EA015562B1

EA015562B1 - Применение пептидных соединений тро и фармацевтических композиций для лечения анемии

Info

Publication number: EA015562B1
Application number: EA200870261A
Authority: EA
Inventors: Эдвард Дж. Юрков; Брайан Р. Макдональд; Джеффри К. Уэйс
Original assignee: Янссен Фармацевтика Н.В.
Priority date: 2006-02-14
Filing date: 2006-02-14
Publication date: 2011-08-30
Also published as: DK1984014T3; SI1984014T1; NO20083928L; WO2007094781A1; BRPI0621347B1; JP2009526841A; BRPI0621347A2; EP1984014A1; NO341872B1; IL193268A; NZ570124A; PT1984014E; HK1129571A1; NI200800216A; PL1984014T3; HK1125055A1; AU2006338308B2; EP1984014B1; EA200870261A1; CN101374540A

Abstract

Раскрывается способ лечения анемии. Способ включает введение субъекту пептидного соединения ТРО. Также раскрываются фармацевтические композиции, содержащие пептидное соединение ТРО и фармацевтически приемлемый носитель, а также диагностические способы, в которых используются меченые пептидные соединения ТРО.

Description

В настоящем изобретении предлагаются пептидные соединения, которые связываются с тромбопоэтиновым рецептором (с-тр1 или ТРО-Р) и активируют тромбопоэтиновый рецептор (с-тр1 или ТРО-Р) или иным образом действуют как агонисты тромбопоэтина (ТРО). Изобретение имеет приложения в области биохимии и медицинской химии, и, в частности, предлагает использование агонистов ТРО для лечения заболеваний человека. Пептидные соединения по настоящему изобретению могут использоваться для лечения анемии и/или предупреждения развития анемии, и/или поддержания нормальной продукции эритроцитов.

Предпосылки изобретения

Был клонирован и охарактеризован ген, кодирующий ТРО. См. Ки1ег е! а1. Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 91:11104-11108 (1994); Ваг1еу е! а1. Се11 77:1117-1124 (1994); Каизйапзку е! а1. Иа!иге 369:568-571 (1994); \Уепб1шд е! а1. Иа!иге 369:571-574 (1994); и 8ацуаде е! а1. Иа!иге 369:533-538 (1994). ТРО представляет собой гликопротеин, имеющий по крайней мере две формы с кажущимися молекулярными массами 25 кДа и 31 кДа и обычной Ν-концевой аминокислотной последовательностью. См. Вагбеу е! а1. Се11 77:1117-1124 (1994). В ТРО существуют две четко выделяемые области, разделенные потенциальным сайтом расщепления Агд-Агд. Амино-концевая область у человека и мыши высококонсервативна и обладает определенной гомологией с эритропоэтином и интерфероном-а и интерфероном-Ь. Для карбоксиконцевой области характерно широкое видовое разнообразие.

Были описаны последовательности ДНК и кодируемые пептидные последовательности для ТРО-Р человека (также известного как с-тр1). См. У1доп е! а1. Ргос. Иа!1. Асаб. 8сЕ И8А 89:5640-5644 (1992). ТРО-Р входит в семейство рецепторов факторов роста гематопоэтина, которое характеризуется общей структурой внеклеточного домена, включая четыре консервативных С-остатка в Ν-концевой части и мотив \У8Х\У8 (8ЕЦ ΙΌ N0:1) вблизи трансмембранной области. См. Вахап Ргос. Иа!1. Асаб. 8сЕ И8А 87:6934-6938 (1990). Доказательство того, что этот рецептор играет функциональную роль в гематопоэзе, включает результаты наблюдений, указывающие, что его экспрессия у мышей ограничивается селезенкой, костным мозгом или печенью плода (см. 8оиуг1 е! а1. Се11 63:1137-1147 (1990)) и мегакариоцитами, тромбоцитами и клетками СЭ34' у человека (см. Ме1Ыа е! а1. В1ооб 82:1395-1401 (1993)). Некоторые авторы постулируют, что рецептор функционирует как гомодимер, так же как в случае рецепторов С-С8Р и эритропоэтина.

Доступность клонированных генов ТРО-Р упрощает поиск агонистов для этого важного рецептора. Доступность рекомбинантного рецепторного белка позволяет исследовать лиганд-рецепторные взаимодействия в системах произвольной и полупроизвольной генерации разнообразных пептидов. Информация о таких системах приводится в патентах США № 6251864, 6083913, 6121238, 5932546, 5869451, 6506362 и 6465430, а также в С\\'1г1а е! а1., Ргос. Иа!1. Асаб. 8сЕ И8А 87:6378-6382 (1990), каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки.

К морфологически распознаваемым и функционально активным клеткам крови относятся эритроциты, нейтрофильные, эозинофильные и базофильные гранулоциты, В-, Т-, не В-, не Т-лимфоциты и тромбоциты. Эти зрелые гематопоэтические клетки продуцируются и при необходимости заменяются морфологически распознаваемыми делящимися клетками-предшественниками для соответствующих линий, например, эритробласты для эритроцитарного ряда, миелобласты, промиелоциты и миелоциты для гранулоцитарного ряда, и мегакариоциты для тромбоцитов. Клетки-предшественники образуются из более примитивных клеток, которые для простоты можно подразделить на две основные подгруппы: стволовые клетки и клетки-предшественники (см. обзор Вгохтеуег, Н. Е., 1983, Со1опу Аззауз оГ Нета!оро1ейс Ргодепйог Се11з апб Согге1аИопз !о С1шюа1 8йиа!юпз, СРС Спйса1 Реу1е\\· ίη Опсо1оду/Нета!о1оду 1:227-257).

Определения стволовых клеток и клеток-предшественников носят рабочий характер и зависят скорее от функциональных, чем от морфологических критериев. Стволовые клетки обладают высоким потенциалом самообновления или самоподдержания (Еа/Ша, 01ГГегеп(1а(1оп, 14:23 (1979)), необходимое свойство, поскольку отсутствие или истощение этих клеток может приводить к полному истощению одной или нескольких клеточных линий, что в течение короткого времени приведет к заболеванию и смерти. При необходимости происходит дифференциация некоторых стволовых клеток, но при этом ряд других стволовых клеток продуцируют новые стволовые клетки для поддержания популяции этих клеток. Поэтому, кроме поддержания популяции собственного вида, плюрипотентные стволовые клетки способны к дифференциации в несколько сублиний клеток-предшественников с более ограниченной способностью к самовосстановлению или вообще лишенных такой способности. Такие клетки-предшественники, в конечном счете, приводят к морфологически распознаваемым клеткам-предшественникам. Клеткипредшественники способны к пролиферации или дифференциации по одному или нескольким путям миелоидной дифференциации (Еафйа, В1ооб Се11з, 5:447 (1979)).

Различные возбудители инфекций, генетические отклонения и экологические факторы могут вызывать дефицит одного или нескольких типов гематопоэтических клеток. Кроме того, химиотерапия и радиационная терапия, применяемые для лечения рака и некоторых иммунологических нарушений, могут вызывать панцитопении или сочетания анемии, нейтропении и тромбоцитопении. Поэтому увеличение

- 1 015562 или замещение гематопоэтических клеток часто имеет важное значение для успеха такого рода лечений. (Общее обсуждение гематопоэтических нарушений и их причин см., например, в главе Нета!о1оду в 8с1еи!Шс Атепсаи Мебюше, Е. ВиЬеик!еш апб Ό. Еебетшаи, ебк., Уо1ише 2, Сйар!ет 5, 8с1еи!1йс Атепсаи, Хеи Уогк (1996)).

Современным методом лечения, применяемым в случае множества гематологических заболеваний, а также разрушения эндогенных гематопоэтических клеток, вызванных химиотерапией или радиационной терапией, является трансплантация костного мозга. Однако применение трансплантации костного мозга сильно ограничено, поскольку очень редко удается найти идеально соответствующих (генетически идентичных) доноров, кроме случаев, когда есть идентичный близнец или когда клетки костного мозга пациента на стадии ремиссии хранятся в жизнеспособном замороженном состоянии. За исключением таких аутологичных случаев существует определенная степень неизбежного генетического несоответствия, которое приводит к серьезным и иногда летальным осложнениям. Такие осложнения носят двоякий характер. Во-первых, пациент обычно и до начала пересадки утрачивает иммунитет вследствие применения лекарств, призванных исключить иммунное отторжение чужеродных клеток костного мозга (реакция отторжения транспланта хозяином). Во-вторых, после приживления донорских клеток костного мозга, если таковое наступает, они могут атаковать пациента (реакция транспланта против хозяина), которого они рассматривают как чужеродный организм. Даже при близком соответствии доноров из одной семьи такие осложнения частичного несоответствия являются причиной высокой смертности и заболеваемости непосредственно по причине трансплантации костного мозга от генетически отличающегося донора.

Периферическая кровь также исследовалась как возможный источник стволовых клеток для восстановления гематопоэза (Хо!йбитй, V., е! а1. , 1977, 8саиб. 1. Наета1о1. 19:470-481; 8агре1, 8. С, е! а1., 1979, Ехр. Нета!о1. 7:113-120; Вадйатасйаг, А., е! а1., 1983, 1. Се11. Вюсйет. 8ирр1. 7А:78; 1и11пет, С А., е! а1., 1985, Втй. 1. Наета!о1. 61:739-745; АЬгатк, В. А., е! а1., 1983, 1. Се11. Вюсйет. 8ирр1. 7А:53; Ргиттег, 0., е! а1., 1985, Ехр. Нета!о1. 13:891-898). В некоторых исследованиях были получены обнадеживающие результаты для пациентов с различными формами лейкемии (ВеШегк, 1., е! а1., 1986, Ехр. Нета!о1. 14:312315; Оо1бтаи, 1. М. , е! а1., 1980, Вг. 1. Наета!о1. 45:223-231; Т111у, Н., е! а1., 1и1. 19, 1986, Тйе Ьаисе!, рр. 154-155; см. также То, Ь. В. аиб 1ийиет, С. А., 1987, Втй. 1. Наета!о1. 66: 285-288, и приведенные в них ссылки); и с лимфомами (КотЫшд, М. , е! а1., 1986, В1ооб 67:529-532). В других исследованиях, где применялась периферическая кровь, тем не менее не удалось добиться восстановления (Неткйко, С, е! а1.,

1979, Тйе Еаисе! 1:945-947; Осйк, Н. Ό., е! а1., 1981, Реб1а!г. Век. 15:601). В работах также исследовалось применение трансплантации клеток печени плода (Саш, О. В., е! а1., 1986, Ттаи^айайои 41:32-25; Осйк, Н. Ό., е! а1., 1981, Реб1а!г. Век. 15:601; Раще, С 1., е! а1., 1981, 1. Ехр. Меб. 153:154-165; Тоиташе, 1. Ь.,

1980, Ехсегр!а Меб. 514:277; Тоиташе, 1. Ь., 1983, В1Т1Й ЭеГес1к 19:139; см. также Оооб, В. А., е! а1., 1983, Се11и1аг 1ттиио1. 82:44-45 и приведенные в них ссылки) или трансплантации неонатальных клеток селезенки (Уишк, Е. 1., е! а1., 1974, Ргос. Ха!1. Асаб. 8с1. И.8.А. 72:4100) как источника стволовых клеток для восстановления гематопоэза. В экспериментах по восстановлению иммунитета также проводилась трансплантация клеток неонатального тимуса (Уюкегу. А. С, е! а1., 1983, 1. Ратакйо1. 69 (3) :478-485; Ниокаищ К., е! а1., 1982, С1ш. 1ттиио1. 1ттииора!йо1. 22:297-304).

Очевидно, что существует огромная потребность в способах развития клеток крови ш уйто или способах лечения, которые увеличивают продукцию гематопоэтических клеток ш у1уо.

Анемия, которая определяется как уменьшение концентрации гемоглобина в крови, обычно связывается с уменьшением совокупной массы эритроцитов в системе кровообращения. Независимо от причины анемия уменьшает способность крови к переносу кислорода, а в достаточно острых случаях вызывает клинические симптомы и признаки.

С клинической точки зрения анемия характеризуется бледностью кожи и слизистых оболочек, а также проявлениями гипоксии, очень часто слабостью, усталостью, сонливостью или головокружениями. Миокардиальная гипоксия может вызывать гипердинамическую циркуляцию с повышением частоты сердечных сокращений и систолического объема. Могут развиваться систолические шумы, и если анемия довольно острая, может возникнуть сердечная недостаточность.

Анемии обычно классифицируются одним из двух способов: по этиологической классификации (на основании причины) или по морфологической классификации (по изменениям формы и размеров). Этиологическая классификация имеет более широкое применение.

Аллоиммунная гемолитическая анемия возникает, если антитело одного человека реагирует с эритроцитами другого. Аллоиммунная гемолитическая анемия обычно развивается после переливания несовместимых групп крови по АВО и гемолитической болезни новорожденных. Она также может развиваться после аллогенной трансплантации. (НойЬтаиб, А. V. ш Еккеийа1 Нета!о1оду, 3гб. еб., В1аские11 8с1еиййс РиЬйсайоик, 1993, р.90).

Применение некоторых лекарственных средств может вызывать преходящую медикаментозную анемию. Она может возникать по трем механизмам: 1) антитело, направленное против комплекса лекарственное средство-мембрана эритроцита (например, пенициллин или цефалотин); 2) связывание комплемента через комплекс лекарственное средство-белок (антиген)-антитело с поверхностью эритроцита (например, хинидин или хлорпропамид); или 3) аутоиммунная гемолитическая анемия, при которой роль

- 2 015562 лекарственного средства остается неизвестной (например, метил-ДОФА) . В каждом случае анемия исчезает только после отмены приема лекарства (однако в случае метил-ДОФА антитела могут сохраняться в течение многих месяцев). (НоГГЬгапД, А. V. ίη Е88епНа1 Нета!о1о§у, 3гД. еД., В1аск\\с11 δοίοηΙίΓίο РиЬДсаΐΐοπδ, 1993, р.90-1).

Апластическая анемия определяется как панцитопения (анемия, лейкопения и тромбоцитопения), возникающая при аплазии костного мозга. Она классифицируется по первичным типам: врожденная форма (анемия Фанкони) и приобретенная форма без явной способствующей причины (идиопатическая). Вторичные причины могут быть следствием различных промышленных, ятрогенных или инфекционных воздействий. Основной причиной, по-видимому, является существенное снижение числа гематопоэтических плюрипотентных стволовых клеток и дефект остальных стволовых клеток или иммунная реакция против них, делающая их неспособными к делению и дифференциации, достаточной для восполнения популяции костного мозга.

(НоГГЬгапД, А. V. ίη ЕккепДД Нета!о1оду, 3гД. еД., В1аск\\'е11 БаепЦПс РиЬНсаДопк, 1993, р.121). В некоторых случаях обнаруживались Т-клетки супрессоры, а также иммуноглобулины, которые ингибируют эритропоэтин или блокируют дифференциацию гематопоэтических стволовых клеток ш νίΙΐΌ. (АпДгеой, Т. ш ЕккепДак оГ МеДкше, V. В. БаипДегу 1986, р.349).

В работе №е1к е! а1., В1ооД, 90(1):58-63 (1997) показано, что человеческий рекомбинантный ТРО стимулировал восстановление линии эритроцитов у макак-резусов, получивших дозу облучения всего тела 5 Гр (рентгеновское облучение 300 кВ), причем регенерация ретикулоцитов началась на 10 дней раньше, чем у животных, получавших плацебо. В работе №е1к е! а1. также говорится об улучшившихся показателях гемоглобина и гематокрита по сравнению с контролем.

В работе Ваккег е! а1., В1ооД, 89 (9) :3118-3128 (1997) отмечается, что введение РЕС-гНиМСЭЕ с филгастримом увеличивало численность клеток-предшественников в периферической крови пациентов, получавших карбоплатин в дозировке 600 мг/м² и циклофосфамид в дозировке 1200 мг/м².

В работе Рарауаппорои1ои е! а1., Ехр. Нета!о1., 24 (5):660-669 (1996) рассматриваются эффекты воздействия ЕРО и ТРО на ш νίΙΐΌ дифференциацию в отношении эритропоэза и тромбопоэза.

В работе Каикйапкку е! а1., 1. С1ш. 1пуек!., 96(3):1683-1687 (1995) показано, что ТРО проявляет синергизм при действии совместно с ЕРО, приводя к росту эритроидных клеток-предшественников. В работе Каикйапкку е! а1., Ехр. Нета!о1., 24 (2):265-269 (1996) отмечается, что ТРО приводил к росту клетокпредшественников ВЕИ-Е, СЕИ-СМ и СЕИ-Мк у животных с миелосупрессией.

Анемия представляет собой серьезную проблему, что сделало крайне актуальными поиски агониста фактора роста клеток крови, способного предотвратить развитие анемий, обеспечить ее лечение, стимулировать выживание предшественников эритроцитов и/или поддерживать нормальную продукцию эритроцитов. В настоящем изобретении предлагается такой агонист.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к применению определенных низкомолекулярных пептидных соединений для лечения анемии. Определенные низкомолекулярные пептидные соединения обладают свойством прочно связываться с ТРО-К, в состоянии активировать ТРО-К, потенциально позволяя уменьшить побочные эффекты по сравнению с известными агонистами ТРО, и обладают способностью стимулировать продукцию эритроцитов ш у1уо и ш уДго. Низкомолекулярные пептидные соединения могут иметь различные формы, например, мономеры, димеры и олигомеры и/или могут быть связаны с гидрофильным полимером. Соответственно, такие пептидные соединения пригодны для терапевтических целей лечения и/или предупреждения анемии, а также в диагностических целях при исследовании анемии.

Пептидные соединения, пригодные для терапевтических и/или диагностических целей, имеют 1С₅₀примерно 2 мМ или менее, более предпочтительно 2 нМ или менее, как это определяется, например, по анализу связывания ВаГ/3 (обсуждается ниже), где более низкая 1С₅₀ коррелирует с более высокой аффинностью связывания с ТРО-К. Применяемые для фармацевтических целей пептидные соединения предпочтительно обладают 1С₅₀ не более 100 мкМ, более предпочтительно не более примерно 500 нМ, более предпочтительно не более 100 пМ и еще более предпочтительно не более примерно 5 пМ.

Пептидные соединения, пригодные для терапевтических и/или диагностических целей, имеют ЕС50 примерно 2 мМ или менее, предпочтительно 2 нМ или менее, как это определяется с использованием хорошо известных методик в хорошо известных анализах, например, таких как анализ связывания с ВаГ/3 (обсуждается ниже), при котором более низкая ЕС50 коррелирует с более высокой аффинностью связывания с ТРО-К. Применяемые для фармацевтических целей пептидные соединения предпочтительно имеют ЕС₅₀ не более примерно 100 мкМ, более предпочтительно не более примерно 500 нМ, более предпочтительно не более 100 пМ и еще более предпочтительно не более 5 пМ.

Молекулярный вес пептидных соединений составляет от примерно 500 Да до примерно 8000 Да, более предпочтительно от примерно 900 Да до примерно 2000 Да. Если пептидные соединения олигомеризованы, димеризованы и/или связаны с гидрофильным полимером, как это описано в настоящем документе, молекулярный вес такого пептида будет больше и может составлять от примерно 1500 Да до примерно 120000 Да, более предпочтительно от примерно 3000 Да до примерно 80000 Да и еще более пред

- 3 015562 почтительно от примерно 30000 Да до примерно 50000 Да.

Подходящие гидрофильные полимеры включают, среди прочих, полиалкиловые эфиры, например, полиэтиленгликоль и полипропиленгликоль, полимолочную кислоту, полигликолевую кислоту, полиоксиалкены, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, целлюлозу и производные целлюлозы, декстран и производные декстрана и пр., как описано в патентах США № 5672662 и 5869451, полное содержание которых в качестве ссылки включено в настоящий документ.

Если пептидные соединения связаны с гидрофильным полимером, их растворимость и период полужизни в крови увеличиваются, а их иммунногенность маскируется. Упомянутые выше свойства могут достигаться при незначительном снижении их связывающей активности или без такого снижения. Такие гидрофильные полимеры обычно имеют средний молекулярный вес в пределах от примерно 500 Да до примерно 100000 Да, более предпочтительно от примерно 2000 Да до примерно 40000 Да и еще более предпочтительно от примерно 5000 Да до примерно 20000 Да. В предпочтительных вариантах осуществления такие гидрофильные полимеры обладают средним молекулярным весом примерно 5000 Да, 10000 Да и 20000 Да.

Пептидные соединения по настоящему изобретению могут быть связаны или пришиты к таким полимерам с помощью любых методов, приведенных в работах ΖαΙΙίρκΚν. 8., Вюсоп)цда1е Сйет., 6:150-165 (1995); Μοηίατάίηί, С, е! а1., Вюсоп)цда1е Сйет., 6:62-69 (1995); патент США № 4640835; патент США № 4496689; патент США № 4301144; патент США № 4670417; патент США № 4791192; патент США № 4179337 или \νϋ 95/34326, все эти работы полностью включены в текст настоящего документа в качестве ссылок.

В рассматриваемом предпочтительном варианте осуществления пептидные соединения по настоящему изобретению связываются с полиэтиленгликолем (РЕС). РЕС представляет собой линейный, водорастворимый полимер из повторяющихся единиц этиленоксида с двумя концевыми гидроксильными группами. РЕС классифицируются по их молекулярным массам, которые обычно колеблются в пределах от примерно 500 Да до примерно 40000 Да. В рассматриваемом предпочтительном варианте осуществления используемые РЕС имеют молекулярные массы от 5000 Да до примерно 20000 Да. РЕС, связанные с пептидными соединениями по настоящему изобретению, могут быть как разветвленными, так и неразветвленными. (См., например, Могйагйтт С., е! а1., Вюсопщдйе Сйет., 6:62-69 (1995)). РЕС можно приобрести у №к!ат Тйетареийск (Сан-Карло, Калифорния), 81дта Сйетка1 Со. и других компаний. Такие РЕС включают, среди прочих, монометоксиполиэтиленгликоль (МеРЕС-ОН), монометоксиполиэтиленгликольсукцинат (МеРЕС-8), монометоксиполиэтиленгликоль-сукцинимидилсукцинат (МеРЕС-8-ИН8), монометоксиполиэтиленгликольамин (МеРЕС-ИН₂), монометоксиполиэтиленгликоль-трезилат (МеРЕСТКЕ8) и монометоксиполизтиленгликоль-имидазолилкарбонил (МеРЕС-1М).

Вкратце, в одном варианте осуществления используемый гидрофильный полимер, например, РЕС, предпочтительно блокируется по одному концу нереакционноспособной группой, например, метоксиили этоксигруппой. После этого полимер активируется по другому концу посредством реакции с подходящим активирующим агентом, например, галогенангидридами циануровой кислоты (например, хлорангидридом циануровой кислоты, бромангидридом циануровой кислоты или фторангидридом циануровой кислоты, диимидазолом, ангидридами (например, дигалоянтарным ангидридом, например, дибромянтарным ангидридом), ацилазидом, п-диазонийбензиловым эфиром, 3-(п-диазонийфенокси)-2-гидроксипропиловый эфир) и т. п. Активированный полимер затем реагирует с пептидным соединением по настоящему изобретению с образованием пептидного соединения, связанного с полимером. В качестве альтернативы, функциональная группа пептидных соединений по настоящему изобретению может быть активирована реакцией с полимером, или две группы могут быть связаны в ходе синхронной реакции сочетания с использованием известных способов сочетания. Совершенно очевидно, что пептидные соединения по настоящему изобретению могут быть связаны с РЕС с помощью множества других реакционных схем, известных и используемых специалистами в данной области.

При использовании в диагностических целях пептидные соединения предпочтительно маркируются детектируемой меткой и, соответственно, пептидные соединения без такой метки служат в качестве промежуточных веществ для получения меченых пептидных соединений.

К предпочтительным пептидным соединениям относятся обладающие следующими свойствами:

(1) молекулярный вес менее примерно 5000 Да в мономере, димере или олигомере, и (2) аффиностью связывания с ТРО-К, выражаемой через 1С₅₀, составляющим не более примерно 100 мМ, где ноль или более пептидных [--С(О)ИК--] сшивок (связей) замещены непептидными сшивками, например, --СН₂-карбаматной сшивкой |--СН₂--ОС(О)НК--|; фосфонатной сшивкой; --СН₂-сульфонамидной сшивкой [--СН₂--8(О)₂ ΝΚ-]; сшивкой мочевины [ --ΝΗΕ(Ο)ΝΗ--]; сшивкой вторичным амином --СН₂; или алкилированной пептидной сшивкой [--С(О)NК⁶--, где К⁶ представляет собой низший алкил];

пептиды, где Ν-концевая группа связана с группой --ΝΚΚ¹; с группой --ΝΚΕ(Ο)Β; с группой --ΝΚΕ(Ο)ΟΒ; с группой --ΝΚ8(Ο)₂Κ; с группой --ΝΗ^Ο)ΝΗΒ, где К и К¹ представляют собой водород или низший алкил при условии, что К и К¹ оба не являются водородами; с сукцинимидной группой; с бензилоксикарбонил --NΗ--(СВΖ--NΗ--)группой; или с бензилоксикарбонил --ΝΗ—группой, имеющей от

- 4 015562 до 3 заместителей в фенильном кольце, выбираемых из группы, состоящей из низшего алкила, низшего алкокси, хлора и брома; или пептиды, в которых С-концевая группа связывается с (0)К², где К² выбран из группы, состоящей из низшего алкокси, и --ΝΚ³Κ⁴, где К³ и К⁴ независимым образом выбраны из группы, состоящей из водорода и низшего алкила.

Было установлено, что коровое пептидное соединение может содержать последовательность аминокислот (8Ер ГО N0:2):

Х₁Х₂Х₃Х₄Х₅Х₆Х₇, где Х₁ представляет собой С, Ь, Μ, Р, О, V; Х₂ представляет собой Р, К, Ь, Ν, О, К, 8, Т или V; Х₃ представляет собой С, Р, I, Ь, Μ, К, 8, V или ^; Х₄ представляет собой любую из 20 генетически кодируемых Ь-аминокислот; Х₅ представляет собой А, I), Е, О, К, М, О, К, 8, Т, V или Υ; Х₆представляет собой в-(2-нафтил)аланин (2-Να1); и Х₇ представляет собой С, О, I, К, Ь, М, Ν, К или V.

В предпочтительном варианте осуществления коровое соединение содержит последовательность аминокислот (8Ер ГО N0:3):

Х₈ОХ₁Х₂Х₃Х₄Х₅ (2-Να1) Х₇, где Х₁-Х₇ соответствуют определенным выше; и каждый Х₈ остаток независимо выбран из любых 20 генетически кодируемых Ь-аминокислот, их стереоизомерных I)аминокислот; а также не встречающихся в природе аминокислот.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления коровое пептидное соединение содержит последовательность аминокислот (8Ер ГО Ν0:4):

Х9Х₈ОХ1Х2ХзХ4Х5 (2-Ш)Х7, где Х9 представляет собой А, С, Е, О, I, Ь, М, Р, К, р, 8, Т или V; и Х₈представляет собой А, С, I), Е, К, Е, О, К, 8, Т или V. Более предпочтительно Х₉ представляет собой А или I; и Х₈ представляет собой I), Е или К.

Особенно предпочтительным пептидным соединением является (8Ер ГО Ν0:5):

I Е О Ρ Т Е К О (2-Ла1) Е А А К (8аг) где (8аг) представляет собой саркозин.

В другом варианте осуществления пептидное соединение димеризуют или олигомеризуют, чтобы увеличить аффинность и/или активность пептидного соединения. Особенно предпочтительным пептидным соединением является 29-мерный пептид, содержащий два идентичных 14-мера, связанных лизинамидным остатком. Поэтому особенно предпочтительным пептидным соединением является (8Ер ГО Ν0:6, также называемая в настоящем документе соединением № 1 ТРО) :

IЕ О Р Т Ь К О (2-ΝβΙ) Ь А А К (8аг) \

Κ(ΝΗ₂) /

ΙΕ СР ТЬК О (2-ΝβΙ) Ь А АК (8аг)

Более предпочтительным пептидным соединением является связанный с полиэтиленгликолем вариант соединения № 1 ТРО. Связанная с полиэтиленгликолем форма может включать остаток 20000 МРЕО, ковалентно связанный с каждым Ν-концевым изолейцином. Полная молекулярная структура примера такого соединения приведена ниже:

(Это соединение в настоящем документе называется связанным с РЕО соединением № 1 ТРО). Полное химическое название связанного с РЕО соединения № 1 ТРО: метоксиполиэтиленгликоль20000пропионил-Е-изолейцил-Е-глютамил-глицил-Е-пролил-Е-треонил-Е-лейцил-Е-аргинил-Е-глютаминил-Е2-нафтилаланил-Е-лейцил-Е-аланил-Е-аланил-Е-аргинил-саркозил-Хе-(метоксиполиэтиленгликоль 20000-пропионил-Е-изолейцил-Е-глютамил-глицил-Е-пролил-Е-треонил-Е-лейцил-Е-аргинил-Еглютаминил-Е-2-нафтилаланил-Е-лейцил-Е-аланил-Е-аланил-Е-аргинил-саркозил-)лизинамид.

Связанное с РЕО соединение № 1 ТРО состоит из двух одинаковых пептидных цепочек из 14аминокислотных остатков, сшитых лизинамидным остатком и связанных каждой Ν-концевой группой с цепочкой полиэтиленгликоля (РЕО) с приблизительным молекулярным весом 20000 Да. Молекулярный вес родительского пептида без РЕО составляет 3295 Да, а с двумя цепочками РЕО составляет приблизительно 43295 Да. Связанное с РЕО составляет соединение № 1 ТРО имеет сокращенную молекулярную

- 5 015562 структуру (МРВС-11е-С1и-С1у-Рго-Тйг-Ьеи-Агд-С1п-(2-Ма1)-Ьеи-Л1а-Л1а-Агд- (§аг))₂-Ьу8-ИН₂; где (2-Να1) представляет собой в-(2-нафтил)аланин, (8аг) представляет собой саркозин и МРЕС представляет собой метоксиполиэтиленгликоль (Μ^β составляет примерно 20000 Да).

Одно или несколько пептидных соединений, в частности, связанные с РЕС пептидные соединения, включая их последующие фармацевтически приемлемые эквиваленты (вместе называемые в настоящем документе пептидными соединениями, пептидными соединениями ТРО или пептидными соединениями ТРО по настоящему изобретению), пригодны для предупреждения и лечения заболеваний, опосредованных ТРО, и, в особенности, для лечения и/или предупреждения анемии. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способ лечения и/или предупреждения анемии, при котором пациент, страдающий анемией, или пациент, подверженный риску развития анемии, получает или ему вводят терапевтически или профилактически эффективную дозу или количество пептидного соединения по настоящему изобретению.

Изобретение также обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие одно или несколько описанных в настоящем документе пептидных соединений, а также физиологически приемлемый носитель. Такие фармацевтические композиции могут иметь различные формы, в том числе формы для пероральной дозировки, а также порошки для ингаляции, а также растворы и растворы для инъекций и инфузий.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 демонстрирует эффект воздействия связанного с РЕС соединения № 1 ТРО на уровни гемоглобина в соответствии с результатами примера 1.

Фиг. 2 демонстрирует эффект воздействия связанного с РЕС соединения № 1 ТРО на количество эритроцитов в соответствии с результатами примера 1.

Фиг. 3 демонстрирует эффект воздействия связанного с РЕС соединения № 1 ТРО на гематокрит в соответствии с результатами примера 1.

Фиг. 4 демонстрирует эффект воздействия связанного с РЕС соединения № 1 ТРО на вес тела в соответствии с результатами примера 1.

Фиг. 5 демонстрирует эффект воздействия связанного с РЕС соединения № 1 ТРО на уровни гемоглобина в соответствии с результатами примера 2.

Фиг. б демонстрирует эффект воздействия связанного с РЕС соединения № 1 ТРО на количество эритроцитов в соответствии с результатами примера 2.

Фиг. 7 демонстрирует эффект воздействия связанного с РЕС соединения № 1 ТРО на гематокрит в соответствии с результатами примера 2.

Фиг. 8 демонстрирует эффект воздействия связанного с РЕС соединения № 1 ТРО на вес тела в соответствии с результатами примера 2 .

Фиг. 9 демонстрирует эффект воздействия связанного с РЕС соединения № 1 ТРО на уровни гемоглобина в соответствии с результатами примера 3.

Фиг. 10 демонстрирует эффект воздействия связанного с РЕС соединения № 1 ТРО на количество эритроцитов в соответствии с результатами примера 3.

Фиг. 11 демонстрирует эффект воздействия связанного с РЕС соединения № 1 ТРО на гематокрит в соответствии с результатами примера 3.

Фиг. 12 демонстрирует эффект воздействия связанного с РЕС соединения № 1 ТРО на вес тела в соответствии с результатами примера 3.

Фиг. 13 демонстрирует эффект воздействия связанного с РЕС соединения № 1 ТРО на гематокрит в соответствии с результатами примера 4.

Фиг. 14 демонстрирует эффект воздействия связанного с РЕС соединения № 1 ТРО на вес тела в соответствии с результатами примера 4.

Фиг. 15 демонстрирует эффект воздействия связанного с РЕС соединения № 1 ТРО на вес тела в соответствии с результатами примера 5.

На фиг. 16 приводится предполагаемый антианемический механизм действия связанного с РЕС соединения № 1 ТРО.

На фиг. 17 показан ряд предполагаемых эффектов воздействия связанного с РЕС соединения № 1 ТРО на линии гематопоэтических клеток.

Фиг. 18А и фиг. 18В демонстрируют эффект воздействия на тромбоциты и гематокрит мышей, получавших карбоплатин, в результате лечения связанным с РЕС соединением № 1 ТРО в соответствии с результатами примера 6.

Фиг. 19 демонстрирует эффект отложения фибриногена и кровяных сгустков в отделах мозга у мышей, получавших карбоплатин, в результате лечения связанным с РЕС соединением № 1 ТРО в соответствии с результатами примера 6.

Фиг. 20 демонстрирует эффект воздействия связанного с РЕС соединения № 1 ТРО на активацию ТРО-К человека в клетках ВаГ/3 в соответствии с результатами примера 7.

На фиг. 21 показано, что связанное с РЕС соединение № 1 ТРО активировало клетки ВаГ/3, приводя

- 6 015562 к рекомбинантной экспрессии ТРО-К человека в зависимости от дозы в соответствии с результатами примера 7.

Описание конкретных вариантов осуществления

Вводятся следующие формулировки для иллюстрации и определения смысла и охвата различных терминов, используемых для описания изобретения, приведенного в настоящем документе.

Агонистом называют биологически активный лиганд, который связывается со своим комплементарным биологически активным рецептором и активирует последний с тем, чтобы вызвать биологический ответ рецептора или усилить ранее наблюдавшуюся биологическую активность рецептора.

ЕС50 и 50%-ной эффективной концентрацией называют концентрацию агониста, которая вызывает 50% от максимально возможного эффективного ответа данного агониста.

1С₅₀ и 50%-ной концентрацией ингибирования называют концентрацию конкурирующего лиганда, который вытесняет 50% специфически связывающегося агониста.

Фармацевтически приемлемые эквиваленты включают, среди прочих, фармацевтически приемлемые соли, соли, образованные при добавлении кислоты, эфиры, амиды, гидраты, метаболиты, пролекарства и изостеры. Предполагается, что многие фармацевтически приемлемые эквиваленты будут проявлять одинаковую или близкую активность ίη νίίτο или ίη νίνο как и пептидные соединения по настоящему изобретению.

Фармацевтически приемлемыми солями называют нетоксичные соли щелочных металлов, щелочно-земельных металлов и аммония, которые обычно используются в фармацевтической промышленности, в том числе соли натрия, калия, лития, кальция, магния, бария, аммония и протамин-цинка, которые получают с использованием методов, известных специалистам в данной области. Этот термин также охватывает нетоксичные соли, образованные при добавлении кислоты, которые обычно получают при взаимодействии пептидных соединений по настоящему изобретению с подходящей органической или неорганической кислотой. Характерными примерами солей являются гидрохлорид, гидробромид, сульфат, бисульфат, ацетат, оксалат, валерат, олеат, лаурат, борат, бензоат, лактат, фосфат, тозилат, цитрат, малеат, фумарат, сукцинат, тартрат, напсилат и им подобные.

Фармацевтически приемлемыми солями, образованными при добавлении кислоты называют такие соли, которые сохраняют биологическую эффективность и свойства свободных оснований, и которые не являются нежелательными по биологическим или иным соображениям, и которые образуются в реакции с неорганическими кислотами, например, соляной кислотой, бромисто-водородной кислотой, серной кислотой, азотной кислотой, фосфорной кислотой и им подобными, а также органическими кислотами, например, уксусной кислотой, пропионовой кислотой, гликолевой кислотой, пировиноградной кислотой, щавелевой кислотой, яблочной кислотой, малоновой кислотой, янтарной кислотой, малеиновой кислотой, фумаровой кислотой, винной кислотой, лимонной кислотой, бензойной кислотой, коричной кислотой, миндальной кислотой, метансульфоновой кислотой, этансульфоновой кислотой, птолуолсульфоновой кислотой, салициловой кислотой и им подобными. Описание фармацевтически приемлемых солей, образованных при добавлении кислоты, как пролекарств см. Випбдаагб, Н., выше.

Фармацевтически приемлемым эфиром называют такие эфиры, которые при гидролизе эфирной связи сохраняют биологическую активность и свойства карбоновой кислоты или спирта и не являются нежелательными по биологическим или иным соображениям. Описание фармацевтически приемлемых эфиров как пролекарств см. в Випбдаагб, Н., еб., Эс5щп о£ Ргобгидк, Е15су1сг 8с1епее РиЫ18Йег8, Ашйегбаш (1985). Такие эфиры обычно образуются из соответствующей карбоновой кислоты и спирта. Эфир, как правило, может быть получен с помощью стандартных синтетических методик. (См., например, Магсй Αбνаηссб Огдашс СйетШгу, 3гб Еб., ίοΐιη №беу & 8оп§, Ыете Уотк (1985) р.1157 и приведенные ссылки, а также Магк с1 а1. Епсус1ореб1а о£ СНсш1са1 Тес1шо1оду. ίοΐιη №беу & 8оп§, Ыете Уотк (1980)). Спиртовая функция эфира будет обычно представлена (ί) алифатическим спиртом С₂-С₁₂, который содержит или не содержит одну или несколько двойных связей или содержит или не содержит разветвленные углеводородные цепи или (ίί) ароматические или гетероароматические спирты С₇-С₁₂. Настоящее изобретение также предполагает использование таких композиций, которые одновременно являются эфирами, как это описано в настоящем документе, и одновременно представляют собой их фармацевтически приемлемые соли, образованные при добавлении кислот.

Фармацевтически приемлемым амидом называют такие амиды, которые при гидролизе амидной связи сохраняют биологическую активность и свойства карбоновой кислоты или амина и не являются нежелательными по биологическим или иным соображениям. Описание фармацевтически приемлемых амидов как пролекарств см. в Випбдаагб, Н., еб., Эс51дп о£ Ргобгидк, Е15СУ1ег 8с1епсе РиЫкйега, Лш51егбат (1985). Такие амиды обычно образуются из соответствующей карбоновой кислоты и амина. Амид, как правило, может быть получен с помощью стандартных синтетических методик. (См., например, Магсй Αбνаηсеб Огдашс СйетШгу, 3гб Еб., ίοΐιη \УПсу & δοηκ, Ыете Уотк (1985) р. 1152 и Магк с1 а1. Епсус1ореб1а о£ С11с1шса1 Тесйпо1оду, ίοΐιη XVПсу & δοηκ, Ыете Уотк (1980)). Настоящее изобретение также предполагает использование таких композиций, которые одновременно являются амидами, как это описано в настоящем документе, и одновременно представляют собой их фармацевтически приемлемые соли, образованные при добавлении кислот.

- 7 015562

Фармацевтически или терапевтически приемлемым носителем называют среду носителя, которая не влияет на уровень биологической активности действующих ингредиентов и не является токсичной для организма хозяина или пациента.

Стереизомером называют химическое соединение, имеющее такой же молекулярный вес, химический состав и строение, как и другое соединение, но по-другому сгруппированные атомы. То есть определенные химические компоненты имеют различные ориентации в пространстве, а потому в выделенном состоянии обладают способностью вращать плоскость поляризованного света. При этом некоторые чистые стереоизомеры могут обладать столь незначительным оптическим вращением, что его невозможно зарегистрировать с помощью современной аппаратуры. Пептидные соединения по настоящему изобретению могут иметь один или несколько асимметричных атомов углерода, а потому включать несколько различных стереоизомеров. Все такие стереоизомеры составляют предмет по настоящему изобретению.

Терапевтически или фармацевтически эффективным количеством в применении к композициям по настоящему изобретению называют количество композиции достаточное, чтобы вызвать желаемый биологический результат. Таким результатом может быть смягчение признаков, симптомов или причин заболевания или любое иное желаемое изменение в биологической системе. В настоящем изобретении результат обычно будет подразумевать повышение продукции эритроцитов.

Для аминокислотных остатков в пептидах используются следующие сокращения: фенилаланин -РЬе или Е; лейцин -- Ьеи или Ь; изолейцин -- 11е или I; метионин -- Ме! или М; валин --Уа1 или V; серин -8ег или 8; пролин -- Рго или Р; треонин --ТЬг или Т; аланин -- А1а или А; тирозин -- Туг или Υ; гистидин - Нк или Н; глутамин -- С1и или О; аспарагин -- Ави или Ν; лизин -- Ьув или К; аспарагиновая кислота -Авр или Ό; глутаминовая кислота -- С1и или Е; цистеин -- Сув или С; триптофан -- Тгр или \; аргинин -Агд или В; и глицин -- С1у или С. Кроме того, Ви -- бутокси, Βζ1 -- бензил, СНА --циклогексиламин, Ас -ацетил, Ме -- метил, Реп -пеницилламин, А1Ь - аминоизомасляная кислота, Ννα -- норвалин, АЬи аминомасляная кислота, ТЫ -- тиенилаланин, ОВп -- о-бензил и Ьур -- гидроксипролин.

В добавление к пептидам, содержащим лишь природные аминокислоты, также приводится информация для пептидомиметиков или пептидных аналогов. Пептидные аналоги обычно используются в фармацевтической отрасли как непептидные лекарства со свойствами, аналогичными модельному пептиду. Такие типы непептидных соединений называются пептидными миметиками или пептидомиметиками (ЕаисЬеге, 1. Абу. Эгид Вев. 15:29 (1986); VеЬе^ апб Еге1бшдег ΉΝ8 р.392 (1985); и Еуапв е! а1. 1. Меб. СЬет. 30:1229 (1987), которые в качестве ссылки включены в настоящий документ). Пептидные миметики, которые структурно подобны терапевтически применяемым пептидам, могут использоваться для получения эквивалентного или усиленного терапевтического или профилактического эффекта.

Пептидомиметики, как правило, структурно подобны модельному полипептиду (то есть полипептиду, который обладает биологической или фармакологической активностью), например, природному полипептиду, связывающемуся с рецептором, но при этом одна или несколько пептидных связей в их молекулах заменяется связью, выбираемой из группы, в которую входят: --СН₂МН--, --СН₂8--, --СН₂--СН₂--, --СН=СН-- (цис и транс), — СОСН₂--, --СН(ОН)СН₂-- и --СН₂8О--, с помощью методов, известных специалистам в данной области и более подробно изложенных в следующих работах: 8ра!о1а, А. Е. ш СЬетк!гу апб ВюсЬетк!гу о£ Атшо Ас1бв. Рерббев, апб Рго!ешв, В. \Уешв1еш. ебв. , Магсе1 Эеккег. Νον Υογ1<. р.267 (1983); 8ра!о1а, А. Е., Vеда Эа1а (МагсЬ 1983), νο1.1, 1ввие 3, Рерйбе ВаскЬопе МобШса!юпв (общий обзор); Мог1еу, Тгепбв РЬагт 8с1 (1980) рр. 463-468 (общий обзор); Нибвоп, Ό. е! а1., 1п! 1 Рер! Рго! Вев 14:177-185 (1979) (--СН₂к1Н--, СН₂СН₂--); 8ра!о1а е! а1. ЫЕе 8с 38:1243-1249 (1986) (--СН₂--8) ; Напп 1. СЬет. 8ос Регкш Тгапв. I 307-314 (1982) (--СН--СН--, цис и транс); А1тцик! е! а1. 1. Меб. СЬет. 23:13921398 (1980) (--СОСН2--) ; Лепптдв-АбШе е! а1. Те!гаЬебгоп Ьей 23:2533 (1982) (--СОСН2--) ; 8ζе1ке е! а1. Еигореап Арр1п. ЕР 45665 СА (1982): 97:39405 (1982) (--СН(ОН)СН₂--); Но11абау е! а1. Те!гаЬебгоп Ье!! 24:4401-4404 (1983) (--С(ОН)СН₂--); и НгиЬу Ьйе 8с 31:189-199 (1982) (--СН₂--8--); каждая из которых включена в настоящий документ в качестве ссылки. Особенно предпочтительной непептидной связью является --СН₂№Н--. Такие пептидомиметики могут иметь значительные преимущества по сравнению с другими применениями полипептидов, в том числе, например: более экономически выгодное производство, более высокая химическая стабильность, усиление фармакологических свойств (время полужизни, абсорбция, активность, эффективность и пр.), модифицированная специфичность (например, широкий спектр биологической активности), пониженная антигенность и прочие.

Введение метки в пептидомиметики обычно подразумевает ковалентное присоединение одной или нескольких меток, напрямую или через спейсер (например, амидную группу); в не оказывающее воздействия положение (положения) в структуре пептидомиметика, которые прогнозируются по данным количественного моделирования структура-активность и/или молекулярного моделирования. К таким не оказывающим воздействия положениям обычно относятся положения, которые не вступают в прямой контакт с макромолекулой (макромолекулами) (например, молекулами суперсемейства иммуноглобулинов) , с которыми связываются пептидомиметики для достижения терапевтического эффекта. Получение производных (например, введение метки) пептидомиметиков не должно существенно влиять на желаемую биологическую или фармакологическую активность пептидомиметика. Как правило, пептидомиметики связывающихся с рецептором пептидов связываются с рецептором с высокой аффинностью и обладают

- 8 015562 поддающейся обнаружению биологической активностью (то есть являются агонистами или антагонистами одного или нескольких опосредованных рецепторами фенотипических изменений).

Систематическое замещение одной или нескольких аминокислот консенсусной последовательности Ό-аминокислотой того же типа (например, Ό-лизин вместо Ь-лизина) может использоваться для получения более стабильных пептидов. Кроме того, пептиды с ограничениями, включающие консенсусную последовательность или в значительной мере идентичные вариации консенсусной последовательности могут быть получены методами, известными специалистам в данной области (Κίζο аиб Сйегакей Αηη. Κον. Вюейет. 61:387 (1992), в качестве ссылки включается в настоящий документ); например, посредством добавления внутренних остатков цистеина, способных к образованию внутримолекулярных дисульфидных мостиков, которые приводят к циклизации пептида.

Детектируемой меткой называют функциональные группы, которые при ковалентном связывании с пептидными соединениями по настоящему изобретению позволяют детектировать пептидное соединение ίη νίνο в организме пациента, которому было введено пептидное соединение. Подходящие детектируемые метки хорошо известны специалистам в данной области и, например, включают радиоизотопы, флуоресцентные метки (например, флуоресцеин) и пр. Выбор конкретной используемой детектируемой метки не имеет особого значения и производится с учетом количества используемой метки, а также токсичности метки при ее используемом количестве. Выбор метки с учетом таких факторов хорошо известен специалистам в данной области.

Ковалентное связывание детектируемой метки с пептидным соединением достигается с помощью общепринятых методов, хорошо известных специалистам в данной области. Например, если в качестве детектируемой метки используется радиоизотоп ¹²⁵1, ковалентное связывание ¹²⁵1 с пептидным соединением может достигаться включением аминокислоты тирозина в структуру пептидного соединения с последующим иодированием пептидного соединения. Аналогичным образом, в пептидное соединение может быть включен ³²Р в форме фосфатной функции через, например, гидроксильную группу пептидного соединения с помощью стандартных химических методов.

Настоящее изобретение обеспечивает пептидные соединения, которые связываются с ΤΡΟ-Κ и активируют его или иным образом ведут себя как агонист ТРО. К таким пептидным соединениям относятся основные пептидные соединения и эквивалентные или производные пептидные соединения, сконструированные таким образом, чтобы обладать такой же или сходной молекулярной структурой или формой, как и основные пептидные соединения, но отличаться от основных пептидных соединений либо по подверженности гидролизу или протеолизу и/или по другим биологическим свойствам, например, повышенной аффинностью по отношению к рецептору. Настоящее изобретение также обеспечивает композиции, содержащие эффективное количество агониста ТРО и, в частности, пептидного соединения, которое применяется для лечения анемии.

Пептидные соединения по настоящему изобретению могут также вводиться теплокровным животным, включая человека, для активации ΤΡΟ-Κ ίη νίνο. Таким образом, настоящее изобретение охватывает способы терапевтического лечения анемии, которые включают введение пептидного соединения по настоящему изобретению в количествах, достаточных для имитации эффектов ТРО на ΤΡΟ-Κ ίη νίνο.

Активность пептидных соединений по настоящему изобретению может оцениваться ίη νίίτο или ίη νίνο, например, с помощью одной из многих моделей, описанных в работе ΜοΟοη;·ι16 Ат. 1. οί Ρο6ίαΐΓΐο Ηοιηαίοίοβν/Οηοοίοβν 14:8-21 (1992), которая в качестве ссылки включается в настоящий документ, а также методов анализа, приведенных в настоящем документе.

Согласно одному из вариантов осуществления композиции по настоящему изобретению пригодны для лечения анемии, связанной с пересадками костного мозга, радиационной терапией или химиотерапией. Пептидные соединения обычно будут вводиться профилактически до химиотерапии, радиационной терапии или трансплантации костного мозга или после указанной процедуры.

Соответственно, настоящее изобретение также представляет фармацевтические композиции, содержащие в качестве активного ингредиента по крайней мере одно пептидное соединение по настоящему изобретению вместе с фармацевтическим носителем или разбавителем. Пептидные соединения по настоящему изобретению могут вводиться перорально, пульмонально, парентерально (внутримышечная, внутрибрюшинная, внутривенная (в/в) или подкожная инъекция), ингаляционно (в форме состава в мелком порошке), чрезкожно, назально, вагинально, ректально или сублингвально и могут готовиться в лекарственных формах в соответствии с каждым методом введения. См., например, Вегпйет οί а1. РСТ ΡαίеШ Ριιόΐίοηίίοη № \¥Ο 93/25221; Ρίίί еί а1. ΡСΤ Ρаίеηί Ριιόΐίοηίίοη № \¥Ο 94/17784; и Ρίίί еί а1. Εи^ορеаη ΡαίеЩ Αρρίίοηίίοη 613,683, каждый из которых в качестве ссылки включен в настоящий документ.

К твердым лекарственным формам для перорального применения относятся капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых лекарственных формах активное пептидное соединение предварительно смешивается по крайней мере с одним фармацевтически приемлемым носителем, например, сахарозой, лактозой или крахмалом. Такие лекарственные формы в соответствии с нормальной практикой могут также включать дополнительные вещества, кроме инертных разбавителей, например, смазывающие вещества, такие как стеарат магния. В случае капсул, таблеток и пилюль лекарственные формы также могут включать буферные вещества. Таблетки и капсулы могут также готовиться с кишеч

- 9 015562 норастворимыми покрытиями.

Жидкие лекарственные формы для перорального введения включают фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы, причем такие эликсиры содержат инертные разбавители, обычно используемые в фармакологии, например, воду или физиологический раствор. Кроме таких инертных разбавителей, композиции могут также включать адъюванты, например, смачивающие вещества, эмульгаторы и суспендирующие вещества, а также подсластители, вкусовые вещества и ароматизаторы.

Препараты по настоящему изобретению для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии или эмульсии. Примерами неводных растворителей или носителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, например, оливковое масло и кукурузное масло, желатин, а также инъецируемые органические эфиры, например, этилолеат. Такие лекарственные формы также могут содержать адъюванты, например, консерванты, смачивающие, эмульгирующие и диспергирующие вещества. Их можно стерилизовать, например, фильтрацией через фильтр, задерживающий бактерии, посредством введения в состав стерилизующих веществ, облучением композиций или их нагреванием. Их можно также готовить с использованием стерильной воды или какой-либо другой стерильной инъецируемой среды, добавляемой непосредственно перед применением.

Композиции для ректального или вагинального введения предпочтительно представляют собой суппозитории, которые могут содержать, кроме активного соединения, наполнители, например, масло какао или восковой суппозиторий. Композиции для назального или сублингвального введения также готовятся с помощью стандартных наполнителей, хорошо известных специалистам в данной области.

Композиции по настоящему изобретению могут также микроинкапсулироваться, например, с помощью метода, предложенного в работе Тюе апй В1Ы (ίη ТгеаНке оп Соп!го11ей Эгид ЭеНуегу, ей. А. Куйошеик, Магсе1 Эеккег, Ν.Υ. (1992), рр.315-339).

Композиции, содержащие пептидное соединение, могут вводиться в целях профилактики и/или терапевтического лечения. В терапевтических целях композиции вводят пациенту, уже страдающему заболеванием, как это описано выше, в количестве, достаточном для лечения или по крайней мере частичного купирования симптомов заболевания и его осложнений. Достаточное для этого количество определяется как терапевтически эффективная доза. Количества, эффективные для такого применения, будут зависеть от остроты заболевания, веса и общего состояния пациента.

В профилактических целях композиции, содержащие пептидные соединения по настоящему изобретению, вводят пациенту, восприимчивому или подверженному риску конкретного заболевания. Такое количество определяется как профилактически эффективная доза. При таком применении точное количество опять-таки зависит от состояния здоровья и веса пациента.

Количества агониста ТРО, необходимые для эффективной терапии, будут зависеть от многих различных факторов, в том числе способов введения, целевого сайта, физиологического состояния пациента и других вводимых медикаментозных средств. Поэтому для оптимизации безопасности и эффективности необходимо титровать лечебные дозировки. Как правило, дозировки, используемые ш νίΙΐΌ. могут быть полезным указанием в отношении количеств, применяемых для введения этих реагентов ш кйи. Исследования на животных эффективных доз для лечения конкретных заболеваний будут дополнительным прогнозирующим указанием дозировок для человека. Различные соображения приводятся, например, в работе Сйша'п е1 а1. (ейк), Соойтап апй Сйтап'к: ТНе РНагтасо1од1са1 Ваык оГ ТНегареийск, 8(Н ей. , Регдатоп Ргекк (1990); и КеттдЮп'к РНагтасеи11са1 8аепсек, 7111 ей., Маск РиЬНкЫпд Со., Еак!оп, Ра. (1985); каждая из которых в качестве ссылки включена в настоящий документ.

Пептидные соединения по настоящему изобретению эффективны для лечения анемии при введении в диапазоне дозировок от примерно 1 мкг до примерно 300 мкг/кг веса тела в день. Конкретная применяемая доза зависит от способа введения, а также от мнения наблюдающего врача с учетом таких факторов, как тяжесть состояния, возраст и общее состояние пациента и пр.

Примеры модели на животных

Наблюдались эффекты воздействия связанного с РЕС соединения № 1 ТРО на мышей, получавших карбоплатин. Во всех приведенных в настоящем документе примерах готовили исходный раствор 10 мг/мл связанного с РЕС соединения № 1 ТРО в стерильном физиологическом растворе. Для смешения препарат помещали в ротационный шейкер на 15 мин при 200 об/мин. Этот метод использовался для растворения связанного с РЕС соединения № 1 ТРО без пенообразования. Исходный раствор фильтровали через фильтр СУ МШех (0,22 мкм) . Из полученного исходного раствора затем готовили растворы для введения с использованием стерильного физиологического раствора. Исходный раствор и растворы для введения готовились свежими в день введения.

Пример 1.

Наблюдалось воздействие связанного с РЕС соединения № 1 на продолжительность и остроту анемии после введения мышам карбоплатина, которое определялось по изменениям уровней гемоглобина, эритроцитов и гематокрита. В этом исследовании нарастающие количества связанного с РЕС соединения № 1 вводились мышам через день после дозы карбоплатина, чтобы выяснить возможный зависимый от дозы эффект воздействия на различные параметры эритроцитов.

Группы мышей получали карбоплатин или носитель (фосфатный буферный физиологический рас

- 10 015562 твор, РВ8) посредством внутрибрюшного введения на -2-й и -1-й день, как указано ниже. Ранее было показано, что оптимальной дозой карбоплатина, используемой для формирования тромбоцитопении у мышей линии ВАЬВ/с, была фракционированная суммарная доза 120 мг/кг, вводимая во время двух последовательных ежедневных инъекций (то есть 2x60 мг/кг). Через день после второй дозы карбоплатина группы мышей получали связанное с РЕО соединение № 1 или носитель (стерильный физиологический раствор, 88, без консервантов, 0, 9% хлорида натрия) в форме в/в (болюсной) инъекции, как указано в таблице 1. Доза вводилась по весу (100 мкл/10 г веса тела).

Таблица 1

Группы испытаний:
Группа	№	Премедикация (в/б), День-2 и -1	Тестируемый препарат	Доза (в/в) День 0	Анализ крови
1	10	Носитель (РВ8)	Носитель (88)	Симуляция	Эвтаназия 5 мышей на 5-й и 11-й день
2	20	Карбоплатин	Носитель (88)	Симуляция	Эвтаназия 5 мышей на 5-й, 7-й, 9-й и 11-й день
3	20	Карбоплатин	Связанное с РЕО соединение № 1 ТРО	300 мкг/кг	Эвтаназия 5 мышей на 5-й, 7-й, 9-й и 11-й день
4	20	Карбоплатин	Связанное с РЕО соединение №1 ТРО	1000 мкг/кг	Эвтаназия 5 мышей на 5-й, 7-й, 9-й и 11-й день
5	20	Карбоплатин	Связанное с РЕО соединение № 1 ТРО	3000 мкг/кг	Эвтаназия 5 мышей на 5-й, 7-й, 9-й и 11-й день

На 5-й, 7-й, 9-й и 11-й день пять мышей из каждой группы взвешивали и умерщвляли с использованием асфиксии в СО₂, после чего обескровливали посредством пункции сердца. Образцы крови переносились в отдельные микроконтейнеры с ΕΌΤΆ (с лиловой крышкой) для гематологического анализа. Обработку групп контрольных мышей (5) проводили на 5-й и 11-й день. Результаты приводятся на фиг. 1-4. Данные представлены графически как среднее по группе +СОС.

Введение мышам одного только карбоплатина вызывало примерно 20% уменьшение уровней гемоглобина у мышей на 11-й день. Такое уменьшение ингибировалось введением любых доз связанного с РЕО соединения №1 ТРО. Незначительные сокращения числа эритроцитов и гематокрита также связывались с введением карбоплатина, этот эффект ингибировался введением связанного с РЕО соединения № 1 ТРО; однако статистическая оценка такого воздействия не проводилась. Мыши во всех группах, получавшие только карбоплатин или карбоплатин с различными дозами связанного с РЕО соединения № 1 ТРО, теряли вес на 5-й, 7-й и 9-й день по сравнению с показателями веса тела, полученными в день 0. Анализ измерений веса тела в подгруппе мыщей за 11-дневный период исследования показывает, что наблюдаемое снижение веса тела было вызвано введением одного только карбоплатина и что связанное с РЕО соединение № 1 ТРО стимулировало восстановление утраченного веса тела при всех проверенных дозах.

У мышей, получавших только карбоплатин, на 5-й день начиналось проявление изменений во внешнем виде и поведении. Некоторые из мышей становились сгорбленными и выглядели вялыми. У многих мышей также отмечались загрязнения в аногенитальных областях. Введение связанного с РЕО соединения № 1 ТРО отсрочивало проявление, уменьшало частоту и остроту этих симптомов, с очевидной зависимостью от дозы.

Пример 2. Анализировалась возможность того, что связанное с РЕО соединение № 1 ТРО в состоянии сенсибилизировать гематопоэтические стволовые клетки костного мозга мышей по отношению к токсическим эффектам введения карбоплатина. В таком исследовании доза связанного с РЕО соединения № 1 ТРО вводилась мышам за семь дней до дозы карбоплатина или сразу же после введения крабоплатина. Дополнительная группа получала связанное с РЕО соединение № 1 ТРО как до, так и после введения карбоплатина. Также наблюдался эффект воздействия таких схем дозировки на гематологические параметры.

Группы мышей получали карбоплатин или носитель (фосфатный буферный физиологический раствор, РВ8) посредством в/б введения на 7-й и 8-й день, как указано ниже. Ранее было показано, что оптимальной дозой карбоплатина, используемой для формирования тромбоцитопении у мышей линии ВАЬВ/с, была фракционированная суммарная доза 120 мг/кг, вводимая во время двух последовательных ежедневных инъекций (то есть 2x60 мг/кг). За семь дней до первой дозы карбоплатина или через 1 (один) час после второй дозы карбоплатина группы мышей получали связанное с РЕО соединение № 1 ТРО (300 мкг/кг) или носитель (стерильный физиологический раствор, 88, без консервантов, 0,9% хлорида натрия) посредством в/в (болюсной) инъекции, как указано в таблице 2. Дополнительная группа получала связанное с РЕО соединение № 1 ТРО как до (день 0), так и после (8-й день, 1=1 ч) дозы карбоплатина. Все дозы вводились по весу (100 мкл/10 г веса тела).

- 11 015562

Таблица 2

Структура исследования:
Группа	№	Доза (в/в) День 0	Карбоплатин (СВРЬ) [60 мг/кг, 2 р/д], (в/б), 7-й и 8-й день	Доза (в/в) 8-й день (1 ч после 2^й дозы СВРЬ)	Отбор крови Эвтаназия 5 мышей в следующие дни
1	10	Носитель (*88)	Носитель (РВ8)	Носитель (*88)	14-й и 26-й
2	20	Носитель (*88)	Карбоплатин	Носитель (*88)	14-й, 18-й, 22-й и 26-й
3	20	Связанное с РЕО соединение № 1 ТРО 300 мг/кг	Карбоплатин	Носитель (*δδ)	14-й, 18-й, 22-й и 26-й
4	20	Носитель (*88)	Карбоплатин	Связанное с РЕО соединение № 1 ТРО 300 мкг/кг	14-й, 18-й, 22-й и 26-й
5	20	Связанное с РЕО соединение № 1 ТРО 300 мг/кг	Карбоплатин	Связанное с РЕО соединение № 1 ТРО 300 мкг/кг	14-й, 18-й, 22-й и 26-й

На 14-й, 18-й, 22-й и 26-й день пять мышей из каждой группы взвешивали и умерщвляли с использованием асфиксии в СО₂, после чего обескровливали посредством пункции сердца. Образцы крови переносились в отдельные микроконтейнеры с 1Т)ТА (с лиловой крышкой) для гематологического анализа. Обработку групп контрольных мышей (5) проводили на 14-й и 26-й день. Результаты приводятся на фиг. 5-8. Данные представлены графически как среднее группы + СОС.

Введение мышам только карбоплатина вызвало снижение (примерно 18%) уровней гемоглобина, числа эритроцитов и гематокрита у выживших мышей на 18-й и 22-й день по сравнению с контрольными группами. Таким уменьшениям препятствовало введение связанного с РЕО соединения № 1 ТРО на 8-й день (через 1 час после второго введения карбоплатина) без или с дополнительной дозой связанного с РЕО соединения № 1 ТРО в день 0; однако введение связанного с РЕО соединения № 1 ТРО в день 0 (только) не оказывало воздействия на вызванные карбоплатином изменения в указанных параметрах эритроцитов.

У всех мышей в контрольной группе отмечалось нормальное увеличение веса в период с 7-го по 26-й день, тогда как все мыши, получавшие только карбоплатин, за тот же период времени демонстрировали незначительное снижение веса тела (в среднем примерно 4%). Мыши во всех группах, которые получали карбоплатин и различные дополнительные дозировки связанного с РЕО соединения № 1 ТРО, либо сохранили вес тела, либо демонстрировали нормальный привес в период с 7-го по 2 6-й день. Анализ измерений веса тела за период исследований показывает, что введение карбоплатина вносило основной вклад в наблюдаемое снижение веса тела и что дополнительное введение связанного с РЕО соединения № 1 ТРО препятствовало такой потере веса, однако статистический анализ полученных данных не проводился. Различия в весе тела, регистрировавшиеся в период с 7-го дня (до введения карбоплатина) до 26-го дня (завершение исследования), представлены на фиг. 8.

Все мыши в контрольных группах имели нормальный внешний вид в течение всего периода исследования. У мышей, получавших только карбоплатин, уже на 12-й день начинали появляться признаки измененного внешнего вида и поведения, они часто выглядели сгорбленными и взъерошенными. Многие из мышей, получавших карбоплатин (без связанного с РЕО соединения № 1 ТРО или при его введении) становились сгорбленными и выглядели взъерошенными в течение второй половины периода исследования. Введение связанного с РЕО соединения № 1 ТРО на 8-й день без или с дополнительным введением в день 0, очевидно, задерживало проявление таких симптомов, а введение на 0-й и 8-й день также снижало их остроту и продолжительность; однако подробный анализ эффектов введения на системные наблюдения не проводился.

Пример 3. Наблюдалось воздействие связанного с РЕО соединения № 1 ТРО на продолжительность и остроту анемии после схем применения, в рамках которых связанное с РЕО соединение № 1 ТРО вводилось в различные моменты времени после введения карбоплатина. Для такого исследования определенное количество связанного с РЕО соединения № 1 ТРО вводилось мышам через 1 (один) час, 1 (один) день или 4 (четыре) дня после дозы карбоплатина.

Группы мышей получали либо карбоплатин, либо носитель (фосфатный буферный физиологический раствор, РВ8) посредством в/б введения на 0-й и -1-й день, как указано ниже. Ранее было показано, что оптимальной дозой карбоплатина, используемой для формирования тромбоцитопении у мышей линии ВАГВе, была фракционированная суммарная доза 120 мг/кг, вводимая во время двух последовательных ежедневных инъекций (то есть 2x60 мг/кг). Через один час (день 0), один день (1-й день) или четыре дня (4-й день) после второй дозы карбоплатина группы мышей получали связанное с РЕО соединение № 1 ТРО (300 мкг/кг) или носитель (стерильный физиологический раствор, 88, без консервантов, 0,9% хлорида натрия) посредством в/в (болюсной) инъекции, как показано в таблице 3. Доза вводилась исходя из веса (100 мкл/10 г веса тела).

- 12 015562

Таблица 3

Группы испытаний:
Группа	№	Премедикация [2x60 мг/кг], (в/б), 1-й и 0-й день	Тестируемый препарат	Доза (в/в)	Отбор крови Эвтаназия 5 мышей
1	10	Носитель (РВ8)	Носитель (88)	Симуляция	6-й и 12-й дни
2	20	Карбоплатин	Носитель (88)	Симуляция	6-й, 8-й, 10-й и 12-й дни
3	20	Карбоплатин	Связанное с РЕО соединение № 1 ТРО	300 мкг/кг, 0-й день	6-й, 8-й, 10-й и 12-й дни
4	20	Карбоплатин	Связанное с РЕО соединение № 1 ТРО	300 мкг/кг, 1-й день	6-й, 8-й, 10-й и 12-й дни
5	20	Карбоплатин	Связанное с РЕО соединение № 1 ТРО	300 мкг/кг, 4-й день	6-й, 8-й, 10-й и 12-й дни

На 6-й, 8-й, 10-й и 12-й день пять мышей из каждой испытательной группы взвешивали и умерщвляли с использованием асфиксии в СО₂, после чего обескровливали посредством пункции сердца. Образцы крови переносились в отдельные микроконтейнеры с Е1)ТА (с лиловой крышкой) для гематологического анализа. Обработку групп контрольных мышей (5) проводили на 6-й и 12-й день. Результаты приводятся на фиг. 9-12. Данные представлены в графическом виде как среднее по группе + СОС.

Введение мышам только карбоплатина вызвало резкое снижение (примерно 47%) уровней гемоглобина, числа эритроцитов и гематокрита у выживших на 12-й день мышей (2 мыши) по сравнению с контрольными группами. Такому снижению препятствовало введение связанного с РЕО соединения № 1 ТРО на день 0 (1 час после введения карбоплатина) и в 1-й день; однако, введение связанного с РЕО соединения № 1 ТРО на 4-й день не оказало воздействия на вызванные карбоплатином изменения в указанных параметрах эритроцитов.

Мыши во всех группах, получавшие только карбоплатин или карбоплатин вместе с различными дозами связанного с РЕО соединения № 1 ТРО, на 6-й, 8-й, 10-й и 12-й день теряли в весе по сравнению с измерениями массы тела, проведенными в -1-й день. Анализ измерений веса тела за период исследований показывает, что карбоплатин был основным фактором наблюдаемых снижений веса тела. Введение связанного с РЕО соединения № 1 ТРО в 0-й, 1-й или 4-й день, очевидно, не оказывало воздействия на потерю веса, вызванную введением карбоплатина, однако статистический анализ полученных данных не проводился. Снижения веса тела, наблюдаемые в период с -1-го по 10-й день, приведены на фиг. 11.

Все мыши контрольных групп в течение периода исследований выглядели нормально. У мышей, получавших только карбоплатин, уже на 2-й день начинали появляться признаки измененного внешнего вида и поведения, они часто выглядели сгорбленными и взъерошенными. Многие из мышей, получавших карбоплатин (без связанного с РЕО соединения № 1 ТРО или при его введении), становились сгорбленными и выглядели взъерошенными в течение второй половины периода исследования. У некоторых из этих мышей также были загрязненные аногенитальные области. К другим редким проявлениям относились истощенный внешний вид, отеки век и аномальное недержание. Очевидно, что введение связанного с РЕО соединения № 1 ТРО не оказывало заметного воздействия на развитие, частоту или остроту таких симптомов, однако подробный анализ этих данных не проводился.

Предупреждение развития вызванной карбоплатином анемии наблюдалось в том случае, если животным вводили связанное с РЕО соединение № 1 ТРО в течение 24 ч после химиотерапии. Эти данные показывают, что связанное с РЕО соединение № 1 ТРО обладает свойствами миелопротектора, которые не ограничиваются линиями мегакариоцитов.

Пример 4.

Наблюдалась способность связанного с РЕО соединения № 1 ТРО выступать в качестве фактора выживания для линий мегакариоцитов и эритроцитов у мышей, получавших карбоплатин, которая определялась по изменениям гематологических параметров. В проведенных выше исследованиях было показано, что дозы связанного с РЕО соединения № 1 ТРО уже в 300 мкг/кг предупреждают развитие анемии, вызванной карбоплатином. В настоящем исследовании проверялось воздействие более низких доз связанного с РЕО соединения № 1 ТРО (например, 30, 100 и 300 мкг/кг) на выживаемость линий эритроцитов, чтобы охарактеризовать зависимый от дозы отклик для такого эффекта.

Группы мышей получали карбоплатин или носитель (фосфатный буферный физиологический раствор, РВ8) посредством в/в введения в -1-й и 0-й день, как указано ниже. Ранее было показано, что оптимальной дозой карбоплатина, используемой для формирования тромбоцитопении у мышей линии ВАЬВ/с, была фракционированная суммарная доза 120 мг/кг, вводимая во время двух последовательных ежедневных инъекций (то есть 2x60 мг/кг). Примерно через один час после второй дозы карбоплатина группы мышей получали связанное с РЕО соединение № 1 ТРО или носитель (стерильный физиологический раствор, 88, без консервантов, 0,9% хлорид натрия) посредством в/в (болюсной) инъекции, как указано в таблице 4. Доза вводилась по весу (100 мкл/10 г веса тела).

- 13 015562

Таблица 4

Группы испытаний:
Группа	№	Премедикация (в/б), -1-й и 0-й день	Тестируемый препарат	Доза (в/в) День 0	Отбор крови
1	10	Носитель (РВ8)	Носитель (88)	Симуляция	Эвтаназия 5 мышей на 6-й и 12-й день
2	15	Карбоплатин	Носитель (88)	Симуляция	Эвтаназтия 5 мышей на 6-й, 8-й и 12-й день
3	15	Карбоплатин	Связанное с РЕО соединение № 1 ТРО	30 мкг/кг	Эвтаназия 5 мышей на 6-й, 8-й и 12-й день
4	15	Карбоплатин	Связанное с РЕС соединение № 1 ТРО	100 мкг/кг	Эвтаназия 5 мышей на 6-й, 8-й и 12-й день
5	15	Карбоплатин	Связанное с РЕС соединение № 1 ТРО	300 мкг/кг	Эвтаназия 5 мышей на 6-й, 8-й и 12-й день

На 6-й, 8-й и 12-й день пять мышей из каждой испытательной группы взвешивали и умерщвляли с использованием асфиксии в СО₂, после чего обескровливали посредством пункции сердца. Образцы крови переносились в отдельные микроконтейнеры с БОТА (с лиловой крышкой) для гематологического анализа. Обработка групп контрольных мышей (5) проводилась на 6-й и 12-й день. Результаты приведены на фиг. 13-14.

Введение мышам только карбоплатина на 12-й день вызывало у мышей более чем 25%-ное снижение уровней гемоглобина. Такое снижение полностью ингибировалось при введении любых доз связанного с РЕС соединения № 1 ТРО. Связанное с РЕС соединение № 1 ТРО также эффективно ингибировало снижения числа эритроцитов и гематокрита, которые были вызваны введением карбоплатина.

По существу, у всех мышей во всех группах, получавших либо один карбоплатин, либо карбоплатин с различными дозами связанного с РЕС соединения № 1 ТРО, на 6-й, 8-й и 12-й день наблюдалась потеря веса по сравнению с измерениями веса, проводившимися в 1-й день. Анализ измерений веса тела за 13-дневный период исследования показывает, что наблюдаемое снижение веса тела было вызвано одним только введением карбоплатина. Очевидно, что в рамках настоящего исследования связанное с РЕС соединение № 1 ТРО не оказывало воздействие на потерю веса или его восстановление.

У мышей, получавших только карбоплатин, на 4-й день начинали появляться признаки измененного внешнего вида и поведения. Некоторые мыши выглядели сгорбленными и взъерошенными. У многих мышей также отмечался жидкий стул. Некоторые животные выглядели вялыми, и у некоторых наблюдалась кровь в стуле. Введение связанного с РЕС соединения № 1 ТРО отсрочивало проявление, уменьшало частоту и остроту этих симптомов, с очевидной зависимостью от дозы.

Действие связанного с РЕС соединения № 1 ТРО было направлено на поддержание выживаемости линий эритроцитов у мышей, получавших карбоплатин, что подтверждается численностью тромбоцитов в периферической крови и другими гематологическими параметрами. Было обнаружено, что все дозы связанного с РЕС соединения № 1 ТРО на 12-й день полностью предупреждают развитие анемии, вызванной карбоплатином. Полученные результаты свидетельствуют от дифференцированной чувствительности/реактивности линий мегакариоцитов и эритроцитов в отношении воздействия связанного с РЕС соединения № 1 ТРО на сохранение выживаемости.

Пример 5. Группы мышей проходили два цикла введения химиотерапевтического агента (карбоплатина), разнесенные на десять дней, причем каждый цикл включал последовательное введение карбоплатина в течение двух дней (например, 7 0 мг/кг/день вводилось в -1-й и 0-й день и в 10-й и 11-й день), как это указано ниже. Доза карбоплатина, используемая для таких исследований выживаемости, превышала максимально допустимую дозу для мышей (то есть 120 мг/кг; вводимые в виде 60 мг/кг/день в течение 2 дней подряд). Через час после второй дозы карбоплатина в каждом цикле (то есть в 0-й и 11-й день) мыши получали связанное с РЕС соединение № 1 ТРО (100 мкг/кг) или носитель (стерильный физиологический раствор, 88, без консервантов, 0,9% хлорида натрия) посредством в/в (болюсной) инъекции, как указано ниже. Доза вводилась по весу (100 мкл/10 г веса тела).__

Структура исследования:

Группа

Премедикация (в/б), -1-й и 0-й день, 10-й и 11-й день Носитель (РВ8)

Испытуемый препарат 100 мкг/кг (в/в) Носитель (*88)

Карбоплатин (70 мг/кг)

Носитель (*88)

Связанное с РЕО соединение № 1

ТРО

Доза (в/в) ~1 ч после 2-й дозы

СВРЕ дла каждого _______цикла_______

Симуляция, 0-й и 11 -й день

Симуляция, 0-й и 11-й день

100 мкг/кг, 0-й и 11-й день

Отбор крови / анализ Эвтаназия 5 мышей на

7-й, 10-й, 18-й, 21-й и

28-й день

7-й, 10-й, 18-й, 21-й и

28-й день

7-й, 10-й, 18-й, 21-й и

28-й день

- 14 015562

На 7-й, 10-й, 18-й, 21-й и 28-й день пять мышей из каждой испытательной группы (25 мышей/группа) умерщвляли с использованием асфиксии в СО₂, после чего обескровливали посредством пункции сердца. Образцы крови переносились в отдельные микроконтейнеры с ЕЭТА (с лиловой крышкой) для гематологического анализа. Обработку групп контрольных мышей, получавших только носители, проводили таким же образом. Результаты приводятся на фиг. 15. Введение мышам карбоплатина в два цикла вызывало развитие умеренной анемии, которая наблюдалась в промежутке между 10-м и 21-м днями, тогда как мыши, получавшие карбоплатин в два цикла вместе со связанным с РЕС соединением № 1 ТРО, в течение всего этого периода сохранили значения гематокрита, которые были близки к показателям контрольной группы. Интересно, что из мышей, не использовавшихся для гематологической оценки, 7 мышей в группе, получавшей только карбоплатин, погибли в интервале между 4-м и 18-м днем, тогда как в группе, получавшей комбинационную терапию, за тот же период погибла лишь 1 мышь, причем большинство летальных исходов наблюдалось в период анемии. Эти результаты показывают, что вызванная карбоплатином анемия может способствовать гибели мышей, получавших высокие уровни химиотерапии, и что связанное с РЕС соединение № 1 ТРО может вызывать повышение выживаемости мышей за счет предупреждения развития анемии.

Пример 6. Для исследования механизма группам мышей вводили контрольный препарат или возрастающие количества карбоплатина (например, 60, 70 или 80 мг/кг) в течение 2 дней подряд (-1-й и 0-й день). Примерно через час после второй дозы карбоплатина группам мышей вводили связанное с РЕС соединение № 1 ТРО (100 мкг/кг) или носитель (стерильный физиологический раствор, 88, без консервантов, 0, 9% хлорида натрия) в форме в/в (болюсной) инъекции, как указано в табл. 5.

Таблица 5

Структу	за исследования:
Группа	№	Введенный СВРЬ -1-й и 0-й день (в/б)	Введение (в/в), 1-й день, 1 ч после СВРЬ	Отбор крови / анализ Эвтаназия 3 мышей
1	3	Носитель (РВ8)	Носитель (*88)	15-й день
2	3	Карбоплатин (60 мг/кг)	Носитель (*88)	15-й день

3	3	Карбплатин (70 мг/кг)	Носитель (*88)	15-й день
4	3	Карбоплатин (80 мг/кг)	Носитель (*88)	15-й день
5	3	Карбоплатин (60 мг/кг)	Связанное с РЕС соединение № 1 ТРО (100 мкг/кг)	15-й день
6	3	Карбоплатин (70 мг/кг)	Связанное с РЕС соединение № 1 ТРО (100 мкг/кг)	15-й день
7	3	Карбоплатин (80 мг/кг)	Связанное с РЕС соединение № 1 ТРО (100 мкг/кг)	15-й день

На 15-й день мышей во всех испытательных группах умерщвляли с использованием асфиксии в ССА после чего обескровливали посредством пункции сердца. Образцы крови переносились в отдельные микроконтейнеры с БЭТА (с лиловой крышкой) для гематологического анализа. Кроме того, проводилось отделение и обработка для гистологического анализа нескольких органов (в том числе мозг) контрольных мышей и мышей, получавших 2x70 мг/кг карбоплатина без и с дополнительным введением связанного с РЕС соединения № 1 ТРО. Срезы этих тканей проходили иммунногистохимическую обработку для определения фибриногена/фибрина.

Введение мышам нарастающих количеств одного карбоплатина вызывало резкое падение числа тромбоцитов у мышей, получавших 2x70 мг/кг на 15-й день, а также зависимое от дозы снижение гематокрита (НСТ) у мышей, получавших 60 и 70 мг/кг карбоплатина (без других соединений). Такое снижение числа тромбоцитов и эритроцитов, вызванное карбоплатином, полностью ингибировалось введением связанного с РЕС соединения № 1 ТРО. Следует отметить, что все мыши, получавшие 2x80 мг/кг карбоплатина (без других соединения) либо погибли, либо были умерщвлены (были в состоянии агонии) до завершения исследования. Интересно, что все мыши, получавшие 2x80 мг/кг карбоплатина и связанное с РЕС соединение № 1 ТРО, доживали до установленного срока завершения исследования и на 15-й день не проявляли симптомов тромбоцитопении или анемии.

Гистологическое исследование мозга контрольных мышей выявило небольшие кровеносные сосуды, которые выглядели нормальными. Во многих сосудах содержались эритроциты, и отмечалось размытое окрашивание из-за присутствия фибриногена. Проявление размытого внутрисосудистого окрашивания из-за фибрина/фибриногена у этих контрольных мышей было вполне ожидаемым, поскольку фибриноген относится к обычным компонентам плазмы. Срезы мозга мышей, получавших только карбоплатин (2x70 мг/кг), содержали небольшие кровеносные сосуды, которые были полностью закупорены материа

- 15 015562 лом, окрашивание которого указывало на высокую концентрацию фибриногена/фибрина. Такие микротромбы часто наблюдались в срезах тканей у всех мышей из этой группы дозы. Небольшие сосуды в срезах мозга мышей, получавших карбоплатин и связанное с РЕС соединение № 1 ТРО, выглядели нормальными или демонстрировали окрашивание из-за фибриногена/фибрина, которое было лишь чуть более интенсивным по сравнению с контрольной группой. Для всей группы дозы отмечался единичный случай образования микротромбов.

Результаты проведенного исследования показывают, что случаи образования микротромбов были вызваны химиотерапией, и поскольку считается, что микротромбы способствуют механическому лизису эритроцитов, такие сосудистые изменения, скорее всего, способствуют развитию анемии, вызванной химиотерапией. Кроме того, способность связанного с РЕС соединения № 1 ТРО предупреждать развитие таких тромбов может быть составляющей механизма, посредством которого данное вещество препятствует развитию анемии, вызванной химиотерапией. Наконец, случаи образования микротромбов могли также способствовать смертности животных, прошедших химиотерапию в высоких дозах. Поэтому способность связанного с РЕС соединения № 1 ТРО предупреждать развитие таких случаев тромбоза может определять повышенный уровень выживаемости животных, подвергнутых химиотерапии в высоких дозах вместе с исследуемым веществом.

Фиг. 18А и фиг. 18В демонстрируют воздействие введения связанного с РЕС соединения № 1 ТРО на тромбоциты и гематокрит мышей, получавших карбоплатин [согласно процедуре, изложенной в примере 6].

На фиг. 19 показано, что введение связанного с РЕС соединения № 1 ТРО уменьшает отложение фибриногена и кровяных сгустков в срезах мозга, взятых у мышей, получавших карбоплатин согласно процедуре, приведенной в примере 6.

Предлагаемый механизм действия

На фиг. 16 приводится предполагаемый механизм действия антианемических эффектов связанного с РЕС соединения № 1 ТРО. Как можно видеть из фиг. 16, химиотерапия вызывает повреждение эндотелия небольших кровеносных сосудов и подавляет гематопоэз. В отсутствие связанного с РЕС соединения № 1 ТРО быстро развивается тромбоцитопения, поскольку циркулирующие в крови тромбоциты активируются измененным эндотелием и откладываются на стенках небольших кровеносных сосудов. Измененные тромбоциты, продуцируемые поврежденным костным мозгом, способствуют данному процессу. Активированные тромбоциты вызывают отложение фибрина внутри поврежденных сосудов, и формируются микроангиопатические тромбы. Такие микроангиопатические тромбы опосредуют механическое разрушение эритроцитов, способствуя развитию анемии, вызванной химиотерапией. Совместное применение связанного с РЕС соединения № 1 ТРО ингибирует вызванное химиотерапией повреждение эндотелия кровеносных сосудов и/или усиливает антитромботические и профибринолитические свойства тромбоцитов в системе кровообращения. Микроангиопатические тромбы не формируются, и сохраняется структурная целостность эритроцитов. Воздействие связанного с РЕС соединения № 1 ТРО на предшественники мегакариоцитов в костном мозге стимулирует продукцию нормальных тромбоцитов. Поддерживается гемостаз и предупреждается развитие анемии.

На фиг. 17 показаны предполагаемые эффекты воздействия связанного с РЕС соединения № 1 ТРО на линии гематопоэтических клеток.

Пример 7. Анализ связывания.

Активность пептидных соединений может определяться с использованием стандартных методик анализа относительной люминесценции. При анализе используются, например, рекомбинантные мышиные клетки, стабильно экспрессирующие ТРО рецептор человека, и репортерная конструкция люциферазы с ίθδ-промотором. Анализ может проводиться следующим образом: выделенные из сыворотки клетки ВаГ/3 11ТР0г ίοδ/ΐιιχ. экспрессирующие рецептор ТРО человека, с-тр1 (йТРОг), и репортерная конструкция люциферазы обрабатываются нарастающими концентрациями гйТРО или пептидного соединения в течение примерно 18 часов. Затем клетки инкубируются в среде, содержащей субстрат люциферазы, и люминесценция клеток измеряется люминометром.

Как показано на фиг. 20, связанное с РЕС соединение № 1 ТРО активировало клетки ВаГ/3, рекомбинантно экспрессирующие ТРО-Р человека с очевидной зависимостью от дозы. Как показано на фиг. 21, более высокая активация ТРО-Р наблюдалась, если клетки стимулировались связанным с РЕС соединением № 1 ТРО, а не ТРО в той же концентрации. ЕС₅₀ для связанного с РЕС соединения № 1 ТРО составляла примерно 5 пМ.

Несмотря на то, что выше подробно описывались только предпочтительные применения по настоящему изобретению, следует понимать, что в его описание могут быть внесены модификации, не затрагивающие сущности и охвата изобретения.

Claims

1. Способ предупреждения развития анемии после лечения, предусматривающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества пептидного соединения ТРО, содержащего следующую структуру:

I Е С Р Т Ь К 0 (2-Иа1) Ь А А К (Заг) (ЗЕО Ю N0:5).

2. Способ по п.1, в котором указанное лечение выбрано из группы, состоящей из лечения цитотоксическими средствами, противоопухолевыми средствами и радиационного облучения.

3. Способ по п.1, в котором указанное эффективное количество составляет от примерно 1 мкг до примерно 300 мкг/кг веса тела в день.

4. Способ лечения анемии, включающий стадию введения субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества пептидного соединения ТРО, содержащего следующую структуру:

1ЕСРТЬК0 (2-Иа1) Ь А А К (Заг) (ЗЕО 10 N0:5).

5. Способ предупреждения развития анемии после лечения, предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества пептидного соединения ТРО, содержащего сле- дующую структуру:

где МРЕС представляет собой метоксиполи(этиленгликоль), имеющий молекулярный вес примерно 20000 Да.

6. Способ по п.5, в котором указанное лечение выбрано из группы, состоящей из лечения цитотоксическими средствами, противоопухолевыми средствами и радиационного облучения.

7. Способ по п.5, в котором указанное эффективное количество составляет от примерно 1 мкг до примерно 300 мкг/кг веса тела в день.

8. Способ лечения анемии, предусматривающий стадию введения субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества пептидного соединения ТРО, содержащего следующую структуру:

9. Способ предупреждения развития анемии после лечения, предусматривающий введение субъекту, нуждающемуся в этом эффективного количества пептидного соединения ТРО, содержащего следую щую структуру:

- 17 015562

IЕ О Р Т Ь К <2 (2-ΝαΙ) Ь А А К (8аг) ' . А

Κ(ΝΗ₂) / 1ЕОРТЬКр(2-Ма1)ЬААК(8аг)

10. Способ по п.9, в котором указанное лечение выбрано из группы, состоящей из лечения цитотоксическими средствами, противоопухолевыми средствами и радиационным облучением.

11. Способ по п.9, в котором указанное эффективное количество составляет от примерно 1 мкг до примерно 300 мкг/кг веса тела в день.

12. Способ лечения анемии, предусматривающий стадию введения субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества пептидного соединения ТРО, содержащего следующую структуру:

IЕ О Р Т Ь К. (2~Ма1) Ь А А К (8аг) \

Κ(ΝΗ₂) /