EA008674B1 - Method for storing spermatozoa and product for telegenesis - Google Patents
Method for storing spermatozoa and product for telegenesis Download PDFInfo
- Publication number
- EA008674B1 EA008674B1 EA200600709A EA200600709A EA008674B1 EA 008674 B1 EA008674 B1 EA 008674B1 EA 200600709 A EA200600709 A EA 200600709A EA 200600709 A EA200600709 A EA 200600709A EA 008674 B1 EA008674 B1 EA 008674B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- sperm
- spermatozoa
- microspheres
- microsphere
- cryopreservation
- Prior art date
Links
Abstract
Description
К уникальным единичным микроскопическим биологическим объектам могут быть отнесены единичные сперматозоиды, выделенные из спермы пациентов с тяжелой олигозооспермией (незначительное количество или почти полное отсутствие сперматозоидов), а также тканевых образцов, полученных в результате пункции яичка или придатка яичка у пациентов с азооспермией (полное отсутствие сперматозоидов в сперме). Такие сперматозоиды являются уникальным биологическим материалом пациента, стремление которого иметь генетически собственных детей должно быть по возможности удовлетворено.Unique spermatozoa isolated from the sperm of patients with severe oligozoospermia (a small amount or almost complete absence of sperm), as well as tissue samples obtained as a result of puncture of the testis or epididymis in patients with azoospermia (complete absence of spermatozoa, can be referred to unique microscopic biological objects). in semen). Such spermatozoa are a unique biological material of the patient, the desire of which to have genetically own children should be satisfied if possible.
К уникальным микроскопическим биологическим объектам могут быть отнесены и сперматозоиды беспозвоночных и позвоночных животных, в том числе быков, лошадей, а также исчезающих видов животных.Spermatozoa of invertebrates and vertebrates, including bulls, horses, and also endangered species of animals, can be attributed to unique microscopic biological objects.
В случае высокого риска невозможности получения мужских половых клеток требуется криоконсервация полученных единичных сперматозоидов. Основная проблема состоит в том, что в процессе криоконсервации и подготовки к непосредственному использованию полученные сперматозоиды могут быть утрачены даже в небольших, порядка нескольких микролитров, объемах.In the case of a high risk of the impossibility of obtaining male germ cells, cryopreservation of the obtained single spermatozoa is required. The main problem is that in the process of cryopreservation and preparation for direct use, the resulting sperm can be lost even in small volumes of the order of several microliters.
Решить эту проблему позволяют микроконтейнеры. Физически локализуя объект в большем объеме, микроконтейнеры значительно упрощают и облегчают манипуляции, связанные с обработкой криопротекторами (веществами, снижающими повреждающие эффекты замораживания), размораживанием и поиском сперматозоидов для оплодотворения методом 1С81 (искусственное введение под микроскопом единичного сперматозоида в яйцеклетку при помощи специального стеклянного капилляра-иглы).Microcontainers allow to solve this problem. By physically localizing the object in a larger volume, microcontainers greatly simplify and facilitate the manipulations associated with processing with cryoprotectants (substances that reduce the damaging effects of freezing), thawing and searching for spermatozoa for fertilization using the 1C81 method (artificially introducing a single sperm cell into the egg using a microscope needles).
В настоящее время криоконсервация единичных сперматозоидов в микроконтейнерах не является распространенной практикой в клинической эмбриологии, но являет собой скорее демонстрацию экспериментальных возможностей. Одним из условий успешного внедрения криоконсервации единичных сперматозоидов в клиническую практику является наличие постоянного и легкодоступного источника микроконтейнеров, которые в полной мере отвечали бы своему предназначению.Currently, cryopreservation of single sperm in microcontainers is not a common practice in clinical embryology, but rather a demonstration of experimental capabilities. One of the conditions for the successful implementation of cryopreservation of single spermatozoa in clinical practice is the presence of a constant and easily accessible source of microcontainers that would fully meet their purpose.
Такие контейнеры должны быть достаточно малы, чтобы обеспечить локализацию отдельного сперматозоида в пределах манипуляционного поля. Идеальный размер контейнера, очевидно, должен быть соизмерим с длиной сперматозоида (не менее 60 мкм), с тем чтобы производить манипуляции под микроскопом с одним объективом (суммарное увеличение ~ 200х). Размер более 500 мкм затрудняет манипуляции. Наиболее подходящая для манипуляций с использованием техники 1С81 форма контейнера сфероидная.Such containers should be small enough to allow localization of a single sperm within the manipulation field. The ideal container size should obviously be commensurate with the length of the sperm (at least 60 microns) in order to perform manipulations under a microscope with a single lens (total magnification ~ 200 x ). The size of more than 500 microns complicates the manipulation. The spheroid shape of the container is most suitable for manipulations using the 1C81 technique.
Микроконтейнеры должны быть прозрачны, а также иметь упругую стенку, чтобы обеспечить захват их присасывающим капилляром и избежать деформации при помещении или извлечении сперматозоида микроинъекционной иглой.Microcontainers must be transparent, and also have an elastic wall to ensure that they are captured by the suction capillary and to avoid deformation when the sperm is placed or the microinjection needle is removed.
Есть несколько путей получения микроконтейнеров для криоконсервации единичных сперматозоидов. Одним из очевидных способов является использование естественных микросфероидов растительного или животного происхождения. Это могут быть оболочки яиц животных организмов или пыльцы растений, оболочки или покровы каких-либо организменных структур. Сложность поиска адекватных природных микроконтейнеров усугубляется необходимостью их предварительной обработки для удаления содержимого или дезактивации биологически активных веществ и придания требуемых свойств. В настоящее время в качестве микроконтейнеров естественного происхождения успешно используют пустые хопае ре11ис1бае (прозрачные оболочки яйцеклеток) мыши, хомячка или человека, поскольку эти контейнеры идеально соответствуют указанным выше характеристикам [Сойеп I., Сапга С.Т. Сопдебо-Ееггага Т.А., К1еск К.А., 8еЫшше1 Т.№., 8сой В.Т. Сгуоргекегуайоп оГ кшд1е йишап крегшаЮхоа//Ниш. Вергоб. 1997. V. 12. Р. 994-1001], [№а1шк1еу В., Сойеп I., Еетгата-Сопдебо Т., Вешд А., Сайта I. Тйе Ь1Пйк апб опдошд ргедпапаек аккоааЮб χνίΐΐι крегт сгуоргекегуайог еуасиа!еб едд хопае//Ншп. Вергоб. 1998. V. 13. 8ирр1 4. Р. 61-70], [Ьш I., 2йепд Χ.Ζ., Вагатк1 Т.А., Сотр1оп С., Υηχίβί В.А., Ка1х Е. Стуорге-кегуайоп оГ а кта11 питЬег оГ Ггекй йитап 1екйси1аг крегтаЮхоа апб 1екйси1аг крегтаЮхоа сийипеб ш уйго Гог 3 баук ш ап етр1у хопа ре11ис1ба//1. Апбго1. 2000. V. 21. Р. 409-413], [Нией Υ., Тка1 Н., Сйапд С., Ьо Н. Сгуоргекегуайоп оГ йитап крегтаЮхоа \νί11ιίπ йитап ог тоике етр1у хопа ре11ис1бае//Еегй1. 81егб. 2000. V. 73. Р. 694698], [Вопш А., 8егеш Е., Вопи., Е1ат1дш С. Егеехшд а Ге\\' 1екйси1аг крегтаЮхоа гейгеуеб Ьу ТЕ8А//Мо1. Се11. Епбосппо1. 2000. V. 169. Р. 27-32], [Ьеу1-8е1й Р.Е., А1Ьаш Е., №дп Ь., Секапа А., Ыоуага Р., В1апсЫ 8. Сгуоргекегуайоп оГ а кта11 питЬег оГ крегтаЮхоа ш уо1к-й11еб йитап хопае ре11иабае//Агсй. Йа1. Иго1. Апбго1. 2003. V. 75. V. 195-198].There are several ways to obtain microcontainers for cryopreservation of single sperm. One obvious way is to use natural microspheroids of plant or animal origin. It can be shells of eggs of animal organisms or pollen of plants, shell or cover of any organism structures. The difficulty of finding adequate natural microcontainers is compounded by the need for their preliminary processing to remove the contents or deactivate biologically active substances and impart the required properties. Currently, empty hopae pe11is1bae (transparent egg shells) of a mouse, hamster, or human are successfully used as microcontainers of natural origin, since these containers perfectly correspond to the above characteristics [Soyep I., Sapga S.T. Sopdebo-Eeggaga T.A., K1esk K.A., 8eBb1, T.no., 8soy V.T. Sgorgekeguayop OG kshd1e yishap krebshaYuhoa // Nish. Vergob. 1997. V. 12. R. 994-1001], [No. a1shk1eu V., Soyep I., Etgata-Sopdebo T., Veshd A., Site I. Thye L1 Pyk apb oddod rzhedpapaek akkoaYub χνίΐΐι creg sguorgekeguayog euasiaeeb! // Nshp. Vergob. 1998. V. 13. 8irr1 4. P. 61-70], [LI I., 2yepd Χ.Ζ., Vagatk1 T.A., Sotrop S., Υηχίβί V.A., Ka1kh E. Storge-keguayop oG And KTA11 PITEG OG Ggeky yitap 1eksi1ag krgta Yuhoa apb 1eksi1ag krgtaYuhoi siiipeb sh uigo Gog 3 bauk sh ap etr1u hop re11is1ba // 1. Apbgo 1. 2000. V. 21. R. 409-413], [Niyo Υ., Tk1 N., Syapd S., Lauder Sguorgekeguayop oG yitap krestta Yuhoa \ νί11ιίπ yitap ogotike etr1u hop re11is1bae // Eegy1. 81egb. 2000. V. 73. P. 694698], [Vopsh A., 8egesh E., Vopi., E1at1dsh S. Egeehshd a Ge Ce11. Eppospo1. 2000. V. 169. R. 27-32], [Lew1-8e1y R.E., Alash E., No. L., Secapa A., Louaga R., Blaps 8. Sgorgekeguayop oG and kta11 piteg oG kregta Juhoha sh uo1k-y11eb yitap hope re11iabae // Agsy. Ya1. Yoke 1. Apbgo 1. 2003. V. 75. V. 195-198].
Однако описанные микроконтейнеры имеют некоторые существенные недостатки. Использование хопае ре11ис1бае животных и человека связано с риском инфицирования, а также с нежелательной в данном случае способностью сперматозоидов связываться с их поверхностью. Кроме того, подготовка таких контейнеров требует микрохирургических манипуляций по удалению содержимого, что значительно усложняет методику. Стерилизация хопае ре11ис1бае и биохимическая обработка с целью избежать связывания со сперматозоидом также создает дополнительные трудности.However, the described microcontainers have some significant drawbacks. The use of animal and human hopes is associated with a risk of infection, as well as with the undesirable ability of sperm to bind to their surface in this case. In addition, the preparation of such containers requires microsurgical manipulations to remove the contents, which greatly complicates the technique. The sterilization of hope re11isbae and biochemical treatment to avoid binding to the sperm also creates additional difficulties.
Известен способ хранения сперматозоидов млекопитающих для искусственного оплодотворения,A known method of storing mammalian sperm for artificial insemination,
- 1 008674 включающий сбор живых зрелых сперматозоидов или сперматозоидов с нарушенной мембраной, суспензирование их в физиологическую среду, поддерживающую жизнеспособность сперматозоидов, отобранных от выбранного вида млекопитающих с последующим помещением полученной суспензии в контейнер, замораживанием суспензии и высушиванием замороженных сперматозоидов под вакуумом до влажности не менее 1%. Сбор живых зрелых сперматозоидов млекопитающих осуществляют из спермы, которую помещают на дно пробирки, добавляют в нее физиологическую среду и центрифугируют, отделяют сперматозоиды, затем повторно суспенизируют отделенные сперматозоиды в физиологической среде до желаемой концентрации для процесса высушивания вымораживанием. Для получения сперматозоидов с нарушенной мембраной сперматозоиды обрабатывают анионным детергентом или ультразвуком. В качестве контейнеров используют ампулы стеклянные, пластиковые соломки, криотрубочки пластиковые [Патент России 2244525, МПК Α61Ό19/02, Α61Ό19/04, Α01Ν1/02, опубл. 2005 г.].- 1 008674 including collecting live mature spermatozoa or sperm cells with a disturbed membrane, suspending them in a physiological medium that maintains the viability of spermatozoa selected from the selected mammalian species, then placing the resulting suspension in a container, freezing the suspension and drying the frozen spermatozoa under vacuum to at least 1 to a vacuum to % The collection of live mature mammalian sperm is carried out from semen, which is placed on the bottom of the tube, added to it physiological medium and centrifuged, the sperm are separated, then the separated sperm are resuspended in the physiological medium to the desired concentration for the freeze-drying process. To produce spermatozoa with a broken membrane, sperm are treated with anionic detergent or ultrasound. As containers use glass ampoules, plastic straws, plastic cryotubes [Russian Patent 2244525, IPC ПК61Ό19 / 02, Α61Ό19 / 04, Α01Ν1 / 02, publ. 2005].
Получению требуемого технического результата в вышеописанном способе препятствует сложность подготовки сперматозоидов к хранению, необходимость значительного количества спермы и выделение из нее сперматозоидов.Obtaining the desired technical result in the above method is hampered by the complexity of preparing sperm for storage, the need for a significant amount of sperm and the release of sperm from it.
Известен способ хранения сперматазоидов, включающий смешивание спермы с нетоксичным гидрофильным полимером, выбранным из группы, состоящей из полиуретана, полиоксиэтилена и полиуретановых полиэстеровых полимеров с последующим микрокапсулированием смеси, охлаждением ее до получения геля и хранение полученных микрокапсул [Патент США 4840891, опубл. 1989, А 01Ν1/02]. При использовании указанного способа продуктом для искусственного оплодотворения являются микрокапсулы, содержащие сперматозоиды, заключенные в матрицы полимера, размещенные в инкубационной среде.A known method of storing spermatozoa, including mixing sperm with a non-toxic hydrophilic polymer selected from the group consisting of polyurethane, polyoxyethylene and polyurethane polyester polymers, followed by microencapsulation of the mixture, cooling it to a gel, and storing the obtained microcapsules [US Pat. No. 4,840,891, publ. 1989, A 01-1 / 02]. When using this method, the product for artificial insemination are microcapsules containing spermatozoa enclosed in polymer matrices placed in an incubation medium.
Получению требуемого технического результата в вышеописанном способе препятствуют высокие потери сперматозоидов при использовании вышеописанного способа.The achievement of the desired technical result in the above method is hindered by high sperm losses when using the above method.
Известен способ хранения сперматозоидов, включающий приготовление микрокапсул [Патент США 6596310, опубл. 1989, Α01Ν1/02]. Раствор, состоящий из альгината натрия, агарозы, плавящейся при температуре 37-42°С, и веществ, препятствующих капацитации спермы (фруктозо-6-фосфат), смешивали со спермой, потом полимеризовали эту смесь в микросферы в присутствии ионов кальция, калия и фосфатов, при этом происходила полимеризация альгината с образованием стенки микросферы. Затем смесь немного охлаждали, например до комнатной температуры, что вызывало полимеризацию агарозы и иммобилизацию (обездвиживание) сперматозоидов, а потом растворяли альгинатную твердую стенку в цитрате натрия. В результате происходит образование суспензии иммобилизованных в сферических микроблоках некапацитированных сперматозоидов.A known method of storing sperm, including the preparation of microcapsules [US Patent 6596310, publ. 1989, Α01Ν1 / 02]. A solution consisting of sodium alginate, agarose, melting at a temperature of 37-42 ° C, and substances that prevent sperm capacitation (fructose-6-phosphate) were mixed with sperm, then this mixture was polymerized in microspheres in the presence of calcium, potassium and phosphate ions while the polymerization of alginate occurred with the formation of the microsphere wall. Then the mixture was slightly cooled, for example, to room temperature, which caused the polymerization of agarose and immobilization (immobilization) of spermatozoa, and then the alginate solid wall was dissolved in sodium citrate. The result is the formation of a suspension of uncapitated sperm immobilized in spherical microblocks.
С существенными признаками первого объекта заявляемого изобретения совпадают такие признаки прототипа, как использование для хранения микросфер, стенки которых содержат агарозный гель, а также наличие инкубационной среды.Significant features of the first object of the claimed invention coincide with such features of the prototype as the use for storage of microspheres whose walls contain agarose gel, as well as the presence of an incubation medium.
С существенными признаками второго объекта заявляемого изобретения совпадают такие признаки прототипа, как наличие полой микросферы, стенка которой содержит агарозный гель, внутри которой находится инкубационная среда и сперматозоиды.Significant features of the second object of the claimed invention coincide with such features of the prototype as the presence of a hollow microsphere, the wall of which contains an agarose gel, inside which there is an incubation medium and sperm.
С существенными признаками третьего объекта заявляемого изобретения совпадают такие признаки прототипа, как наличие полой микросферы, стенка которой содержит агарозный гель, внутри которой находится среда и сперматозоиды, подвергнутой криоконсервации.Significant features of the third object of the claimed invention coincide with such features of the prototype as the presence of a hollow microsphere, the wall of which contains an agarose gel, inside which is a medium and spermatozoa subjected to cryopreservation.
Получению требуемого технического результата в вышеописанном способе препятствуют высокие потери сперматозоидов при использовании смешивания сперматозоидов с веществом, образующим капсулу.The achievement of the desired technical result in the above method is hindered by high sperm losses when using sperm mixing with the capsule-forming substance.
Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, - расширение арсенала технических средств для лечения бесплодия, сохранение исчезающих видов животных и размножение уникальных пород животных.The problem to which the invention is directed is to expand the arsenal of technical means for the treatment of infertility, preserve endangered species of animals and breed unique animal breeds.
Технический результат заключается в реализации расширения арсенала технических средств путем обеспечения возможности сохранения единичных сперматозоидов, повышении сохранения жизнеспособности сперматозоидов и их функции, в повышении нормальной морфологии и сохранения подвижности сперматозоидов после периода хранения, в улучшении стерильности процесса, что предотвращает возможность инфицирования сперматозоидов, за счет использования биологически безопасных микросфер, полученных из биологически инертного агарозного геля.The technical result consists in expanding the arsenal of technical means by ensuring the ability to preserve single sperm, increasing the preservation of viability of sperm and their function, increasing normal morphology and maintaining sperm motility after a period of storage, in improving the sterility of the process, which prevents the possibility of infection of sperm, due to the use biologically safe microspheres obtained from a biologically inert agarose gel.
Для достижения вышеуказанного технического результата по первому объекту изобретения в способе хранения сперматозоидов по меньшей мере один сперматозоид вводят путем инъекции в полую микросферу из агарозного геля, находящуюся в инкубационной среде.To achieve the above technical result according to the first aspect of the invention, in the sperm storage method, at least one sperm is injected into the hollow microsphere from an agarose gel in an incubation medium.
В частных случаях выполнения изобретения по первому объекту полые микросферы имеют диаметр от 50 до 200 мкм, а толщина стенки микросферы составляет от 10 до 25 мкм.In particular cases of carrying out the invention according to the first object, the hollow microspheres have a diameter of from 50 to 200 microns, and the wall thickness of the microspheres is from 10 to 25 microns.
В частном случае выполнения изобретения по первому объекту по меньшей мере одну микросферу по меньшей мере с одним помещенным в нее сперматозоидом помещают в раствор по меньшей мере одного криопротектора, а затем проводят криоконсервацию.In the particular case of the invention, according to the first object, at least one microsphere with at least one sperm placed in it is placed in a solution of at least one cryoprotectant, and then cryopreservation is carried out.
Для достижения вышеуказанного технического результата по второму объекту изобретения проTo achieve the above technical result according to the second object of the invention,
- 2 008674 дукт для искусственного оплодотворения ίη νίΐτο содержит по меньшей мере одну полую микросферу из агарозного геля, заполненную инкубационной средой, в которой путем инъекции размещен по меньшей мере один сперматозоид.- 2 008674 duct for artificial insemination ίη νίΐτο contains at least one hollow microsphere from an agarose gel filled with incubation medium in which at least one sperm is placed by injection.
В частном случае выполнения изобретения по второму объекту микросфера или микросферы имеют диаметр от 50 до 200 мкм.In the particular case of the invention according to the second object, the microsphere or microspheres have a diameter of from 50 to 200 microns.
Для достижения вышеуказанного технического результата по третьему объекту изобретения продукт для искусственного оплодотворения содержит подвергнутую криоконсервации по меньшей мере одну полую микросферу из агарозного геля, заполненную раствором по меньшей мере одного криопротектора, в которой путем инъекции размещен по меньшей мере один сперматозоид.In order to achieve the above technical result in the third aspect of the invention, the product for artificial insemination comprises cryopreserved at least one hollow microsphere of agarose gel filled with a solution of at least one cryoprotectant in which at least one sperm is placed by injection.
В частном случае выполнения изобретения по второму объекту микросфера или микросферы имеют диаметр от 50 до 130 мкм.In the particular case of the invention according to the second object, the microsphere or microspheres have a diameter of from 50 to 130 microns.
Объекты изобретения по отношению к прототипу характеризуется такими отличительными признаками, как введение сперматозоида путем инъекции в полую микросферу из агарозного геля.Objects of the invention in relation to the prototype is characterized by such distinguishing features as the introduction of a sperm by injection into a hollow microsphere from an agarose gel.
В отличие от описанных в уровне технике способов в заявляемом способе используют микросферы из агарозного геля в качестве микроконтейнеров для хранения и криоконсервации единичных сперматозоидов, что имеет неоспоримые преимущества, т.к. исключает возможность инифицирования или неблагоприятного воздействия на гаметы биологически активных веществ. Введение сперматозоидов путем инъекции позволяет, во-первых, сохранять единичные сперматозоиды, а, во-вторых, положительно сказывается на сохранении их нормальной морфологии. Использование полых микросфер обеспечивает достаточный объем для движения сперматозоида. Использование агарозного геля в качестве материала микросфер обеспечивает возможность прохождения обмена веществ через гелеобразную стенку микросферы, что положительно влияет на сохранение жизнеспособности сперматозоидов. Предварительное помещение единичных сперматозоидов в микросферы из агарозы локализует сперматозоиды в большей области пространства, что делает возможным совершать с ними необходимые для криоконсервации манипуляции с использованием бинокулярной лупы. При разморозке микросфер из агарозного геля с единичными сперматозоидами отсутствует необходимость трудоемких процедур поиска и выделения единичных сперматозоидов из большого объема эякулята.In contrast to the methods described in the prior art, the inventive method uses microspheres from agarose gel as microcontainers for storage and cryopreservation of single spermatozoa, which has undeniable advantages, because excludes the possibility of initiation or adverse effects on gametes of biologically active substances. The introduction of sperm by injection allows, firstly, to preserve single sperm, and, secondly, positively affects the preservation of their normal morphology. The use of hollow microspheres provides sufficient volume for sperm movement. The use of agarose gel as a material of microspheres provides the possibility of metabolism passing through the gel-like wall of the microsphere, which positively affects the preservation of sperm viability. The preliminary placement of single sperm into microspheres from agarose localizes the sperm in a larger region of space, which makes it possible to perform manipulations with them using cryopreservation using a binocular magnifier. When defrosting microspheres from an agarose gel with single spermatozoa, there is no need for laborious procedures for searching and isolating single spermatozoa from a large volume of ejaculate.
Изобретение поясняется чертежами, где на фиг. 1 схематично представлена операция подготовки к введению единичных сперматозоидов в полые микросферы из агарозного геля, используемое устройство вид сверху, на фиг. 2 схематично представлена операция подготовки к введению единичных сперматозоидов в полые микросферы из агарозного геля, используемые устройства вид сбоку, на фиг. 3 схематично представлена операция введения сперматозоида в полую микросферу, операция подведения иглы к сперматозоиду, на фиг. 4 схематично представлена операция введения сперматозоида в полую микросферу, операция захвата сперматозоида иглой, на фиг. 5 схематично представлена операция введения сперматозоида в полую микросферу, операция прокалывания стенки полой микросферы иглой, на фиг. 6 схематично представлена полая микросфера с введенным в нее единичным сперматозоидом, на фиг. 7 представлена фотография микросферы из агарозного геля, на фиг. 8 представлена фотография подведения иглы к полой микросфере, на фиг. 9 представлена фотография полой микросферы с введенным в нее сперматозоидом, на фиг. 10 - увеличенная фотография полой микросферы с введенным в нее сперматозоидом по фиг. 9. Заявляемый способ хранения сперматозоидов характеризуется выполнением следующих операций. В качестве камеры 1 для проведения способа можно использовать крышку от стерильной пластиковой чашки Петри диаметром 40 мм (фиг. 1) или специальные планшеты. По периферии перевернутой крышки делают несколько капель 2 инкубационной среды с буфером, поддерживающим рН 7,2-7,6. В центре крышки делают большую каплю 3 вязкой среды для снижения подвижности сперматозоидов. В качестве инкубационной среды для работы со спермой используют, например, 8ретт Ртератабоп Мебннп (Меб1Си11, Дания). [Тгоипкоп А., Оатбпет Ό.Κ. НапбЬоок оГ ίη νίίτο Геги1|/аОоп/СЯС Ргекк, 2000. 2-пб еб. 560 р.]. Капли среды заливают минеральным маслом 4. В периферические капли 2 помещают полые микросферы 5 из агарозного геля, а в центральную каплю 3 - сперматозоиды 6. Использование термина агарозный гель в заявляемом изобретении эквивалентно понятию агарозный студень. Для использования отбирают полые микросферы с диаметром от 50 до 200 мкм. Толщины стенки полых микросфер из агарозного геля оставляют от 10 до 25 мкм. Манипуляции с полыми микросферами 5 и сперматозоидами 6 проводят при помощи стеклянных микроинструментов 7, например специальной присасывающей пипетки, и прецизионных манипуляторов 8, например иглой микроинъектора, которую обычно используют для проведения 1С81 (ш1гасу1ор1акш1с крегт Щ)ес1юп, Тгоипкоп А., Оатбпет Ό.Κ. НапбЬоок оГ ш νίίΐΌ ГегИНтабоп/СКС Ргекк, 2000. 2-пб еб. 560 р.) (фиг. 2).The invention is illustrated by drawings, where in FIG. 1 schematically shows the operation of preparing for the introduction of single sperm into hollow microspheres from agarose gel, the device used is a top view, in FIG. 2 schematically shows the operation of preparing for the introduction of single sperm into hollow microspheres of agarose gel, the devices used are a side view, in FIG. 3 schematically shows the operation of introducing a sperm into the hollow microsphere, the operation of bringing the needle to the sperm, in FIG. 4 schematically shows the operation of introducing a sperm into the hollow microsphere, the operation of capturing the sperm with a needle, in FIG. 5 schematically shows the operation of introducing a sperm into the hollow microsphere, the operation of piercing the wall of the hollow microsphere with a needle, in FIG. 6 schematically shows a hollow microsphere with a single sperm inserted into it; FIG. 7 is a photograph of an agarose gel microsphere; FIG. 8 is a photograph of bringing the needle to the hollow microsphere; FIG. 9 is a photograph of a hollow microsphere with a sperm inserted in it; FIG. 10 is an enlarged photograph of a hollow microsphere with the sperm in FIG. 9. The inventive method of storing sperm is characterized by the following operations. As the camera 1 for carrying out the method, you can use the cover of a sterile plastic Petri dish with a diameter of 40 mm (Fig. 1) or special tablets. A few drops of 2 incubation medium with a buffer that maintains a pH of 7.2-7.6 are made around the periphery of the inverted lid. A large drop of 3 viscous medium is made in the center of the lid to reduce sperm motility. As an incubation medium for working with sperm, for example, 8rett RTeratabop Mebnnp (Meb1Ci11, Denmark) is used. [Tgoipkop A., Oatbpet Ό.Κ. Nabbyok OG ίη νίίτο Gegi1 | / aoop / SNF Rgekk, 2000. 2-pb eb. 560 p.]. Drops of medium are poured with mineral oil 4. Hollow microspheres 5 of agarose gel are placed in peripheral drops 2, and sperm 6 are placed in the central drop 3. The use of the term agarose gel in the invention is equivalent to the term agarose gel. For use, hollow microspheres with a diameter of 50 to 200 μm are selected. The wall thickness of the hollow microspheres of agarose gel leave from 10 to 25 microns. Manipulations with hollow microspheres 5 and spermatozoa 6 are carried out using glass micro-tools 7, for example, a special suction pipette, and precision manipulators 8, for example, a micro-injector needle, which is usually used to carry out 1C81 (sh1gasu1or1aksh1s krgt Shch) es1yup, Tgopkop A., . Napbok oG sh νίίΐΌ GegINTabop / SCS Rgekk, 2000. 2-pb eb. 560 p.) (Fig. 2).
Сперматозоиды могут быть как подвижными, так и предварительно обездвижены. Сперматозоид 6, выбранный для инъекции, может быть обездвижен путем прижимания жгутика сперматозоида инъекционной иглой 8 к дну чашки 1. Затем сперматозоид 6 набирают в иглу 1 (фиг. 3, 4). Микросферы 5 фиксиSperm can be both motile and pre-immobilized. The sperm 6 selected for injection can be immobilized by pressing the sperm flagella with the injection needle 8 to the bottom of the cup 1. Then, the sperm 6 is inserted into the needle 1 (Fig. 3, 4). Microspheres 5 Fixi
- 3 008674 руют присасывающей микропипеткой 7. Инъекционной иглой 8 прокалывают оболочку (стенку) полой микросферы из агарозного геля и вводят сперматозоид (фиг. 5). Все манипуляции проводят с применением антисептиков. Вышеприведенные операции также отражены на фиг. 7-10. Рекомендуемое количество вводимых сперматозоидов в одну полую микросферу до 10 шт.- 3 008674 is injected with a suction micropipette 7. The shell (wall) of the hollow microsphere from the agarose gel is punctured with an injection needle 8 and a sperm cell is introduced (Fig. 5). All manipulations are carried out using antiseptics. The above operations are also reflected in FIG. 7-10. The recommended number of sperm injected into one hollow microsphere is up to 10 pcs.
В результате использования заявляемого способа хранения сперматозоидов получают продукт для искусственного оплодотворения ίη νίΐτο, содержащий по меньшей мере одну полую микросферу 5 из агарозного геля, заполненную инкубационной средой 2, в которой путем инъекции размещен по меньшей мере один сперматозоид 6.As a result of using the inventive method for storing sperm, an artificial insemination product ίη νίΐτο is obtained containing at least one hollow microsphere 5 of agarose gel filled with incubation medium 2, in which at least one sperm 6 is placed by injection.
Криоконсервацию микросфер 5 с введенными в них сперматозоидами 6 производят в соответствии со стандартными процедурами, предусмотренными для криоконсервации спермы. Микросферы со сперматозоидами помещают в раствор криопротекторов на 5-10 мин, затем помещают в соломину для криоконсервации объемом 250 мкл. Большинство сред для криоконсервации спермы в качестве основных компонентов содержат глицерин и сывороточный альбумин или его заменители |Ма11абс\гап М., ТтоипзопCryopreservation of microspheres 5 with sperm 6 introduced into them is carried out in accordance with standard procedures provided for cryopreservation of sperm. Microspheres with sperm are placed in a solution of cryoprotectants for 5-10 minutes, then placed in a straw for cryopreservation with a volume of 250 μl. Most sperm cryopreservation media contain glycerol and serum albumin or its substitutes as main components | Ma11abs / g ap M., Ttoipzop
А.О. ЕГГсс1 оГ егуорго1се1Е'с шефа апб ббибоп шсбюбз оп 111с ртсзстайоп оГ Нитап зрсгтаЮхоа//Апбго1оща. 1983. V. 15. Р. 355-366]. Соломины замораживают в течение 30 мин в парах жидкого азота, после чего погружают непосредственно в жидкий азот на время от 30 мин до 2 суток. Размораживание проводят, помещая соломины под струю холодной проточной воды, микросферы извлекают из соломин и отмывают в среде для обработки сперматозоидов. Жизнеспособность сперматозоидов после размораживания оценивают по сохранению подвижности.A.O. EGGss1 OG egorgo1se1E's chef apb bbibop ssbyubz op 111s rtszstayop oG Nitap zrsgtaYuhoa // Apbgo1oshcha. 1983. V. 15. R. 355-366]. The straws are frozen for 30 minutes in pairs of liquid nitrogen, after which they are immersed directly in liquid nitrogen for a period of 30 minutes to 2 days. Thawing is carried out by placing straws under a stream of cold running water, the microspheres are removed from the straws and washed in a sperm processing medium. Sperm viability after thawing is evaluated by maintaining motility.
Таким способом было заморожено 53 подвижных и 41 предварительно обездвиженных сперматозоидов в 23 агарозных микросферах. Сперматозоиды помещали в микросферы в количестве 1-10 шт. После криоконсервации и последующего размораживания все сперматозоиды сохранили характерную нормальную морфологию, что указывает на отсутствие серьезных механических повреждений, связанных с образованием кристаллов льда. 29 из 53 сперматозоидов (более половины) сохранили подвижность.In this way, 53 motile and 41 pre-immobilized spermatozoa in 23 agarose microspheres were frozen. Sperm cells were placed in microspheres in an amount of 1-10 pcs. After cryopreservation and subsequent thawing, all spermatozoa retained their characteristic normal morphology, which indicates the absence of serious mechanical damage associated with the formation of ice crystals. 29 of 53 spermatozoa (more than half) retained motility.
В результате криоконсервации получают продукт для искусственного оплодотворения, который содержит подвергнутую криоконсервации по меньшей мере одну полую микросферу 5 из агарозного геля, заполненную раствором по меньшей мере одного криопротектора, в которой путем инъекции размещен по меньшей мере один сперматозоид 6.As a result of cryopreservation, a product for artificial insemination is obtained that contains cryopreserved at least one hollow microsphere 5 of an agarose gel filled with a solution of at least one cryoprotectant in which at least one sperm 6 is placed by injection.
Изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами, которые не охватывают весь объем притязаний, но и не ограничивают его.The invention is illustrated by the following examples, which do not cover the entire scope of the claims, but do not limit it.
Пример 1.Example 1
Подвижные сперматозоиды человека инъецировали в полые микросферы из агарозного геля диаметром 150-200 мкм, в количестве от 1-10 шт. на микросферу, используя базовую технику, оборудование и расходные материалы для инъекции методом 1С81. Микросферы с помещенными в них сперматозоидами под контролем бинокулярной лупы при помощи пластиковой пипетки-капилляра переносили в раствор криопротектора, содержащий 50% среды 8рсгт Егсс/тд Мсбшт (Мсб1Сик, Дания) и 50% среды 8рсгт Ргерагабоп Мсбшт (Мсб1Сик, Дания), на 5-10 мин. Затем микросферы помещали в пластиковую соломину для криоконсервации объемом 250 мкл. Соломины замораживали в течение 30 мин в парах жидкого азота, после чего погружали непосредственно в жидкий азот на время от 30 мин до 2 суток. Размораживание проводили, помещая соломины под струю холодной проточной воды, микросферы извлекали из соломин и отмывали в 5 каплях среды 8рстт Егсс/шд Мсбшт (Мсб1Сик, Дания). Жизнеспособность сперматозоидов после размораживания оценивали по сохранению подвижности. Таким способом было заморожено 253 подвижных сперматозоида в 54 микросферах из агарозного геля. После криоконсервации и последующего размораживания все сперматозоиды сохранили характерную нормальную морфологию, что указывает на отсутствие серьезных механических повреждений, связанных с образованием кристаллов льда. Из 253 сперматозоидов 162 (64%) сохранили подвижность.Mobile human sperm cells were injected into hollow microspheres from an agarose gel with a diameter of 150-200 μm, in an amount of 1-10 pcs. on the microsphere, using basic equipment, equipment and supplies for injection method 1C81. Microspheres with sperm placed in them under the control of a binocular magnifier using a plastic pipette-capillary were transferred to a cryoprotectant solution containing 50% of the medium 8rsgt EGSS / td Msbsht (Msb1Sik, Denmark) and 50% of the medium 8rsgt Rgeragabop Msbst 5, -10 minutes. Then the microspheres were placed in a plastic straw for cryopreservation with a volume of 250 μl. The straws were frozen for 30 minutes in liquid nitrogen vapor, after which they were immersed directly in liquid nitrogen for a period of 30 minutes to 2 days. Thawing was carried out by placing straws under a stream of cold running water, the microspheres were removed from the straws and washed in 5 drops of medium 8rstt EGSS / sd Msbsht (Msb1Sik, Denmark). Sperm viability after thawing was evaluated by maintaining motility. In this way, 253 motile sperm cells were frozen in 54 agarose gel microspheres. After cryopreservation and subsequent thawing, all spermatozoa retained their characteristic normal morphology, which indicates the absence of serious mechanical damage associated with the formation of ice crystals. Of the 253 sperm, 162 (64%) retained motility.
Пример 2.Example 2
У пациента с диагнозом олигоастенотератозооспермия был получен эякулят, содержащий единичные подвижные сперматозоиды нормальной морфологии. Из эякулята были выделены единичные подвижные сперматозоиды. Инъекция сперматозоидов в полые микросферы из агарозного геля диаметром 150 мкм, с толщиной стенок, равной от 15 до 20 мкм, с использованием техники 1С81 и тех же расходных материалов (стеклянные микроинструменты: игла и присасывающая пипетка для 1С81), оборудования техники 1С81. В одну микросферу вводили сперматозоиды в количестве от 1 до 5 шт.In a patient diagnosed with oligoastenoteratozoospermia, an ejaculate was obtained containing single motile spermatozoa of normal morphology. Single mobile sperm cells were isolated from the ejaculate. Injection of sperm into hollow microspheres from an agarose gel with a diameter of 150 μm, with a wall thickness of 15 to 20 μm, using the 1C81 technique and the same consumables (glass micro-tools: a needle and a suction pipette for 1C81), equipment of the 1C81 technique. Sperm cells were introduced into one microsphere in an amount of 1 to 5 pcs.
Микросферы, содержащие единичные сперматозоиды, были заморожены в жидком азоте в соломинах для криоконсервации спермы, по 1-2 шт. на соломину с использованием среды 8рстт Егсс/шд Мсбшт (Мсб1Сик, Дания) в соответствии с прилагаемой к среде инструкцией и помещены в криохранилище. Поскольку микросфера со сперматозоидом внутри имеет объем ничтожный по отношению к объему соломинки (250-500 мкл), после инъекции сперматозоида микросфера помещается в смесь препарата 8рстт Егсс/шд Мсбшт и специальной среды для обработки спермы, например 8рстт Ртсрагабоп Мсбшт (Мсб1Сик, Дания). Микросферы вместе с этой средой (смесью) набирали в соломинки для криоконсервации. Соломинки помещали горизонтально непосредственно над поверхностью жидкого азота на 30 мин, затем помещали в жидкий азот и переносили в криохранилище. Предварительное помещение единичныхMicrospheres containing single spermatozoa were frozen in liquid nitrogen in straws for cryopreservation of sperm, 1-2 pcs. on a straw using the medium 8rstt Egss / shd Msbsht (Msb1Sik, Denmark) in accordance with the instructions attached to the medium and placed in a cryogenic storage. Since the microsphere with the sperm inside has a volume insignificant in relation to the volume of the straw (250-500 μl), after the injection of the sperm, the microsphere is placed in a mixture of 8rstt EGSS / sd Msbsht and a special sperm processing medium, for example 8rstt Rtsragabop Msbsht (Msb1Sik, Denmark). Microspheres together with this medium (mixture) were collected in straws for cryopreservation. The straws were placed horizontally directly above the surface of liquid nitrogen for 30 minutes, then placed in liquid nitrogen and transferred to a cryogenic storage. Preliminary placement of single
- 4 008674 сперматозоидов в микросферы из агарозы локализует сперматозоиды в большей области пространства, что делает возможным совершать с ними необходимые для криоконсервации манипуляции с использованием бинокулярной лупы. Криоконсервация единичных сперматозоидов в микросферах из агарозы, помещенных в отдельные соломины, позволяет избежать риска отсутствия у пациента нормальных сперматозоидов в эякуляте при осуществлении последующих программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). При разморозке микросфер из агарозы с единичными сперматозоидами отсутствует необходимость трудоемких процедур поиска и выделения единичных сперматозоидов из большого объема эякулята.- 4,008674 spermatozoa in microspheres from agarose localizes sperm in a larger area of space, which makes it possible to perform manipulations necessary for cryopreservation using a binocular magnifier. Cryopreservation of single spermatozoa in agarose microspheres placed in separate straws avoids the risk of the patient having normal sperm in the ejaculate during subsequent in vitro fertilization (IVF) programs. When defrosting microspheres from agarose with single sperm, there is no need for laborious procedures for searching and isolating single sperm from a large volume of ejaculate.
Пример 3.Example 3
Подвижные сперматозоиды крупного рогатого скота (быка) инъецировали в полые микросферы из агарозного геля диаметром 100-150 мкм, в количестве от 5-15 шт. на микросферу, используя базовую технику, оборудование и расходные материалы для инъекции методом 1С81. Микросферы с помещенными в них сперматозоидами под контролем бинокулярной лупы при помощи пластиковой пипеткикапилляра переносили в раствор криопротектора, содержащий 50% среды 8регш Егеехтд Мебшш (Меб1Си11, Дания) и 50% среды 8регш РгерагаБоп Мебшш (МеФСиИ, Дания), на 15 мин. Затем микросферы помещали в пластиковую соломину для криоконсервации объемом 250 мкл. Соломины замораживали в течение 30 мин в парах жидкого азота, после чего погружали непосредственно в жидкий азот на одни сутки. Размораживание проводили, помещая соломины под струю холодной проточной воды, микросферы извлекали из соломин и отмывали в среде 8регш Егее/шд Мебшш (Меб1Си11, Дания). После криоконсервации и последующего размораживания все сперматозоиды сохранили характерную нормальную морфологию. Было проведено оплодотворение 10 ооцитов путем введения в цитоплазму ооцитов единичных сперматозоидов, предварительно извлеченных из полых. В 7 случаях оплодотворение прошло успешно.Mobile sperm of cattle (bull) were injected into hollow microspheres from agarose gel with a diameter of 100-150 μm, in an amount of 5-15 pcs. on the microsphere, using basic equipment, equipment and supplies for injection method 1C81. Microspheres with sperm placed in them under the control of a binocular magnifier using a plastic pipette capillary were transferred into a cryoprotectant solution containing 50% medium 8grech Egeehtd Mebschs (Meb1Ci11, Denmark) and 50% medium 8regger RheragaBop Mebsh (MeFsi, min. Denmark). Then the microspheres were placed in a plastic straw for cryopreservation with a volume of 250 μl. The straws were frozen for 30 min in liquid nitrogen vapors, after which they were immersed directly in liquid nitrogen for one day. Thawing was carried out by placing the straws under a stream of cold running water, the microspheres were removed from the straws and washed in a medium of 8gr Eger / sd Mebsch (Meb1Ci11, Denmark). After cryopreservation and subsequent thawing, all spermatozoa retained their characteristic normal morphology. Fertilization of 10 oocytes was carried out by introducing single sperm into the cytoplasm of oocytes previously extracted from the hollow. In 7 cases, fertilization was successful.
Реализация изобретения позволит сохранить уникальные биологические объекты.The implementation of the invention will save unique biological objects.
Claims (7)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA200600709A EA200600709A1 (en) | 2005-12-29 | 2005-12-29 | METHOD OF STORAGE OF SPERMATOSIS AND PRODUCT FOR ARTIFICIAL IMPLEMENTATION (OPTIONS) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA200600709A EA200600709A1 (en) | 2005-12-29 | 2005-12-29 | METHOD OF STORAGE OF SPERMATOSIS AND PRODUCT FOR ARTIFICIAL IMPLEMENTATION (OPTIONS) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA008674B1 true EA008674B1 (en) | 2007-06-29 |
| EA200600709A1 EA200600709A1 (en) | 2007-06-29 |
Family
ID=41263890
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200600709A EA200600709A1 (en) | 2005-12-29 | 2005-12-29 | METHOD OF STORAGE OF SPERMATOSIS AND PRODUCT FOR ARTIFICIAL IMPLEMENTATION (OPTIONS) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA200600709A1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2504581C2 (en) * | 2012-02-02 | 2014-01-20 | Константин Владимирович Кириенко | Method for vital immobilisation of human and animal sperm cells |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110367243A (en) * | 2019-08-07 | 2019-10-25 | 中国人民解放军第四军医大学 | A kind of hollow agar sugar ball and preparation method for monosperm freezen protective |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999047642A2 (en) * | 1998-03-20 | 1999-09-23 | University Of Hawaii | Development of normal offspring from oocytes injected with freeze-dried spermatozoa |
| RU2154465C2 (en) * | 1994-04-12 | 2000-08-20 | Липожель | Microspheres and method for producing them |
| US6132952A (en) * | 1997-05-30 | 2000-10-17 | Saint Barnabas Medical Center | Storage system comprising an emptied zona pellucida and spermatozoa placed therein and a method of cryopreservation |
| RU2254101C2 (en) * | 2001-08-01 | 2005-06-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Башкирское" по племенной работе | Method for preparing for spermatic cryoconservation in farm animals |
-
2005
- 2005-12-29 EA EA200600709A patent/EA200600709A1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2154465C2 (en) * | 1994-04-12 | 2000-08-20 | Липожель | Microspheres and method for producing them |
| US6132952A (en) * | 1997-05-30 | 2000-10-17 | Saint Barnabas Medical Center | Storage system comprising an emptied zona pellucida and spermatozoa placed therein and a method of cryopreservation |
| WO1999047642A2 (en) * | 1998-03-20 | 1999-09-23 | University Of Hawaii | Development of normal offspring from oocytes injected with freeze-dried spermatozoa |
| RU2254101C2 (en) * | 2001-08-01 | 2005-06-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Башкирское" по племенной работе | Method for preparing for spermatic cryoconservation in farm animals |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2504581C2 (en) * | 2012-02-02 | 2014-01-20 | Константин Владимирович Кириенко | Method for vital immobilisation of human and animal sperm cells |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA200600709A1 (en) | 2007-06-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hwang et al. | Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes | |
| Hafez | Preservation and cryopreservation of gametes and embryos | |
| Gook et al. | Cryopreservation of mouse and human oocytes using 1, 2-propanediol and the configuration of the meiotic spindle | |
| US20060046243A1 (en) | Method for vitrification of mammalian cells | |
| Schiewe et al. | Validation of microSecure vitrification (μS-VTF) for the effective cryopreservation of human embryos and oocytes | |
| Rajan et al. | Development and application of cryoprotectants | |
| Checura et al. | Effect of macromolecules in solutions for vitrification of mature bovine oocytes | |
| US20060147894A1 (en) | Jacketed vessel for holding semen for sex biasing mammals through artificial insemination and systems and methods for enhancing the probability of sex biasing using the same | |
| EP1476013B1 (en) | Methods and device for freezing and thawing biological samples | |
| EP2048943B1 (en) | Preservation and controlled delivery/ release of spermatozoa | |
| JP2013528435A (en) | Apparatus for manipulating biological material in the process of cryopreservation and use of such apparatus | |
| Endo et al. | Single spermatozoon freezing using Cryotop | |
| US20150313211A1 (en) | A Method of Vitrification | |
| Hammitt et al. | Fertility of frozen-thawed porcine semen following controlled-rate freezing in straws | |
| EA008674B1 (en) | Method for storing spermatozoa and product for telegenesis | |
| DK2048943T3 (en) | Preservation and controlled delivery / release of spermatozoa | |
| Paynter et al. | Cryopreservation of mammalian oocytes | |
| Dupesh et al. | Human Sperm Freezing: Mini Update | |
| Keros et al. | Cryopreservation of mammalian oocytes: slow cooling and vitrification as successful methods for cryogenic storage | |
| Keros et al. | Cryopreservation of mammalian oocytes | |
| Kresna et al. | Cryoprotectant combination ethylene glycol and propanediol on mice blastocyst viability post vitrification | |
| RU2707252C1 (en) | Method for cattle oocyte freezing | |
| CA2207013C (en) | Application of bio-spectrum in animal embryonic engineering | |
| Hredzak et al. | Survival of mouse embryos after vitrification depending on the cooling rate of the cryoprotectant solution | |
| HARVEY¹ et al. | Practical methods for chilled and frozen storage of tilapia spermatozoa |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |