EA007992B1 - Process for producing hollow microspheres and hollow microsphere thus obtained - Google Patents
Process for producing hollow microspheres and hollow microsphere thus obtained Download PDFInfo
- Publication number
- EA007992B1 EA007992B1 EA200600708A EA200600708A EA007992B1 EA 007992 B1 EA007992 B1 EA 007992B1 EA 200600708 A EA200600708 A EA 200600708A EA 200600708 A EA200600708 A EA 200600708A EA 007992 B1 EA007992 B1 EA 007992B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- microspheres
- agarose
- aqueous solution
- hollow microspheres
- medium
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения полых микросфер, предназначенных для размещения в них микроскопических биологических объектов, таких как сперматозоиды млекопитающих, ооциты или клетки организмов.The invention relates to biotechnology and can be used to obtain hollow microspheres, designed to accommodate microscopic biological objects, such as mammalian spermatozoa, oocytes or cells of organisms.
К уникальным единичным микроскопическим биологическим объектам могут быть отнесены единичные сперматозоиды, выделенные из спермы пациентов с тяжелой олигозооспермией (незначительное количество или почти полное отсутствие сперматозоидов), а также тканевых образцов, полученных в результате пункции яичка или придатка яичка у пациентов с азооспермией (полное отсутствие сперматозоидов в сперме). К уникальным микроскопическим биологическим объектам могут быть отнесены и сперматозоиды беспозвоночных и позвоночных животных, в том числе быков, лошадей, а также исчезающих видов животных.The unique single microscopic biological objects can be attributed to single spermatozoa isolated from the sperm of patients with severe oligozoospermia (a small or almost complete absence of spermatozoa), as well as tissue samples obtained by puncture of the testicle or epididymis in patients with azoospermia (complete absence of spermatomatosis) in semen). The spermatozoa of invertebrates and vertebrates, including bulls, horses, and endangered animal species can also be classified as unique microscopic biological objects.
В случае высокого риска невозможности повторного получения биологического материала важно исключить любую возможность утраты материала. Решить эту проблему позволяют микроконтейнеры. Физически локализуя объект в большем объеме, микроконтейнеры значительно упрощают и облегчают манипуляции, связанные с обработкой биологический материалов.In the case of a high risk of the impossibility of re-obtaining biological material, it is important to exclude any possibility of material loss. To solve this problem allow microcontainers. Physically localizing an object in a larger volume, microcontainers greatly simplify and facilitate the manipulations associated with the processing of biological materials.
В настоящее время хранение единичных сперматозоидов в микроконтейнерах не является распространенной практикой в клинической эмбриологии, но являет собой скорее демонстрацию экспериментальных возможностей. Одним из условий успешного внедрения методов лечения с использованием единичных сперматозоидов в клиническую практику является наличие постоянного и легкодоступного источника микроконтейнеров, которые в полной мере отвечали бы своему предназначению.Currently, the storage of single sperm in microcontainers is not a common practice in clinical embryology, but is rather a demonstration of experimental capabilities. One of the conditions for the successful introduction of treatment methods using single spermatozoa into clinical practice is the presence of a constant and easily accessible source of microcontainers that would fully meet their intended purpose.
Такие контейнеры должны быть достаточно малы, чтобы обеспечить локализацию отдельного сперматозоида в пределах манипуляционного поля. Идеальный размер контейнера, очевидно, должен быть соизмерим с локализуемым объектом, например длиной сперматозоида (не менее 60 мкм), с тем чтобы производить манипуляции под микроскопом с одним объективом (суммарное увеличение ~ 200х). Размер более 500 мкм затруднит манипуляции. Наиболее подходящей для манипуляций, например, в методе или с использованием техники 1СЗ1 (искусственное введение под микроскопом единичного сперматозоида в яйцеклетку при помощи специального стеклянного капилляра-иглы) вялеятся сфероидная форма микроконтейнера.Such containers should be small enough to ensure the localization of a single sperm cell within the manipulation field. The ideal container size obviously must be commensurate with the object to be localized, for example, the length of a sperm cell (not less than 60 μm) in order to perform manipulations under a single-lens microscope (total magnification ~ 200 x ). A size greater than 500 microns will make manipulation more difficult. The most suitable for manipulation, for example, in the method or using the 1SZ1 technique (artificial introduction of a single sperm cell under a microscope into an egg cell using a special glass capillary needle), the spheroid shape of the microcontainer is dried.
Микроконтейнеры должны быть прозрачны, а также иметь упругую стенку, чтобы обеспечить захват их присасывающим капилляром и избежать деформации при помещении или извлечении биологического материала микроинъекционной иглой.Microcontainers should be transparent and also have an elastic wall to ensure that they are gripped by a suction capillary and to avoid deformation when the biological material is placed or extracted with a microinjection needle.
Известно использование естественных микросфероидов растительного или животного происхождения для локализации биологических объектов, например оболочки яиц животных организмов или пыльцы растений, оболочки или покровы каких-либо организменных структур. Сложность поиска адекватных природных микроконтейнеров усугубляется необходимостью их предварительной обработки для удаления содержимого или дезактивации биологически активных веществ и придания требуемых свойств. В настоящее время в качестве микроконтейнеров естественного происхождения успешно используют пустые хопае ре11иабае (прозрачные оболочки яйцеклеток) мыши, хомячка или человека, поскольку эти контейнеры идеально соответствуют указанным выше характеристикам [Собеп 1.. Сайта С.Т. СопдебоРеггага Т.А., Кгеск К.А., 8сЫтше1 Т.^., 8соб К.Т. Сгуоргекегуабоп οί ктд1е битап крегтаЮхоа // Нит. Кергоб. 1997. V. 12. Р. 994-1001.], [^а1тк1еу К., Собеп 1., Реггага-Сопдебо Т., Кешд А., Сапга 1. Тбе Ыйбз апб опдошд ргедпапшек аккос1а!еб пбб крегт сгуоргекегуабог еуасиа!еб едд хопае // Нит. Кергоб. 1998. V. 13. Зирр1 4. Р. 61-70.], [Ьш 1., 2бепд Χ.Ζ., Вагатк1 Т.А., Сотр1оп С., Υπχίβί К.А., Ка1х Е. Сгуорге-кегуабоп ок а кта11 питбег ок Ггекб битап 1екбси1аг крегтаЮхоа апб 1екбси1аг крегтаЮхоа сибигеб ш уйго Гог 3 баук ίπ ап етр!у хопа ребиаба // 1. Апбго1. 2000. V. 21. Р. 409-413], [Ныеб Υ., Тка1 Н., Сбапд С, Ьо Н. Сгуоргекегуабоп оГ битап крегтаЮхоа пббш битап ог тоике етр!у хопа ре11ис1бае // Рейб. 81еп1. 2000. V. 73. Р. 694-698.], [Вопш А., Зегеш Е., Вопи., Р1ат1дш С. Ргеехбщ а Геп 1екбси1аг крегтаЮхоа гебгеуеб Ьу ТЕЗА // Мо1. Се11. Епбосппо1. 2000. V. 169. Р. 27-32.], [Ьеу1-8е1б Р.Е., А1Ьап Е., Ыедп Ь., Секапа А., Ыоуага Р., В1апсб1 З. Сгуоргекегуабоп оГ а кта11 питбег оГ крегтаЮхоа т уо1к-Г111еб битап хопае ребиабае // Агсб. Йа1. Иго1. Апбго1. 2003. V. 75. V. 195-198.].It is known to use natural microspheroids of plant or animal origin for the localization of biological objects, for example, the shell of eggs of animal organisms or pollen of plants, the shell or cover of any organismic structures. The difficulty of finding adequate natural microcontainers is exacerbated by the need to pretreat them to remove the contents or deactivate biologically active substances and impart the required properties. At the present time, empty hopper and labyrinths (transparent egg membranes) of a mouse, hamster, or human are successfully used as microcontainers of natural origin, since these containers ideally correspond to the above characteristics [Soben 1 .. S.T.T. Sopdeborereggaga, T.A., Kgesk, K.A., 8sYtysh1, T. ^., 8s. K.T. Sguorhegeguabop οί ctd1e bitap kregtaYuhoa // Neath. Kirgob 1997. V. 12. R. 994-1001.], [^ A1tk1eu K., Sobiep 1., Reggaga-Sopdebo T., Keshd A., Sapga 1. Tbe Ыybz apb headhead ryadpapshek accos1a! Ébb pb krengt sguorgegeguubog euasia! fuck edd hopay // Neath. Kirgob 1998. V. 13. Zyrr1 4. R. 61-70.], [Шш 1., 2bepd Χ.Ζ., Vagatk1 T.А., Sotr1op S., Υπχίβί KA, Ka1kh E. Sguorge-keguabop ok akta11 pitbeg ok Ggekb bitap 1ksbig1ag cregtaYuhoa apb 1kbtsiagy krigtaYuhoa sibigeb sh uygo Gog 3 bauk π up etr! at hop rebiab // 1. Apbgo1. 2000. V. 21. R. 409-413], [Nyeb Υ., Tka1 N., Sbapd S, Bo N. Sguorhegeguabop oG bitap krengta Juhopbsh bitap otoko etr! At hop re11is1bay // Reib. 81un1 2000. V. 73. R. 694-698.], [Vopsha A., Zegesh E., Vopi., P1at1dsh S. Regechbsch Heppecienta Crigta Juhogegegeueb LU TESA // Mo1. Ce11. EPBOSPPO1. 2000. V. 169. R. 27-32.], [Leu1-8e1b R.E., A1bap E., Gedp L., Sekapa A., Joagha R., V1apsb1 Z. Sguorheguguabop oG and kta11 Pittgge GG Cregta Juaa t u1k-G111eb bitap hopai rebiabae // Agsb. Ya1. Igo1. Apbgo1. 2003. V. 75. V. 195-198.].
Однако описанные микроконтейнеры имеют некоторые существенные недостатки. Использование хопае ре11ис1бае животных и человека связано с риском инфицирования, а также с нежелательной в данном случае способностью, некоторых биологических материалов, например сперматозоидов, связываться с их поверхностью. Кроме того, подготовка таких контейнеров требует микрохирургических манипуляций по удалению содержимого, что значительно усложняет способ. Стерилизация хопае ре11ис1бае и биохимическая обработка с целью избежать связывания со сперматозоидом также создает дополнительные трудности.However, the described microcontainers have some significant drawbacks. The use of hopes of animals and humans is associated with the risk of infection, as well as with the undesirable ability in this case, of some biological materials, such as spermatozoa, to bind to their surface. In addition, the preparation of such containers requires microsurgical manipulation to remove the contents, which greatly complicates the method. Sterilization of hopae re11isbaye and biochemical treatment in order to avoid binding with the spermatozoon also creates additional difficulties.
Известен способ получения полых микросфер, содержащих микроскопические биологические объекты, в частности, сперматозоиды млекопитающих, включающий смешивание микроскопического объекта с биологической средой и нетоксичным предварительно стерилизованным гидрофильным полимером, выбранным из группы, состоящей из полиуретана, полиоксиэтилена и полиуретановых полимеров с последующим микрокапсулированием смеси [патент США 4840891, МПК Λ01Ν1/02, опубл. 1989].A method of obtaining hollow microspheres containing microscopic biological objects, in particular, mammalian sperm, includes mixing a microscopic object with a biological medium and a non-toxic pre-sterilized hydrophilic polymer selected from the group consisting of polyurethane, polyoxyethylene and polyurethane polymers, followed by microencapsulation of the mixture [US patent 4840891, IPC Λ01Ν1 / 02, publ. 1989].
Получению требуемого технического результата препятствует трудоемкость процесса полученияObtaining the required technical result is hampered by the complexity of the process of obtaining
- 1 007992 микросфер, а также ограниченные функциональные возможности использования микросфер, связанные с невозможностью размещения в них необходимых объектов в готовых микросферах.- 1 007992 microspheres, as well as limited functionality of the use of microspheres associated with the impossibility of placing the necessary objects in them in the finished microspheres.
Известен способ получения микросфер, содержащих микроскопические биологические объекты, в частности, сперматозоиды млекопитающих, включающий смешивание гелеобразного вещества, физиологической среды и спермы с последующим распылением и образованием микрокапсул, содержащих сперматозоиды [патент США № 6596310, опубл. 2003, А 61К9/52]. Приготовление микрокапсул осуществляли следующим образом: раствор, состоящий из альгината натрия, агарозы, плавящейся при температуре 37-42°С, и веществ, препятствующих капацитации спермы (фруктозо-6-фосфат), смешивали со спермой, потом полимеризовали эту смесь в микросферы в присутствии ионов кальция, калия и фосфатов, при этом происходила полимеризация альгината с образованием стенки микросферы. Затем смесь немного охлаждали, например, до комнатной температуры, что вызывало полимеризацию агарозы и иммобилизацию (обездвиживание) сперматозоидов, а потом растворяли альгинатную твердую стенку в цитрате натрия. В результате происходит образование суспензии иммобилизованных в сферических микроблоках некапацитированных сперматозоидов.A method of obtaining microspheres containing microscopic biological objects, in particular, mammalian spermatozoa, including mixing a gel-like substance, physiological medium and sperm, followed by spraying and formation of microcapsules containing sperm [US patent No. 6596310, publ. 2003, A 61K9 / 52]. Preparation of microcapsules was carried out as follows: a solution consisting of sodium alginate, agarose, melting at a temperature of 37-42 ° C, and substances that prevent the accumulation of sperm (fructose-6-phosphate), was mixed with sperm, then polymerized this mixture into microspheres in the presence of ions of calcium, potassium and phosphates, while alginate is polymerized to form the wall of the microsphere. Then the mixture was slightly cooled, for example, to room temperature, which caused the polymerization of agarose and the immobilization (immobilization) of spermatozoa, and then dissolved the alginate solid wall in sodium citrate. As a result, a suspension of uncapacitated spermatozoa immobilized in spherical microblocks occurs.
С существенными признаками первого объекта заявляемого изобретения совпадают такие признаки прототипа, как получение микросфер путем распыления над жидкой средой смеси с последующим перемещением образовавшихся микросфер в жидкую среду.With the essential features of the first object of the claimed invention, such features of the prototype coincide, such as obtaining microspheres by spraying a mixture over a liquid medium, followed by transferring the formed microspheres into a liquid medium.
С существенными признаками второго объекта заявляемого изобретения совпадают такие признаки прототипа, как форма сферическая форма и наличие агарозного геля в стенках.With the essential features of the second object of the claimed invention, such features of the prototype coincide, such as the shape of a spherical shape and the presence of an agarose gel in the walls.
Получению требуемого технического результата препятствует положенный в основу способа получения микросфер принцип химической сопряженной полимеризации в жидкой дисперсионной среде, что приводит к необходимости введения биологических объектов непосредственно в среду, которая подвергается распылению, наличие биологической среды во время прохождения химических реакций, что увеличивает риск потери уникальных биологических материалов. Указанный способ не применим для сохранения единичных уникальных биологических материалов.Obtaining the required technical result is hampered by the principle of chemical conjugated polymerization in a liquid dispersion medium underlying the method of producing microspheres, which leads to the necessity of introducing biological objects directly into the medium that is sprayed, the presence of a biological medium during the passage of chemical reactions, which increases the risk of loss of unique biological materials. This method is not applicable to the preservation of single unique biological materials.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка новых микроконтейнеров для локализации и хранения микроскопических биологических объектов.The challenge to which the invention is directed, is the development of new microcontainers for the localization and storage of microscopic biological objects.
Технический результат заключается в реализации расширения арсенала технических средств для локализации и хранения микроскопических биологических объектов. Технический результат заключается в упрощении способа получения полых микросфер, улучшении стерильности процесса, получении нового устройства для локализации и хранения биологических микроскопических объектов из биохимически инертного и нетоксичного материала. Технически результат заключается также в повышении прозрачности, однородности и упругости стенки полой микросферы.The technical result consists in the implementation of the expansion of the arsenal of technical means for the localization and storage of microscopic biological objects. The technical result consists in simplifying the method of obtaining hollow microspheres, improving the sterility of the process, obtaining a new device for localizing and storing biological microscopic objects from biochemically inert and non-toxic material. The technical result is also to increase the transparency, uniformity and elasticity of the wall of the hollow microsphere.
Для достижения вышеуказанного технического результата по первому объекту изобретения в способ получения полых микросфер характеризуется тем, что над водной средой осуществляют распыление водного раствора расплавленной агарозы с образованием аэрозоля в газовой среде при температуре ниже температуры застудневания водного раствора агарозы, с последующим перемещением образовавшихся микросфер в водную среду.To achieve the above technical result according to the first aspect of the invention, the method for producing hollow microspheres is characterized by spraying an aqueous solution of molten agarose over an aqueous medium with the formation of an aerosol in a gaseous medium at a temperature below the freezing point of an aqueous solution of agarose, followed by moving the resulting microspheres into an aqueous medium .
В частных случаях выполнения изобретения по первому объекту перед распылением водный раствор расплавленной агарозы нагревают до температуры кипения В частных случаях выполнения изобретения по первому объекту в качестве газовой среды используют воздушную среду или среду инертных газов.In particular cases of carrying out the invention on the first object, before spraying, an aqueous solution of molten agarose is heated to the boiling point. In particular cases of carrying out the invention on the first object, an air medium or an inert gas environment is used as the gaseous medium.
В частных случаях выполнения изобретения по первому объекту для приготовления водного раствора агарозы используют деионизованную воду.In private cases, the implementation of the invention according to the first object for the preparation of an aqueous solution of agarose using deionized water.
В частных случаях выполнения изобретения по первому объекту в качестве водной среды, над которой осуществляют распыление и в которую перемещаются образовавшиеся микросферы, используют водную среду предварительно охлажденную до температуры от 3 до 10°С.In private cases, the implementation of the invention in the first object as an aqueous medium over which carry out spraying and in which the formed microspheres move, use the aqueous medium previously cooled to a temperature of from 3 to 10 ° C.
В частных случаях выполнения изобретения по первому объекту распыление водного раствора расплавленной агарозы осуществляют под давлением через форсунку с диаметром сопла от 50 до 200 мкм.In private cases, the implementation of the invention in the first object, the spraying of an aqueous solution of molten agarose carried out under pressure through a nozzle with a nozzle diameter of 50 to 200 microns.
Для достижения вышеуказанного технического результата по второму объекту изобретения микросфера, характеризуется тем, что выполнена полой, ее диаметр составляет от 50 до 200 мкм, а стенка выполнена из агарозного геля, образованного застудневанием 0,5-2% водного раствора расплавленной агарозы.To achieve the above technical result according to the second object of the invention, the microsphere is characterized by the fact that it is made hollow, its diameter is from 50 to 200 microns, and the wall is made of an agarose gel formed by gelling a 0.5-2% aqueous solution of molten agarose.
В частных случаях выполнения изобретения по второму объекту толщина стенки микросферы составляет от 10 до 25 мкм.In private cases, the execution of the invention according to the second object, the thickness of the wall of the microsphere is from 10 to 25 microns.
В отличие от описанных в уровне технике способов в заявляемом изобретении используют водный раствор расплавленной агарозы, а в качестве жидкой среды, в которую перемещаются микросферы, водная среда, что позволяет обеспечить наибольшую стерильность процесса. Распыление с образованием аэрозоля в газовой среде при температуре ниже температуры застудневания водного раствора агарозы, с последующим перемещением образовавшихся микросфер в водную среду, исключает химические реакции при образовании полых микросфер, за счет чего стенки микросфер имеют большую однородность, прозрачность и достаточную упругость. Полученные заявленным способом полые микросферы сразуIn contrast to the methods described in the prior art, in the invention, an aqueous solution of molten agarose is used, and an aqueous medium is used as the liquid medium in which the microspheres are transferred, which allows for the highest sterility of the process. Spraying with the formation of an aerosol in a gaseous medium at a temperature below the gel point of an aqueous solution of agarose, followed by transfer of the formed microspheres into the aqueous medium, eliminates chemical reactions during the formation of hollow microspheres, due to which the walls of the microspheres have greater uniformity, transparency and sufficient elasticity. Obtained by the claimed method hollow microspheres immediately
- 2 007992 готовы к размещению в них микроскопических биологических объектов. Использование водного раствора расплавленного агарозного геля позволяет получить полые микросферы из биохимически инертного и нетоксичного материала, что исключает возможность инифицирования или неблагоприятного воздействия на биологические объекты.- 2 007992 ready for placement of microscopic biological objects in them. The use of an aqueous solution of molten agarose gel makes it possible to obtain hollow microspheres from biochemically inert and non-toxic material, which excludes the possibility of initiating or adverse effects on biological objects.
В отличие от описанных в уровне техники микросфер в заявляемом изобретении микросфера выполнена полой, а в прототипе образующаяся сфера не является полой, т. к. в результате процесса заполнена полимерным гелем, в котором иммобилизированы сперматозоиды. В отличие от прототипа стенки микросфер состоят только из агарозного геля, без включений. По сравнению с прототипом размеры микросферы гораздо меньше.In contrast to the microspheres described in the prior art, in the invention, the microsphere is made hollow, and in the prototype, the resulting sphere is not hollow, because the process is filled with a polymer gel in which spermatozoa are immobilized. Unlike the prototype, the walls of microspheres consist only of agarose gel, without inclusions. Compared with the prototype, the size of the microsphere is much smaller.
Изобретение поясняется чертежами, где на фиг. 1 - схематично представлен способ получения полых микросфер;The invention is illustrated by drawings, where in FIG. 1 shows a schematic representation of a method for producing hollow microspheres;
на фиг. 2 - представлена фотография полученных микросфер из агарозного геля, на фиг. 3 - представлена фотография одной микросферы из агарозного геля, на фиг. 4 - представлена фотография подведения иглы к полой микросфере, на фиг. 5 - представлена фотография полой микросферы с введенным в нее сперматозоидом. Изобретение осуществляется следующим образом.in fig. 2 is a photograph of the microspheres obtained from an agarose gel; FIG. 3 shows a photograph of a single microsphere from an agarose gel; FIG. 4 is a photograph of a needle leading to a hollow microsphere; FIG. 5 - a photograph of a hollow microsphere with a sperm introduced into it. The invention is as follows.
В качестве материала для изготовления полых микросфер используют агарозу. Агароза относится к так называемым полиуроновым или альгиновым кислотам, это полисахарарид, состоящий из Όгалактозы и 3,6-ангидро-Ь галактозы. Агароза достаточно биологически инертна и совершенно нетоксична для биологических объектов, в том числе гамет и эмбрионов человека. Хорошо известно свойство агарозы связывать воду и образовывать гидрогель. Агарозный гель упругий, проницаемый, в тонком слое достаточно прозрачен. Такой гидрогель по своей биохимической структуре и физическим свойствам во многом сходен с веществом, образующим хопае ре11ис1бае (прозрачные оболочки яйцеклеток мыши, хомячка или человека), но лишен ряда недостатков и более доступен.As the material for the manufacture of hollow microspheres using agarose. Agarose refers to the so-called polyuronic or alginic acids, it is a polysaccharide consisting of Ό galactose and 3,6-anhydro-b galactose. Agarose is quite biologically inert and completely non-toxic to biological objects, including gametes and human embryos. The property of agarose to bind water and form a hydrogel is well known. Agarose gel is elastic, permeable, in a thin layer is quite transparent. Such a hydrogel, in its biochemical structure and physical properties, is in many respects similar to the substance forming the hopaye reisensbaye (transparent membranes of mouse, hamster, or human eggs), but lacks a number of drawbacks and is more accessible.
Способ получения микросфер основан на использовании в качестве матрицы микроскопических пузырьков воздуха, образующихся в аэрозольных частицах при распылении расплавленного водного раствора агарозы. Готовят водный раствор расплавленной агарозы, предпочтительно используя деионизованную воду. Процент агарозы в водном растворе может быть от 0,5 до 2%). Затем раствор нагревают до температуры приблизительно +100°С. Затем приготовленный раствор 1 распыляется под давлением через микрофорсунку 2 (фиг. 1). Обычно диаметр микрофорсунки 2 составляет от 50 до 200 мкм. Распыление производят в газовой среде, например воздушной среде или среде инертных газов, температуре ниже температуры застудневания водного раствора агарозы. Распыление осуществляют над поверхностью водной среды 3, например холодной (от 3 до 10°С) деионизованной воды. Образующиеся в аэрозоле микропузырьки полимеризуются в газовой среде, т. к. температура газовой среды ниже температуры застудневания водного раствора агарозы, образуя микросферы 4. Образующиеся микросферы, оседая на поверхности, перемещаются в водную среду. Стенки микросфер образованы застудневшим раствором агарозы, для которого применяется понятие агарозный гель. Газы, находящиеся в полости микросфер, через стенку агарозного геля растворяются в холодной воде, и микросферы оседают на дно (фиг. 1). Осевшие на дно микросферы из агарозного геля собирают под контролем бинокулярной лупы при помощи стеклянной микропипетки с диаметром сопла примерно 130-200 мкм и помещают в выбранную среду.The method of producing microspheres is based on using as a matrix microscopic air bubbles formed in aerosol particles when spraying a molten aqueous solution of agarose. Prepare an aqueous solution of molten agarose, preferably using deionized water. The percentage of agarose in aqueous solution can be from 0.5 to 2%). Then the solution is heated to a temperature of approximately + 100 ° C. Then, the prepared solution 1 is sprayed under pressure through the micro nozzle 2 (Fig. 1). Typically, the diameter of microtsunk 2 is from 50 to 200 microns. Spraying is carried out in a gaseous medium, for example, an air medium or an inert gas medium, at a temperature below the gel point of an aqueous solution of agarose. Spraying is carried out over the surface of the aqueous medium 3, for example cold (from 3 to 10 ° C) deionized water. The microbubbles formed in the aerosol polymerize in a gaseous environment, since the temperature of the gaseous medium is lower than the gel point temperature of the aqueous solution of agarose, forming microspheres 4. The resulting microspheres, settling on the surface, move into the aqueous medium. The walls of the microspheres are formed by a starchy solution of agarose, for which the concept of agarose gel is used. Gases in the cavity of the microspheres through the wall of the agarose gel dissolve in cold water, and the microspheres settle to the bottom (Fig. 1). Microspheres of agarose gel settled to the bottom are collected under the control of a binocular loupe using a glass micropipette with a nozzle diameter of about 130-200 microns and placed in the chosen medium.
Полученные аэрозольным способом микросферы имеют диаметр от 50 до 200 мкм, с оболочками различной толщины от 10 до 25 мкм и внутреннюю замкнутую полость (фиг. 2).The microspheres obtained by the aerosol method have a diameter of from 50 to 200 μm, with shells of various thickness from 10 to 25 μm and an internal closed cavity (Fig. 2).
Полученные таким образом полые микросферы могут быть использованы для хранения и криоконсервации сперматозоидов млекопитающих, для локализации стволовых клеток с целью изучения дифференцировки стволовых клеток, для приготовления ультратонких срезов в электронной микроскопии, для обучения манипуляциям с ооцитами и ранними эмбрионами млекопитающих.Hollow microspheres obtained in this way can be used for storing and cryopreservation of mammalian spermatozoa, for localizing stem cells to study stem cell differentiation, for preparing ultrathin sections in electron microscopy, for teaching manipulations with oocytes and early mammalian embryos.
Изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами, которые не охватывают весь объем притязаний, но и не ограничивают его.The invention is illustrated by the examples below, which do not cover the entire scope of the claims, but do not limit it.
Пример 1. Использование полых микросфер из агарозного геля для локализации сперматозоидов с целью последующей криоконсервации.Example 1. The use of hollow microspheres from agarose gel for the localization of spermatozoa for subsequent cryopreservation.
Последовательность операций представлена на фиг. 3-5.The sequence of operations is shown in FIG. 3-5
Подвижные сперматозоиды человека инъецировали в полые микросферы из агарозного геля диаметром 150-200 мкм, в количестве от 1-10 шт. на микросферу, используя базовую технику, оборудование и расходные материалы для инъекции методом 1С81. Сперматозоид, выбранный для локализации инъекции набирают в иглу (фиг. 3). Микросферы фиксируют присасывающей микропипеткой (фиг. 3, 4). Инъекционной иглой прокалывают оболочку (стенку) полой микросферы из агарозного геля и вводят сперматозоид (фиг. 5). Микросферы с помещенными в них сперматозоидами под контролем бинокулярной лупы при помощи пластиковой пипетки-капилляра переносили в раствор криопротектора, содержащий 50% среды 8регш Ргеехйщ Мебшш (МеФСиЙ, Дания) и 50% среды 8регш РгерагаДоп МеФиш (МеФСиЙ, Дания), на 5-10 мин. Затем микросферы помещали в пластиковую соломину для криоконсервации объемом 250 мкл. Соломины замораживали в течение 30 мин в парах жидкого азота, после чего погружали непосредственно в жидкий азот на время от 30 мин до 2 сут. Размораживание проводили, помещая солоHuman spermatozoa were injected into hollow microspheres from agarose gel with a diameter of 150-200 microns, in an amount of from 1-10 pcs. on the microsphere using basic equipment, equipment and consumables for injection using the 1S81 method. The sperm selected to localize the injection is collected in the needle (Fig. 3). Microspheres fixed suction micropipette (Fig. 3, 4). An injection needle pierces the shell (wall) of the hollow microsphere from an agarose gel and injects the spermatozoon (Fig. 5). Microspheres placed in them under the control of sperm binocular magnifier with a plastic pipette, capillary transferred to a cryoprotectant solution containing 50% medium 8regsh Rgeehysch Mebshsh (MeFSiY, Denmark) and 50% medium 8regsh RgeragaDop MeFish (MeFSiY, Denmark), at 5-10 min Then the microspheres were placed in a plastic cryopreservation straw with a volume of 250 μl. Straws were frozen for 30 minutes in vapors of liquid nitrogen, after which they were immersed directly in liquid nitrogen for a period of from 30 minutes to 2 days. Defrosting was performed by placing a solo.
- 3 007992 мины под струю холодной проточной воды, микросферы извлекали из соломин и отмывали в 5 каплях среды 8регт Бгеехтд МеФит (МеФСиИ, Дания). Жизнеспособность сперматозоидов после размораживания оценивали по сохранению подвижности. Таким способом было заморожено 253 подвижных сперматозоида в 54 микросферах из агарозного геля. После криоконсервации и последующего размораживания все сперматозоиды сохранили характерную нормальную морфологию, что указывает на отсутствие серьезных механических повреждений, связанных с образованием кристаллов льда. Из 253 сперматозоидов 162 (64%) сохранили подвижность.- 3 007992 mines under a stream of cold running water, the microspheres were removed from the straws and washed in 5 drops of 8grt Bgeehtd MeFit medium (MeFSI, Denmark). The viability of spermatozoa after thawing was assessed by the preservation of mobility. In this way, 253 motile sperm were frozen in 54 microspheres from an agarose gel. After cryopreservation and subsequent thawing, all spermatozoa retained their characteristic normal morphology, which indicates the absence of serious mechanical damage associated with the formation of ice crystals. Of the 253 spermatozoa, 162 (64%) remained motile.
Пример 2. Использование полых микросфер из агарозного геля для изучения дифференцировки стволовых клеток.Example 2. The use of hollow microspheres from agarose gel to study the differentiation of stem cells.
Выделяли перевиваемые клетки тератокарциномы мыши, обрабатывали раствором трипсин-ЭДТА и помещали в микросферы из агарозы с диаметром внутренней полости 90 мкм, в количестве 50-100 клеток на микросферу, с использованием техники 1С81. Помещенные в микросферы из агарозы группы стволовых клеток тератокарциномы культивировали при 37°С в атмосфере трехгазовой смеси (5% СО2, 5% О2, 90% Ν2) в среде БМЕМ с добавлением Ь-меркаптоэтанола. В этих условиях клетки тератокарциномы образуют эмбриоидные тельца, в которых происходит тканевая дифференцировка клеток. Микро сферы с заключенными в них эмбриоидными тельцами были использованы для гистологического анализа с применением иммуноцитохимических методик.The transplanted teratocarcinoma cells of the mouse were isolated, treated with trypsin-EDTA solution and placed in microspheres from agarose with an internal cavity diameter of 90 μm, in an amount of 50-100 cells per microsphere, using 1C81 technique. Teratocarcinoma stem cell groups placed in agarose microspheres were cultured at 37 ° C in an atmosphere of a three-gas mixture (5% CO 2 , 5% O 2 , 90% 2 ) in BMEM medium supplemented with L-mercaptoethanol. Under these conditions, teratocarcinoma cells form embryoid bodies in which tissue differentiation of cells occurs. Microspheres with embryoid bodies enclosed in them were used for histological analysis using immunocytochemical techniques.
Пример 3. Использование полых микросфер из агарозного геля с целью приготовления ультратонких срезов в электронной микроскопии.Example 3. The use of hollow microspheres of agarose gel with the aim of preparing ultrathin sections in electron microscopy.
Единичные живые клетки или группы клеток помещают в микросферы из агарозного геля с использованием техники 1С81. Микросферы с помещенными в них микроскопическими объектами фиксируют, окрашивают и после соответствующей подготовки заключают в блоки из эпоксидной смолы. Помещение в микросферы из агарозного геля делает возможным визуализацию микроскопических объектов из эпоксидной смолы, что значительно облегчает приготовление ультратонких срезов для электронной микроскопии.Single living cells or groups of cells are placed in microspheres from agarose gel using 1C81 technique. Microspheres with microscopic objects placed in them are fixed, painted and, after appropriate preparation, are enclosed in epoxy resin blocks. Placing microspheres from agarose gel makes it possible to visualize microscopic objects from epoxy resin, which greatly facilitates the preparation of ultrathin sections for electron microscopy.
Пример 4. Использование полых микросфер из агарозного геля для обучения манипуляциям с ооцитами и ранними эмбрионами.Example 4. The use of hollow microspheres of agarose gel for training in the manipulation of oocytes and early embryos.
Манипуляции с ооцитами и ранними (доимплантационными) зародышами млекопитающих при экстракорпоральном оплодотворении (ЭКО) в медицинских или научных целях проводят под контролем бинокулярной лупы при помощи пластиковой или стеклянной микропипетки-капилляра. При обучении эмбриологов-клиницистов, зоотехников и биологов работе с этими микроскопическими объектами обычно используют биологический материал, подлежащий утилизации (погибшие ооциты и эмбрионы). Такой материал может быть недоступен в нужный момент в необходимом количестве, особенно при групповом обучении. По размеру, внешнему виду и оптическим свойствам микросферы из агарозы сходны с ооцитами и ранними (доимплантационными) зародышами млекопитающих и могут быть с успехом использованы в качестве их адекватной альтернативы.Manipulations with oocytes and early (pre-implantation) mammalian embryos for extracorporeal fertilization (IVF) for medical or scientific purposes are carried out under the control of a binocular magnifying glass using a plastic or glass micropipette-capillary. When teaching clinical embryologists, zootechnicians and biologists to work with these microscopic objects, biological material is usually used for disposal (dead oocytes and embryos). Such material may be unavailable at the right time in the required quantity, especially during group training. Microspheres from agarose are similar in size, appearance, and optical properties to oocytes and early (pre-implantation) mammalian embryos and can be successfully used as their adequate alternative.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет с достаточной простотой получить полые микросферы из агарозного геля с многофункциональным назначением по локализации микроскопических биологических объектов. Использование полученных полых микросфер позволяет визуализировать объект как при помощи оптики (микроскопы, бинокулярные лупы, увеличительные стекла), так и без нее; совершать с микроскопическим объектом манипуляции под контролем микроскопа, бинокулярной лупы или без использования оптических средств; избежать или минимизировать риск утери микроскопического объекта при совершении с ним манипуляций.Thus, the proposed method allows with sufficient simplicity to obtain hollow microspheres from an agarose gel with a multifunctional purpose for the localization of microscopic biological objects. The use of the obtained hollow microspheres allows visualization of the object both with the help of optics (microscopes, binocular loupes, magnifying glasses), and without it; perform a microscopic manipulation with a microscopic object under the control of a microscope, a binocular loupe or without the use of optical means; to avoid or minimize the risk of losing a microscopic object when manipulating it.
Claims (8)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA200600708A EA007992B1 (en) | 2005-12-29 | 2005-12-29 | Process for producing hollow microspheres and hollow microsphere thus obtained |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA200600708A EA007992B1 (en) | 2005-12-29 | 2005-12-29 | Process for producing hollow microspheres and hollow microsphere thus obtained |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200600708A1 EA200600708A1 (en) | 2007-02-27 |
| EA007992B1 true EA007992B1 (en) | 2007-02-27 |
Family
ID=42121399
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200600708A EA007992B1 (en) | 2005-12-29 | 2005-12-29 | Process for producing hollow microspheres and hollow microsphere thus obtained |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA007992B1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110167666A (en) * | 2016-10-19 | 2019-08-23 | 界面咨询有限责任公司 | Sacrifice microballoon |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1355212A1 (en) * | 1984-06-22 | 1987-11-30 | Институт проблем криобиологии и криомедицины АН УССР | Method of preserving manъs sperm |
| US6596310B1 (en) * | 2000-08-23 | 2003-07-22 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Method of artificial insemination by timed release of sperm from capsules or solid beads |
-
2005
- 2005-12-29 EA EA200600708A patent/EA007992B1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1355212A1 (en) * | 1984-06-22 | 1987-11-30 | Институт проблем криобиологии и криомедицины АН УССР | Method of preserving manъs sperm |
| US6596310B1 (en) * | 2000-08-23 | 2003-07-22 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Method of artificial insemination by timed release of sperm from capsules or solid beads |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MONTAG M. et al., Laser-assisted cryopreservation of single human spermatozoa in cell-free zona pellucida. Andrologia, 1999, 31, Ôäû 1, s. 49-53, referat [naydeno 30.06.2006] Medline [on-layn] PMID: 9949889 * |
| WALMSLEY R. et al., The first births and ongoing pregnancies associated with sperm cryopreservation within evacuated egg zonae, Hum. Reprod., 1998, Dec, 13 Suppl 4, p. 61-70, referat [naydeno 30.06.2006] Medline [on-layn] PMID: 10091058 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110167666A (en) * | 2016-10-19 | 2019-08-23 | 界面咨询有限责任公司 | Sacrifice microballoon |
| CN110167666B (en) * | 2016-10-19 | 2023-03-10 | 界面咨询有限责任公司 | Sacrificial microspheres |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA200600708A1 (en) | 2007-02-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zimmermann et al. | Alginate-based encapsulation of cells: past, present, and future | |
| Brito et al. | Three-dimensional systems for in vitro follicular culture: overview of alginate-based matrices | |
| CN101312756A (en) | Nerve guide | |
| JP2013528435A (en) | Apparatus for manipulating biological material in the process of cryopreservation and use of such apparatus | |
| CN112972760B (en) | Endothelial extracellular matrix loaded 3D printing bone defect repair support and preparation method thereof | |
| JPH02504221A (en) | Cell culture methods, culture products and culture products | |
| Wu et al. | Vitreous cryopreservation of cell–biomaterial constructs involving encapsulated hepatocytes | |
| WO2016140716A1 (en) | Injectable microtissue systems, devices, and methods | |
| US6176089B1 (en) | Methods and compositions for cryopreservation of cells and tissues | |
| Flood et al. | Using hydrogels in microscopy: A tutorial | |
| US20070086986A1 (en) | Preparation of three-dimensional mammalian ovarian follicular cell and ovarin follicle culture systems in a biocompatible matrix | |
| Vajta et al. | Back to the future: optimised microwell culture of individual human preimplantation stage embryos | |
| Kuleshova et al. | Vitrification of encapsulated hepatocytes with reduced cooling/warming rates | |
| US20210123013A1 (en) | System for cell culture in a bioreactor | |
| CN111269877B (en) | Method for polymerization and in-vitro culture of embryo without zona pellucida before implantation | |
| EA007992B1 (en) | Process for producing hollow microspheres and hollow microsphere thus obtained | |
| Rowghani et al. | Maintenance of morphology and growth of ovarian follicles in suspension culture | |
| DK2048943T3 (en) | Preservation and controlled delivery / release of spermatozoa | |
| Gardner | Application of alginate gels to the study of mammalian development | |
| EA008674B1 (en) | Method for storing spermatozoa and product for telegenesis | |
| CN111849888A (en) | Method for efficiently inducing mesenchymal stem cells to differentiate into sweat glands based on 3D biological printing technology | |
| Plant et al. | Schwann Cell Transplantation Methods Using Biomaterials | |
| Metka et al. | Artifical Insemination Using a Micromanipulator | |
| Khunmanee et al. | Thiol-yne click crosslink hyaluronic acid/chitosan hydrogel for three-dimensional in vitro follicle development | |
| Espona-Noguera et al. | Immobilization of INS1E insulin-producing cells within injectable alginate hydrogels |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |