EA007992B1 - Способ получения полых микросфер и полая микросфера, полученная данным способом - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения полых микросфер, предназначенных для размещения в них микроскопических биологических объектов, таких как сперматозоиды млекопитающих, ооциты или клетки организмов. Способ получения полых микросфер характеризуется тем, что над водной средой (3) осуществляют распыление водного раствора расплавленной агарозы (1) с образованием аэрозоля (4) в газовой среде при температуре ниже температуры застудневания водного раствора агарозы, с последующим перемещением образовавшихся микросфер в водную среду (3). Получаемые полые микросферы из агарозного геля готовы к размещению в них микроскопических биологических объектов. Технический результат заключается в реализации расширения арсенала технических средств для локализации и хранения микроскопических биологических объектов. Технический результат заключается в упрощении способа получения полых микросфер, улучшении стерильности процесса, получении нового устройства для локализации и хранения биологических микроскопических объектов из биохимически инертного и нетоксичного материала. Технически результат заключается также в повышении прозрачности, однородности и упругости стенки полой микросферы.

Description

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения полых микросфер, предназначенных для размещения в них микроскопических биологических объектов, таких как сперматозоиды млекопитающих, ооциты или клетки организмов.

К уникальным единичным микроскопическим биологическим объектам могут быть отнесены единичные сперматозоиды, выделенные из спермы пациентов с тяжелой олигозооспермией (незначительное количество или почти полное отсутствие сперматозоидов), а также тканевых образцов, полученных в результате пункции яичка или придатка яичка у пациентов с азооспермией (полное отсутствие сперматозоидов в сперме). К уникальным микроскопическим биологическим объектам могут быть отнесены и сперматозоиды беспозвоночных и позвоночных животных, в том числе быков, лошадей, а также исчезающих видов животных.

В случае высокого риска невозможности повторного получения биологического материала важно исключить любую возможность утраты материала. Решить эту проблему позволяют микроконтейнеры. Физически локализуя объект в большем объеме, микроконтейнеры значительно упрощают и облегчают манипуляции, связанные с обработкой биологический материалов.

В настоящее время хранение единичных сперматозоидов в микроконтейнерах не является распространенной практикой в клинической эмбриологии, но являет собой скорее демонстрацию экспериментальных возможностей. Одним из условий успешного внедрения методов лечения с использованием единичных сперматозоидов в клиническую практику является наличие постоянного и легкодоступного источника микроконтейнеров, которые в полной мере отвечали бы своему предназначению.

Такие контейнеры должны быть достаточно малы, чтобы обеспечить локализацию отдельного сперматозоида в пределах манипуляционного поля. Идеальный размер контейнера, очевидно, должен быть соизмерим с локализуемым объектом, например длиной сперматозоида (не менее 60 мкм), с тем чтобы производить манипуляции под микроскопом с одним объективом (суммарное увеличение ~ 200^х). Размер более 500 мкм затруднит манипуляции. Наиболее подходящей для манипуляций, например, в методе или с использованием техники 1СЗ1 (искусственное введение под микроскопом единичного сперматозоида в яйцеклетку при помощи специального стеклянного капилляра-иглы) вялеятся сфероидная форма микроконтейнера.

Микроконтейнеры должны быть прозрачны, а также иметь упругую стенку, чтобы обеспечить захват их присасывающим капилляром и избежать деформации при помещении или извлечении биологического материала микроинъекционной иглой.

Известно использование естественных микросфероидов растительного или животного происхождения для локализации биологических объектов, например оболочки яиц животных организмов или пыльцы растений, оболочки или покровы каких-либо организменных структур. Сложность поиска адекватных природных микроконтейнеров усугубляется необходимостью их предварительной обработки для удаления содержимого или дезактивации биологически активных веществ и придания требуемых свойств. В настоящее время в качестве микроконтейнеров естественного происхождения успешно используют пустые хопае ре11иабае (прозрачные оболочки яйцеклеток) мыши, хомячка или человека, поскольку эти контейнеры идеально соответствуют указанным выше характеристикам [Собеп 1.. Сайта С.Т. СопдебоРеггага Т.А., Кгеск К.А., 8сЫтше1 Т.^., 8соб К.Т. Сгуоргекегуабоп οί ктд1е битап крегтаЮхоа // Нит. Кергоб. 1997. V. 12. Р. 994-1001.], [^а1тк1еу К., Собеп 1., Реггага-Сопдебо Т., Кешд А., Сапга 1. Тбе Ыйбз апб опдошд ргедпапшек аккос1а!еб пбб крегт сгуоргекегуабог еуасиа!еб едд хопае // Нит. Кергоб. 1998. V. 13. Зирр1 4. Р. 61-70.], [Ьш 1., 2бепд Χ.Ζ., Вагатк1 Т.А., Сотр1оп С., Υπχίβί К.А., Ка1х Е. Сгуорге-кегуабоп ок а кта11 питбег ок Ггекб битап 1екбси1аг крегтаЮхоа апб 1екбси1аг крегтаЮхоа сибигеб ш уйго Гог 3 баук ίπ ап етр!у хопа ребиаба // 1. Апбго1. 2000. V. 21. Р. 409-413], [Ныеб Υ., Тка1 Н., Сбапд С, Ьо Н. Сгуоргекегуабоп оГ битап крегтаЮхоа пббш битап ог тоике етр!у хопа ре11ис1бае // Рейб. 81еп1. 2000. V. 73. Р. 694-698.], [Вопш А., Зегеш Е., Вопи., Р1ат1дш С. Ргеехбщ а Геп 1екбси1аг крегтаЮхоа гебгеуеб Ьу ТЕЗА // Мо1. Се11. Епбосппо1. 2000. V. 169. Р. 27-32.], [Ьеу1-8е1б Р.Е., А1Ьап Е., Ыедп Ь., Секапа А., Ыоуага Р., В1апсб1 З. Сгуоргекегуабоп оГ а кта11 питбег оГ крегтаЮхоа т уо1к-Г111еб битап хопае ребиабае // Агсб. Йа1. Иго1. Апбго1. 2003. V. 75. V. 195-198.].

Однако описанные микроконтейнеры имеют некоторые существенные недостатки. Использование хопае ре11ис1бае животных и человека связано с риском инфицирования, а также с нежелательной в данном случае способностью, некоторых биологических материалов, например сперматозоидов, связываться с их поверхностью. Кроме того, подготовка таких контейнеров требует микрохирургических манипуляций по удалению содержимого, что значительно усложняет способ. Стерилизация хопае ре11ис1бае и биохимическая обработка с целью избежать связывания со сперматозоидом также создает дополнительные трудности.

Известен способ получения полых микросфер, содержащих микроскопические биологические объекты, в частности, сперматозоиды млекопитающих, включающий смешивание микроскопического объекта с биологической средой и нетоксичным предварительно стерилизованным гидрофильным полимером, выбранным из группы, состоящей из полиуретана, полиоксиэтилена и полиуретановых полимеров с последующим микрокапсулированием смеси [патент США 4840891, МПК Λ01Ν1/02, опубл. 1989].

Получению требуемого технического результата препятствует трудоемкость процесса получения

- 1 007992 микросфер, а также ограниченные функциональные возможности использования микросфер, связанные с невозможностью размещения в них необходимых объектов в готовых микросферах.

Известен способ получения микросфер, содержащих микроскопические биологические объекты, в частности, сперматозоиды млекопитающих, включающий смешивание гелеобразного вещества, физиологической среды и спермы с последующим распылением и образованием микрокапсул, содержащих сперматозоиды [патент США № 6596310, опубл. 2003, А 61К9/52]. Приготовление микрокапсул осуществляли следующим образом: раствор, состоящий из альгината натрия, агарозы, плавящейся при температуре 37-42°С, и веществ, препятствующих капацитации спермы (фруктозо-6-фосфат), смешивали со спермой, потом полимеризовали эту смесь в микросферы в присутствии ионов кальция, калия и фосфатов, при этом происходила полимеризация альгината с образованием стенки микросферы. Затем смесь немного охлаждали, например, до комнатной температуры, что вызывало полимеризацию агарозы и иммобилизацию (обездвиживание) сперматозоидов, а потом растворяли альгинатную твердую стенку в цитрате натрия. В результате происходит образование суспензии иммобилизованных в сферических микроблоках некапацитированных сперматозоидов.

С существенными признаками первого объекта заявляемого изобретения совпадают такие признаки прототипа, как получение микросфер путем распыления над жидкой средой смеси с последующим перемещением образовавшихся микросфер в жидкую среду.

С существенными признаками второго объекта заявляемого изобретения совпадают такие признаки прототипа, как форма сферическая форма и наличие агарозного геля в стенках.

Получению требуемого технического результата препятствует положенный в основу способа получения микросфер принцип химической сопряженной полимеризации в жидкой дисперсионной среде, что приводит к необходимости введения биологических объектов непосредственно в среду, которая подвергается распылению, наличие биологической среды во время прохождения химических реакций, что увеличивает риск потери уникальных биологических материалов. Указанный способ не применим для сохранения единичных уникальных биологических материалов.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка новых микроконтейнеров для локализации и хранения микроскопических биологических объектов.

Технический результат заключается в реализации расширения арсенала технических средств для локализации и хранения микроскопических биологических объектов. Технический результат заключается в упрощении способа получения полых микросфер, улучшении стерильности процесса, получении нового устройства для локализации и хранения биологических микроскопических объектов из биохимически инертного и нетоксичного материала. Технически результат заключается также в повышении прозрачности, однородности и упругости стенки полой микросферы.

Для достижения вышеуказанного технического результата по первому объекту изобретения в способ получения полых микросфер характеризуется тем, что над водной средой осуществляют распыление водного раствора расплавленной агарозы с образованием аэрозоля в газовой среде при температуре ниже температуры застудневания водного раствора агарозы, с последующим перемещением образовавшихся микросфер в водную среду.

В частных случаях выполнения изобретения по первому объекту перед распылением водный раствор расплавленной агарозы нагревают до температуры кипения В частных случаях выполнения изобретения по первому объекту в качестве газовой среды используют воздушную среду или среду инертных газов.

В частных случаях выполнения изобретения по первому объекту для приготовления водного раствора агарозы используют деионизованную воду.

В частных случаях выполнения изобретения по первому объекту в качестве водной среды, над которой осуществляют распыление и в которую перемещаются образовавшиеся микросферы, используют водную среду предварительно охлажденную до температуры от 3 до 10°С.

В частных случаях выполнения изобретения по первому объекту распыление водного раствора расплавленной агарозы осуществляют под давлением через форсунку с диаметром сопла от 50 до 200 мкм.

Для достижения вышеуказанного технического результата по второму объекту изобретения микросфера, характеризуется тем, что выполнена полой, ее диаметр составляет от 50 до 200 мкм, а стенка выполнена из агарозного геля, образованного застудневанием 0,5-2% водного раствора расплавленной агарозы.

В частных случаях выполнения изобретения по второму объекту толщина стенки микросферы составляет от 10 до 25 мкм.

В отличие от описанных в уровне технике способов в заявляемом изобретении используют водный раствор расплавленной агарозы, а в качестве жидкой среды, в которую перемещаются микросферы, водная среда, что позволяет обеспечить наибольшую стерильность процесса. Распыление с образованием аэрозоля в газовой среде при температуре ниже температуры застудневания водного раствора агарозы, с последующим перемещением образовавшихся микросфер в водную среду, исключает химические реакции при образовании полых микросфер, за счет чего стенки микросфер имеют большую однородность, прозрачность и достаточную упругость. Полученные заявленным способом полые микросферы сразу

- 2 007992 готовы к размещению в них микроскопических биологических объектов. Использование водного раствора расплавленного агарозного геля позволяет получить полые микросферы из биохимически инертного и нетоксичного материала, что исключает возможность инифицирования или неблагоприятного воздействия на биологические объекты.

В отличие от описанных в уровне техники микросфер в заявляемом изобретении микросфера выполнена полой, а в прототипе образующаяся сфера не является полой, т. к. в результате процесса заполнена полимерным гелем, в котором иммобилизированы сперматозоиды. В отличие от прототипа стенки микросфер состоят только из агарозного геля, без включений. По сравнению с прототипом размеры микросферы гораздо меньше.

Изобретение поясняется чертежами, где на фиг. 1 - схематично представлен способ получения полых микросфер;

на фиг. 2 - представлена фотография полученных микросфер из агарозного геля, на фиг. 3 - представлена фотография одной микросферы из агарозного геля, на фиг. 4 - представлена фотография подведения иглы к полой микросфере, на фиг. 5 - представлена фотография полой микросферы с введенным в нее сперматозоидом. Изобретение осуществляется следующим образом.

В качестве материала для изготовления полых микросфер используют агарозу. Агароза относится к так называемым полиуроновым или альгиновым кислотам, это полисахарарид, состоящий из Όгалактозы и 3,6-ангидро-Ь галактозы. Агароза достаточно биологически инертна и совершенно нетоксична для биологических объектов, в том числе гамет и эмбрионов человека. Хорошо известно свойство агарозы связывать воду и образовывать гидрогель. Агарозный гель упругий, проницаемый, в тонком слое достаточно прозрачен. Такой гидрогель по своей биохимической структуре и физическим свойствам во многом сходен с веществом, образующим хопае ре11ис1бае (прозрачные оболочки яйцеклеток мыши, хомячка или человека), но лишен ряда недостатков и более доступен.

Способ получения микросфер основан на использовании в качестве матрицы микроскопических пузырьков воздуха, образующихся в аэрозольных частицах при распылении расплавленного водного раствора агарозы. Готовят водный раствор расплавленной агарозы, предпочтительно используя деионизованную воду. Процент агарозы в водном растворе может быть от 0,5 до 2%). Затем раствор нагревают до температуры приблизительно +100°С. Затем приготовленный раствор 1 распыляется под давлением через микрофорсунку 2 (фиг. 1). Обычно диаметр микрофорсунки 2 составляет от 50 до 200 мкм. Распыление производят в газовой среде, например воздушной среде или среде инертных газов, температуре ниже температуры застудневания водного раствора агарозы. Распыление осуществляют над поверхностью водной среды 3, например холодной (от 3 до 10°С) деионизованной воды. Образующиеся в аэрозоле микропузырьки полимеризуются в газовой среде, т. к. температура газовой среды ниже температуры застудневания водного раствора агарозы, образуя микросферы 4. Образующиеся микросферы, оседая на поверхности, перемещаются в водную среду. Стенки микросфер образованы застудневшим раствором агарозы, для которого применяется понятие агарозный гель. Газы, находящиеся в полости микросфер, через стенку агарозного геля растворяются в холодной воде, и микросферы оседают на дно (фиг. 1). Осевшие на дно микросферы из агарозного геля собирают под контролем бинокулярной лупы при помощи стеклянной микропипетки с диаметром сопла примерно 130-200 мкм и помещают в выбранную среду.

Полученные аэрозольным способом микросферы имеют диаметр от 50 до 200 мкм, с оболочками различной толщины от 10 до 25 мкм и внутреннюю замкнутую полость (фиг. 2).

Полученные таким образом полые микросферы могут быть использованы для хранения и криоконсервации сперматозоидов млекопитающих, для локализации стволовых клеток с целью изучения дифференцировки стволовых клеток, для приготовления ультратонких срезов в электронной микроскопии, для обучения манипуляциям с ооцитами и ранними эмбрионами млекопитающих.

Изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами, которые не охватывают весь объем притязаний, но и не ограничивают его.

Пример 1. Использование полых микросфер из агарозного геля для локализации сперматозоидов с целью последующей криоконсервации.

Последовательность операций представлена на фиг. 3-5.

Подвижные сперматозоиды человека инъецировали в полые микросферы из агарозного геля диаметром 150-200 мкм, в количестве от 1-10 шт. на микросферу, используя базовую технику, оборудование и расходные материалы для инъекции методом 1С81. Сперматозоид, выбранный для локализации инъекции набирают в иглу (фиг. 3). Микросферы фиксируют присасывающей микропипеткой (фиг. 3, 4). Инъекционной иглой прокалывают оболочку (стенку) полой микросферы из агарозного геля и вводят сперматозоид (фиг. 5). Микросферы с помещенными в них сперматозоидами под контролем бинокулярной лупы при помощи пластиковой пипетки-капилляра переносили в раствор криопротектора, содержащий 50% среды 8регш Ргеехйщ Мебшш (МеФСиЙ, Дания) и 50% среды 8регш РгерагаДоп МеФиш (МеФСиЙ, Дания), на 5-10 мин. Затем микросферы помещали в пластиковую соломину для криоконсервации объемом 250 мкл. Соломины замораживали в течение 30 мин в парах жидкого азота, после чего погружали непосредственно в жидкий азот на время от 30 мин до 2 сут. Размораживание проводили, помещая соло

- 3 007992 мины под струю холодной проточной воды, микросферы извлекали из соломин и отмывали в 5 каплях среды 8регт Бгеехтд МеФит (МеФСиИ, Дания). Жизнеспособность сперматозоидов после размораживания оценивали по сохранению подвижности. Таким способом было заморожено 253 подвижных сперматозоида в 54 микросферах из агарозного геля. После криоконсервации и последующего размораживания все сперматозоиды сохранили характерную нормальную морфологию, что указывает на отсутствие серьезных механических повреждений, связанных с образованием кристаллов льда. Из 253 сперматозоидов 162 (64%) сохранили подвижность.

Пример 2. Использование полых микросфер из агарозного геля для изучения дифференцировки стволовых клеток.

Выделяли перевиваемые клетки тератокарциномы мыши, обрабатывали раствором трипсин-ЭДТА и помещали в микросферы из агарозы с диаметром внутренней полости 90 мкм, в количестве 50-100 клеток на микросферу, с использованием техники 1С81. Помещенные в микросферы из агарозы группы стволовых клеток тератокарциномы культивировали при 37°С в атмосфере трехгазовой смеси (5% СО₂, 5% О₂, 90% Ν₂) в среде БМЕМ с добавлением Ь-меркаптоэтанола. В этих условиях клетки тератокарциномы образуют эмбриоидные тельца, в которых происходит тканевая дифференцировка клеток. Микро сферы с заключенными в них эмбриоидными тельцами были использованы для гистологического анализа с применением иммуноцитохимических методик.

Пример 3. Использование полых микросфер из агарозного геля с целью приготовления ультратонких срезов в электронной микроскопии.

Единичные живые клетки или группы клеток помещают в микросферы из агарозного геля с использованием техники 1С81. Микросферы с помещенными в них микроскопическими объектами фиксируют, окрашивают и после соответствующей подготовки заключают в блоки из эпоксидной смолы. Помещение в микросферы из агарозного геля делает возможным визуализацию микроскопических объектов из эпоксидной смолы, что значительно облегчает приготовление ультратонких срезов для электронной микроскопии.

Пример 4. Использование полых микросфер из агарозного геля для обучения манипуляциям с ооцитами и ранними эмбрионами.

Манипуляции с ооцитами и ранними (доимплантационными) зародышами млекопитающих при экстракорпоральном оплодотворении (ЭКО) в медицинских или научных целях проводят под контролем бинокулярной лупы при помощи пластиковой или стеклянной микропипетки-капилляра. При обучении эмбриологов-клиницистов, зоотехников и биологов работе с этими микроскопическими объектами обычно используют биологический материал, подлежащий утилизации (погибшие ооциты и эмбрионы). Такой материал может быть недоступен в нужный момент в необходимом количестве, особенно при групповом обучении. По размеру, внешнему виду и оптическим свойствам микросферы из агарозы сходны с ооцитами и ранними (доимплантационными) зародышами млекопитающих и могут быть с успехом использованы в качестве их адекватной альтернативы.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет с достаточной простотой получить полые микросферы из агарозного геля с многофункциональным назначением по локализации микроскопических биологических объектов. Использование полученных полых микросфер позволяет визуализировать объект как при помощи оптики (микроскопы, бинокулярные лупы, увеличительные стекла), так и без нее; совершать с микроскопическим объектом манипуляции под контролем микроскопа, бинокулярной лупы или без использования оптических средств; избежать или минимизировать риск утери микроскопического объекта при совершении с ним манипуляций.

Claims (8)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения полых микросфер, характеризующийся тем, что над водной средой осуществляют распыление водного раствора расплавленной агарозы с образованием аэрозоля в газовой среде при температуре ниже температуры застудневания водного раствора агарозы с последующим перемещением образовавшихся микросфер в водную среду.
2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед распылением водный раствор расплавленной агарозы нагревают до температуры кипения.
3. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве газовой среды используют воздушную среду или среду инертных газов.
4. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что для приготовления водного раствора агарозы используют деионизованную воду.
5. 5. Способ по п.1 или 4, отличающийся тем, что в качестве водной среды, над которой осуществляют распыление и в которую перемещаются образовавшиеся микросферы, используют водную среду, предварительно охлажденную до температуры от 3 до 10°С.
6. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что распыление водного раствора расплавленной агарозы осуществляют под давлением через форсунку с диаметром сопла от 50 до 200 мкм.
7. 7. Микросфера, характеризующаяся тем, что выполнена полой, ее диаметр составляет от 50 до 200

   - 4 007992 мкм, а стенка выполнена из агарозного геля, образованного застудневанием 0,5-2% водного раствора расплавленной агарозы.
8. 8. Микросфера по п.7, отличающаяся тем, что толщина стенки составляет от 10 до 25 мкм.