKARh(SEQ ID NO：3)
RAAvRAKYRh(SEQ ID NO：4)
RAAvRIKYRh(SEQ ID NO：5)
RSTqRYRVRh(SEQ ID NO：6)
RSTqRYKVRh(SEQ ID NO：7)
RGGgRGKGRh(SEQ ID NO：8)
RHHhRHKHRh(SEQ ID NO：9)
RVVvRVKVRh(SEQ ID NO：10)
RLLlRLKLRh(SEQ ID NO：11)
RMMmRMKMRh(SEQ ID NO：12)
RIIiRIKIRh(SEQ ID NO：13)
RYFVRiKYRh(SEQ ID NO：25)
RSTqRYRVR(SEQ ID NO：26)
RYFvRIKYR(SEQ ID NO：15)
RYFvRIKAR(SEQ ID NO：27)
RAAvRAKYR(SEQ ID NO：28)
RAAvRIKYR(SEQ ID NO：29)
RSTqRYRVR(SEQ ID NO：30)
RSTqRYKVR(SEQ ID NO：31)
RGGgRGKGR(SEQ ID NO：32)
RHHhRHKHR(SEQ ID NO：33)
RVVvRVKVR(SEQ ID NO：34)
RLLlRLKLR(SEQ ID NO：35)
RMMmRMKMR(SEQ ID NO：36)
RIIiRIKIR(SEQ ID NO：37)
RYFVRIKYR(SEQ ID NO：14)
RYFVRiKYR(SEQ ID NO：16)
＊小写表示D-对映异构体；大写表示L-对映异构体
除包含共有序列(i)或(ii)所述的肽或由共有序列(i)或(ii)所述的肽构成的肽类、多肽和化合物以外，本发明还进一步包括本文所明确公开的示例性肽序列的变体。所述变体包括在可自由选择位置上的替代，即在2、4、6、8和3位(其中7位是按照上文规则(b)定义/选择，如D-或L-赖氨酸或者D-或L-精氨酸)或7位(其中3位是按照上文规则(b)定义/选择，如D-或L-赖氨酸或者D-或L-精氨酸)用保守氨基酸替代。如本领域所熟知，“保守替代”是用另一种具有类似特征的氨基酸替代，例如，小的氨基酸替代小的氨基酸，酸性氨基酸替代酸性氨基酸等，这是针对氨基酸的任何特征分类，例如极性氨基酸、碱性氨基酸、疏水性氨基酸和芳香性氨基酸。按照本发明的特定残基的优选替代可以选自其保守替代组中的其它成员。六个保守替代组是本领域内通常认可的：(1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)；(2)天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；(3)天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)；(4)精氨酸(R)、组氨酸(H)和赖氨酸(K)；(5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)；和(6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。
然而，本文所明确公开的共有序列(i)和(ii)中所述的任何肽序列的可自 由选择位置上的替代不需要都用其保守替代组的成员。本发明还包括在可自由选择位置上的替代不需要都用其保守替代组的成员。本发明还包括在可自由选择位置，即在2、4、6、8和3位(其中7位是按照上文规则(P2)定义/选择，如D-或L-赖氨酸或者D-或L-精氨酸)或7位(其中3位是按照上文规则(P2)定义/选择，如D-或L-赖氨酸或者D-或L-精氨酸)的任何残基用任何其它L-或D-氨基酸(但L-或D-精氨酸或者L-或D-赖氨酸除外)按照本文所概括的共有序列规则进行替代。如本文所详细描述，未定义的位置基本上不促成靶向作用。
在本发明的全部实施方案中，应当避免在任何共有序列(i)-(x)中(例如在任何其所定义的化学连接体/间隔物中)使用氨基酸脯氨酸(P)，因为认为该残基将会破坏或充分扭曲分子或肽的三维构象，从而显著降低结合活性或亲和力。
与本领域已知的或本文所述的共有序列(i)和(ii)中相应残基等价的适合于保持3个精氨酸残基(即，Arg1、Arg5和Arg9)和1个精氨酸或赖氨酸(即，Arg/Lys3或Arg/Lys7，但不都是)的间隔及相对3D定向/呈现的任何适合的化学连接体或化学间隔物都可以用于按照共有结构(iii)-(vi)的本发明分子(包括具有任何共有序列(vii)-(x)的实施方案)的构建。合适的化学连接体/间隔物的非限定性实例包括β-和γ-肽类；基于糖氨基酸的支架；β-发夹拟肽类；α-螺旋模拟物、β-折叠模拟物以及β-转角模拟物和环肽类。在优选的实施方案中，所述化学连接体/间隔物是不带正电荷的。所述连接体应当经受代谢降解、无毒性(包括代谢物)且不应当显著降低本发明化合物的溶解度。
可以明确预见的是，本申请全文中所述的实施方案，无论是否认定为优选(包括最优选)，都可以在本发明的肽的设计与选择中独立地实施和/或可以与其它公开的实施方案组合。因此，本发明的肽、多肽、分子或化合物的靶向部分的序列或结构必须满足上文所列出的规则(1)-(5)，且可以任选地不满足、满足一个或多个本文所公开的其它实施方案(无论是否优选)中所概括的条件。
本发明可以包含按照共有序列(iii)-(vi)(包括按照共有序列(i)和(ii)以及共有结构(vii)-(x)的实施方案)的分离的分子和化合物(包括分离的分子、肽类、多肽以及包含或由所述分子、肽类和/或多肽构成的化合物)，且可以进一步包含生物活性部分(BAM；也称为靶向部分的“货物”)。(BAM)-(靶向部分)构建体还可以在本公开物的全文中称为本发明的BAM-缀合物。该BAM可以与本发明的化合物、肽类、多肽和/或分子直接化学缀合和/或可以通过连接体基团与其连接。
如本公开物全文所用，直接缀合是指BAM部分与共有序列(iii)-(vi)(包括按照共有序列(i)和(ii)以及共有结构(vii)-(x)的实施方案)内的任何氨基酸残基或者与任何氨基酸残基或其中适合的化学基团进行缀合，使用本领域已知的或本文所述适合于将BAM部分与氨基酸残基(例如氨基酸侧链)和/或化学基团缀合的化学偶联方法。因此，直接偶联可能导致一个或多个化学基团间隔于BAM部分和残基-间隔物构建体的氨基酸(例如氨基酸侧链)或化学基团之间，所述基团的形成是本领域已知的偶联反应的结果。
或者，如本文所述，BAM部分可以与共有序列(iii)-(vi)(包括按照共有序列(i)和(ii)以及共有结构(vii)-(x)的实施方案)内的任何氨基酸残基或化学基团间接缀合，即通过连接基团缀合。因此，如本公开物全文所用，间接缀合的含义是BAM是与连接基团缀合，该连接基团与本文所定义的共有序列内的氨基酸残基或化学基团缀合。BAM与连接基团之间以及连接基团与共有序列(iii)-(vi)(包括按照共有序列(i)和(ii)以及共有结构(vii)-(x)的实施方案)的氨基酸残基或化学基团之间的缀合，可以是任何适合于产生如本文所述或如本领域内其它已知的这类缀合的缀合方法和/或化合物。
BAM部分的直接或间接缀合可以指向本发明分子内的任何氨基酸残基或化学连接体/间隔物基团。因此，BAM部分可以直接或间接与在共有序列(iii)-(vi)(包括按照共有序列(i)和(ii)以及共有结构(vii)-(x)的实施方案)的N或C末端的氨基酸残基缀合。可选择地或者另外地，BAM部分可以与本发明分子内的内部氨基酸残基或化学连接体/间隔物基团直接或间接缀合。如本公开物全文所用，内部残基或内部化学基团是指不处于线性肽 链或线性残基-间隔物构建体末端的共有序列(iii)-(vi)(包括按照共有序列(i)和(ii)以及共有结构(vii)-(x)的实施方案)的氨基酸残基或化学基团。如本领域已知，缀合方法(无论直接或间接)可能需要一个或两个缀合位点的化学修饰(例如，本发明分子内的氨基酸残基的修饰、化学基团的修饰和/或BAM部分的修饰)。因此，本发明还包括本发明分子、包含或由所述分子和/或缀合组分构成的化合物的化学修饰。
在优选的实施方案中，本发明化合物包含肽-缀合物或由肽-缀合物构成，例如BAM-缀合物，其具有缀合在如本文所述的共有序列或结构(i)-(x)末端的BAM。因此，在这些优选的实施方案中，该BAM-缀合物具有根据如下共有结构(xi)-(xiv)或其反向序列的共有结构：
(xi)(BAM)-(LINK)-Arg1-(SPA)-Arg5-(SPB)-X-(SPC)-Arg9-(LD10)n-(XD11)m；
(xii)(BAM)-(LINK)-Arg1-(SPC)-X-(SPB)-Arg5-(SPA)-Arg9-(LD10)n-(XD11)m；
(xiii)(XD-2)m-(LD-1)n-Arg1-(SPA)Arg5-(SPB)-X-(SPC)-Arg9-(LINK)-(BAM)；或
(xiv)(XD-2)m-(LD-1)n-Arg1-(SPC)-X-(SPB)-Arg5-(SPA)-Arg9-(LINK)-(BAM)，
(BAM)代表生物活性部分；其中(LINK)代表任选的连接基团；其中,LD10或LD-1代表任何L-或D-氨基酸，且n具有0-10的值；其中XD11或XD-2代表任何D-氨基酸，且m具有0或1的值；
其中
(a)Arg1、Arg5和Arg9代表L-精氨酸；且X代表L-赖氨酸或L-精氨酸，或者
(b)Arg1、Arg5和Arg9代表D-精氨酸；且X代表D-赖氨酸或D-精氨酸；
其中(SPA)代表化学连接体，其
(a)由3个氨基酸残基的肽链构成，其中各个残基可以独立地选自任何氨基酸残基，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；或
(b)将相邻的氨基酸残基分隔
Figure BDA0000755574230000151
其中(SPC)代表化学连接体，其
(a)由单个氨基酸残基构成，其可以是任何氨基酸残基，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；或者
(b)当该分子处于伸展构象时，将相邻的氨基酸残基分隔
Figure BDA0000755574230000161
且其中(SPB)-X-(SPC)或其反向序列(SPC)-X-(SPB)代表化学连接体
(a)其中SPB和SPC各自代表单个氨基酸残基，其可以独立地选自任何氨基酸残基，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；或
(b)当该构建体处于伸展构象时，将相邻的氨基酸残基Arg1和Arg5或Arg5和Arg9分隔
Figure BDA0000755574230000162
除了存在BAM部分和任选的连接基团(LINK)外，共有序列(xi)-(xiv)与共有序列(iii)-(vi)是相同的。因此，化学间隔物(SPA)、(SPB)和(SPC)(其可以仅包含氨基酸残基或同时包含如本文所述的化学连接体和氨基酸残基)的选择如本文对共有序列(iii)-(vi)所述进行，包括：
·选择这些化学间隔物以便仅包含如本公开物全文详述的共有序列(i)和(ii)的实施方案(及其组合)中所述的氨基酸残基，以及
·选择这些化学间隔物以便同时包含如本公开物全文详述的共有结构(vi)-(x)的实施方案(及其组合)中所述的化学连接体和氨基酸残基二者。
当存在连接基团(例如在共有结构(xi)-(xiv)中的(LINK))，和/或用于BAM与任何共有序列/结构(i)-(x)中的氨基酸残基或化学基团间接连接的连接基团时，该连接体可以是本领域已知或者本文公开的适合于将BAM与剩余靶向部分连接的任何连接体，例如肽连接体。BAM可以化学缀合于连接基团，或者，例如当该连接基团(例如结构(xi)-(xiv)中的(LINK))和BAM都是肽或多肽时，BAM可以通过肽键与连接基团连接，并且该连接基团也可以通过肽键与共有序列/结构的靶向部分连接。连接基团的非限定性的实例包括肽连接体，例如包含一个或多个谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸的残基及其组合。在某些实施方案中，结构(xi)-(xiv)的连接基团(LINK)是单个氨基酸，其为L-或D-谷氨酸。
本发明还包括含有所述分子例如肽-缀合物/残基-间隔物-缀合物 /BAM-缀合物或由其构成的分子和化合物，其不包含连接基团，即，共有结构(xi)-(xiv)不含(LINK)部分和/或BAM部分与任何共有序列/结构(i)-(x)内的任何氨基酸残基或化学基团直接连接。当本发明的BAM-缀合物不含连接基团时，该BAM可以直接与分子的氨基酸残基或化学基团(例如化学连接体的化学基团)缀合，例如化学缀合。所述化学缀合的非限定性实例包括与分子在N-末端共价连接和/或与N-末端或者在C-末端的氨基酸残基经酰胺键连接和/或经酯键与C-末端的氨基酸残基连接。当BAM是肽或多肽时，该BAM可以直接与N-末端和/或N-末端的氨基酸或者与C-末端和/或C-末端的氨基酸经肽键连接。
本发明涵盖了期望将在向生物体施用或者递送到生物体的一种或多种细胞时(无论体外或体内)产生治疗相关的活性的任何BAM。因此，本发明所涵盖的BAM的非限定性的实例包括单糖和多糖类、细胞毒药物、抗肿瘤药物、抗炎药物、抗病毒剂、抗菌剂以及用于治疗原虫感染的药物。所述BAM还可以是脱氧核糖或核糖。
按照本发明方法可以用作BAM的抗肿瘤药的非限定性实例包括但不限于阿地白介素、阿仑珠单抗、阿利维A酸、别嘌呤醇、六甲蜜胺、氨磷汀、阿那曲唑、阿比特龙、砷、阿西替尼、阿扎胞苷、苯达莫司汀、贝沙罗汀、博来霉素、硼替佐米、白消安、卡巴他赛、卡普睾酮、卡培他滨、卡铂、卡非佐米、卡莫司汀、卡莫司汀、塞来昔布、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、克唑替尼、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、更生霉素、放线菌素D、达沙替尼、柔红霉素、地西他滨、右雷佐生、多西紫杉醇、多柔比星、恩替诺特、表柔比星、艾日布林(eribulin)、厄洛替尼、雌莫司汀、依托泊苷、依维莫司、依西美坦、Fostamatinib、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、5-FU、氟维司群、吉非替尼、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、来那度胺、异环磷酰胺、伊马替尼、洛莫司汀、伊立替康、异维A酸、伊沙匹隆、拉帕替尼、来那度胺、来曲唑、甲酰四氢叶酸、左旋咪唑、洛莫司汀、CCNU、Marizomib、甲川氯、氮芥、美法仑、L-PAM、巯嘌呤、6-MP、Mertansine、美司钠、氨甲喋呤、甲氧沙林、丝裂霉素、 米托坦、米托蒽醌、诺龙、奈拉滨、尼洛替尼、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸盐、帕唑帕尼、培加酶、培美曲塞、喷司他丁、哌血生、普乐沙福、普利霉素、光辉霉素、卟菲尔钠、普拉曲沙、丙卡巴肼、奎纳克林、雷帕霉素、罗米地辛、鲁索替尼(ruxolitinib)、索拉非尼、链脲菌素、舒尼替尼、他莫昔芬、替莫唑胺、替西罗莫司、替尼泊苷、VM-26、睾内酯、沙利度胺、硫鸟嘌呤、6-TG、噻替哌、拓扑替康、托瑞米芬、维A酸、ATRA、尿嘧啶氮芥、戊柔比星、凡德他尼、威罗菲尼、维替泊芬、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、Vismodegib、伏立诺他、唑来膦酸、核苷类似物AZT、b-D-阿拉伯呋喃糖、阿糖腺苷、2-氯脱氧腺苷、嵌入药物、激酶抑制剂、克罗他滨、拉罗莫司汀、环磷酰胺、门冬酰胺酶、地塞米松、泼尼松和来他替尼。上文列出的抗肿瘤药不仅可以按照本文所公开的方法用于与肿瘤疾病相关的疾病，还可以用于治疗、预防和/或缓解其它疾病或其症状，如本领域已知的，例如治疗、预防和/或缓解与抗炎或自身免疫相关的疾病和/或其症状。
按照本发明方法可以用作BAM的抗炎药的实例包括但不限于COX-2抑制剂、泼尼松、帕唑帕尼、法莫替丁、Dalfampridine、Pegloticase、埃索美拉唑、阿司匹林、塞来昔布、双氯芬酸、伐地昔布、罗非昔布、二氟尼柳、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、奥沙普秦、吡罗昔康、舒林酸、托美汀、兰索拉唑、甲氯灭酸盐、曲安西龙、甲泼尼龙、倍他米松、布地奈德、泼尼松龙、氢化可的松、地塞米松和可的松。
按照本发明方法可以用作BAM的抗原虫药的实例包括但不限于氯喹、甲氟喹、伯氨喹、氯胍盐酸盐、氯胍盐酸盐与阿托伐醌、乙胺嘧啶、磺胺多辛、奎宁、喹啉、多西环素、克林霉素、青蒿琥酯、二氯尼特、甲硝唑、替硝唑、盐酸米帕林、两性霉素、喷他脒、乙胺嘧啶、磺胺嘧啶、阿奇霉素、阿托伐醌、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、氨苯砜、阿托伐醌、喷他脒依西酸盐、阿莫地喹、氯苯胍、依氟鸟氨酸、羟氯喹、双碘喹啉、葡甲胺、美拉胂醇、硝呋莫司、巴龙霉素、葡萄糖酸锑钠、苏拉明和锥虫胂 胺。
如本文所详细描述，本发明化合物包含或由可以有效进行BAM的细胞内转运的BAM-缀合物(即BAM与靶向部分缀合；还称为肽-缀合物)构成。因此，在优选的实施方案中，本发明包括含有本发明化合物(例如BAM-缀合物)和可药用载体的药物组合物。包含例如BAM-缀合物的本发明的药物组合物可用于任何已知的或者预期可用BAM治疗的适应证。例如，当BAM是抗病毒剂时，该包含BAM-缀合物的药物组合物可以用于治疗病毒感染或其症状，包括但不限于HIV；爱泼斯坦-巴尔病毒；麻疹病毒属；副粘病毒；风疹病毒属；疱疹病毒；登革热病毒；单纯疱疹病毒；细小病毒属；呼吸道合胞病毒；天花病毒；水痘；黄病毒属；人类嗜T淋巴细胞病毒；甲、乙、丙、丁或戊型肝炎病毒、拉沙病毒和/或流感病毒。当BAM是抗原虫药时，该包含BAM-缀合物的药物组合物可以用于治疗原虫感染，例如利什曼病和/或疟疾。
共有序列/结构(i)-(xiv)的靶向部分特异性地与蛋白聚糖类、特别是软骨素-4-硫酸酯(C4S)相互作用。C4S优选地与某些细胞表面标记物例如CD68相关表达，并且相对于其它蛋白聚糖类优选地被某些细胞类型例如白细胞和髓细胞表达。因此，本发明包括所述分子和化合物例如BAM-缀合物特异性地靶向于表达CD68和/或C4S的细胞的用途。本发明包括所述分子和化合物例如BAM-缀合物促进BAM部分向表达CD68和/或C4S的细胞例如髓细胞和白细胞内转运的用途。
发现本发明的分子和化合物(包括包含或由任何共有序列(i)-(xiv)构成的分离的分子、肽、多肽和化合物)在靶向白细胞和/或髓细胞中的用途，并且因此可以发现在治疗、预防或缓解其中与白细胞具有病理生理关联的疾病或病症相关的症状中的特定用途。此类疾病或病症的非限定性的实例包括中性粒细胞增多、中性粒细胞减少、白细胞减少、嗜碱性粒细胞减少、嗜碱性粒细胞增多、嗜酸粒细胞减少、嗜酸粒细胞增多、特发性嗜酸细胞增多综合征、淋巴细胞增多、淋巴细胞增多症、淋巴细胞减少症、单核细胞增多、单核细胞减少、梅-海二氏异常、佩-休二氏异常、奥-赖氏颗粒异 常(Alder-Reilly Anomaly)、切-希二氏综合征(Chedial-Higashi syndrome)、乔布综合征(高IgE)、懒惰白细胞综合征、先天性C3缺陷、慢性肉芽肿病、白细胞、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、髓过氧化物酶缺陷-良性、严重联合免疫缺陷病、迪格奥尔格综合征、内兹罗夫综合征、婴儿伴性低丙种球蛋白血症、普通可变的低丙种球蛋白血症、粘多糖贮积症、lipodoses、戈谢病、尼曼皮克病、法布里病、法伯病、神经节苷脂累积病；泰-萨克斯病、Sandhoff病、克拉伯病、异染性脑白质营养不良、Wolman病、白血病、急性淋巴细胞白血病(L1、L2、L3)、慢性淋巴细胞白血病、所有类型的急性髓性白血病(AML)，包括未分化的AML(M0)、成髓细胞白血病(M1)、成髓细胞白血病(M2)、前髓细胞性白血病(M3)、粒单核细胞白血病(M4)、单核细胞性白血病(M5)、红白血病(M6)、巨核母细胞性白血病(M7)、慢性髓性白血病以及未分化的或双表型的急性白血病(同时具有淋巴细胞的和髓细胞的特征的白血病)，以及所有形式的淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤和滤泡淋巴瘤。
4.定义
本文所用的术语“其中与白细胞具有病理生理关联的疾病或病症”及类似词语是指：i)病症，其中所述疾病的病因首先取决于骨髓或淋巴样细胞，例如恶性转化，包括全部形式的白血病以及非恶性白细胞障碍，包括白细胞功能的遗传性疾病；ii)由毒性侵害所导致或由白细胞的病毒、细菌、原虫或其它寄生虫感染所导致的白细胞功能的继发性障碍；或者iii)关于一般情况下在炎症和免疫应答中普遍存在的白细胞问题，例如在疾病和病症或其症状中，其既不是由白细胞引发的原发性也不是继发性的，但是其可以通过调节(刺激或抑制)白细胞活性来进行治疗、预防、减弱或缓解。
本文所用的术语“化学衍生物”是指氨基酸、氨基酸侧链和肽键的(化学)修饰(包括在共有结构/序列的骨架内的在N-末端、C-末端的那些)，以及共有结构(iii)-(xiv)的化学间隔物/连接体内任何化学基团的修饰。该术语 不意味着是指氨基酸或肽链中氨基酸残基的任何添加、替代或删除。L-氨基酸或L-对映异构体的氨基酸的化学衍生物通常情况下包含这些氨基酸的任何天然或非天然产生的衍生物，包括但不限于包含翻译后修饰或合成修饰的如上文所定义的氨基酸，包括乙酰化(在(多-)肽序列的N-末端，在赖氨酸残基上，等等)；脱乙酰化；烷基化例如甲基化、乙基化等(优选地在(多-)肽序列内的赖氨酸或精氨酸残基)；脱烷基化，例如脱甲基、脱乙基等；酰胺化(优选地在(多-)肽序列的C-末端)；甲酰化；γ-羧化；谷氨酰化；糖基化(优选地在(多-)肽序列内的天冬酰胺、赖氨酸、羟基赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基等)；添加血红素部分；羟基化；碘化；添加类异戊二烯部分如法尼基或香叶基香叶醇等的异戊烯化；脂酰化(lipoylation)(连接脂肪酸酯官能团)，例如异戊烯化，形成GPI锚定点，包括豆蔻酰化、法尼基化、香叶基香叶酰化等；氧化、磷酸化(例如对(多-)肽序列内的丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或组氨酸基团等)；硫酸化(例如酪氨酸)；硒酰化(selenoylation)、硫酸化等。氨基酸的化学衍生物还包括但不限于修饰过的氨基酸，其已通过引入标记，包括放射性标记、染色或荧光基团或者化学发光基团进行修饰。
如本文所用，术语“可自由选择的位点”、“可自由选择的氨基酸”及类似的术语是指在包含共有序列(i)和(ii)的实施方案中靶向部分内的未明确定义的位点。共有序列(i)和(ii)的靶向部分是由Arg1-X2-X3-X4-Arg5-X6-X7-X8-Arg9代表，其中Arg1、Arg5和Arg9代表D-或L-精氨酸(全部相同手性)，且其中剩余氨基酸X2至X4和X6至X8可以是任何L-或D-氨基酸，但L-赖氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或D-精氨酸除外，条件是X3或X7(但不都是)赖氨酸或精氨酸，其具有与Arg1、Arg5和Arg9相同的手性。因此，共有序列(i)和(ii)中共有5个可自由选择的位点，其是X2、X4、X6、X8以及X3(当位点X7被定义/选择为D-或L-赖氨酸或者D-或L-精氨酸时)或X7(当位点3被定义/选择为D-或L-赖氨酸或者D-或L-精氨酸时)。如本文进一步定义，本发明还包括用化学间隔物(其也可以包含氨基酸残基)代替可自由选择的氨基酸以形成残基-间隔物构建体，从而使得三个精氨酸和一个赖氨酸或精氨酸的相对3D定向与共有序列(i) 和(ii)中Arg1、Arg5和Arg9以及位点3或7的Arg/Lys(但不都是)相同(即全文中所提及的残基-间隔物)。可以代替本发明分子(例如残基-间隔物构建体)中的可自由选择的氨基酸的化学间隔物/连接体在共有结构(iii)-(vi)和(xi)-(xiv)中用(SPA)、(SPB)和(SPC)代表，并且在共有结构(vii)-(x)中用(CLA)、(CLB)和(CLC)代表。
在本发明的全文中，L-氨基酸(如本领域已知且在本文称作L-对映异构体氨基酸)是优选地选自天然存在的氨基酸或其衍生物。天然存在的氨基酸是公认为标准的(形成蛋白质的)氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸，但是也包含非标准氨基酸，例如鸟氨酸、瓜氨酸、高半胱氨酸、S-腺苷蛋氨酸、羟脯氨酸、硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、羊毛硫氨酸、2-氨基异丁酸、脱氢丙氨酸和γ-氨基丁酸。
类似地，在本发明的全文中，D-氨基酸(如本领域已知且在本文称作D-对映异构体氨基酸)是优选地选自非天然(非形成蛋白质的)“逆-反”氨基酸，其中，这些非天然(非形成蛋白质的)“逆-反”氨基酸被公认是衍生自如上文所定义的天然存在的L-氨基酸和/或其衍生物。在本文中，术语“逆-反”是指如上文定义的天然存在的L-氨基酸的异构体(以及由其制备的肽类)，其中天然存在的L-氨基酸残基的手性反转为对应的D-氨基酸。换言之，在D氨基酸的肽键中羰基和氨基基团交换位置，同时在各个α碳的侧链位置保持不变。因此，D-氨基酸可以插入包含或由L-氨基酸构成的肽序列中，并因此可以通过本领域内已知的或者本文所定义的方法与上文所定义的L-氨基酸缀合。
本文中所用的氨基酸缩写如以下对应表中所示。如本公开物全文中所用以及如下表中所详细描述，大写的1个字母符号代表L-氨基酸，而小写的1个字母符号代表D-氨基酸。
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本文所用的术语“白细胞”是指如本文所定义或如本领域已知的任何类型的白细胞。该术语包含白细胞的前体细胞和/或其不同的发育阶段。术语“白细胞”通常包括粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状 细胞、肥大细胞和/或小神经胶质细胞。粒细胞包括但不限于中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。淋巴细胞包括但不限于NK细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、γδT细胞和B细胞。
如本文所用，术语“肽类”、“多肽”和“蛋白质”具有其如本领域内所通常理解的含义，即是指氨基酸链。但是，该术语不应理解为限制了氨基酸链的长度。
5.附图简述
图1：以伸展构象的TAT肽(左侧分子)和C4S(右侧分子)的呈现，指示了按照模型预测的某些化学基团之间的计算距离。
图2：本发明的靶向部分(即九肽)(左侧分子)与C4S蛋白聚糖(右侧分子)之间相互作用的模型的三维呈现。
图3：C4S与本发明的靶向肽之间相互作用的图解展示。
图4：具有序列RYFvRIKYRh的本发明的肽(“RYF”)与多种蛋白聚糖(4A)的结合和与TAT肽(4B)的结合的比较；HS:硫酸肝素；C4S:软骨素-4-硫酸酯；C6S：软骨素-6-硫酸酯；HA:透明质酸。本发明的RYF肽相对于其它蛋白聚糖而言特异性地且选择性地结合C4S。
图5：本发明的肽与C4S的结合率。大写字母代表L-对映异构体，小写字母代表D-对映异构体。只有当1、5、9以及3或7位全部具有相同手性时才可以保持对C4S的结合率。
图6：本发明的肽与C4S的结合率。大写字母代表L-对映异构体，小写字母代表D-对映异构体。相对于结合蛋白聚糖肝素和透明质酸盐而言对C4S的选择性结合与所述肽的降低的负电荷相关。
图7：预先用FITC-标记的本发明的肽:RYFvRIKYRh(“RYF”；SEQ ID NO:2)孵育的表达C4S的CHO细胞和缺失C4S的Sog9细胞的LUMASCOPETM荧光显微镜检查图像。RYF不能与Sog9细胞结合，该细胞缺少C4S表达。
图8：本发明的FITC-标记的肽:RYFvRIKYRh(“RYF”；SEQ ID NO:2) 与预先用0、3、10或30μM氯酸盐(一种磺基转移酶抑制剂(因此是C4S表达的抑制剂))孵育16小时的巨噬细胞结合的LUMASCOPETM荧光显微镜检查图像。随着C4S表达的减少，RYF结合减少。
图9：来自Atlas阵列的CHST11基因表达数据。
图10：当与巨噬细胞提取物接触时N-末端缀合的FITC从本发明的肽上释放。肽1、5和6具有共有序列:RXXxRXXXRh；肽14、15和16具有共有序列：RXxXRXXXRh；肽23、24和25具有共有序列：rXXXrXXXr。肽和FITC之间的缀合是通过常规共价肽键连接在所述肽的N-末端氨基酸而实现。+/-是指存在或不存在细胞提取物。
图11：用2.5μM指定的核苷类似物或作为与RYF(SEQ ID NO:2)的缀合物的所述类似物在酚红的存在下孵育的原始巨噬细胞衍生的细胞的生长。包含分裂细胞的培养物将培养基变澄清，而包含未分裂细胞的培养物的培养基保持深色(活性化合物)(图11A)。通过检测LDH的相对含量来确定生长百分率(图11B)。
图12：在酚红的存在下与3’氨基β-D-阿拉伯呋喃糖苷单独接触或者以与RYF(SEQID NO:2)肽的缀合物形式接触的原始巨噬细胞衍生的细胞的生长。包含分裂细胞的培养物将培养基变澄清，而包含未分裂细胞的培养物的培养基保持深色。只有经D-氨基酸连接的与RYF(SEQ ID NO:2)的缀合证实了细胞毒性。
图13：在酚红的存在下与3’AdT(3’氨基脱氧胸腺嘧啶核苷)和3’氨基β-D-阿拉伯呋喃糖苷(Ribo)单独接触或者以与RYF(SEQ ID NO:2)肽的缀合物形式接触的原始巨噬细胞衍生的细胞的生长。包含分裂细胞的培养物将培养基变澄清，而包含未分裂细胞的培养物的培养基保持深色。与D-对映异构体“e”的连接将无活性化合物转化为高度的细胞生长抑制化合物。
图14：与指定化合物或作为与RYF(SEQ ID NO:2)肽(本发明的示例性的肽)的缀合物的化合物接触的MOLT4细胞的生长。
图15：TAT和C4S的潜在相互作用的化学残基之间平均距离的图解性详述。框起来的数字标识了用于模拟的和如本文所述的各个分子的残基 编号。
图16：TAT和C4S的潜在相互作用的化学残基之间平均距离的图解性详述。框起来的数字标识了用于模拟的和如本文所述的各个分子的残基编号。
图17：TAT和C4S的残基对之间相互作用的发生频率，以30个MD模拟进行计算，每个长度20ns，分别从(A)TAT和C4S的三重相互作用的残基对1/4、3/5和5/6开始；和分别从(B)TAT和C4S的三重相互作用的残基对3/4、5/5和7/6开始。所计算的发生频率的区间是90-100％(方块)、80-90％(十字形)、70-80％(三角形)、50-70％(星形)和30-50％(菱形)。实线的小圈显示在MD模拟开始时引入的相互作用的残基对，而虚线的小圈显示预期的相互作用的残基对，如果假设的相互作用方案是正确的，那么预期的相互作用的残基对应当自发形成。
图18：(A)用于启动MD模拟(其结果存在于图17A)的TAT/C4S复合物的最初构象。仅有TAT和C4S的残基1/4、3/5和5/6分别相互作用。
(B)从一个MD模拟中提取的一个框，显示了TAT的残基7和9与C4S的很有限的残基(包括残基7和8)之间的相互作用的自发形成。
6.发明详述
本发明涉及分子、肽类、多肽以及包含此类具有特定共有序列或结构的分子、肽类或多肽或由其构成的化合物，以及其用于将生物活性部分(BAM)向细胞内环境(细胞质和/或细胞核)特异性转运的用途。发明人令人吃惊地发现，分子和肽类的某些共有结构或序列能够选择性地靶向特定的蛋白聚糖，特别是软骨素-4-硫酸酯(C4S)。因此，包含此类含有一个或多个本文所公开的共有序列或由其构成的分子、肽类或多肽的分子、蛋白质、多肽以及化合物可以发现用作将BAM靶向递送至表达C4S的细胞中的转运部分的特殊用途。
尽管某些肽类与蛋白聚糖类和磷脂类的结合是已知的，但其先前已经被认为是主要由普遍存在的流体静力学相互作用所驱使的非特定性过程。 因此，以前并未提出能够利用此类相互作用以获得选择性，从而避免所述肽类用于特定的靶向。尽管这些相互作用被认为普遍存在的性质，发明人已经令人吃惊地发现，可以设计出一般情况下对某些蛋白聚糖而非磷脂类表现出选择性的特定的肽序列。特别地是，发明人已经发现包含在1、5和9位含有精氨酸以及在3或7位的赖氨酸或精氨酸的9个残基的序列的肽，或者表现出与这4个残基(例如残基-间隔物构建体)等价的相对3D构象的分子构建体，能够最佳地通过与C4S的氨基聚糖单元上硫酸盐的静电桥连相互作用。此外，在剩余位点包含不带电的氨基酸或不带正电荷的化学间隔物提供了选择性，抑制或基本上减少肽与其它蛋白聚糖和/或磷脂的非特异性的相互作用。因此，残基的独特组合和/或特定残基的3D呈现使得要设计的肽和残基-间隔物构建体表现出与C4S蛋白聚糖而非其它蛋白聚糖以及其它磷脂类的选择性结合。
C4S已知是仅部分硫酸化的，即，该分子未在全部硫酸化的潜在位点硫酸化。分子相互作用的计算机模拟显示，至少在9肽的1、5和9位(和/或在9肽的等价3D位点，例如在残基间隔物构建体中)的精氨酸特异性地与C4S特定的硫酸盐模式相互作用。其它带电的氨基酸，特别是在3或7位(和/或在其等价的3D位点)的精氨酸或赖氨酸(但不都是)也发现是特异性结合所必需的。该模型模拟显示3位或7位在9肽内特别是与其它用以相互作用的相关残基(即在1、5和9位)在三维上的空间定向中是相同的。
该模型未预测到剩余的残基参与肽与C4S的结合，并且，如果在肽中1、5、9和(3或7)位残基的三维线性构象不被扰乱，那么用多种多样的氨基酸(包括非天然氨基酸，例如D-氨基酸)在可自由选择的位点2、4、6、8和(3(当7选择为赖氨酸或精氨酸时)或7(当3选择为赖氨酸或精氨酸时))替代对与C4S的特异性结合影响很小甚至无影响。因此，发明人令人吃惊地发现，如果这3个精氨酸残基和一个赖氨酸或精氨酸残基的3D呈现和/或定向在分子中保持不变，那么对C4S的特异性结合也将保持不变。因此，本发明包含用化学间隔物代替这些可自由选择的位点的残基，条件是在1、5和9位的精氨酸以及在3或7位的精氨酸或赖氨酸的相对3D定向保持与 共有序列(i)、(ii)中的一样。但是，在这些可自由选择的位点(当氨基酸残基存在时)使用带电的氨基酸精氨酸或赖氨酸和/或带电的连接基团，特别是带正电荷的基团，增加了与其它蛋白聚糖和磷脂类非特异性相互作用的可能性。因此，为了保持特异性，避免在本发明的肽中在可自由选择的位点使用精氨酸和赖氨酸和/或当本发明的残基-连接体构建体中一个或多个可自由选择的残基由化学连接体代替时避免使用带电的连接基团。
此外，发现在本发明的分子(例如肽或残基-间隔物构建体)中在与C4S结合相关的位点(即Arg1、Arg5、Arg9和(Arg/Lys3或Arg/Lys7))使用D-氨基酸可以保持特异性，条件是全部位点具有相同的手性。应当相信，在这些位点使用单一的手性代表了氨基酸侧链的相同的三维结构。当这些位点的一个或多个具有不同手性时，该三维线性排列被破坏。因此，本发明包括含有3个精氨酸残基和1个精氨酸或赖氨酸残基的分子，其中这4个残基各自是L-残基或者其中这4个残基各自是D-残基，条件是该分子表现出与共有序列(i)和(ii)中Arg1、Arg5、Arg9和Arg/Lys3或Arg/Lys7相同或类似的3D定向和构型(特别是当该分子在溶液中时)。
本发明分子的共有序列优选地被视为转运载体部分，用于相关货物分子/部分的细胞内转运。含有蛋白聚糖的细胞表面分子，例如CD68，已知通过胞内体循环。为了有助于本发明的化合物从胞内体释放(并有助于避免进一步降解)，能够用作质子海绵的一个或数个氨基酸残基可以任选地加至转运载体部分的N-或C-末端。质子海绵升高了胞内体的渗透性，引起溶胀并破裂，导致其内容物的细胞溶质释放而非其降解。本领域已知的或本文所述的能够作为质子海绵起作用的任何氨基酸残基或残基的组合都可以按照本发明使用。该任选的质子海绵残基系列的末端氨基酸(即该质子海绵残基(如果存在)最终的N-末端或C-末端残基)还可以任选地是D-对映异构体，以避免该质子海绵残基的降解/裂解。因此，本发明包含了将一个或多个氨基酸残基加至转运载体部分的N-或C-末端的任选的用途，其中N-或C-末端残基分别任选地是D-对映异构体。在优选的实施方案中，质子海绵残基的一个或多个残基不是赖氨酸或精氨酸残基。如本文所定义的质子海 绵的任选的残基在本发明的共有序列(i)-(xiv)中由LD10或LD-1代表。质子海绵的任选的N-或C-末端残基在本发明的共有序列(i)-(xiv)中由XD11或XD-2代表。因此，在优选的实施方案中，共有序列(i)-(xiv)的LD10或LD-1(如果存在)代表任何L-或D-氨基酸，但L-或D-精氨酸或者L-或D-赖氨酸除外；与这些优选的实施方案相关联或者作为独立的实施方案，共有序列(i)-(xiv)的XD11或XD-2(如果存在)优选地是任何D-氨基酸，但D-精氨酸或D-赖氨酸除外。在最优选的实施方案中，质子海绵残基的一个或多个残基是组氨酸残基。因此，在最优选的实施方案中，共有序列(i)-(xiv)的LD10或LD-1代表L-或D-组氨酸；与这些优选的实施方案相关联或者作为独立的实施方案，共有序列(i)-(xiv)的XD11或XD-2最优选是D-组氨酸。
6.1 分子共有结构
发明人的上述发现可以用共有结构代表。一般而言，本发明涉及至少一种分离的分子，或者包含所述分子或由其构成的化合物，其中所述分子具有如(iii)-(vi)中任一所述的共有结构，或其反向序列：
(iii)Arg1-(SPA)-Arg5-(SPB)-X-(SPC)-Arg9-(LD10)n-(XD11)m；
(iv)Arg1-(SPC)-X-(SPB)-Arg5-(SPA)-Arg9-(LD10)n-(XD11)m；
(v)(XD-2)m-(LD-1)n-Arg1-(SPA)Arg5-(SPB)-X-(SPC)-Arg9；或
(vi)(XD-2)m-(LD-1)n-Arg1-(SPC)-X-(SPB)-Arg5-(SPA)-Arg9
其中，LD10或LD-1代表任何L-或D-氨基酸，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；且n具有0-10的值；其中XD11或XD-2代表任何D-氨基酸，但D-精氨酸或D-赖氨酸除外，且m具有0或1的值；
其中
(a)Arg1、Arg5和Arg9代表L-精氨酸；且X代表L-赖氨酸或L-精氨酸，或
(b)Arg1、Arg5和Arg9代表D-精氨酸；且X代表D-赖氨酸或D-精氨酸；
其中(SPA)代表化学连接体，其
(a)由3个氨基酸残基的肽链构成，其中各个残基可以独立地选自任何氨基酸残基，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；或
(b)将相邻的氨基酸残基分隔
Figure BDA0000755574230000301
其中(SPC)代表化学连接体，其
(a)由单个氨基酸残基构成，其可以是任何氨基酸残基，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；或
(b)当该分子处于伸展构象时，将相邻的氨基酸残基分隔
Figure BDA0000755574230000303
且其中(SPB)-X-(SPC)或其反向序列(SPC)-X-(SPB)代表化学连接体
(a)其中SPB和SPC各自代表单个氨基酸残基，其可以独立地选自任何氨基酸残基，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；或
(b)当该构建体处于伸展构象时，将相邻的氨基酸残基Arg1和Arg5或者Arg5和Arg9分隔
Figure BDA0000755574230000302
当本发明的分子或化合物包含一个或多个化学间隔物/连接体(其不是仅由氨基酸残基构成)时，必须注意Arg1、Arg5、Arg9和Arg/Lys3或Arg/Lys7的侧链应保持与其在共有序列(i)和/或(ii)的肽和/或多肽中对应的侧链相同或近似的3D呈现。因此，按照本发明方法的残基-间隔物构建体中Arg1、Arg5、Ang9和Arg/Lys3或Arg/Lys7的侧链在当该分子和/或构建体处于伸展构象时在3D空间内以线性或近乎线性排列存在。
6.2 肽共有序列
在本发明的实施方案中，其中按照任何共有序列(iii)-(vi)的分子和/或化合物包含氨基酸残基或仅由氨基酸残基构成，该共有结构可以由肽或多肽的共有序列代表。因此，在某些实施方案中，本发明涉及包含至少一种分离的肽或多肽或由其构成的化合物，所述的肽或多肽具有按照如下共有序列(i)或(ii)或其反向序列的氨基酸序列：
(i)Arg1-X2-X3-X4-Arg5-X6-X7-X8-Arg9-(LD10)n-(XD11)m，或
(ii)(XD-2)m-(LD-1)n-Arg1-X2-X3-X4-Arg5-X6-X7-X8-Arg9
其中，
(a)Arg1、Arg5和Arg9代表L-精氨酸；LD10或LD-1代表任何L-或D- 氨基酸，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；且n具有0-10的值；其中XD11或XD-2代表任何D-氨基酸，但D-精氨酸或D-赖氨酸除外，且m具有0或1的值；且其中剩余氨基酸X2至X4和X6至X8可以是任何L-或D-氨基酸，但L-赖氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或D-精氨酸除外，条件是X3或X7代表但不是二者都代表L-赖氨酸或L-精氨酸；
或者其中,
(b)Arg1、Arg5和Arg9代表D-精氨酸；LD10或LD-1代表任何L-或D-氨基酸，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；且n具有0-10的值；其中XD11或XD-2代表任何D-氨基酸，但D-精氨酸或D-赖氨酸除外，且m具有0或1的值；且其中剩余氨基酸X2至X4和X6至X8可以是任何L-或D-氨基酸，但L-赖氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或D-精氨酸除外，条件是X3或X7代表但不是二者都代表D-赖氨酸或D-精氨酸。
上述共有序列(i)，具有条件(a)的是SEQ ID NO:17，具有条件(b)的是SEQ ID NO:19。上述共有序列(ii)，具有条件(a)的是SEQ ID NO:18，具有条件(b)的是SEQ ID NO:20。
6.3 残基-间隔物共有结构
在本发明的实施方案中，其中在任何共有结构(iii)-(vi)中由SPA、SPB和SPC代表的化学连接体/间隔物不包含氨基酸残基，该共有结构可以由残基-间隔物构建体的共有结构代表。在这些实施方案中，本发明可以定义为涉及至少一种残基-间隔物构建体，或者包含其或由其构成的化合物，其中该构建体具有如(vii)-(x)中任一或其反向序列的共有结构。
(vii)Arg1-(CLA)-Arg5-(CLB)-X-(CLC)-Arg9-(LD10)n-(XD11)m；
(viii)Arg1-(CLC)-X-(CLB)-Arg5-(CLA)-Arg9-(LD10)n-(XD11)m；
(ix)(XD-2)m-(LD-1)n-Arg1-(CLA)Arg5-(CLB)-X-(CLC)-Arg9；或
(x)(XD-2)m-(LD-1)n-Arg1-(CLC)-X-(CLB)-Arg5-(CLA)-Arg9
其中，LD10或LD-1代表任何L-或D-氨基酸，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；且n具有0-10的值；其中XD11或XD-2代表任何D-氨基酸，但D-精氨酸或D-赖氨酸除外，且m具有0或1的值；
其中
(a)Arg1、Arg5和Arg9代表L-精氨酸；且X代表L-赖氨酸或L-精氨酸，或
(b)Arg1、Arg5和Arg9代表D-精氨酸；且X代表D-赖氨酸或D-精氨酸；
其中(SPA)代表化学连接体，其将相邻的氨基酸残基分隔
Figure BDA0000755574230000321
其中(SPC)代表化学连接体，当该分子处于伸展构象时，其将相邻的氨基酸残基分隔
Figure BDA0000755574230000322
且其中(SPB)-X-(SPC)或其反向序列(SPC)-X-(SPB)代表化学连接体，当该分子处于伸展构象时，其将相邻的氨基酸残基Arg1和Arg5或Arg5和Arg9分隔
Figure BDA0000755574230000323
当本发明的分子或化合物包含一个或多个化学间隔物/连接体(其不仅包含氨基酸残基)时，必须注意Arg1、Arg5、Arg9和Arg/Lys3或Arg/Lys7的侧链应保持与其在共有序列(i)和/或(ii)的肽和/或多肽中对应的侧链相同或近似的3D呈现。因此，按照本发明方法的残基-间隔物构建体中Arg1、Arg5、Ang9和Arg/Lys3或Arg/Lys7的侧链在当该分子和/或构建体处于伸展构象时在3D空间内以线性或近乎线性排列存在。
6.4 靶向部分
按照共有序列(iii)-(vi)的上述分子和化合物发现作为转运和/或靶向部分的特殊用途，尤其是识别和/或结合蛋白聚糖(例如在细胞表面表达的)，特别是选择性地结合蛋白聚糖C4S而非其它蛋白聚糖。用作靶向部分的特异性地与C4S蛋白聚糖相互作用的上述共有序列(iii)-(vi)的部分用Arg1-(SPA)-Arg5-(SPB)-X-(SPC)-Arg9或Arg1-(SPC)-X-(SPB)-Arg5-(SPA)-Arg9代表(包括含有靶向部分共有序列或结构Arg1-X2-X3-X4-Arg5-X6-X7-X8-Arg9(SEQ ID NO:21，其中SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的片段；SEQ ID NO:22，其中SEQID NO:19或SEQ ID NO:20的片段)、Arg1-(CLA)-Arg5-(CLB)-X-(CLC)-Arg9和Arg1-(CLC)-X-(CLB)-Arg5-(CLA)-Arg9)的具体实施方案)，其对于与Arg1、 Arg5、Arg 9和Arg/Lys3或Arg/Lys 7以及特别是这些残基的侧链对应的氨基酸侧链的3D呈现而言是相同的分子。因此，任何按照共有序列(iii)-(vi)的包含3个精氨酸残基和1个赖氨酸残基的分子都可以按照以下规则开发为靶向部分：
(1)残基Arg1、Arg5和Arg9中各自必须是精氨酸的相同旋光异构体，即各自必须是L-精氨酸或者各自必须是D-精氨酸。
(2)Arg1必须使用一个或多个化学间隔物(其可以仅由一个或多个氨基酸残基构成或者可以同时包含氨基酸残基和化学间隔物/连接体)与Arg5连接，从而当该分子处于伸展构象时，将它们分隔
Figure BDA0000755574230000331
Arg5可以使用一个或多个化学间隔物(其可以仅由一个或多个氨基酸残基构成或者可以同时包含氨基酸残基和化学间隔物/连接体)与Arg9连接，从而当该分子处于伸展构象时，也将它们分隔
Figure BDA0000755574230000332
(3)所述靶向部分还必须在Arg1和Arg5或在Arg5和Arg 9之间(但不都是)的连接中包含一个赖氨酸或精氨酸残基，其与Arg1、Arg5和Arg9具有相同的手性(该残基与在共有序列(i)和(ii)中的3位或7位(但不同时都是)的残基以及共有序列(iii)-(x)中的残基“X”相对应)。换言之，当Arg1、Agr5和Agr9是L-精氨酸时，该赖氨酸/精氨酸必须是L-赖氨酸或L-精氨酸；且当Arg1、Arg5和Arg9是D-精氨酸时，该赖氨酸/精氨酸必须是D-精氨酸或D-赖氨酸。
(4)当赖氨酸/精氨酸位于Arg1和Arg5之间的连接处时，其将Arg1分隔到距离其
Figure BDA0000755574230000333
当赖氨酸/精氨酸位于Arg5和Arg9之间的连接处时，其将Arg9分隔到距离其
Figure BDA0000755574230000334
(5)剩余连接可以包含任何本领域已知的和/或本文所述的化学间隔物或连接体(其可以仅由一个或多个氨基酸残基构成或者可以同时包含氨基酸残基和化学间隔物/连接体)，所述间隔物或连接体适合于保持Arg1、Arg5、Arg9和X的所需间隔，以及适合于保持与共有序列(i)和(ii)中对应残基近似或者相同的氨基酸及其侧链的3D定向和/或3D呈现。在Arg1、Arg5、Arg9和X之间的连接不应带正电荷。当Arg1、Arg5、Arg9和X 之间的连接是氨基酸残基或者包含氨基酸残基时，所述残基可以是任何D-或L-氨基酸，但D-或L-精氨酸或者D-或L-赖氨酸除外。
当本发明的共有结构仅包含氨基酸或由氨基酸构成时，如上文刚刚所述的靶向部分可以按下文设计。在共有结构(iii)-(vi)中靶向部分的序列，其中该结构仅包含氨基酸残基，其由Arg1-X2-X3-X4-Arg5-X6-X7-X8-Arg9(参见例如共有序列(i)和(ii))代表。该结构满足上述规则(2)。即，当其所分隔的分子处于伸展构象时，所述连接将Arg1和Arg5以及将Arg5和Arg9分隔
Figure BDA0000755574230000341
所述连接是由3个氨基酸残基构成的肽。进一步应用于肽共有序列的上文刚刚所述的规则是：
(P1)Arg1、Arg5和Arg9各自必须是精氨酸的相同旋光异构体，即各自必须是L-精氨酸，或者各自必须是D-精氨酸(对应于上述规则(1))。
(P2)残基X3或X7(但不都是)是与Arg1、Arg5和Arg9相同手性的赖氨酸或精氨酸。即，当Arg1、Agr5和Agr9是L-精氨酸时，X3或X7(但不都是)必须是L-赖氨酸或L-精氨酸；且当Arg1、Arg5和Arg9是D-精氨酸，X3或X7(但不都是)必须是D-精氨酸或D-赖氨酸(对应于上述规则3和4)。
(P3)剩余残基，即X2、X4、X6、X8和X3(当X7是按照上文刚刚所述的规则P2选择时)或X7(当X3是按照上文刚刚所述的规则P2选择时)可以是任何氨基酸，但L-或D-精氨酸或者L-或D-赖氨酸除外。
6.5 化学连接体
在共有序列(iii)-(xiv)中的SPA、SPB和SPC代表化学连接体/间隔物，其形成本发明分子骨架的一部分，且可以仅包含一个或多个氨基酸残基；可以包含一个或多个化学连接体(其不是氨基酸残基)；或者可以同时包含氨基酸残基和化学连接体。按照本发明方法使用的不是氨基酸残基的化学连接体可以是任何适合保持3个精氨酸残基(Arg1、Arg5和Arg9)和1个精氨酸或赖氨酸(Arg/Lys3或Arg/Lys7，但不都是)的空间和相对3D定向/呈现与共有序列(i)和(ii)中对应的残基相同的合适的化学连接体或化学间隔物。任何本领域内已知或本文所述的化学连接体/间隔物都可以用于本发明 的分子的构建中，且本领域内技术人员具有选择和将该连接体适用于本发明方法的能力。合适的化学连接体/间隔物的非限定性的实例包括β-和γ-肽类，例如那些在如Seebach等人,Chem.Biodivers.1(2004), 1111-1239中所公开和描述的那些；基于糖氨基酸的支架，例如那些在如Chakraborty等人, Comb.Chem.High Throughput Screen.5(2002),373-387中所公开和描述的那些；β发夹肽模拟物，例如那些在如Robinson,Acc.Chem.Res.41(2008),1278-1288；中所公开和描述的那些；α-螺旋模拟物、β-折叠模拟物和β-转角模拟物，例如那些在如Hershberger等人, Curr.Top.Med.Chem.7(2007),928-924中所公开和描述的那些，以及环肽，例如那些在如Jagadish和Camarero,Biopolymers 94(2010),611-616中所公开和描述的那些。在优选的实施方案中，所述化学连接体/间隔物是不带正电荷的。
6.6 BAM缀合物
如本文详细描述，包含按照共有序列和结构(i)-(x)的分子、肽类和/或多肽或由其构成的本发明的分子和化合物被认为在优选的实施方案中能够作为特异性转运相关货物分子/部分的转运载体部分起作用。在优选的实施方案中，本发明的分子和化合物包含按照进一步与生物活性部分(BAM)缀合的任何共有序列(i)-(x)的序列和/或结构或由其构成；所述结构在本说明书全文中用BAM-缀合物表示。BAM是已知或期望当向生物体施用时或者引入细胞时(无论体外或体内)表现出治疗作用的任何部分。在优选的实施方案中，本发明的化合物包含BAM-缀合物或由BAM-缀合物构成，其具有缀合在如本文所述的共有序列或结构(i)-(x)的末端的BAM。因此，在这些优选的实施方案中，BAM-缀合物具有根据下文共有结构(xi)-(xiv)或其反向序列的共有结构：
(xi)(BAM)-(LINK)-Arg1-(SPA)-Arg5-(SPB)-X-(SPC)-Arg9-(LD10)n-(XD11)m；
(xii)(BAM)-(LINK)-Arg1-(SPC)-X-(SPB)-Arg5-(SPA)-Arg9-(LD10)n-(XD11)m；
(xiii)(XD-2)m-(LD-1)n-Arg1-(SPA)Arg5-(SPB)-X-(SPC)-Arg9-(LINK)-(BAM)；或
(xiv)(XD-2)m-(LD-1)n-Arg1-(SPC)-X-(SPB)-Arg5-(SPA)-Arg9-(LINK)-(BAM)
其中(BAM)代表生物活性部分；其中(LINK)代表任选的连接基团；其中，LD10或LD-1代表任何L-或D-氨基酸，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；且n具有0-10的值；其中XD11或XD-2代表任何D-氨基酸，但D-精氨酸或D-赖氨酸除外，且m具有0或1的值；
其中
(a)Arg1、Arg5和Arg9代表L-精氨酸；且X代表L-赖氨酸或L-精氨酸，或
(b)Arg1、Arg5和Arg9代表D-精氨酸；且X代表D-赖氨酸或D-精氨酸；
其中(SPA)代表化学连接体，其
(a)由三个氨基酸残基的肽链构成，其中各个残基可以独立地选自任何氨基酸残基，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；或
(b)将相邻的氨基酸残基分隔
Figure BDA0000755574230000361
其中(SPC)代表化学连接体，其
(a)由单个氨基酸残基构成，其可以是任何氨基酸残基，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；或
(b)当分子处于伸展构象时，将相邻的氨基酸残基分隔
Figure BDA0000755574230000362
且其中(SPB)-X-(SPC)或其反向序列(SPC)-X-(SPB)代表化学连接体
(a)其中SPB和SPC各自代表单个氨基酸残基，其可以独立地选自任何氨基酸残基，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；或
(b)当分子处于伸展构象时，将相邻的氨基酸残基Arg1和Arg5或Arg5和Arg9分隔
Figure BDA0000755574230000363
6.6.1 任选的连接基团
除了存在BAM部分和任选的连接基团(LINK)外，共有序列(xi)-(xiv)与共有序列(iii)-(vi)是相同的。因此，化学间隔物(SPA)、(SPB)和(SPC)(其可以仅包含氨基酸残基或同时包含如本文所述的化学连接体和氨基酸残基)的选择如本文对共有序列(iii)-(vi)所述进行，包括：
·选择这些化学间隔物以便仅包含如本公开物全文详述的共有序列(i)和(ii)的实施方案(及其组合)中所述的氨基酸残基，以及
·选择这些化学间隔物以便同时包含如本公开物全文详述的共有结构(vi)-(x)的实施方案(及其组合)中所述的化学连接体和氨基酸残基二者。
任选的连接基团(LINK)可以是肽连接体。如果使用肽连接体序列，该连接体序列优选地形成2-10个残基的弹性序列，更加优选1-5个残基。在优选的实施方案中，该连接体序列包含至少20％、更加优选至少40％且甚至更加优选至少50％的甘氨酸或β-丙氨酸残基。连接基团的非限定性实例包括GlyGlyGlyGlyGly(SEQ ID NO:23)、GlyGlyGlyGly(SEQID NO:24)、GlyGlyGly、CysGlyGly或GlyGlyCys等。合适的连接体序列是本领域技术人员熟知的且可以容易地选择和制备。任选的连接体基团可以由D-氨基酸、L-氨基酸和/或其组合构成。
或者，BAM和转运载体部分可以以本领域内或本文所述的任何合适的方法经化学偶联连接，例如交叉连接方法。但是，必须注意许多已知的化学交叉连接方法是非特异性的事实，即它们不将偶联位点指向载体/转运载体部分或货物部分(例如BAM)中的任何特定位点。因此，使用非特异性的交叉连接试剂可能攻击官能位点或者在空间上阻隔活性位点，使本发明的BAM-缀合物分子的BAM/转运载体组分中的一个或两个都生物失活。其涉及本领域技术人员通过使用合适的保护基团阻隔潜在反应性基团的知识。或者，可以使用强大且通用的肟和腙连接技术，其是化学选择性实体，可以用于组分(A)与组分(B)的交叉连接。该连接技术在例如Rose等人(1994),JACS 116,30中所描述。
通过直接化学偶联至在BAM组分和转运载体部分中仅出现一次或少 数几次的官能团来提升偶联的特异性。本发明肽-缀合物分子的两个组分的偶联可以通过本领域已知的偶联或缀合试剂来完成，包括标准(多-)肽合成偶联试剂，例如HOBt、HBTU、DICI、TBTU。有几种可以使用的分子间交叉连接试剂，参见例如Means和Feeney,Chemical Modification of Proteins,Holden-Day,1974,pp.39-43。这些试剂包括但不限于N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸盐(SPDP)或N,N'-(1,3-亚苯基)双马来酰亚胺；N,N'-亚乙基-双-(碘乙酰胺)或其它此类具有6-11个碳亚甲基桥的试剂；和1,5-二氟-2,4-二硝基苯。其它用于此目的的交叉连接试剂包括但不限于：p,p'-二氟-m,m'-二硝基二苯基砜；二甲基己二酸；苯酚-1,4-二磺酰氯；六亚甲基二异氰酸酯或二异硫氰酸酯或偶氮苯基-p-二异氰酸酯；戊二醛和二偶氮联苯胺。交叉连接试剂还可以是同源双官能团的，即具有两个进行相同反应的官能团。优选的同源双官能团交叉连接试剂是二马来酰亚胺基己烷(BMH)。BMH包含两个马来酰亚胺官能团，其特异性地与含巯基的化合物在温和的条件(pH 6.5-7.7)下反应。两个马来酰亚胺基团被烃链连接。因此，BMH是用于包含半胱氨酸残基的蛋白质(或多肽)的不可逆交叉连接。交叉连接试剂还可以是异源双官能团的。异源双官能团交叉连接试剂具有两个不同的官能团，例如胺反应基团和硫醇反应基团，其将交叉连接分别含有游离胺和硫醇的两种蛋白质。异源双官能团交叉连接试剂的非限定性的实例是琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-甲酸酯(SMCC)、m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)和琥珀酰亚胺4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)、MBS的延伸链的类似物。这些交叉连接剂的琥珀酰亚胺基基团与伯胺反应，且硫醇-反应性马来酰亚胺与半胱氨酸残基的硫醇形成共价键。由于交叉连接试剂通常具有低的水溶性，可以将亲水性部分例如磺酸盐基团加至交叉连接试剂上以提升其水溶性。磺基-MBS和磺基-SMCC是改良水溶性的交叉连接试剂的实例。许多交叉连接试剂生成在细胞条件下基本上不可裂解的缀合物，其不是优选的。因此，某些交叉连接试剂包含共价键，例如二硫化物，其在细胞条件下时可裂解的。例如，Traut试剂、二巯基二(琥珀酰亚胺酰胺丙酸酯)(DSP)和 N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸盐(SPDP)是熟知的可裂解交叉连接体剂。使用可裂解的交叉连接试剂使得货物部分例如BAM在递送入靶向细胞后从新的转运载体部分分离。出于此目的，也可以使用直接二硫键连接。化学交叉连接还可以包括使用间隔臂。间隔臂提供分子内弹性或调整缀合部分之间的分子内距离，并因此有助于保持生物活性。间隔臂可以是包含间隔氨基酸如脯氨酸的蛋白质(或多肽)部分的形式。或者，间隔臂可以是交叉连接试剂例如“长链SPDP”的一部分(例如Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.,目录号21651H)。很多交叉连接试剂(包括上文所讨论的那些)是市场可获得的。其使用的详细说明可以从商品供应商处容易地获得。蛋白质交叉连接和缀合物制备的一般性参考是：Wong,Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking,CRC Press(1991)。
应当理解，BAM缀合物分子的不同组分应当按照使不同组分仍可以将至少一部分其个体活性和/或性质传递给整个转运载体-货物缀合物分子的方式偶联。例如，组分的偶联优选地不会导致在靶向于C4S中的总体损失。
6.6.2 BAM部分
本发明包含任何已知的BAM或者期望用于治疗或预防疾病、障碍或病症或者缓解其症状的治疗活性组分，例如化学化合物、蛋白质、脂质体、纳米粒和(多-)肽类。此外或可选择地，BAM可以是可检测的标记物，用于疾病或病症的诊断，例如荧光染料、放射性标记或化学发光基团。
A.细胞毒类药物
优选地，本发明的“BAM-缀合物”的BAM是药物，例如选自细胞毒药物或抗肿瘤药物，其适合作为化疗药物。一般而言，适合用作组分(B)的化疗药物可以基于其作用机理分为三个主要类别。其可以：
(a)阻止前DNA分子结构单元的合成。这些试剂以许多不同方式起作用。DNA结构单元是叶酸、杂环碱基和核苷酸类，它们是细胞内天然制造的。全部这些试剂作用于阻断核苷酸类或脱氧核糖核苷酸类(制造DNA所必需)形成中的某个步骤。当这些步骤被阻断时，作为DNA和RNA结构 单元的核苷酸类就不能合成。由于其没有核苷酸类而不能制造DNA，所以细胞不能复制。此类药物的实例包括甲氨蝶呤
Figure BDA0000755574230000401
氟尿嘧啶
Figure BDA0000755574230000402
羟基脲
Figure BDA0000755574230000403
和巯嘌呤
Figure BDA0000755574230000404
硫鸟嘌呤、生育酚，或者在更通常情况下是任何核苷酸类似物，例如2'-脱氧胞苷类似物；
(b)直接破坏细胞核内的DNA。这些试剂化学破坏DNA和RNA。它们中断DNA的复制并且完全终止复制或者引起无义DNA或RNA的制备(即，新的DNA或RNA不进行任何有用的编码)。此类药物的实例包括顺铂
Figure BDA0000755574230000405
和抗生素类-柔红霉素
Figure BDA0000755574230000406
属于蒽环类抗肿瘤药物的多柔比星
Figure BDA0000755574230000407
和依托泊苷
Figure BDA0000755574230000408
或任何插入剂；其它还包括通常用于靶向癌症治疗(例如铋-213)的放射性核素(如α-放射性核素)；或者
(c)影响合成或破坏有丝分裂纺锤体。当细胞开始自身分裂成两个新的细胞时，有丝分裂纺锤体是作为细胞内“南北极”的分子通道起作用。这些纺锤体非常重要，因为它们帮助分裂新复制的DNA，使拷贝在细胞分裂过程中各自进入两个新的细胞中。这些药物中断了这些纺锤体的形成，并因此中断了细胞分裂。此类有丝分裂中断剂药物的实例包括：长春碱
Figure BDA0000755574230000409
长春新碱
Figure BDA00007555742300004010
和紫杉醇
Figure BDA00007555742300004011
本发明的“BAM-缀合物”的BAM可以按照上文所述作用模式之一起作用。换言之，各类抗肿瘤药物即烷化剂、亚硝基脲、抗代谢药、植物生物碱、抗肿瘤抗生素和类固醇激素类都可以用作本发明的转运载体货物缀合物分子的BAM组分。为了更加详细的描述这些药物，要强调地是，各种抗癌药物还可以按照其对如上文所公开的细胞周期和细胞化学的作用进行分类。烷化剂通过直接攻击DNA来杀死细胞。
具体而言，在慢性白血病、霍奇金病、淋巴瘤和肺、乳腺、前列腺和卵巢的某些癌症治疗中可以使用的烷化剂。环磷酰胺是通常使用的烷化剂的实例。亚硝基脲类作用类似于烷化剂，并且还抑制DNA修复所必需的改变。这些试剂通过血脑病症，并因此用于治疗脑肿瘤、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和恶性黑色素瘤。卡莫司汀和洛莫司汀是此类中的主要药物。抗代 谢药是通过干扰某些活动(通常为DNA合成)来阻断细胞生长的药物。一旦摄入细胞中后，它们阻止正常发育和复制。此类中的全部药物在细胞周期的“S”相期间影响细胞。抗代谢药可以用于治疗急性和慢性白血病、绒毛膜癌和胃肠道、乳腺和卵巢的某些肿瘤。通常使用的抗代谢药的非限定性的实例是6-巯基嘌呤和5-氟尿嘧啶(5FU)。抗肿瘤抗生素是一个种类复杂的化合物组。一般而言，它们通过与DNA结合并阻止RNA合成来起作用。这些试剂广泛地用于治疗多种癌症。该组中最通常使用的药物是多柔比星(阿霉素)、丝裂霉素-C和博来霉素。植物(长春花属)生物碱是来自植物的抗肿瘤试剂。这些药物通过在有丝分裂期阻断细胞分裂来特异性地起作用。它们通常用于治疗急性成淋巴细胞性白血病、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、神经细胞瘤、维尔姆斯瘤以及肺、乳腺和睾丸的癌症。长春新碱和长春碱是该组中通常使用的试剂。类固醇激素类对于治疗某些类型的肿瘤有用。此类包括肾上腺皮质类固醇类、雌激素类、抗雌激素类、孕酮和雄激素类。尽管其特定的作用机制尚不明确，但类固醇激素类修正某些激素依赖性癌症的生长。他莫昔芬是个实例，其用于雌激素依赖性乳腺癌。全部上文提及的肿瘤种类都可以用本发明的包含任何上述抗肿瘤试剂作为BAM的BAM-缀合物分子治疗。
可用作本发明的“BAM-缀合物”的BAM组分的一组细胞毒或抗肿瘤药物选自烷化剂、抗代谢药、细胞抑制剂或与激素治疗有关的药物。在此方面，优选选择金属的细胞毒或抗肿瘤药物、尤其是铂(衍生物)和紫杉醇类。具体而言，所述药物部分选自例如以下药物：顺铂、反铂(transplatin)、沙铂、奥沙利铂、卡铂、奈达铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、美法仑、硫唑嘌呤、氟尿嘧啶、(6)-巯基嘌呤、甲氨蝶呤(methrexate)、诺龙、氨鲁米特、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、丙卡巴肼、多西他赛、紫杉醇、伊立替康、表鬼臼毒素、鬼臼毒素、长春新碱、长春碱、多西紫杉醇、道诺霉素、柔红霉素、多柔比星、米托蒽醌、拓扑替康、博来霉素、吉西他滨、氟达拉滨、诺维本和5-FUDR。特别优选的是包含金属的抗癌药物类型，例如铂化合物类。
可用作本发明的“BAM-缀合物”的BAM组分的其他的细胞毒或抗肿瘤药物有：阿利维A酸、六甲蜜胺、硫唑嘌呤、比卡鲁胺、白消安、硼替佐米、卡培他滨、卡非佐米、环磷酰胺、依西美坦、来曲唑、非那雄胺、Fostamatinib、吉非替尼、伊马替尼、来那度胺、Marizomib、醋酸甲地孕酮、尼罗替尼、曲普瑞林、替莫唑胺、米非司酮、维甲酸、他莫昔芬、替尼泊苷、硫酸培洛霉素或喜树碱类。
可用作本发明的“BAM-缀合物”的BAM组分的其他细胞毒或抗肿瘤药物是放射性核素(例如发射α粒子的放射性核素)，例如本领域熟知的在靶向癌症治疗中常用的那些。可用于本发明的这些放射性核素的非限制性实例包括：钼-99、锝-99m、铋-213、铬-51、钴-60、铜-64、镝-165、铒-169、钬-166、碘-125、碘-131、铱-192、铁-59、镥-177、钯-103、磷-32、钾-42、铼-186、铼-188、钐-153、硒-75、钠-24、锶-89、氙-133、镱-169、镱-177、钇-90，铯、金和钌的放射性同位素。还包括回旋加速器放射性同位素，例如碳-11、氮-13、氧-15、氟-18、钴-57、镓-67、铟-111、碘-123、氪-81m、铷-82、锶-92、铊-201。或者或此外，任何以上非限制性的实例也可用于诊断或成像用途。
另一组可用作本发明的“BAM-缀合物”的BAM组分的细胞毒性或抗肿瘤药物是吲哚并咔唑化合物，例如星形孢菌素(及其类似物)和Rebeccamycin。应当指出地是，属于苯胺喹唑啉类的化合物(例如吉非替尼)也是特别优选用作本发明的BAM-缀合物的BAM组分。
其它可用作本发明的“BAM-缀合物”的BAM组分的细胞毒性或抗肿瘤药物可以选自拓扑异构酶抑制剂例如伊立替康，或有丝分裂驱动蛋白或DHFR的抑制剂。
此外，可用作本发明的“BAM-缀合物”的BAM组分的细胞毒性或抗肿瘤药物可以选自抑制或刺激下述的因子：细胞增殖(PDGF)、细胞内通路，例如RAS/RAF信号通路，如RAF/MEK/ERK信号通路的成员(例如RAF-1)或分裂原活化蛋白激酶途径、CMGC激酶家族(包含CDK(细胞周期蛋白依赖激酶)、MAPK、GSK3、CLK)，属于AGC激酶家族(包括PKA、PKG、 PKC家族)的Ser/Thr激酶，涉及受体酪氨酸激酶，例如在新血管生成和肿瘤进程中，包括血管内皮生长因子受体(VEGFR)-2、VEGFR-3，血小板衍生生长因子受体β、Flt-3，内皮缩血管肽(ET)系统，其包括ET-1、ET-2、ET-3，和ETA受体(ETAR)和ETBR，以及c-KIT，其通过例如抑制其功能而靶向，以及IGF家族，例如IGF-1、IGF-2、IGF-1R、IGF2R等。
另一组可用作本发明的“BAM-转运载体缀合物”的BAM组分的细胞毒性或抗肿瘤药物可以选自靶向于肿瘤细胞增殖和肿瘤血管发生的抑制剂。本文中特别优选的是小分子的抗肿瘤激酶抑制剂，其针对恶性细胞和/或血管细胞的靶点，具有抗血管生成活性。激酶抑制剂例如针对EGFR、Her2/neu、BCR-ABL、c-KIT、PKC、Raf和PI3的那些，由于其阻断了受影响的恶性细胞的血管生成因子的分泌，所以是抗血管生成的。激酶抑制剂例如针对VEGFR2、VEGFR1、PDGFR、PKC、Raf和PI3的那些，通过对血管细胞的作用而抗血管生成。合成的细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂(CDKI)的实例是奥罗莫星、Flavopiridol、丁内酯及其衍生物，且因此抑制肿瘤细胞增殖。另一方面，适合作为本发明的肽-缀合物/BAM-缀合物分子的BAM组分的抗肿瘤化合物可以选自癌症细胞中细胞凋亡程序的活化剂(例如星状孢子素)或通过下调抗细胞凋亡的蛋白质，例如Bcl-2。
6.7 可自由选择的位点
如本文所讨论，当按照(iii)-(vi)结构的本发明分子或化合物的共有结构仅包含氨基酸残基时，与C4S特异性相互作用的靶向部分用以下序列代表：
Arg1-X2-X3-X4-Arg5-X6-X7-X8-Arg9
(SEQ ID NO:21，按照规则SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18；
SEQ ID NO:22，按照规则SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20)
如本文所详细描述，2、4、6、8和(3(当按照本文所述规则将7位定义为D-或L-精氨酸或赖氨酸时)或7(当按照本文所述规则将3位定义为D-或L-精氨酸或赖氨酸时))位对于本发明化合物与C4S蛋白聚糖的特异性结合几乎没有影响，因此这些位点在本文中被称为可自由选择的。如本文所 提及，避免使用带电荷的氨基酸精氨酸或赖氨酸，因为一般而言这些倾向于提高与蛋白聚糖非特异性的相互作用的可能性。
此外，认为靶向部分表现出对C4S的特异性是由于在1、5、9位的精氨酸和在3或7位的精氨酸或赖氨酸的最佳的线性排列，因此，优选地选择剩余氨基酸以避免三维结构例如α-螺旋的诱导。α-螺旋形成的倾向对于各种天然存在的肽氨基酸而言是已知的，例如Chakrabartty等人,Protein Sci.3(1994),843-852，最高至最低的α-螺旋可能性的分级如下：
Ala>Arg+>Leu>Lys+>Gluo>Met>Gln>Glu->Ile>Tyr>Hiso>Ser>Cys>Asn>Asp->Asp>Trp>Phe>Val>Thr>His+>Gly>Pro
因此，优选在可自由选择的位点使用不超过3个具有高概率形成α-螺旋的氨基酸。因此，在优选的实施方案中，在可自由选择的位点使用不超过3个丙氨酸。在另外的或更优选的实施方案中，在可自由选择的位点不使用脯氨酸。
还优选在可自由选择的位点是庞大和/或疏水的氨基酸，此类氨基酸能够有助于膜插入和细胞穿透(参见例如Rothbard,Cell-Penetrating Peptides:Processes and Applications.Lanel
Figure BDA0000755574230000441
(Ed),CRC Press(2000))。因此，因此，在优选的实施方案中，其中本发明的分子或化合物包含按照共有序列(i)或(ii)的序列或由其构成，所述可自由选择的位点2、4、6、8和(3(其中7位是按照本文所述规则定义为D-或L-精氨酸或者赖氨酸)或7(其中7位是按照本文所述规则定义为D-或L-精氨酸或者赖氨酸)独立地选自Phe、Trp、Tyr、Val、Met、Ile和Leu。
已知D-氨基酸增强对蛋白酶类和/或其它的蛋白质降解方式的抵抗力。因此，在进一步优选的实施方案中，4位或6位是D-氨基酸。
还应当注意，本发明化合物的共有序列包含用作质子海绵的任选的氨基酸残基。在共有序列(i)-(xiv)中，(XD11)m或(XD-2)m和(LD10)n或(LD-1)n(其中m是0或1且n是0-10)代表任选的质子海绵氨基酸。质子海绵的残基可以选自本领域内已知的或者本文所述的能够用作质子海绵的任何残基或残基的组合。在优选的实施方案中，XD11或XD-2(如果该残基存在)代表任 何D-氨基酸，但D-精氨酸或D-赖氨酸除外，且LD10或LD-1(如果该残基存在)代表任何L-或D-氨基酸，但L-或D-精氨酸或者L-或D-赖氨酸除外。在最优选的实施方案中，XD11或XD-2(如果该残基存在)代表D-组氨酸且LD10或LD-1(如果该残基存在)代表L-或D-组氨酸。如本领域内所公认，在酸性囊泡例如胞内体内的特定氨基酸残基的集聚产生了蛋白质海绵作用。例如，组氨酸的咪唑环是弱碱，当环境pH降至6以下时，其具有获取阳离子电荷的能力，这可以进一步促进膜融合以及胞内体逃逸。
已经清楚地预期到，本部分以及本申请书全文所述的实施方案，无论是否确定为优选(包括最优选)，都可以独立的实施或者可以与在本发明化合物的设计与选择中其它公开的实施方案组合。因此，化合物的共有序列和/或靶向部分可以任选地不满足、满足一个或多个本部分和/或本说明书全文中所概述的实施方案。作为此类组合的非限定性的实例，所述可自由选择的位点可各自独立地选自Phe、Trp、Tyr、Val、Met、Ile和Leu，4位可以是D-氨基酸，(LD10)n的n可以是0且(XD11)m的m可以是1。
新的D/L氨基酸构型和/或新的化学连接体/间隔物的组合和/或本发明化合物的组合使本领域人员能确定如上文所定义的本发明分子或化合物在体内或体外试验中在细胞中的存留，具体而言，具有在该转运构建体被蛋白酶降解前与施用于细胞或核内的例如BAM的半寿期紧密匹配的半寿期。
在本发明的背景中，肽和/或多肽的变体和/或片段优选包含或由以下(多)肽序列构成：所述肽序列具有与本文清楚公开的(多)肽序列全长至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或85％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少99％的序列同一性，并且符合选择共有序列的所述规则。
6.8 本发明化合物的用途
本发明的共有序列(i)-(x)充当转运载体部分，其有效转运通过细胞膜，进入细胞质和/或细胞核。本文公开的所有治疗化合物(即BAM)普遍需要穿过细胞膜以用作抗癌药物。通过将属于这些类型的化合物(在细胞核中直接 破坏DNA的化合物、引起有丝分裂纺锤体合成或断裂、或阻止前DNA分子结构单元合成的化合物)与本发明的共有序列(i)-(x)偶联，增强了所述抗癌药物进入细胞和/或增强其溶解性，从而增加这些治疗化合物的效力。因此，这些化合物增加的细胞吸收和优选在水性环境(例如细胞液)中更好的溶解性，可允许实现降低这些抗癌治疗化合物的剂量。
本发明化合物的靶向部分的共有序列针对特别是C4S蛋白聚糖。这些蛋白聚糖优先与白细胞的表面蛋白质例如CD68联合表达。事实上，白细胞不可能不表达其他类型的蛋白聚糖。因此，本发明的分子和化合物能够特异性地靶向于白细胞。因此，本发明的分子、化合物和方法帮助有效递送所负载的部分例如BAM至白细胞，并提供选择性递送目的物质至白细胞内的普遍手段。所以，与转运载体部分缀合的BAM优选是本领域技术人员已知或期望在白细胞活性方面发挥作用、包括治疗作用(例如治疗、预防、减轻或缓解疾病)的任何物质，或者用于标记白细胞的目的，例如用于诊断目的或科学研究的目的。特别令人关注的是靶向于髓系细胞。
本发明的BAM-缀合物可用于治疗、改善、预防或诊断很大范围的其中白细胞具有病理生理学关联的疾病或病症。涉及原发性或继发性的白细胞功能异常的非限制性的示例性疾病包括：中性粒细胞增多、中性粒细胞减少、白细胞减少、嗜碱性粒细胞减少、嗜碱性粒细胞增多、嗜酸粒细胞减少、嗜酸粒细胞增多、特发性嗜酸细胞增多综合征、淋巴细胞增多、淋巴细胞增多症、淋巴细胞减少症、单核细胞增多、单核细胞减少、梅-海二氏异常、佩-休二氏异常、奥-赖氏颗粒异常(Alder-Reilly Anomaly)、切-希二氏综合征(Chedial-Higashisyndrome)、乔布综合征(高IgE)、懒惰白细胞综合征、先天性C3缺陷、慢性肉芽肿病、白细胞、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、髓过氧化物酶缺陷-良性、严重联合免疫缺陷病、迪格奥尔格综合征、内兹罗夫综合征、婴儿伴性低丙种球蛋白血症、普通可变的低丙种球蛋白血症、粘多糖贮积症、lipodoses、戈谢病、尼曼皮克病、法布里病、法伯病、神经节苷脂累积病；泰-萨克斯病、Sandhoff病、克拉伯病、异染性脑白质营养不良、Wolman病、白血病、急性淋巴细胞白血病(L1、L2、 L3)、慢性淋巴细胞白血病、所有类型的急性髓性白血病(AML)，包括未分化的AML(M0)、成髓细胞白血病(M1)、成髓细胞白血病(M2)、前髓细胞性白血病(M3)、粒单核细胞白血病(M4)、单核细胞性白血病(M5)、红白血病(M6)、巨核母细胞性白血病(M7)、慢性髓性白血病以及未分化的或双表型的急性白血病(同时具有淋巴细胞的和髓细胞的特征的白血病)，以及所有形式的淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤和滤泡淋巴瘤。
或者或此外，本发明的BAM-缀合物用于治疗其中病因学主要是髓细胞或淋巴细胞的功能障碍的疾病。非限制性的疾病实例包括急性髓性白血病(AML)的各种形式，特别是急性淋巴母细胞白血病、急性成髓细胞白血病、急性髓性白血病、急性髓样白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性未分化白血病、慢性B淋巴细胞白血病、(急性)B细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、髓样白血病、前B细胞白血病、T细胞白血病、急性T淋巴母细胞白血病、T细胞白血病(在肺癌中)、皮肤T细胞白血病、人单核细胞白血病、肥大细胞白血病、混合连锁白血病、毛细胞白血病、T细胞幼淋巴细胞白血病、大颗粒淋巴细胞白血病、成人T细胞白血病，和所有形式的淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤，以及滤泡淋巴瘤。
与继发性白细胞功能障碍有关的示例性疾病包括由任何一种以下病原体引起的感染：HIV；爱泼斯坦-巴尔病毒；麻疹病毒属(麻疹)；副粘病毒；风疹病毒属；疱疹病毒6型；疱疹病毒；登革热病毒；单纯疱疹病毒1型；单纯疱疹病毒2型；细小病毒属；呼吸道合胞病毒；天花病毒；水痘；黄病毒属；人类嗜T淋巴细胞病毒1型；人类嗜T淋巴细胞病毒2型；人类嗜T淋巴细胞病毒3型；人类嗜T淋巴细胞病毒4型；甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、拉沙病毒、甲型流感病毒、甲型流感病毒的H1N1和H3N2亚型、乙型流感病毒、丙 型流感病毒或锥虫原生动物，包括利什曼原虫。最优选地，与继发性白细胞功能障碍有关的疾病是HIV感染和AIDS或利什曼病。
可以通过调节白细胞活性来治疗、预防、减轻或改善的示例性疾病包括急性或慢性炎症性疾病，包括慢性阻塞性肺病(COPD)、类风湿关节炎(RA)、银屑病关节炎、炎症性肠病、银屑病、狼疮、哮喘、过敏反应，以及自身免疫性疾病，包括但不限于急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、艾迪生病、无丙种球蛋白血症、斑秃、肌萎缩侧索硬化症、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、抗合成酶综合征、特应性过敏、特应性皮炎、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性心肌病、自身免疫性肠病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征、自身免疫性周围神经病变、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌腺病综合征、自身免疫性黄体酮皮炎、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性荨麻疹、自身免疫性葡萄膜炎、巴洛病/巴洛同心圆性硬化、贝赫切特病、贝格尔病、比克斯塔夫脑炎、布劳综合征、大疱性类天疱疮、癌症、巨淋巴结增生、腹腔疾病、美洲锥虫病、慢性炎症性脱髓鞘性多神经病、慢性复发性多灶性骨髓炎、慢性阻塞性肺病、Churg-Strauss综合征、瘢痕性类天疱疮、科根综合征、冷凝集素病、补体成分2缺乏、接触性皮炎、颅动脉炎、CREST综合征、克罗恩病(包括两种类型的特发性炎性肠病“IBD”)、库欣综合征、表皮白细胞破碎性血管炎、窦根病、德卡姆病、疱疹样皮炎、皮肌炎、1型糖尿病、弥漫性皮肤系统性硬化症、德雷斯勒综合征、药物性狼疮、盘状红斑狼疮、湿疹、子宫内膜异位症、起止点炎相关的关节炎、嗜酸性筋膜炎、嗜酸细胞性胃肠炎、大疱性表皮松解症、结节性红斑、胎儿成红细胞增多症、必需的混合型冷球蛋白血症、埃文斯综合征、进行性骨化性纤维发育不良、纤维性肺泡炎(或特发性肺纤维化)、胃炎、胃肠道类天疱疮、巨细胞动脉炎、肾小球肾炎、肾炎综合征、格雷夫斯病、吉兰-巴雷综合征(GBS)、桥本氏脑病、桥本氏甲状腺炎、过敏性紫癜、妊娠疱疹又名妊娠性类天疱疮、化脓性汗腺炎、休-斯二氏综合征、低丙种球蛋白血症、特发性炎性脱髓鞘病、特发性肺纤维化、特发性血小 板减少性紫癜(参见自身免疫性血小板减少性紫癜)、IgA肾病、包涵体肌炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、间质性膀胱炎、幼年特发性关节炎又名幼年类风湿性关节炎、川崎病、肌无力综合征、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、线状IgA病(LAD)、Lou Gehrig病(也称肌萎缩性侧索硬化症)、类狼疮性肝炎的自身免疫性肝炎、红斑狼疮、马吉德综合征、梅尼埃病、显微镜下多血管炎、MillerFisher综合征参见吉兰-巴雷综合征、混合性结缔组织病、硬斑病、Mucha-Habermann病又名急性痘疮样苔藓样糠疹、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、嗜睡、视神经脊髓炎(也称Devic病)、神经性肌强直、眼瘢痕性类天疱疮、眼阵挛-肌阵挛综合征、Ord氏甲状腺炎、复发性风湿病、PANDAS(与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神障碍)、副肿瘤性小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、进行性面偏侧萎缩症、臂丛神经炎、扁平部睫状体炎、寻常型天疱疮、恶性贫血、静脉周围炎、POEMS综合征、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、进行性炎症性神经病、银屑病、银屑病关节炎、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍性贫血、罗斯默森氏症、雷诺现象、复发性多软骨炎、赖特综合征、不安腿综合征、腹膜后纤维化、类风湿性关节炎、风湿热、结节病、精神分裂症、施密特综合征，另一种形式的APS、Schnitzler综合征、巩膜炎、硬皮病、血清病、舍格伦综合征、脊柱关节病、斯蒂尔病参见幼年类风湿性关节炎、Stiff-Person综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、Susac综合征、Sweet综合征、小舞蹈病参见PANDAS、交感性眼炎、系统性红斑狼疮见红斑性狼疮、多发性大动脉炎、颞动脉炎(也被称为“巨细胞动脉炎”)、血小板减少症、痛性眼肌麻痹、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎(两种类型的特发性炎性肠病“IBD”之一)、未分化结缔组织病，其与混合性结缔组织病不同，未分化的脊柱病、荨麻疹性血管炎、血管炎、白癜风和韦格纳肉芽肿。
6.8.1 血液学恶性病
在优选的实施方案中，本发明的“BAM-缀合物”可以用于治疗或缓 解多种血液学恶性病，例如急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病(CML)、全部形式的淋巴瘤和骨髓瘤，以及特别是急性髓性白血病(AML)的全部形式。
AML是一组异质性疾病，其特征在于失控的克隆肿瘤前体细胞增殖，以及正常血细胞生成受损，导致中性粒细胞减少症、贫血症和血小板减少症。出于预防和治疗目的，世界卫生组织(WHO)已经提供了下述AML的粗分类：
具有某些遗传异常的AML，包括
·具有染色体8和21之间易位的AML
·具有染色体16易位或反转的AML
·具有染色体11改变的AML
·APL(M3)，其通常具有染色体15和17之间易位
具有多种系增生异常的AML(涉及多种异常的髓样细胞类型)
与以前的化疗或放射相关的AML
未特定描述的AML，包括：
·未分化的AML(M0)
·微成熟的AML(M1)
·成熟的AML(M2)
·前髓细胞性白血病(M3),
·急性粒单核细胞白血病(M4)
·急性成单核细胞白血病(M5a)急性单核细胞白血病(M5b)
·急性红白血病(M6)
·急性巨核母细胞白血病(M7)
·急性嗜碱粒细胞白血病
·伴有纤维化的急性全骨髓增生症
·骨髓样肉瘤(还称为粒细胞肉瘤或绿色瘤)
未分化的或双表型急性白血病(同时具有淋巴细胞和髓细胞特征的白血病)。有时称为带有髓细胞标记物的ALL、带有淋巴细胞标记物的ALL 或者混合性白血病。
如上文所述任何常规的化疗药物都可以用作用于AML治疗的与本发明的转运肽类缀合的生物活性部分。
优选地，为了治疗AML，BAM选自下述化疗药物之一：
·抗代谢药，例如胞嘧啶阿糖核苷，包括阿糖胞苷；嘌呤类似物例如硫鸟嘌呤；抗叶酸剂，包括甲氧苄氨嘧啶和培美曲塞；或嘧啶类似物，包括吉西他滨和氟尿嘧啶；
·拓扑异构酶抑制剂，例如蒽环类，包括柔红霉素、阿霉素(多柔比星)、表柔比星、伊达比星、Anamycin和MEN 10755；喹啉类生物碱，包括喜树碱、SN-38、DX-8951f、托泊替康、9-氨基喜树碱、BN 80915、伊立替康、DB 67、BNP 1350、依莎替康、勒托替康、ST1481和CKD602；鬼臼毒素类似物依托泊苷和替尼泊苷，以及蒽二酮类、米托蒽醌和安吖啶或其它天然产物，包括硫唑嘌呤；布喹那；phenoxizone二环肽类，例如更生霉素；碱性糖肽，例如博来霉素；蒽醌糖苷类，例如普利霉素(mithrmycin)；蒽二酮类，例如米托蒽醌；吖丙啶并吡咯并吲哚二酮类，例如丝裂霉素；大环免疫抑制剂，例如环孢菌素、FK-506(他克莫司、普乐可复)、雷帕霉素等；等等；
·干扰微管组装的药物，例如长春花生物碱类家族，包括长春花生物碱，包括长春碱、长春新碱；长春瑞滨、长春地辛；长春刀灵和长春胺；紫杉醇类和二萜类，包括紫杉醇和多西紫杉醇，
·金属复合物，例如顺铂(顺-DDP)、卡铂等；脲类，例如羟基脲；和肼类，例如N-甲基肼，三氧化二砷；
·类视黄醇类，例如维生素A、13-顺式-维A酸、反式维A酸、异维A酸等；类胡萝卜素类，例如β-胡萝卜素、维生素D等。
越来越多的证据文件显示，包含多种形式的AML在内的髓性恶性肿瘤是由组成性激活涉及信号转导的酶的基因突变引起。因此，在某些实施方案中，本发明的BAM-缀合物可以包含设计为靶向于这些酶、这些酶的下游调节物或者一个或多个其组成性活性的后果的BAM部分。这些酶和/ 或下游效应物的非限定性的实例包括法尼基转移酶；血管内皮生长因子和其它血管生成蛋白；有助于促进白血病胚细胞增殖和存活的酶，例如FLT3或RAS；有助于受损的造血细胞分化的酶，例如HDAC抑制剂，抗细胞凋亡基因BCL-2，M-CSF、af10、alox12、arhgef12、arnt、axl、bax、bad、bcl、bcl3、bcl6、btg1、cav1、cbfb、cdc23、cdh17、cdx2、cebpa、clc、cr1、crebbp、dek、dleu1、dleu2、egfr、ets1、evi2a、evi2b、foxo3a、fus、gli2、gmps、hox11、hoxa9、irf1、kit、laf4、lcp1、ldb1、lmo1、lmo2、lyl1、madh5、mll3、mllt2、mllt3、mov10l1、mtcp1、myc、nfkb2、notch1、notch3、npm1、nup214、nup98、p53、pbx1、pbx2、pbx3、pbxp1、pitx2、pml、rab7、rgs2、runx1、set、sp140、tal1、tal2、tcl1b、tcl6、thra、tra和znfn1a1的抑制剂。
与此一致，近期已经确定了治疗多种形式的AML的基因型特异性药物靶点。所述靶向治疗包括特别是蛋白激酶抑制剂，包括酪氨酸激酶(Flt3、c-kit、BCR-ABL)、极光激酶以及细胞内信号通路的其它组分(例如Ras)的抑制剂。
在优选的实施方案中，与本发明的转运部分缀合的生物活性部分可以是干扰异常信号转导的试剂，例如法尼基转移酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶和蛋白酶体抑制剂、抗血管生成剂、FLT3抑制剂、细胞凋亡抑制剂或M-CSF抑制剂。
这些试剂可以选择性地抑制信号通路的特定组分，或者与多种组分相互作用，例如多个激酶的抑制剂索拉非尼。
可以按照本发明使用的蛋白激酶抑制剂包括克唑替尼、吉非替尼、伊马替尼、埃罗替尼、帕唑帕尼、舒尼替尼、索拉非尼、达沙替尼、拉帕替尼、来他替尼、尼罗替尼、鲁索替尼、坦度替尼、凡德他尼、西地尼布、Seliciclib、米哚妥林、L-21649、ABT-86、多韦替尼和PKC412、Tipifarnib、AFG206、AFG210和AHL196、AUZ454和ATH686、SU5416和SU6668。
按照本文所公开的方法可以用于治疗急性髓性白血病以外的血液学恶性肿瘤的BAM的非限定性实例包括：蛋白酶抑制剂(例如硼替佐米、 Carfilzomib、Marizomib)、mTOR抑制剂(例如雷帕霉素)、主要在白细胞中表达的蛋白激酶的抑制剂(例如Fostamatinib)和表观遗传修饰药物(作用于写入和/或擦除表观遗传密码的化合物，例如伏立诺他)。
6.8.2 炎症性病症和自身免疫疾病
本发明的分子和化合物还可以用于治疗或预防炎症性病症；与自身免疫疾病和障碍相关的疾病或病症；和/或缓解此类炎症性病症和/或自身免疫疾病的症状。可用本发明的化合物和方法治疗的病症的非限定性实例包括:急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、艾迪生病、无丙种球蛋白血症、斑秃、肌萎缩侧索硬化症、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、抗合成酶综合征、特应性过敏、特应性皮炎、自身免疫性再生障碍性贫血、自身免疫性心肌病、自身免疫性肠病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴细胞增生综合征、自身免疫性周围神经病变、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性多内分泌腺病综合征、自身免疫性黄体酮皮炎、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性荨麻疹、自身免疫性葡萄膜炎、巴洛病/巴洛同心圆性硬化、贝赫切特病、贝格尔病、比克斯塔夫脑炎、布劳综合征、大疱性类天疱疮、癌症、巨淋巴结增生、腹腔疾病、美洲锥虫病、慢性炎症性脱髓鞘性多神经病、慢性复发性多灶性骨髓炎、慢性阻塞性肺病、Churg-Strauss综合征、瘢痕性类天疱疮、科根综合征、冷凝集素病、补体成分2缺乏、接触性皮炎、颅动脉炎、CREST综合征、克罗恩病(包括两种类型的特发性炎性肠病“IBD”)、库欣综合征、表皮白细胞破碎性血管炎、窦根病、德卡姆病、疱疹样皮炎、皮肌炎、1型糖尿病、弥漫性皮肤系统性硬化症、德雷斯勒综合征、药物性狼疮、盘状红斑狼疮、湿疹、子宫内膜异位症、起止点炎相关的关节炎、嗜酸性筋膜炎、嗜酸细胞性胃肠炎、大疱性表皮松解症、结节性红斑、胎儿成红细胞增多症、必需的混合型冷球蛋白血症、埃文斯综合征、进行性骨化性纤维发育不良、纤维性肺泡炎(或特发性肺纤维化)、胃炎、胃肠道类天疱疮、巨细胞动脉炎、肾小球肾炎、肾炎综合征、格雷夫斯病、吉兰-巴雷综合征(GBS)、桥本氏脑病、桥本氏甲状腺炎、过敏性紫癜、妊娠疱疹又名妊娠性类天疱疮、 化脓性汗腺炎、休-斯二氏综合征、低丙种球蛋白血症、特发性炎性脱髓鞘病、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(参见自身免疫性血小板减少性紫癜)、IgA肾病、包涵体肌炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、间质性膀胱炎、幼年特发性关节炎又名幼年类风湿性关节炎、川崎病、肌无力综合征、白细胞破碎性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔藓、线状IgA病(LAD)、Lou Gehrig病(也称肌萎缩性侧索硬化症)、类狼疮性肝炎的自身免疫性肝炎、红斑狼疮、马吉德综合征、梅尼埃病、显微镜下多血管炎、Miller Fisher综合征参见吉兰-巴雷综合征、混合性结缔组织病、硬斑病、Mucha-Habermann病又名急性痘疮样苔藓样糠疹、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、嗜睡、视神经脊髓炎(也称Devic病)、神经性肌强直、眼瘢痕性类天疱疮、眼阵挛-肌阵挛综合征、Ord氏甲状腺炎、复发性风湿病、PANDAS(与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神障碍)、副肿瘤性小脑变性、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)、进行性面偏侧萎缩症、臂丛神经炎、扁平部睫状体炎、寻常型天疱疮、恶性贫血、静脉周围炎、POEMS综合征、结节性多动脉炎、风湿性多肌痛、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、进行性炎症性神经病、银屑病、银屑病关节炎、坏疽性脓皮病、纯红细胞再生障碍性贫血、罗斯默森氏症、雷诺现象、复发性多软骨炎、赖特综合征、不安腿综合征、腹膜后纤维化、类风湿性关节炎、风湿热、结节病、精神分裂症、施密特综合征，另一种形式的APS、Schnitzler综合征、巩膜炎、硬皮病、血清病、舍格伦综合征、脊柱关节病、斯蒂尔病参见幼年类风湿性关节炎、Stiff-Person综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、Susac综合征、Sweet综合征、小舞蹈病参见PANDAS、交感性眼炎、系统性红斑狼疮见红斑性狼疮、多发性大动脉炎、颞动脉炎(也被称为“巨细胞动脉炎”)、血小板减少症、痛性眼肌麻痹、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎(两种类型的特发性炎性肠病“IBD”之一)、未分化结缔组织病，其与混合性结缔组织病不同，未分化的脊柱病、荨麻疹性血管炎、血管炎、白癜风和韦格纳肉芽肿。
可以用于此类病症治疗的BAM的非限定性实例包括COX-2抑制剂、 泼尼松、帕唑帕尼、法莫替丁、达伐吡啶、Pegloticase、艾美拉唑、阿司匹林、塞来考昔、双氯芬酸、伐地考昔、罗非昔布、二氟尼柳、依托度酸、非诺洛芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮洛酸、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、奥沙普秦、吡罗昔康、舒林酸、托美丁、兰索拉唑、甲氯灭酸盐、曲安西龙、甲泼尼龙、倍他米松、布地奈德、泼尼松龙、氢化可的松、地塞米松和可的松。
6.8.3 原虫病和感染性疾病
本发明的分子和化合物还可以用于治疗或预防与原虫感染或其它感染性病症相关的疾病和病症，和/或缓解其所伴随的症状。可用本发明的化合物和方法治疗的疾病和病症的非限定性实例包括：不动杆菌感染、放线菌病、非洲昏睡病(非洲锥虫病)、艾滋病(获得性免疫缺陷综合征)、阿米巴病、无形体病、炭疽病、溶血隐秘杆菌感染、阿根廷出血热、蛔虫病、曲霉菌病、星状病毒感染、巴贝虫病、蜡样芽胞杆菌感染、细菌性肺炎、细菌性阴道病(BV)、类杆菌感染、结肠小袋虫病、贝利蛔线虫属感染、BK病毒感染、黑色毛结节菌病、人芽囊原虫感染、芽生菌病、玻利维亚出血热、伯氏疏螺旋体感染、肉毒中毒(婴儿肉毒中毒)、巴西出血热、布氏杆菌病、伯克霍尔德菌感染、布鲁里溃疡、杯状病毒感染(诺沃克样病毒和札幌病毒)、空肠弯曲杆菌、念珠菌感染(念珠菌病；鹅口疮)、猫抓病、蜂窝组织炎、南美锥虫病(美洲锥虫病)、软下疳、水痘、衣原体、肺炎衣原体感染、霍乱、着色芽生菌病、华支睾吸虫病、艰难梭菌感染、球孢子菌病、科罗拉多蜱热(CTF)、普通感冒(急性病毒性咽炎；急性鼻炎)、克雅氏病(CJD)、克里米亚-刚果出血热(CCHF)、隐球菌病、隐孢子虫病、皮肤幼虫移行症(CLM)、环孢子虫感染、囊尾蚴病、巨细胞病毒感染、登革热、双核阿米巴病、白喉、裂头绦虫病、线虫病、埃博拉出血热、包虫病、埃里希体病、蛲虫病(蛲虫感染)、肠球菌感染、肠道病毒感染、流行性斑疹伤寒、传染性红斑(第五病)、幼儿急疹(第六病)、姜片虫病、片形吸虫病、致死性家族性失眠症(FFI)、丝虫病、由产气荚膜梭菌造成的食物中毒、自由生活的阿米巴感染、梭杆菌属感染、气性坏疽(气性坏疽)、地霉病、吉斯特曼-斯召 斯列综合征(GSS)、贾第虫病、马鼻疽、颚口线虫病、淋病、腹股沟肉芽肿(肉芽肿)、A组链球菌感染、B组链球菌感染、流感嗜血杆菌感染、手足口病(HFMD)、汉坦病毒肺综合征(HPS)、幽门螺杆菌感染、溶血性尿毒症综合征(HUS)、肾综合征出血热(HFRS)、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、单纯疱疹、组织胞浆菌病、钩虫感染、人类博卡病毒感染、人类埃里希体病、人粒细胞无形体病(HGA)、人变性肺病毒感染、人单核细胞埃里希体病、人乳头状瘤病毒(HPV)感染、人类副流感病毒感染、绦虫病、爱泼斯坦-巴尔病毒传染性单核细胞增多症(Mono)、流行性感冒(流感)、等孢子球虫病、川崎病、角膜炎、金氏金氏杆菌感染、库鲁病、拉沙热、军团杆菌病(军团病)、军团杆菌病(庞蒂亚克热)、利什曼病、麻风、钩端螺旋体病、李氏杆菌病、莱姆病(莱姆包柔氏体螺旋病)、淋巴结丝虫病(象皮肿)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、疟疾、马尔堡出血热(MHF)、麻疹、类鼻疽(惠特莫尔氏病)、脑膜炎、脑膜炎球菌病、后殖吸虫病、微孢子虫病、传染性软疣(MC)、流行性腮腺炎、斑疹伤寒(地方性斑疹伤寒)、支原体肺炎、足菌肿、蝇蛆病、新生儿结膜炎(眼炎)、(新)变异型克雅氏病(vCJD、nvCJD)、诺卡菌病、盘尾丝虫病(河盲症)、副球孢子菌病(南美芽生菌病)、肺吸虫病、巴氏杆菌病、盆腔炎性疾病(PID)、百日咳(百日咳)、瘟疫、肺炎球菌感染、卡氏肺孢子虫肺炎(PCP)、肺炎、脊髓灰质炎、普氏菌感染、原发性阿米巴脑膜脑炎(PAM)、渐进性多灶性白质脑病、鹦鹉热、Q热、狂犬病、鼠咬热、呼吸道合胞病毒感染、鼻孢子虫病、鼻病毒感染、立克次体感染、立克次体痘、裂谷热(RVF)、落矶山斑疹热(RMSF)、轮状病毒感染、风疹、沙门氏菌病、SARS(严重急性呼吸综合征)、疥疮、血吸虫病、败血症、志贺氏菌病(细菌性痢疾)、带状疱疹(带状疱疹)、天花(天花)、孢子丝菌、葡萄球菌食物中毒、金黄色葡萄球菌感染、粪类圆线虫病、梅毒、绦虫病、破伤风(牙关紧闭)、须癣(理发痒)、头癣(头皮的钱癣)、体癣(身体的钱癣)、股癣(股癣)、手癣(手的钱癣)、黑癣、脚癣(脚气)、甲癣(灰指甲)、花斑癣(汗斑)、弓蛔虫病(眼幼虫移行症(OLM))、弓蛔虫病(内脏幼虫移行症(VLM))、弓形体病、旋毛虫病、滴虫病、鞭虫病(鞭虫感染)、 肺结核、兔热病、解脲脲原体感染、委内瑞拉马脑炎、委内瑞拉出血热、病毒性肺炎、西尼罗河热、白色毛结节菌病(白癣)、假结核病耶尔森菌、耶尔森菌病、黄热病和接合菌病。
可用于治疗所述病症的BAM的非限制性实例包括氯喹、甲氟喹、伯氨喹、氯胍盐酸盐、氯胍盐酸盐与阿托伐醌、乙胺嘧啶、磺胺多辛、奎宁、喹啉、多西环素、克林霉素、青蒿琥酯、二氯尼特、甲硝唑、替硝唑、米帕林盐酸盐、两性霉素、喷他脒、乙胺嘧啶、磺胺嘧啶、阿奇霉素、阿托伐醌、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、氨苯砜、阿托伐醌、羟乙磺酸喷他脒、阿莫地喹、氯苯胍、依氟鸟氨酸、羟氯喹、双碘喹啉、葡甲胺、美拉胂醇、硝呋莫司、巴龙霉素、葡萄糖酸锑钠、苏拉明和锥虫胂胺。
6.8.4 HIV/艾滋病
已经公认，白细胞特别是巨噬细胞在HIV-1感染中发挥了决定性作用。它们在首批被HIV-1感染的细胞中，且已经预期在被感染的人体内形成HIV-1的储库。它们还用作将病毒向其它组织例如大脑传播的工具。此外，所述病毒可以储存在这里，同时保持隐藏以避免可能的中和抗体或其它形式的免疫应答。
根据上文所述，选择性地靶向巨噬细胞并帮助细胞内转运的本发明的转运部分理想地适合用作细胞内HIV药物的载体部分。
因此，与本发明的转运部分缀合的BAM可以特别是：
·NRTI(核苷或核苷酸逆转录酶抑制剂)，包括齐多夫定、去羟肌苷、司他夫定、拉米夫定、恩曲他滨、阿巴卡韦和替诺福韦、Apricitabine、艾夫他滨、OBP-601、Amdoxovir、拉米夫定、立妥威、司他夫定、扎西他滨、AZT；司他夫定、4-Ed4T、Amdoxovir、Dexelvucitabine、DOT(二氧戊环胸腺嘧啶)、Fosalvudine、GS-9131、GS-9148、IDX12899、IDX12989、喹诺酮类、Racivir、Thiovir、TSAO-T衍生物；
·NNRTI(非核苷逆转录酶抑制剂)、包括奈韦拉平、delaviradme、依法韦仑、etravinne和rilpivi[pi]ne、依曲韦林、 HBY097、IDX899、V026048、RDEA806、RDEA427、RDEA640、UK-435061；或
·蛋白酶抑制剂、包括利托纳韦、替拉那韦、沙奎那韦、奈芬纳韦、英地纲韦、氨普那韦、呋山那韦、阿扎那韦、洛匹那韦、Darunavir(TMC-114)、拉西那韦和Brecanavir(VX-385)、GRL-02031、SPI-256。
6.8.5 抗原虫药/利什曼病
利什曼原虫属是属于动体目和锥虫科的原生动物。利什曼病是由白蛉传播的媒介传染疾病。人的感染是由大约30个感染哺乳动物的不同种属引起。这些包括具有3个物种(杜氏利什曼原虫、婴儿利什曼原虫和恰加斯利什曼原虫)的杜氏利什曼原虫复合体；具有3个主要物种(墨西哥利什曼原虫、亚马逊利什曼原虫和委内瑞拉利什曼原虫)的墨西哥利什曼原虫复合体；热带利什曼原虫；硕大利什曼原虫；埃塞俄比亚利什曼原虫；和具有4个主要物种的圭亚那亚属(巴西利什曼原虫、圭亚那利什曼原虫、巴拿马利什曼原虫和秘鲁利什曼原虫)。所述不同的种是在形态学上难以区分的，但是它们可以通过同工酶分析、分子方法或单克隆抗体进行区分。
利什曼病是多种类型疾病的成因，包括黑热病、皮肤利什曼病(局部或弥散型)和黏膜皮肤利什曼病。临床特征的差异性是源于利什曼原虫的物种以及宿主的免疫应答的多样性。
在人类以及其它哺乳动物中，寄生虫是作为有鞭毛的细胞外的前鞭毛体通过其节肢动物媒介透过皮肤而接种。在其哺乳动物宿主中，利什曼原虫前鞭毛体必须首先避免补体介导的溶胞作用，直至它们被巨噬细胞吞噬。利什曼原虫前鞭毛体随后分化进入更具抵抗性的无鞭毛体阶段，并保持为感染单核细胞/巨噬细胞系的造血细胞的专性的细胞内病原体。将其自身隐藏在宿主的细胞中，使得利什曼原虫避免直接对抗它的许多免疫应答。但是，为了在其宿主细胞的抗微生物活性下存活，并且为了防止有效的免疫应答活化，多个利什曼原虫的物种在蛋白质或基因表达水平参与了复杂的机制以破坏正常的巨噬细胞功能，特别是那些参与免疫监视和巨噬细胞活 化的功能。
除了抑制宿主巨噬细胞的抗微生物活性以外，利什曼原虫还抑制宿主细胞向免疫系统的其它组成部分呈递寄生虫抗原的能力。因此，利什曼原虫通过抑制许多细胞因子(特别是涉及炎症反应那些(IL-1和肿瘤坏死因子α[TNF-α]))的产生来阻止有效的免疫应答活化。利什曼原虫阻断巨噬细胞抗微生物机制的强大能力使该寄生虫避免了最初的先天性免疫应答，并创造安全的增殖环境。此外，位于宿主巨噬细胞内的隐藏区域在很大程度上是化学疗法缺乏效力的原因，因为其削弱了治疗性药物的进入。
为了提高抗利什曼原虫药的活性，并降低药物治疗的毒性，研发了脂质体药物递送系统以靶向于单核巨噬细胞系统。因此，例如脂质体两性霉素B已经用于治疗黑热病。
尽管如此，迄今为止，已经在超过50年以前研究开发的五价锑(Sb)，尽管其微弱的疗效和副作用，仍然保持作为利什曼病治疗的一线药物。因此，存在对有效的抗黑热病药物的实质性需要，其选择性地靶向宿主的巨噬细胞，从而增强抗利什曼原虫药物的活性并减少毒性。借助其特异性地靶向于髓系细胞的能力，本发明的化合物可以用于转运和递送具有抗利什曼原虫活性的药物至感染的宿主巨噬细胞。
因此，按照本发明的一个优选实施方案，可缀合形成本发明的BAM-缀合物的所述BAM可以是具有抗原生动物活性的物质，包括但不限于氯喹、甲氟喹、伯氨喹、氯胍盐酸盐、氯胍盐酸盐与阿托伐醌、乙胺嘧啶、磺胺多辛、奎宁、喹啉、多西环素、克林霉素、青蒿琥酯、二氯尼特、甲硝唑、替硝唑、米帕林盐酸盐、两性霉素、喷他脒、乙胺嘧啶、磺胺嘧啶、阿奇霉素、阿托伐醌、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、甲氧苄啶、氨苯砜、阿托伐醌、羟乙磺酸喷他脒、阿莫地喹、氯苯胍、依氟鸟氨酸、羟氯喹、双碘喹啉、锑酸葡甲胺、美拉胂醇、硝呋莫司、巴龙霉素、葡萄糖酸锑钠、苏拉明和锥虫胂胺。
6.9 药物组合物及其给药
本发明还涉及药物组合物，其包含本发明的分子和化合物，例如BAM-缀合物。这些组合物包含有效量的所述化合物和可药用的载体或赋形剂。所述载体或赋形剂包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇和/或其组合。所述药物组合物还可包含其他用于治疗所给出的要治疗疾病的治疗剂。配制制剂以适应给药方式。一般而言，施用多肽的方法是本领域众所周知的，并能够应用于本发明缀合物的给药。
给药是通过任何通常用于将分子引入而与血液最终接触的途径。向患者施用本发明中的这类缀合物的合适方法是可获得的，包括口服和胃肠外途径。尽管能够使用不止一种途径来施用具体组合物，但是具体途径通常能够提供比另一途径更快和更有效的作用或反应。
优选本发明的BAM-缀合物通过胃肠外的给药方式施用，尤其是通过静脉内、腹膜内、肌内、真皮内、皮下硬膜内、眼球内、眼球后、肺内或关节内的方式。这些给药途径和适宜制剂是本领域技术人员公知的。适合于胃肠外给药的制剂包括含水和不含水的、等渗的无菌注射溶液，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和能使制剂与预期受者的血液等渗的溶质；以及含水和不含水的无菌混悬液，其可包含助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。载体多肽-靶向多肽缀合物也可通过脂质体施用。
本发明的分子和化合物单独地或与其他合适组分组合，也可配制到气雾剂制剂中(即，它们能够被“喷雾”)，以便通过吸入给药。气雾剂制剂可以放置到加压的可接受的抛射剂中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等。
在一个优选的实施方案中，本发明的组合物以冷冻干燥的形式提供，以便在施用前进行重配。用于重配药物组合物的缓冲液和溶液可以与该药物组合物一起提供，以制备用于施用的本发明的水性组合物。
短语“可药用的或药理学可接受的”是指在向动物或人施用时不产生不良反应、过敏反应或其他不希望的反应的分子实体和组合物。如本文所用的“可药用载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。
可药用载体部分地通过所施用的具体组合物以及用于施用组合物的具 体方法而确定。因此，有很多种本发明的药物组合物的合适制剂。可药用的载体和赋形剂是本领域众所周知的，并且本发明的一种或多种缀合物可通过公知的方法配制到组合物中(参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,A.R.Gennaro编辑,Mack Publishing Company(2005)；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins,S.Frokjaer和L.Hovgaard编辑,Taylor&Francis(2000)；以及Handbook of Pharmaceutical Excipients,第3版,A.Kibbe编辑,Pharmaceutical Press(2000))。
包含一种或多种本发明的BAM-缀合物的药物组合物任选地在一种或多种适宜的体外和/或体内的动物疾病模型中按照本领域公知的方法进行检验，以验证效力、组织代谢，并估计剂量。因此，应当理解，本发明组合物的合适剂量将取决于受者的年龄、健康和体重、同时治疗的类型(如果有的话)、治疗频率和所需效果的性质。但是，剂量将特定针对单个个体，因为这是本领域技术人员无需过度实验就可确定的。治疗剂的总剂量可以以多个剂量或单个剂量施用。在某些实施方案中，组合物单独施用，在其他实施方案中，组合物与针对该疾病的或针对该疾病的其他症状的其他治疗剂联合施用。
在本发明的情况中，施用于患者的剂量足以随时间在患者中有效产生有益的治疗响应，或者例如抑制病原体的感染、降低或预防疾病状态的症状或其他适宜的活性，这取决于具体应用。剂量由具体组合物/制剂的效力和所用的BAM多肽缀合物的活性、稳定性或血清半衰期和患者状况以及所治疗患者的体重或表面积决定。剂量的大小也由在具体患者中施用具体组合物/制剂所伴随的任何不良副作用的存在、性质和程度等决定。
本发明还涉及以下项目：
项目1，分子或化合物，其包含或由以下包含L和D氨基酸的共有结构中之一组成：
Arg1-(SPA)-Arg5-(SPB)-X-(SPC)-Arg9-(LD10)n-(XD11)m；
Arg1-(SPC)-X-(SPB)-Arg5-(SPA)-Arg9-(LD10)n-(XD11)m；
(XD-2)m-(LD-1)n-Arg1-(SPA)Arg5-(SPB)-X-(SPC)-Arg9；或
(XD-2)m-(LD-1)n-Arg1-(SPC)-X-(SPB)-Arg5-(SPA)-Arg9；
其中，LD10或LD-1代表任何L-或D-氨基酸，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；且n具有0-10的值；
其中XD11或XD-2代表任何D-氨基酸，但D-精氨酸或D-赖氨酸除外，且m具有0或1的值；
其中
(a)Arg1、Arg5和Arg9代表L-精氨酸；且X代表L-赖氨酸或L-精氨酸，或
(b)Arg1、Arg5和Arg9代表D-精氨酸；且X代表D-赖氨酸或D-精氨酸；
其中(SPA)代表化学连接体，其
(a)由3个氨基酸残基的肽链构成，其中各个残基可以独立地选自任何氨基酸残基，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；或
(b)将相邻的氨基酸残基分隔
Figure BDA0000755574230000626
其中(SPC)代表化学连接体，其
(a)由单个氨基酸残基构成，其可以是任何氨基酸残基，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；或
(b)将相邻的氨基酸残基分隔
Figure BDA0000755574230000621
且其中(SPB)-X-(SPC)或其反向序列(SPC)-X-(SPB)代表化学连接体
(a)其中SPB和SPC各自代表单个氨基酸残基，其可以独立地选自任何氨基酸残基，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；或
(b)其将相邻的氨基酸残基Arg1和Arg5或Arg5和Arg9分隔
Figure BDA0000755574230000622
Figure BDA0000755574230000623
项目2，如项目1所述的分子或化合物，其中
(SPA)代表化学连接体，其将相邻的氨基酸残基分隔
Figure BDA0000755574230000624
(SPC)代表化学连接体，其将相邻的氨基酸残基分隔
Figure BDA0000755574230000625
且其中(SPB)-X-(SPC)或其反向序列(SPC)-X-(SPB)代表化学连接体，其 将相邻的氨基酸残基Arg1和Arg5或Arg5和Arg9分隔
Figure BDA0000755574230000631
项目3，如项目1或2所述的分子或化合物，其中一个或多个所述化学连接体是β-肽、基于糖氨基酸的支架、β-发夹肽模拟物、α-螺旋模拟物或环肽。
项目4，如项目1所述的分子或化合物，其中(SPA)代表由3个氨基酸残基构成的肽链，各个残基独立地选自任何氨基酸残基，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；且其中(SPB)和(SPC)各自代表单个氨基酸残基，其可以独立地选自任何氨基酸残基，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外。
项目5，如项目1或4所述的分子或化合物，其中(SPA)、(SPB)和(SPC)一起包含不超过3个丙氨酸残基。
项目6，如项目1、4或5所述的分子或化合物，其中(SPA)、(SPB)和(SPC)一起不包含脯氨酸残基。
项目7，如项目1和4-6中任一项所述的分子或化合物，其中(SPA)、(SPB)和(SPC)一起包含一个或多个选自Phe、Trp、Tyr、Val、Met、Ile和Leu的氨基酸。
项目8，如项目1和4-7中任一项所述的分子或化合物，其中(SPB)代表D-氨基酸。
项目9，如项目1-8中任一项所述的分子或化合物，其中LD10代表L-或D-组氨酸。
项目10，如项目1-9中任一项所述的分子或化合物，其中XD11代表D-组氨酸。
项目11，如项目1-10中任一项所述的分子或化合物，其中m值为1。
项目12，如项目1-11中任一项所述的分子或化合物，其中n值为0。
项目13，如项目1或4-8中任一项所述的分子或化合物，其具有序列：
RSTqRYRVRh(SEQ ID NO：1)；
RYFvRIKYRh(SEQ ID NO：2)；
RYFvRIKARH(SEQ ID NO：3)；
RAAvRAKYRh(SEQ ID NO：4)；
RAAvRIKYRh(SEQ ID NO：5)；
RSTqRYRVRh(SEQ ID NO：6)；
RSTqRYKVRh(SEQ ID NO：7)；
RGGgRGKGRh(SEQ ID NO：8)；
RHHhRHKHRh(SEQ ID NO：9)；
RVVvRVKVRh(SEQ ID NO：10)；
RLLlRLKLRh(SEQ ID NO：11)；
RMMmRMKMRh(SEQ ID NO：12)；
RIIiRIKIRh(SEQ ID NO：13)；
RYFVRIKYR(SEQ ID NO：14)；
RYFvRIKYR(SEQ ID NO：15)；
RYFVRiKYR(SEQ ID NO：16).
项目14，如项目1-13中任一项所述的分子或化合物，其进一步与生物活性部分(BAM)缀合。
项目15，如项目14所述的BAM-缀合物，其中BAM按照如下共有结构缀合在所述共有结构的末端：
(BAM)-(LINK)-Arg1-(SPA)-Arg5-(SPB)-X-(SPC)-Arg9-(LD10)n-(XD11)m；
(BAM)-(LINK)-Arg1-(SPC)-X-(SPB)-Arg5-(SPA)-Arg9-(LD10)n-(XD11)m；
(XD-2)m-(LD-1)n-Arg1-(SPA)Arg5-(SPB)-X-(SPC)-Arg9-(LINK)-(BAM)；或
(XD-2)m-(LD-1)n-Arg1-(SPC)-X-(SPB)-Arg5-(SPA)-Arg9-(LINK)-(BAM)
其中(BAM)代表生物活性部分；
其中(LINK)代表任选的连接基团；
其中LD10或LD-1代表任何L-或D-氨基酸，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；且n具有0-10的值；
其中XD11或XD-2代表任何D-氨基酸，但D-精氨酸或D-赖氨酸除外，且m具有0或1的值；
其中
(a)Arg1、Arg5和Arg9代表L-精氨酸；且X代表L-赖氨酸或L-精氨酸，或
(b)Arg1、Arg5和Arg9代表D-精氨酸；且X代表D-赖氨酸或D-精氨酸；
其中(SPA)代表化学连接体，其
(a)由3个氨基酸残基的肽链构成，其中各个残基可以独立地选自任何氨基酸残基，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；或
(b)将相邻的氨基酸残基分隔
Figure BDA0000755574230000651
其中(SPC)代表化学连接体，其
(a)由单个氨基酸残基构成，其可以是任何氨基酸残基，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；或者
(b)将相邻的氨基酸残基分隔
Figure BDA0000755574230000652
且其中(SPB)-X-(SPC)或其反向序列(SPC)-X-(SPB)代表化学连接体
(a)其中SPB和SPC各自代表单个氨基酸残基，其可以独立地选自任何氨基酸残基，但D-精氨酸、D-赖氨酸、L-精氨酸或L-赖氨酸除外；或
(b)将相邻的氨基酸残基Arg1和Arg5或Arg5和Arg9分隔
Figure BDA0000755574230000653
Figure BDA0000755574230000654
项目16，如项目15所述的BAM-缀合物，其中连接体基团(LINK)是L-或D-Glu。
项目17，如项目14-16中任一项所述的BAM-缀合物，其中BAM是通过共价的N-末端酰胺键或C-末端酯键与Arg1或Arg9缀合。
项目18，如项目14所述的BAM缀合物，其中所述BAM是与(SPA)、(SPB)或(SPC)内的氨基酸残基和/或化学基团缀合。
项目19，如项目16所述的BAM缀合物，其中所述缀合是与所述肽序列的内部残基直接缀合或通过连接体基团间接缀合。
项目20，如项目14-19中任一项所述的BAM-缀合物，其中BAM是单糖或多糖、细胞毒药物、抗肿瘤药物、抗炎药物、抗病毒剂、抗菌剂或用于治疗原虫感染的药物。
项目21，如项目14-19中任一项所述的BAM-缀合物，其中BAM是脱氧核糖或核糖。
项目22，药物组合物，其包含项目14所述的分子或化合物或者项目15-21中任一项所述的BAM-缀合物。
项目23，如项目22所述的药物组合物，其用于治疗与白细胞相关的病症，选自肿瘤疾病、炎症疾病、自身免疫疾病、免疫缺陷疾病、病毒感染、细菌感染、原虫或寄生虫感染。
项目24，如项目22所述的药物组合物，其用于治疗HIV；爱泼斯坦-巴尔病毒；麻疹病毒属；副粘病毒；风疹病毒属；疱疹病毒；登革热病毒；单纯疱疹病毒；细小病毒属；呼吸道合胞病毒；天花病毒；水痘；黄病毒属；人类嗜T淋巴细胞病毒；甲、乙、丙、丁或戊型肝炎病毒、拉沙病毒或流感病毒。
项目25，如项目22所述的药物组合物，其用于治疗其中与白细胞具有病理生理关联的疾病或病症：中性粒细胞增多、中性粒细胞减少、白细胞减少、嗜碱性粒细胞减少、嗜碱性粒细胞增多、嗜酸粒细胞减少、嗜酸粒细胞增多、特发性嗜酸细胞增多综合征、淋巴细胞增多、淋巴细胞增多症、淋巴细胞减少症、单核细胞增多、单核细胞减少、梅-海二氏异常、佩-休二氏异常、奥-赖氏颗粒异常(Alder-Reilly Anomaly)、切-希二氏综合征(Chedial-Higashi syndrome)、乔布综合征(高IgE)、懒惰白细胞综合征、先天性C3缺陷、慢性肉芽肿病、白细胞、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、髓过氧化物酶缺陷-良性、严重联合免疫缺陷病、迪格奥尔格综合征、内兹罗夫综合征、婴儿伴性低丙种球蛋白血症、普通可变的低丙种球蛋白血症、粘多糖贮积症、lipodoses、戈谢病、尼曼皮克病、法布里病、法伯病、神经节苷脂累积病；泰-萨克斯病、Sandhoff病、克拉伯病、异染性脑白质营养不良、Wolman病、白血病、急性淋巴细胞白血病(L1、L2、L3)、慢性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病(AML)，未分化的AML(M0)、成髓细胞白血病(M1)、成髓细胞白血病(M2)、前髓细胞性白血病(M3)、粒单核细胞白血病(M4)、单核细胞性白血病(M5)、红白血病(M6)、巨核母细胞性白血病(M7)、慢性髓性白血病。
项目26，如项目22所述的药物组合物，其用于治疗利什曼病。
项目27，如项目1-14中任一项所述的分子或化合物用于帮助将生物活性分子转运进入髓系细胞内的用途。
项目28，如项目1-14中任一项所述的分子或化合物用于制备药物-肽缀合物的用途。
本发明不受本文所述的具体实施方案的范围限制。实际上，除了本文所述的这些，根据以上描述和所附的附图，本发明的各种修改对于本领域技术人员而言是非常明显的。这类修改都落入所附权利要求的范围内。
本文引用了多种出版物，其内容整体引入本文作为参考。
7.实施例
7.1 结合C4S的肽
在计算机模拟中建立模型来模拟TAT肽与C4S的相互作用。所述的模拟模仿了伸展构象的TAT肽与C4S分子，这是这些分子在溶液中最常见的形式。模拟结果表明，TAT残基中对应于本发明的9个氨基酸的肽的1、5、9位的Arg残基(例如，根据序列Arg1-X2-X3-X4-Arg5-X6-X7-X8-Arg9(SEQ ID NO:21，按照SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18的规则；SEQ IDNO:22，按照SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的规则))以适当距离被间隔，从而与C4S的重复硫酸酯发生最佳的相互作用。TAT的Arg残基之间的距离是
Figure BDA0000755574230000671
其最佳地适合于C4S上的硫酸酯的重复间距，该间距是
Figure BDA0000755574230000672
Figure BDA0000755574230000673
(参见图1)。此外，在等效位置X3或X7上的赖氨酸或精氨酸会距离Arg1或Arg9残基约
Figure BDA0000755574230000674
最佳地与位于距离C4S上的硫酸酯为
Figure BDA0000755574230000675
的羧酸酯相互作用(图1)。该模型暗示了TAT序列必须以伸展构象，以便与C4S相互作用，并且对于有效和选择性的结合而言排除了任何螺旋束缚。
在计算机模拟中建立模型模拟本发明的肽与C4S的相互作用。正如上述的模型结果所预测的那样，模拟结果表明，本发明的9个氨基酸的肽的1、5、9位的精氨酸表现出与C4S的糖上的硫酸酯良好的相互作用(例如在图2所示的模拟结构上的1、3、7位)。此外，在9个氨基酸的肽的3位的赖氨酸能够与C4S的2位糖上的羧酸酯相互作用，如图2所模拟的那样。
本发明的靶向肽的1、5、9位与C4S分子的有利相互作用在图3中使用病毒的TAT肽给出图示。如模型所确定的和如图3所代表的那样，仅有1、5、9位的Arg(图3中的圆球)和3位的Lys分别参与了与1、3、7位C4S的糖上的硫酸酯和C4S上2位的羧酸酯的相互作用。而且，由于这些结构是对称的，Lys+3能够移动到+7而具有相同结果。
具体而言，使用改进的ELISA方法，与结合其他蛋白聚糖相比，检验了模型所预测的本发明的9个氨基酸的肽与C4S的结合。ELISA板用在PBS中的1mg/ml的硫酸肝素(HS)、软骨素-4-硫酸酯(C4S)、软骨素-6-硫酸酯(C6S)或透明质酸(HA)涂覆过夜。接着将各孔用PBS洗涤，室温下与1mg/ml的本发明示例性的肽或标准的TAT肽温育1小时，所述的本发明的肽具有序列RYFvRIKYRh(“RYF”；SEQ ID NO:2)。接着将板子用PBS彻底洗涤，随后用LUMASCOPETM发光显微镜照相。接着用ImageJ软件对图像定量(图4)。图4所呈现的结果证明，与标准的TAT肽(图4B)不同，本发明的RYF肽特异性地结合C4S蛋白聚糖，并且尤其是相对于其他所测试的蛋白聚糖，选择性地结合C4S(图4A)。
使用相同的改进的ELISA方法，检验改变1、5、9位和3或7位的氨基酸残基的手性对于肽与C4S的结合的影响。图5证明了高结合活性仅在所有位置Arg1、Arg5、Arg9和Arg/Lys3或Arg/Lys7具有相同手性时才能保持(即，所有这些位置都是D-氨基酸或者都是L-氨基酸)。在图5中，大写字母表示L-对映体，小写字母表示D-对映体。
接着，使用相同的改进的ELISA方法，检验改变肽的净电荷对于肽与C4S的选择性结合的影响。图6的结果证明，肽的“可自由选择的位点”中带负电荷的残基数目和与蛋白聚糖的非特异性结合直接相关，减少这些位置上的负电荷残基的数目增加了对C4S的特异性和/或选择性。
7.2 结合细胞表面表达的C4S的肽
如整个说明书中所解释的那样，本发明的分子相对于其他蛋白聚糖能够选择性结合C4S。在表达C4S的细胞(CHO细胞)和缺少C4S的细胞(Sog9细胞；缺少软骨素4-邻-磺基转移酶1(C4ST-1，也称为CHST11))中，评 价了本发明的FITC缀合的肽RYFvRIKYRh(“RYF”；SEQID NO:2)的结合选择性。Sog9(C4ST-)和CHO细胞在RYF(序列：RYFvRIKYRh)肽(2.5M)存在下温育24小时。接着将细胞在PBS中洗涤3次，随后在甲醇-丙酮(1:1)中固定，并用LUMASCOPETM发光显微镜照相。图7证明，本发明的RYF肽不结合缺少C4S的Sog9细胞；相反，表达C4S的细胞表现出强且均匀的结合。
使用相同的发光显微镜的方法，评价了FITC-RYF肽在用氯酸盐预处理的表达C4S的细胞上的结合。氯酸盐是磺基转移酶的抑制剂，因此，氯酸盐处理降低或抑制了C4S的表达。将巨噬细胞用0、3、10或30μM的氯酸盐处理16小时，随后洗涤、与RYF(SEQ ID NO:2)肽温育，并如上所述进行照相。图8证明，RYF(SEQ ID NO:2)的结合与硫酸软骨素的表达相关。
图7和8所示的实验揭示了本发明的肽相对于其他蛋白聚糖的对C4S的高度选择性。因此，所述的肽能够特异性地靶向于唯一表达C4S的细胞或者相对于其他蛋白聚糖具有高水平C4S的细胞。负责软骨素的4-硫酸酯化并由此产生C4S的主要酶是CHST11。来自Atlas阵列的表达数据表明，CHST11基因优先在来自白细胞谱系的细胞中表达(图9)。因此，本发明的肽和方法优先靶向于白细胞。
7.3 本发明的肽作为治疗剂的载体分子的用途
通过由巨噬细胞提取物引起的FITC基团从肽中释放，检验了本发明的肽用作载体部分的能力以及对其中的D-氨基酸残基的水平和间隔的依赖。将1μg本发明的具有不同D-氨基酸水平和间隔的FITC-标记的肽在“原始的”巨噬细胞提取物中37℃温育最多48小时(参见例如J Exp Med.129(1969),227–245)。随后，与作为对照的游离的FITC一起，将0.5ug的肽点样在纤维素纸上(Whitman#1)，随后使用正丁醇、乙酸、水(4:1:1)作为溶剂进行(薄层)色谱。使用剩余的0.5ug样品进行HPLC-MS/MS分析。在图10中使用的肽的图例如下：肽1、5和6具有共有序列：RXXxRXXXRh；肽14、15和16具有共有序列：RXxXRXXXRh；肽23、24和25具有共 有序列：rXXXrXXXr(参见例如WO 2010/072228)。通过常规的与肽的N-末端氨基酸的共价肽键进行肽与FITC之间的缀合。对于肽23、24和25未观察到降解，这是因为与N-末端的“r”(“d”-氨基酸)缀合。从肽中释放的游离FITC的量为100％(#5)(共有序列：RXXxRXXXRh)到30％(#15)(共有序列：RXxXRXXXRh)。数据表明在肽的4位包含D-氨基酸能够调节稳定性和其释放游离BAM部分的能力。
还在细胞增殖试验中检验了本发明的示例性肽用作载体部分的能力。将原始的巨噬细胞衍生的细胞用2.5μM所示的核苷类似物或作为与RYF肽的缀合物的类似物在酚红存在下温育48小时。包含分裂细胞的培养物使培养基变澄清，而包含非分裂细胞的培养物的培养基保持深色(活性化合物)。图11呈现了培养物的图像。还通过测定LDH的相对含量来确定生长百分率(图11B)。试验证明了本发明的肽-细胞毒剂缀合物能够杀死肿瘤巨噬细胞(即，原始的巨噬细胞衍生的细胞)，而且所述肽能够将细胞毒剂转运到细胞内，从无活性的化合物转化为有效的细胞毒剂。例如，“ribo”和“tg”(硫鸟嘌呤)化合物在测试浓度下(2.5μm)无效果，但是当与本发明的示例性肽载体(即，RYF)缀合时变得具有强的细胞毒性。
重复试验，以研究L-或D-连接对BAM部分的细胞毒性的影响。将细胞与单独的或以与RYF肽的缀合物形式的3’氨基β-D-阿糖胞苷温育。如图12所证明，化合物仅在以缀合物形式提供时发生内化。此外，令人惊讶地发现，仅有使用D-连接的残基(即，“e”代表D-谷氨酸)是细胞毒性的。这证明了通过L-对映体(即，L-氨基酸)与核苷的糖的3’位的连接能够被蛋白酶除去，将修饰的核苷转化为“正常”核苷(即，具有3’位的-OH，其不能用作链终止剂)。但是，一旦3’位与D-对映体缀合，其不能被蛋白酶除去，而且一旦整合到DNA链中，其能够实现防止DNA的进一步延长。
用3’AdT(3’氨基脱氧胸苷)和3’氨基β-D-阿糖胞苷(Ribo)重复试验。将细胞与单独的各化合物或各化合物与RYF通过L-Glu(E)或D-Glu(e)的N-末端连接的缀合物一起温育。接着将细胞温育72小时，随后测定LDH含量。图13证明了与D-对映体D-谷氨酸(“e”)的连接将无活性的化合物转 化为高度细胞毒性的化合物。
使用MOLT4细胞进行类似试验。MOLT4细胞与所示化合物或化合物与RYF肽的缀合物温育5天。MOLT4细胞团聚在一起，从而能够容易地看到细胞生长。图14显示，与原始的巨噬细胞衍生的细胞类似，RYF-细胞毒剂缀合物在体外杀死了肿瘤细胞。
7.4 模拟C4S-TAT相互作用
本文所述的TAT突变研究证明了残基Arg1、Lys/Arg 3或7、Arg5和Arg9是结合C4S的最重要的残基。此外，比较以其伸展构象的TAT和C4S的3D结构，发现TAT的侧链n和n+3之间的平均距离与C4S的残基n和n+1的硫酸酯和羧酸酯基团之间的距离非常接近(图15)。
这些发现表明，TAT和C4S可能由于TAT和C4S的残基对1/n；3/n+1；5/n+2；7/n+3；和9/n+4各自之间有利的静电相互作用而结合。在所述的A/B对中，A和B分别代表TAT和C4S的残基；参见例如图15和16，其提供了TAT和C4S分子的图示，其中根据本文所用的编号指出这些残基。这些残基间有利的相互作用可以通过两个机制(二者并不必然互相排斥)来解释，取决于TAT的Arg1是否结合带有硫酸酯或羧酸酯基团的糖部分。
由于这两个配偶体的性质、大小和柔性，不可能使用对接软件来确认最可能的结合方式。因此，我们使用由以下组成的策略：(i)从这两个分子的伸展的3D构象异构体开始，(ii)人工定位这些分子以形成如上所述的3个相邻接触(例如3/n+1、5/n+2、7/n+3)；(iii)在300K进行总共600ns的分子动力学(MD)模拟，同时保持所选择的三重相关作用；最后(iv)计算新的相互作用是否在MD模拟期间出现和以何种频率出现。重要的是，在MD模拟的刚开始，TAT和C4S之间没有除所选择的最初相互作用以外的相互作用发生。
支持该方法的推理如下：如果所模拟的由五个主要的相互作用残基对构成的相互作用图是正确的，并且如果例如TAT的Arg1优选结合C4S的硫酸酯化基团，那么从仅有三重相互作用(1/n,3/n+1,5/n+2)的复合物开 始的MD模拟应当导致自发形成更优选的相互作用，例如7/n+3和9/n+4，但是仅在C4S的残基n是硫酸酯化的残基时。
使用CHARMM分子模型包(版本c36b1)模拟TAT和C4S之间的相互作用(Brooks等人,J.Comput.Chem.30(2009),1545-1614)。使用CHARMM22全氢力场来描述TAT肽(序列：RKKRRQRRR)(Mackerell等人,J.Phsy.Chem.B 102(1998),3586-3616)，同时使用SwissParam获得C4S分子的拓扑学和参数(Zoete等人,J.Comput.Chem.32(2011),2359-2368)。建立C4S分子模型，包含10个糖基团，例如图16所图示的那样。
通过人工定位TAT和C4S来产生MD模拟的起始点，使用UCSF嵌合体可视化软件来形成所需的相互作用图，即，包括C4S的三个连续的残基和TAT的3个残基(例如残基1,3,5或3,5,7或5,7,9)(Pettersen等人,J.Comput.Chem.25(2004),1605-1612)。为了在MD模拟期间保持所选择的TAT/C4S残基对之间的相互作用，对其应用“NOE”距离束缚：RMIN和RMAX分别设置5和
Figure BDA0000755574230000721
KMIN设置
Figure BDA0000755574230000722
随后，使用ABNR的5000步最小化该系统。最后，对于每个起始相互作用图，在300K进行一组30个独立的MD模拟，每个20ns长度，以检查是否在TAT和C4S之间发生了另外的相互作用。通过FACTS内含的溶剂化模型(每个溶质的介电常数为1)来估计溶剂作用。对于每个MD模拟，从轨迹资料中提取规则分离的100个框架。对于每个框架，相互作用的残基对被鉴定为具有在小于
Figure BDA0000755574230000723
距离的重原子的那些。最终，根据从每组的30个MD模拟中提取的所有框架对每个可能的相互作用的残基对的频率进行平均。
图17提供了在MD模拟期间形成的相互作用方案的两个例子，分别从TAT分子和C4S之间(A)通过残基1/4、3/5和5/6形成的3个接触开始或(B)通过残基3/4、5/5和7/6形成的3个接触开始。正如所能看出的，在(A)所示例的MD模拟期间，系统自发地在TAT的C端和C4S的很有限的残基之间形成相互作用(参见例如图18A和B)，显著地产生相互作用对7/7和9/8，而这是本文上述假说所预期的。相反，在(B)所示例的MD模拟 期间，仅形成了有限的新相互作用。重要的是，没有形成两个预期的相互作用1/3和9/7。有趣的是，在(A)所示例的MD模拟中，相互作用方案对应于其中Arg1预期与C4S的硫酸酯化残基相互作用的方案，而在(B)所对应的MD模拟中，Arg1预期与C4S的羧酸酯化残基相互作用。
进行了一些其他组的模拟，每个使用不同的相互作用方案。在所述方案包括Arg1与C4S的硫酸酯化残基相互作用的所有情况下，几乎所有根据我们上述假说预期的相互作用都在MD模拟期间自发发生了。相反，当起始方案包括Arg1与C4S的羧酸酯化残基的相互作用时，预期的相互作用没有发生。这些模拟的结果支持了以下假说：TAT和C4S由于残基对1/n、3/n+1、5/n+2、7/n+3和9/n+4之间有利的静电相互作用而发生相互作用，其中C4S的残基n、n+2和n+4是硫酸酯化的部分，残基n+1和n+3是羧酸酯部分。
7.5 本发明的肽作为载体分子在多种细胞系中的应用
在人类癌细胞系的筛选清单中研究了本发明的肽作为载体分子的用途。所述的癌筛选清单的人类肿瘤细胞系在含有5％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中生长。对于标准的筛选试验，将细胞以100μL体积接种到96孔微量滴定板中，接种密度为5,000-40,000个细胞/孔，这取决于各细胞系的倍增时间。在细胞接种后，将微量滴定板在37℃、5％CO2、95％空气和100％相对湿度下温育24小时，随后加入试验药物。
在24小时后，将两个板子的每种细胞系用TCA在原位固定，以提供在药物加入时(Tz)的细胞群体的测定。试验治疗剂以400倍的试验所需最高终浓度溶解在二甲亚砜中，冷冻储存直至使用。在加入治疗剂时，将冷冻浓缩物的等分试样解冻，并用含有50μg/ml庆大霉素的完全培养基稀释至2倍的试验所需最高终浓度。还进行四个进一步的10倍或半对数系列稀释，以提供总共5个试验浓度以及对照。将100μl不同稀释液的等分试样加入适宜的已经含有100μl培养基的微量滴定孔中，得到所需的最终试验浓度。
在加入试验化合物之后，将板子在37℃、5％CO2、95％空气和100％相对湿度下温育48小时。对于贴壁细胞，试验通过加入冷TCA而终止。通过轻柔加入50μl冷的50％(w/v)TCA(终浓度，10％TCA)将细胞在原位固定，在4℃温育60分钟。弃去上清液，将板子用自来水洗涤5次，风干。向各孔加入以0.4％(w/v)在1％乙酸中的溶液的磺基罗丹明B(SRB)溶液(100μl)，并将板子在室温温育10分钟。在染色后，通过用1％乙酸洗涤5次来除去未结合的染料，随后风干。结合的染料随后用10mM氨基丁三醇碱溶解，在自动化读板器上以波长515nm读取吸光度。对于悬浮细胞，方法学与上述相同，除了通过轻柔加入50μl的80％TCA(终浓度，16％TCA)而将沉积细胞固定在孔的底部来终止试验。使用7个吸光度测定[零时(Tz)、对照生长(C)和在5个浓度水平的化合物存在下的试验生长(Ti)]，计算每个化合物浓度水平下的生长百分率。生长抑制百分率计算如下：
对于Ti≥Tz的浓度，[(Ti-Tz)/(C-Tz)]x 100
对于Ti<Tz的浓度，[(Ti-Tz)/Tz]x 100。
表2中提供了每个测试细胞系的计算的生长百分率。
表2
Figure BDA0000755574230000741
Figure BDA0000755574230000751
Figure BDA0000755574230000761
对于每个试验药物也计算了三个剂量-响应参数(数据未显示)。根据[(Ti-Tz)/(C-Tz)]x 100＝50来计算50％的生长抑制率(GI50)，其是在药物温育期间导致对照细胞中净蛋白质增加(通过SRB染色测定)达50％降低时的药物浓度。根据Ti＝Tz来计算导致总生长抑制(TGI)的药物浓度。LC50(导致在药物处理结束时所测定的蛋白质与最初时相比达50％减低的药物浓度)表示处理后的细胞净损失，根据[(Ti-Tz)/Tz]x 100＝-50进行计算。如果达到活性水平，对这三个参数的每一个计算其值；但是，如果效果未达到或者超出，参数的值表示为高于或低于所测试的最高或最低浓度。
如表2所见，试验测试了两个与RYF部分缀合而形成本文所述的BAM缀合物的活性化合物(3'AdT和硫鸟嘌呤)。在60个肿瘤细胞系中检验BAM缀合物的生长抑制(白血病、非小细胞肺癌、结肠癌、CNS癌、黑素瘤、卵巢癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌)。包括一个无活性的缀合物(5’AdT，无活性的核苷类似物)作为阴性对照。在非白血病/淋巴瘤细胞系中使用两倍标准偏差作为强制阈值，以检测生长抑制(低于未处理细胞的85％的生长)。
如所预期的那样，阴性对照不抑制细胞生长：60个细胞系中没有生长低于对照细胞的85％的。这表明本发明的肽在该实验环境下自身不具有生长抑制作用。
在6个白血病/淋巴瘤细胞系中有5个观察到两个活性化合物缀合物的生长抑制作用(3’AdT：平均生长为未处理的71％；硫鸟嘌呤：未处理的44.13％)。相反，在54个其他细胞系中仅有3个显示出低于85％的受抑制生长(3’AdT：平均生长为未处理的98.26％；硫鸟嘌呤：未处理的86.65％)。在白血病细胞系和其他来源的癌细胞系之间的生长抑制的差异对于3’AdT(p＝0.010)和硫鸟嘌呤(p＝0.003)而言是统计学显著的，但是对于阴性对照5’AdT(p>0.05)而言不显著。
生长抑制的响应谱对应于所预期的正常和肿瘤的髓系细胞以及肿瘤淋巴样细胞中CHST11基因和C4S的表达。总而言之，结果证明了本发明的肽选择性地靶向于髓和淋巴谱系的肿瘤细胞，它们都表达CHST11基因并由此表达C4S。
Figure IDA0000755574310000011
Figure IDA0000755574310000021
Figure IDA0000755574310000031
Figure IDA0000755574310000041
Figure IDA0000755574310000051
Figure IDA0000755574310000061
Figure IDA0000755574310000071
Figure IDA0000755574310000081
Figure IDA0000755574310000091
Figure IDA0000755574310000101
Figure IDA0000755574310000111

Claims (16)

1.分子或化合物，其由以下序列构成：
RYF
Figure FDA0002276891860000011
IKYRh(SEQ ID NO：2)；
RYFVRiKYRh
Figure FDA0002276891860000012
RYFvRIKYR(SEQ ID NO：15)；
或
RYFVRiKYR(SEQ ID NO：16)。
2.如权利要求1所述的分子或化合物，其进一步与生物活性部分(BAM)缀合以形成BAM-缀合物。
3.如权利要求2所述的BAM-缀合物，其中所述BAM通过任选的连接基团缀合在所述序列的末端。
4.如权利要求3所述的BAM-缀合物，其中连接基团是L-或D-Glu。
5.如权利要求2所述的BAM-缀合物，其中BAM是通过共价的N-末端酰胺键或C-末端酯键与Arg1或Arg9缀合。
6.如权利要求2所述的BAM缀合物，其中所述BAM是与Arg1和Arg5之间的氨基酸残基或Arg5和Arg9之间的氨基酸残基缀合。
7.如权利要求6所述的BAM缀合物，其中所述缀合是与所述肽序列的内部残基直接缀合或通过连接体基团间接缀合。
8.如权利要求2或3所述的BAM-缀合物，其中BAM是单糖或多糖、细胞毒药物、抗肿瘤药物、抗炎药物、抗病毒剂、抗菌剂或用于治疗原虫感染的药物。
9.如权利要求2或3所述的BAM-缀合物，其中BAM是脱氧核糖或核糖。
10.药物组合物，其包含权利要求2所述的BAM-缀合物。
11.如权利要求10所述的药物组合物，其用于治疗与白细胞相关的病症，所述病症选自肿瘤疾病、炎症疾病、自身免疫疾病、免疫缺陷疾病、病毒感染、细菌感染、原虫或寄生虫感染。
12.如权利要求10或11所述的药物组合物，其用于治疗下述病毒感染引起的疾病：HIV；爱泼斯坦-巴尔病毒；麻疹病毒属；副粘病毒；风疹病毒属；疱疹病毒；登革热病毒；细小病毒属；呼吸道合胞病毒；天花病毒；水痘；黄病毒属；人类嗜T淋巴细胞病毒；甲、乙、丙、丁或戊型肝炎病毒、拉沙病毒或流感病毒。
13.如权利要求10或11所述的药物组合物，其用于治疗单纯疱疹病毒感染引起的疾病。
14.如权利要求10或11所述的药物组合物，其用于治疗利什曼病。
15.如权利要求1所述的分子或化合物用于制备帮助将生物活性分子转运进入髓系细胞内的药物的用途。
16.如权利要求1所述的分子或化合物用于制备药物-肽缀合物的用途。
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