EA007792B1

EA007792B1 - Новое медицинское применение соединений, способствующих межклеточным связям

Info

Publication number: EA007792B1
Application number: EA200300912A
Authority: EA
Inventors: Бьярн Дюе Ларсен; Йорген Соберг Петерсен; Эдди Мейер; Анн Луиз Кйолбье; Никлас Рие Йоргенсен; Мортен Шак Ниельсен; Ниельс-Хенрик Хольстейн-Ратлу; Джеймс Б. Мартинс; Петер Холм Йенсен
Original assignee: Зеаланд Фарма А/С
Priority date: 2001-02-22
Filing date: 2002-02-22
Publication date: 2007-02-27
Also published as: AU2002254033B2; BR0207476A; NO20033641D0; NZ527571A; DK1370276T3; CA2439101A1; CA2439101C; EA200300912A1; DE60239126D1; NO20033641L; PL368911A1

Abstract

Изобретение относится к новым пептидам, включая новые антиаритмические пептиды линейной или циклической структуры с улучшенной стабильностью in vitro и/или in vivo, к химическим соединениям, включая упомянутые пептиды, и к использованию упомянутых пептидов при приготовлении лекарственных средств. Задача, на решение которой направлено натоящее изобретение, состоит в использовании химического соединения, которое способствует клеточной коммуникации типа межклеточная коммуникация по щелевому соединению, для производства фармацевтического соединения для профилактики или лечения болезней, и предпочтительно непролиферативных болезней, включая, например, воспаление эпителия дыхательных путей, заболевание альвеолярной ткани, ран, эректильную дисфункцию, для лечения или профилактики ослабленного слуха, вследствие болезни ушной улитки, эндотелиальных поражений, диабетической ретинопатии и диабетической невропатии, нервнопатической боли, ишемии центральной нервной системы, повреждений спинного мозга, заболеваний зубных тканей, включая болезнь пародонта, болезней почек, подострого и хронического воспаления, рака и патологии костного мозга и стволовых клеток при трансплантации.

Description

Область техники изобретения

Настоящее изобретение относится к новым пептидам, включая новые антиаритмические пептиды линейной или циклической структуры с улучшенной стабильностью ίη νίίτο и/или ίη νΐνο, к химическим соединениям, включая упомянутые пептиды, и к использованию упомянутых пептидов при приготовлении лекарственных средств. Настоящее изобретение также относится к использованию соединений, которые способствуют межклеточной коммуникации, для приготовления лекарственных средств при лечении целого ряда болезней, характеризующихся нарушением межклеточной коммуникации по щелевому соединению. Изобретение также относится к способу лечения болезней, например к способу лечения или профилактики заболевания альвеолярной ткани и бронхиальной ткани, нарушения слуха вследствие заболевания ушной улитки, эндотелиальных поражений, диабетической ретинопатии и диабетической невропатии, ишемии центральной нервной системы и спинного мозга, заболеваний зубных тканей, включая болезнь пародонта, почечных болезней, типа выделений из околоклубочкового аппарата, что приводит к артериальной гипертензии, и к способу предотвращения патологий при трансплантации костного мозга.

Предпосылки создания изобретения

Щелевые соединения - специализированные области клеточной мембраны со скоплениями от сотен до тысяч плотно упакованных канальцев щелевых соединений, которые непосредственно соединяют цитоплазматические камеры двух соседних клеток. Канальцы щелевых соединений состоят из двух полуканальцев (коннексонов), отходящих от каждой из двух соседних клеток. Каждый коннексон состоит из шести белков, называемых коннексинами (Сх). Коннексины - большое семейство белков, составляющих основную структуру четырех трансмембранных доменов, двух внеклеточных петель, и цитоплазматической петли. Существует большая вероятность сохранения внеклеточных петель и трансмембранных доменов среди видов и изоформ коннексина. Ввиду того, что длина С-концевых участков существенно меняется, классификация коннексинов выполняется на основе молекулярной массы. Состояние канальца щелевых соединений может переключаться с открытого на закрытое путем перекручивания. В открытых состояниях ионы и малые молекулы могут проходить через пору. Через щелевые соединения осуществляется перенос электрического импульса и межклеточная диффузия сигнальных молекул, и поэтому нормально функционирующие щелевые соединения являются предпосылкой для нормальной межклеточной коммуникации. Нормальная межклеточная коммуникация имеет большое значение для клеточного гомеостаза, пролиферации и дифференцировки.

Между нарушениями в коннексинах и болезнью человека была установлена связь, о чем говорится в следующих разделах. Одним из примеров является болезнь Чагаса, вызываемая протозойным паразитом Ттурапокоша сги/ί. Эта болезнь является основной причиной кардиальной дисфункции в Латинской Америке. В клетках, инфицированных Тгурапокоша сги/ί. наблюдались изменения распределения Сх43 и это изменение может включаться в генезис нарушений проводимости, характеризующих болезнь¹4

В многоклеточном организме координация между клетками имеет большое значение. Среди различных средств клеточного взаимодействия, щелевые соединения обеспечивают самый прямой канал связи. Щелевые соединения являются одним из типов соединительного комплекса, образующегося между соседними клетками, и состоят из агрегированных канальцев, которые напрямую связывают внутриклеточное пространство (цитоплазму) соседних клеток. Щелевые соединения обнаружены в большинстве типов клеток взрослого млекопитающего при одном известном исключении, которым являются элементы циркулирующей крови.

О структуре гена коннексина известно сравнительно мало. Результаты, представленные для Сх43 мыши, показали, что Сх43 содержит два экзона и интрон, расположенные в нетранслированной области 5'. В проксимальном промоторе 5' были идентифицированы несколько предполагаемых сайтов связывания факторов транскрипции. Ση νίίτο исследование показало, что проницаемые канальцы могут быть получены из полуканальцев, состоящих из различных пар коннексинов. Например, из Сх43 можно получить функциональные канальцы с Сх32, Сх37, Сх40 и Сх45 и эндогенным Сх овоцитов (Сх38), но не с Сх26 овоцитов. Однако, очень мало известно об их свойствах, а также о регуляции проницаемости этих гетероканальцев. Сх экспрессированы в огромном большинстве тканей, и одиночные клетки способны экспрессировать несколько различных Сх. Проницаемые щелевые соединения могут образовываться между клетками, которые экспрессируют различные типы Сх. Таким образом, межклеточная коммуникация по щелевому соединению (МКЩС) в тканях, очевидно, является очень важной для сохранения целостности ткани. Очевидно, что несколько генов создают эквивалентные продукты для предотвращения потери МКЩС вследствие мутации в одном гене.

Как отмечалось, диаметр поры канальца щелевого соединения составлял от 0,8 до 1,4 нм. Щелевые соединения относительно не избирательны, что позволяет проходить через них молекулам массой приблизительно до 1000 Да. Такими веществами являются, например, ионы, вода, сахара, нуклеотиды, аминокислоты, жирные кислоты, пептиды малой массы, лекарства и канцерогенные вещества. Для прохода канальца АТФ не требуется и проход осуществляется за счет пассивной диффузии. Этот поток материалов между клетками через канальцы щелевых соединений известен как межклеточная коммуникация по щелевому соединению (МКЩС), которая играет важную роль в регуляции метаболизма клетки, пролиферации, и межклеточной передаче сигналов. С точки зрения физиологии для МКЩС очень важно, что

- 1 007792 бы клетки ткани, купированные с помощью щелевых соединений, были бы не отдельными дискретными объектами, а были бы объединены со своими соседями. Это свойство способствует гомеостазу и обеспечивает также быструю, прямую передачу вторичных мессенджеров между клетками для координации клеточных реакций внутри ткани.

Процесс МКЩС регулируется рядом механизмов, которые могут подразделяться на основные категории. При одном типе регуляции количество щелевых соединений клетки регулируется путем влияния на экспрессию, деградацию, клеточный перенос коннексинов к плазматической мембране или на сборку коннексинов в функциональные щелевые соединения. Ухудшенная МКЩС, вызванная экспрессией коннексина с пониженной регуляцией, например, в клетках опухоли, является примером этого способа регуляции. Другой тип регуляции вообще не включает никакого изменения клеточных уровней щелевых соединений или коннексинов, но вызывает отпирание или запирание (регуляция запирания канальцев) существующих щелевых соединений. К этому типу регуляции могут привести внеклеточные растворимые факторы, типа митогенов (например, ДДТ), гормонов (например, катехоламины), обезболивающих средств (например, галотан), внутриклеточных биомолекул (например, цАМФ) и стресс клетки (например, механический или метаболический стресс). Кроме того, МКЩС регулируется в процессе клеточного цикла и во время миграции клетки.

Для щелевых соединений, особенно для щелевых соединений, состоящих из Сх43, изучался способ регуляции МКЩС или регуляция запирания канальцев. Некоторые факторы оказывают свое ингибирующее влияние на МКЩС косвенно, например, путем изменения среды липида и текучести клеточной мембраны, при этом другие ингибиторы МКЩС включают онкогены, факторы роста и промоторы опухоли, которые вызывают различные модификации Сх43. Для стимуляция определенных биологических функций последней группы может быть необходимо разрушение проницаемости щелевых соединений. Эти агенты инициируют сложные сигнальные пути, включающие активацию киназ, фосфатаз и взаимодействие белков. Понимание механизмов действия модуляторов МКЩС не только позволит определить их соответствующие сигнальные пути, ответственные за регуляцию щелевых соединений, но также предоставит инструментальные средства эксперимента для получения характеристик биологических функций МКЩС и коннексинов.

Изменения цитоплазматического домена карбокси-концевого участка Сх43 при фосфорилировании специфических сайтов оказываются кардинальными для открытия и закрытия щелевого канальца. Фосфорилирование домена карбокси-концевого участка также может быть важным для процесса переноса полукомплекса щелевого соединения Сх43 к клеточной мембране, интернализации и деградации. Периоды полураспада коннексинов (часы) намного короче периодов полураспада большинства белков плазматических мембран (сутки), например, период полураспада Сх43 сердца крысы меньше 1,5 ч. Таким образом, регуляция интенсивности метаболизма была бы важным фактором в регуляции МКЩС.

Домен карбокси-концевого участка содержит предположительно сайты фосфорилирования многочисленных протеинкиназ (РКА, РКС, РКП, МАРК, СаМк11 и тирозинкиназы). Фосфорилирование этих сайтов домена карбокси-концевого участка приводит к смыканию канальцев щелевого соединения, и различные ингибиторы Сх43 канальцев щелевого соединения используют различные сигнальные пути, чтобы вызвать фосфорилирование домена карбокси-концевого участка. По типу клетки и специфичности ингибитора определяют, какие сигнальные пути должны использоваться, а тип включенной протеинкиназы указывает на используемую внутриклеточную систему мессенджера. Таким образом, для активации РКА требуется участие системы вторичного мессенджера цАМФ, в то время как для РКС требуется участие внутриклеточной сигнальной системы фосфоинозитола.

Другие механизмы, регулирующие запирания канальцев, включают внутриклеточные уровни водорода и ионов кальция, транссоединительное напряжение (1гапуипс1юпа1 уоНаде) и свободные радикалы. Пониженный уровень рН или рСа вызывает закрытие канальца специфическим для клетки и коннексина образом.

Помимо регуляции роста МКЩС выполняет и другие многочисленные физиологические функции. Гомеостаз: МКЩС обеспечивает быстрое приведение в равновесие питательных веществ, ионов и жидкости между клетками. Это могло бы быть самой древней, широко распространенной и важной функцией для этих канальцев. Электрическое купирование: щелевые соединения служат электрическими синапсами в электрически возбудимых клетках типа кардиомиоцит, клеток гладкой мускулатуры и нейронов. В этих тканях электрическое купирование обеспечивает более быструю межклеточную передачу потенциалов действия, чем химические синапсы. Это обеспечивает синхронное сокращение кардиомиоцитов и клеток гладкой мускулатуры. Реакция ткани на гормоны: МКЩС может усилить чувствительность тканей к внешним стимулам. Вторичные мессенджеры типа циклических нуклеотидов, кальция и фосфатов инозитола достаточно малы, чтобы пройти от гормонально активизированных клеток до статических клеток через канальцы щелевых соединений и активизировать их. Такой эффект может усилить реакцию ткани на агониста. Регуляция зародышевого развития: щелевые соединения могут служить межклеточными проводящими путями для химиката и/или электрических сигналов развития в эмбрионах и для определения границ групп развития. МКЩС в зародышевых клетках осуществляется определенными спо

- 2 007792 собами, и ухудшение МКЩС вызывает аномалии развития и тератогенные эффекты многих химических веществ.

Межклеточная коммуникация обеспечивает координацию функционирования отдельных клеток и интегрирует это функционирование в динамику рабочей ткани, обслуживающей организм, в котором она установлена. Поэтому нет ничего удивительного в том, что многие самые разнообразные патологические состояния были связаны с ухудшением МКЩС. Как способами ίη νίίτο, так и ίη νΐνο была установлена связь между нарушениями в коннексинах и диапазоном болезненных состояний. Одним примером является регуляция коммуникации по щелевым соединениям с помощью провоспалительного цитокина в эпителии дыхательных путей, где авторы Шансон М., Берклац П.У., Скерри И., Дудец Т., ВернкеДоллрис К., Пицурки Л., Павирани А., Фидлер М.А., Сутер С. (Сйапкоп М., Вегс1ах Ρ.Υ., 8СЕ-т I., Энбех Т., \Усгпкс-Оо11пс5 К., Р|/игк| Ь., ΡανπΉηί А., Е1еб1ег М.А., 8и1ег 8. (Ат 1 Ра1йо1 Май, 2001 г., 158 (5): 1775-84)) обнаружили, что ухудшение межклеточной коммуникации, вызванное ΤΝΕ-альфа, последовательно приводит к воспалению.

Короче говоря, можно сказать, что существует множество доказательств, связывающих дисфункцию типа затворения или смыкания или даже отсутствия щелевых соединений с повышенным риском болезни. В настоящее время отсутствуют лекарственные средства для лечения упомянутых болезней, способствующих межклеточной коммуникации, путем улучшения или усиления функций щелевых соединений. Однако ранее была описана группа пептидов (антиаритмические пептиды), способных увеличивать проводимость щелевых соединений. В документе РСТ/ЭК01/00127, который приводится в данном случае в качестве ссылки, дается ее краткое описание. Краткое описание по настоящему изобретению приводится в υ88Ν 09/792286, поданном 22 февраля 2001 г. υ88Ν 09/792286 приводится в данном случае в качестве ссылки.

Антиаритмические пептиды представляют из себя группу пептидов, которые проявляют свое влияние на щелевые соединения выборочно и таким образом уменьшают разрыв купирования клеток и также уменьшают разброс продолжительности действия потенциала. Однако нативные ААР, а также синтетический ААР10, обладают некоторыми нежелательными особенностями типа низкой стабильности, высокой эффективной концентрации и т.д., которые до настоящего времени препятствовали их использованию в качестве лекарств. С использованием спектроскопии ядерного магнитного резонанса авторы Гровер и Деин (Сгогег апб Ωΐκίη)¹²¹¹ получили характеристики двух полуциклических конформаций ААР10, поэтому, один подход к получению устойчивого антиаритмического пептида мог бы состоять в предусмотрении циклических производных антиаритмических пептидов. В документе ΌΕ19707854 описывается явно циклическое соединение СЕ₃С(О)-О1у-А1а-О1у-4Нур-Рго-Туг-СО:Ж и циклическое соединение ί.’ϋ-Ο1ν-Λ1;·ι-Ο1ν-4Ηνρ-ΡΐΌ-ΤνΓ-ί.’ΘΝΗ. имеющие те же самые антиаритмические свойства как и ААР и ААР10, но, как утверждается, обладающие повышенной стабильностью в водном растворе и после повторных циклов замораживания и размораживания. Однако экспериментальные состояния, описанные в документе ΌΕ 19707854, недостаточны для приготовления упомянутых циклических соединений, и данные химической идентификации, полученные при использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии, не достаточны для идентификации упомянутых циклических соединений. В патенте США № 4775743 описано вещество НР5 - производное пептида, состоящее из последовательности Ν-3-(4гидроксифенил)пропионил-Рго-4Нур-О1у-А1а-О1у-ОН и действующее против агглютинации тромбоцита. Авторы Деин и Тудика (Όΐκίη и Тибука)^[22] выполнили обзор литературы по пептидам, включая производные пептида, принадлежащие группе антиаритмических пептидов, проявляющих активность, и учли концентрацию (см. табл. 1), и нашли только 7 соединений, проявляющих активность, и еще 4 химических соединения, проявляющих слабую активность. Однако ни один из этих пептидов или производных пептида не проявил достаточной стабильности с обеспечением эффективности в режиме терапии.

Пептиды здесь усиливают межклеточную коммуникацию по щелевому соединению (МКЩС) в тканях позвоночных, и специфично, в тканях млекопитающих, и полезны при лечении широкого спектра болезней, в частности болезней позвоночных типа млекопитающих, вызванных пониженной функцией межклеточной коммуникации щелевых соединений, что описано ниже.

Таким образом, целью настоящего изобретения является способ профилактики или лечения болезней и болезненных состояний, которые характеризуются ухудшением или ослаблением клеточной коммуникации, например, вызванных ослаблением межклеточной коммуникации по щелевому соединению или ослаблением купирования, выполненного с помощью щелевого соединения. Примерами болезней и болезненных состояний являются воспаление эпителия дыхательных путей, заболевание альвеолярной ткани, недержание мочи, ослабление слуха вследствие болезни ушной улитки, эндотелиальные поражения, диабетическая ретинопатия и диабетическая невропатия, ишемия центральной нервной системы и спинного мозга, заболевания ткани зубов, включая болезнь пародонта, болезни почек и патологии при трансплантации костного мозга, о чем упоминалось выше.

Краткое изложение сущности изобретения

Цель настоящего изобретения достигается с помощью пептидов, включая химические соединения на основе антиаритмических пептидов.

- 3 007792

В настоящем изобретении предполагаются способы профилактики или лечения болезней, вызванных ослабленной клеточной коммуникацией или ослабленной функцией щелевых соединений. К показательным болезням относятся такие болезни, которые влияют на систему дыхания, кровеносную систему или нервную систему, зрение и слух, зубы, гладкую мускулатуру и трансплантацию клеток и тканей. Такие способы могут использоваться самостоятельно в качестве терапии или в сочетании с одним или большим числом других установленных протоколов по лечению специфических болезней или состояний. Желательно, чтобы лечению подвергались такие млекопитающие как, например, приматы, грызуны (включая мышей, крыс, хомяков и заячьих, типа кроликов), собаки, свиньи и козы. Среди приматов предпочтение отдается человеку. Химические соединения, применяемые в способах по настоящему изобретению, характеризются тем, что способствуют МКЩС.

В частности, настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения непролиферативных болезней, вызванных ослаблением функции щелевых соединений, путем поддержания межклеточной коммуникации в патологически измененных клетках и тканях, осуществляемой по щелевому соединению, желательно путем введения пациенту, страдающему от упомянутой болезни, терапевтически эффективных количеств хотя бы одного химического соединения, которое способствует межклеточной коммуникации по щелевому соединению.

Все химические соединения, которые могут использоваться в настоящем изобретении, обладают свойствами поддержания или стимуляции МКЩС в клетках и тканях. Механизмы, с использованием которых происходит стимулирование МКЩС, могут меняться, так как существует много клеточных механизмов, которые действуют на функционирование коннексина и/или стимулируют функции щелевых соединений. Эти механизмы включают, например, регуляцию числа щелевых соединений в клетке путем регуляции или нормализации экспрессии коннексинов;

ингибирование деградации щелевых соединений и коннексинов, включая регулирование темпа обновления коннексинов путем увеличения периода полураспада;

увеличение клеточного переноса коннексинов к плазматической мембране, стимулирование сборки коннексинов в функциональные щелевые соединения, стимулирование открытия существующих щелевых соединений, например, когда они закрыты или затворены ингибиторами. Этот механизм может быть описан как реверсирование смыкания щелевых соединений, произведенного ингибиторами МКЩС, действующего через прямой или косвенный механизм, типа, например, гиперфосфорилирования цитоплазматического домена карбокси-концевого участка коннексинов, например, Сх43.

Предположительно домен карбокси-концевого участка содержит сайты фосфорилирования для многочисленных протеинкиназ (РКА, РКС, РКС, МАРК, СаМкП и тирозинкиназа). Фосфорилирование этих сайтов домена карбокси-концевого участка приводит к смыканию канальцев щелевого соединения, и для стимулирования фосфорилирования домена карбокси-концевого участка различные ингибиторы канальцев щелевого соединения Сх43 используют различные сигнальные пути. По типу клетки и специфичности ингибитора определяют, какие сигнальные пути должны использоваться, а тип включенной протеинкиназы указывает на используемую внутриклеточную систему мессенджера. Таким образом, для активации РКА требуется участие системы вторичного мессенджера цАМФ, в то время как для РКС требуется участие внутриклеточной сигнальной системы фосфоинозитола.

Другие механизмы, регулирующие запирание канальцев, включают внутриклеточные уровни водорода и ионы кальция, транссоединительное напряжение (1гап5|ипс1юпа1 гоНадс). низкий уровень доступного кислорода и глюкозы и свободные радикалы. Пониженный уровень рН или рСа вызывает закрытие канальца специфическим для клетки и коннексина образом.

Кроме того в настоящем изобретением предлагается использование пептидов, типа антиаритмических пептиды, и предпочтительно пептидов, описанных подробно ниже (описанных в заявках РСТ/ЭК01/00127 и υδδΝ 09/792286, обе поданы 22 февраля 2001. Заявка υδδΝ 09/792286 является развитием предварительной заявки США 60/251659, поданной 6 декабря 2000 г., в которой испрашивается приоритет по отношению к датской заявке на изобретение РА2000 00288, поданной 23 февраля 2000 г. и РА2000 00738, поданной 4 мая 2000 г. Упомянутые заявки υδδΝ 09/792286, 60/251659 и РА2000 00288 и РА2000 00738 включены в данном случае в качестве ссылок), которые являются агонистами рецептора ААР для лечения специфических болезней, включая воспаление эпителия дыхательных путей, заболевание альвеолярной ткани, раны, эректильную дисфункцию, недержание мочи, слух, ослабленный вследствие болезни ушной улитки, эндотелиальные поражения, диабетическую ретинопатию и диабетическую невропатию, нервнопатические боли, ишемию центральной нервной системы, поражения спинного мозга, заболевания зубных тканей, включая болезнь пародонта, болезни почек, подострое и хроническое воспаление, рак и патологии костного мозга и стволовых клеток при трансплантации. Такие болезни или медицинские состояния характеризуются ослаблением МКЩС, которое является основной причиной болезни или развития болезни.

В настоящем изобретении используются антиаритмические пептиды, описанные в заявке РСТ/ЭК01/00127 и ее функциональных аналогах.

- 4 007792

Упомянутые антиаритмические пептиды включают группу пептидов, которые избирательно влияют на щелевые соединения и таким образом уменьшают разрыв купирования клеток и уменьшают разброс продолжительности действия потенциала, и их влияние подобно влиянию, описанному выше для антиаритмического пептида ААР 10. В настоящее время неизвестна молекулярная цель или рецептор для антиаритмических пептидов, однако структура связующего сайта для ААР 10 на предполагаемом рецепторе была предложена как гипотеза авторами Р. Гровером и Ц. Деином (В. Сгоусг и С. Эйст) (Пептиды 2001, 22 1011-1021). Предполагается, что пептид, который применяется в настоящем изобретении, является агонистом рецептора для антиаритмического пептида, типа ААР 10, и что физиологическое влияние взаимодействия пептида и рецептора проявляется в виде улучшения купирования клеток с помощью щелевого соединения, или потенцирования, или стимуляции МКЩС. Однако теоретически существует еще много путей передачи сигналов, которые могут регулировать функции щелевого соединения, и авторы изобретения не хотят связывать себя теорией, объясняющей биологическое действие модуляции МКЩС.

Вообще, в настоящем изобретении предлагаются способы лечения болезней и нарушений ткани, вызванных избытком химически активных видов соединений с кислородом и/или свободными радикалами и/или окисью азота. Примером является диабетическая невропатия и раны, в которых свободные радикалы приводят к истощению глутатиона и, следовательно, к сокращению числа щелевых соединений, или нарушению коммуникации по щелевым соединениям. В ранах с некротической тканью наблюдается плохое снабжение кислородом и/или высокая концентрация свободных радикалов. При диабете, при артериосклерозе, в хирургических ранах, при отеке, инфекции, при ожоговых ранах и при венозной недостаточности наблюдается ухудшенная коммуникация по щелевым соединениям. Свободные радикалы играют важную роль при разрушении нервного окончания, при пониженной проводимости, демиелинизации и повышенной воспалительной реакции. Как известно потеря слуха, вызванная шумом, пресбиакузис, связаны с продуцированием свободных радикалов и с замедлением купирования с помощью щелевых соединений. Во время ангиогенеза избыток свободных радикалов может также привести к уменьшению эндотелиальной репарации и росту капилляров.

Например, и в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения предполагаются способы лечения или профилактики воспаления дыхательных путей. В соответствии с предпочтительными способами настоящего изобретения предлагается введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, такого терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения, которое способствует межклеточной коммуникации по щелевому соединению.

В соответствии с настоящим изобретением предполагаются также способы лечения или профилактики недержания мочи. В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения способы включают введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, такого терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения, которое способствует межклеточной коммуникации по щелевому соединению.

В настоящем изобретении предполагаются также способы лечения или профилактики ослабления слуха, вследствие болезни ушной улитки. Например, и в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения способы включают введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, такого терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения, которое способствует межклеточной коммуникации по щелевому соединению.

В частности, изобретение относится к использованию химического соединения, которое способствует клеточной коммуникации, типа межклеточная коммуникация по щелевому соединению, для производства фармацевтического соединения для профилактики или лечения болезней, и предпочтительно непролиферативных болезней, включая, например, воспаление эпителия дыхательных путей, заболевание альвеолярной ткани, ран, эректильную дисфункцию, для лечения или профилактики ослабленного слуха, вследствие болезни ушной улитки, эндотелиальных поражений, диабетической ретинопатии и диабетической невропатии, нервнопатической боли, ишемии центральной нервной системы, повреждений спинного мозга, заболеваний зубных тканей, включая болезнь пародонта, болезней почек, подострого и хронического воспаления, рака и патологии костного мозга и стволовых клеток при трансплантации.

Подробное описание изобретения

Пептиды, используемые в настоящем изобретении, включают химические соединения по основной формуле

Г—χ-α-β-υ·;

где пунктирная линия означает, что формула I возможно представляет циклическое соединение, и обозначенные связи представляют ковалентные связи; и где А является химической частью с аминогруппой (радикал) и карбоксильной группой (радикал), которые образуют часть пептидной связи, соединяющей А с X и В; В является химической частью с аминогруппой (радикал) и карбоксильной группой (радикал), которые образуют часть пептидной связи, соединяющей А с В и Υ; X является пептидной последовательностью, включающей с 1-го аминокислотного остатка по 3-й, которые независимо друг от друга могут иметь форму Ь или форму Ό, если Υ является пептидной последовательностью С-концевого участка,

- 5 007792 включающего со 2-го аминокислотного остатка по 5-й, которые могут независимо друг от друга иметь форму Ь или форму Ό; или X является модификацией Ν-концевого участка группы А-В, если Υ является С-концевой пептидной последовательностью, включающей со 2-го аминокислотного остатка по 5-й, которые могут независимо друг от друга иметь форму Ь или форму Ό; или X является пептидной последовательностью, включающей со 2-го аминокислотного остатка по 5-й, которые могут независимо друг от друга иметь форму Ь или форму Ό, если Υ является С-концевой пептидной последовательностью, включающей с 1-го аминокислотного остатка по 3-й, которые независимо друг от друга могут иметь форму Ό или Ь; и когда формула I представляет линейный пептид X, претерпевший произвольное химическое изменение своего Ν-концевого участка, и Ь - дополнительная связывающая группа, включающая с 0-го по 8-й атомы основной цепи; и зеркальное отображение или ретроаналог формулы I, или производное формулы I, которое является фармацевтически приемлемой солью, алкилом, арилом или сложным эфиром аралкила, амидом, моно- или двузамещенным амидом, где замещающим веществом является алкил, арил или аралкил, гидразид или спирт;

при условии, что упомянутая общая формула не распространяется на следующие химические соединения

Н-С1у-Рго-Ьеи-С1у-Рго-ОН, Н-Рго-4Нур-С1у-А1а-С1у-ОН, №3-(4-гидроксифенил)пропионил-Рто-4Нур-С1у-А1а-С1у-ОН, №3-фенилпропионил-Рто-4Нур-С1у-А1а-С1у-ОН, №3-фенилпропил-Рто-4Нур-С1у-А1а-С1у-ОН, №3-(4-гидроксифенил)пропионил-Рто-4Нур-С1у-А1а-ОН, №3-(4-гидроксифенил)пропионил-Рто-4Нур-С1у-ОН, №3-(4-гидроксифенил)пропионил-Рто-4Нур-ОН, №3-(4-гидроксифенил)пропионил-Рто-Рго-С1у-А1а-С1у-ОН, Н-С1у-А1а-С1у-4Нур-Р^о-Ту^-NН₂,

Н-С1у-А1а-С1у-4Нур-Рго-Туг-ОН, Н-А1а-С1у-4Нур-Р^о-Ту^-NН₂, Н-С1у-8ат-Рто-С1у-А1а-С1у-ОН, Н-С1у-Рто-8ат-С1у-А1а-С1у-ОН, Н-С1у-8ат-8ат-С1у-А1а-С1у-ОН, Н-С1у-А1а-С1у-Нур-Рго-Туг (3 -Ι)-ΝΉ₂, Н-С1у-А1а-С1у-Нур-Рго-Туг (3 -Ρ)-ΝΉ₂, Н-С1у-А1а-С1у-Нур-Рто-Тут(3-С1)-МН₂, Н-С1у-А1а-С1у-Нур-Р^о-Ту^(3-Β^)-NН₂, Н-А^д-А1а-С1у-Нур-Р^о-Ту^-NН₂, Н-Vа1-А1а-С1у-Нур-Р^о-Ту^-NН₂, Н-А1а-А1а-С1у-Нур-Рго-Туг^Н₂.

Н-С1у-А1а-С1у-Нур-Н^8-Ту^-NН₂, Н-СА-АЫ-СА-Нур-Рго-РНе^Н^ Цикло(СР3С(ОН)-С1у-А1а-С1у-4Нур-Рто-Тут-СОМН), Цикло(СО-С1у-А1а-С1у-4Нур-Р^о-Ту^-СОNН),

С1+С(О)-С1\-А1а-С1\-4Н\р-Рго-Т\г-СО\'Н и СО-С1у-А1а-С1у-4Нур-Р^о-Ту^-СОNН.

Желательно, чтобы ковалентные связи выбирались из пептидных связей, дисульфидных связей, эфирных связей, восстановленных амидных связей, алкокси-связей, оксикарбонильных связей и ацилок-

где η - целое число, имеющее значение 3, 4, или 5, и В является дополнительным заместителем, предпочтительно выбираемым из группы, в состав которой входит галогеновая группа, фенильная группа, гидроксигруппа, ΝΉ₂ и С(1-6)алкил. В предпочтительном варианте по настоящему изобретению как А, так и В является аминокислотой или производным аминокислоты, имеющим функциональную аминогруппу и группу карбоновой кислоты. Дальнейшие примеры А и В представлены формулой 2а

- 6 007792

где η - целое число, имеющее значение 0, 1, 2 и 3, р - целое число, имеющее значение 0, 1, 2 и 3, Ζ является О или 8, и К представляет дополнительный заместитель, предпочтительно выбираемый из группы, в состав которой входит галогеновая группа, фенильная группа, гидроксигруппа, ΝΗ₂ и С(1-6)алкил. Примерами химических соединений по настоящему изобретению, в которых А или В представлены формулой Ζα, являются

Н-О1у-А1а-О1у^СО-Рго-Туг- ΝΗ₂ Химическое соединение 11;

Н-О1у-А1а-О1у-Т4С-Рго-Туг- NΗ₂ Химическое соединение 12; Н-О1у-А1а-О1у-А2С-Рго-Туг- ΝΗ₂ Химическое соединение 13;

Н-О1у-А1а-О1у-РС-Рго-Туг- ΝΗ₂ Химическое соединение 14 и их соли.

Примеры А и В включают (но не ограничиваются) Ν- и С(О)-радикалы следующих химических соединений:

Э/Ь-азетидин-З-карбоновая кислота, П/Ь-азетидин-2-карбоновая добавьте, П/Ь-Индолин-2-карбоновая кислота, Ώ/Ь- 1,3-дигидро-изоиндол-1 -карбоновая кислота, П/Ь-тиазолидин-4- карбоновая кислота,

Ώ/Ь-пипеколиновая кислота,

1)/Р- нипекотиновая кислота,

Изо нипекотиновая кислота,

Ε/Ώ-2-карбоксиморфолин, Ь/П-1/2,3,4-тетрагидрохинолин-3-карбоновая кислота, Ь/П-1,2,3,4-тетрагидрохинолин-3-карбоновая кислота и 4-карбокси-4-фенилпиперидин.

Желательно, чтобы как А так и В являлось аминокислотным остатком, имеющим насыщенную карбоциклическую структуру из 4, 5 или 6 членов, включая один или большее число гетероатомов типа Ν и 8. Упомянутые аминокаслоты включают Ь и I) формы, природные и неприродные аминокислоты и их производные типа остатка пролина, имеющего один или большее число заместителей в позициях 3, 4 или 5, при этом желательно, чтобы упомянутые заместители выбирались из группы, в состав которой входит гидроксигруппа, аминогруппа или фенильная группа; и Ν-замещенные аминокислоты типа саркозина, Νциклогексилглицина и Ν-фенилглицина. Желательно, чтобы последовательность А-В была представлена дипептидом, выбираемым из группы, в состав которой входит 8аг-8аг, 8аг-11ур, Нур-8аг, Рго-8аг, 8аг-Рго, Рго-11ур, Рго-Рго, 11ур-Рго, и Нур- Нур, где Рго и Нур независимо друг от друга могут иметь как форму Ь, так и форму Ώ, где циклическая структура Рго и Нур может произвольно замещаться галогеновой группой, нитрогруппой, метильной группой, аминогруппой или фенильной группой, и Нур является 3гидроксипролином или 4-гидроксипролином, или один, или оба из аминокислотных остатков А-В являются 8аг, или остатком Ν-циклогексилглицина.

Приведенная выше общая Формула может представлять линейный пептид, при этом упомянутая химическая модификация Ν-концевого участка X является ацилированием с произвольно замещенной С(1-22)алкил-карбоновой кислотой типа уксусной кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты и других жирных кислот, или произвольно замещенной С(2-22) алкенилкарбоновой кислотой, или арилкарбоновой кислотой, типа бензойной кислоты, где заместитель выбирается из группы, в состав которой входят гидроксигруппа, галогеновая группа, С(1-6)алкил, нитрогруппа или цианогруппа и может располагаться на углеродной цепи или в ароматической части; или алкилированием с произвольно замещенным С(1-22)алкилом, С(2-22)алкенилом, или арил-С(1-22)алкилом, типа метила, этила, пропила, бутила, фенилпропила, 2-гидроксифенилпропила, и 4-гидроксифенилпропила, где заместитель выбирается из группы, в состав которой входит гидроксигруппа, галогеновая группа, С(1-6)алкил, нитрогруппа или цианогруппа и может располагаться на углеродной цепи или в ароматической части. Лучше, если X выбирается из группы, в состав которой входит Ь-Туг и Ώ-Туг, произвольно ацилируемые С(1-4)карбоновой кислотой, предпочтительно уксусной кислотой, если Υ является пептидной последовательностью Сконцевой пептидной последовательности со 2-го до 5-го аминокислотного остатка, о чем говорилось выше. Желательно также, чтобы X представлял Ν-концевую модификацию группы А-В, при этом желательно, чтобы упомянутая модификация выбиралась из группы, в состав которой входит фенилпропионовая кислота и ее производные типа 4НРРА и 2НРРА; фенилуксусная кислота и их производные, типа

- 7 007792

4НРА, 3НРА и 2НРА; феноксиуксусная кислота и их производные, типа 4НРРА, 2НРРА и 4НМРА; бензоилглицин и его производные, типа 4НВС, 3НВС и 2НВС; и фенилглицин и его производные, связанные амидной связью с А.

Желательно выбирать А-В из группы, в состав которой входит Рго-Нур, Рго-Рго, Нур-Рго и НурНур, где Рго и Нур независимо друг от друга могут иметь форму Ь или форму Ό и желательно, чтобы Нур являлось 4Нур. Желательно, чтобы Υ был пептидом из 3 - 5 аминокислотных остатков, или лучше из 3-4 аминокислотных остатков, имея при этом форму Ь или форму Ό, и желательно, чтобы на его Сконцевом участке был 8аг или С1у, но еще лучше, если Υ является пептидной последовательностью, выбираемый из группы, в состав которой входит

С1у-Ь-А1а-С1у-ОН,

61у-Ь-А1а-61у-МН2,

С1у-Э-А1а-С1у-ОН,

61у-Э-А1а-61у-№Н₂ и 8аг-А1Ь-8аг-ОН/МН₂, при этом X является одиночной аминокислотой.

Примерами химических соединений с нормальной цепью по формуле I являются Н-61у-А1а-61у-61у-Рго-Туг-ОН/МН₂

Ас-Ь-Туг-Ь-Рго-Ь-4Нур-61у-Ь-А1а-61у-ОН/НН₂Ас-О-Туг-О-Рго-О-4Нур-61у-Э-А1а-61у-ОН

Ас-О-Туг-О-Рго-О-4Нур-61у-О-А1а-61у-№Н₂ (химическое соединение 2) Ас-Туг-Рго-4Нур-61у-А1а-61у-ОН (химическое соединение 1)

Ас-Туг-Рго-4Нур-С1у-А1а-С1у-ХН₂

Ас-Туг-Рго-Рго-С1у-А1а-С1у-ОН/ХН₂

Ас-П-Т'\г-П-Рго-П-Рго-61\-П-А1а-61\-ОН/\Н;

Ас-Туг-4Нур-Рго-61у -А1а-61у -ОН/Ν!

Ас-О-Туг-О-4Нур-О-Рго-61у-О-А1а-61у-ОН/ЯН₂Ас-Туг-4Нур-4Нур-С1у-А1а-С1у-ОН/ХН2

Ас-О-Туг-О-4Нур-О-4Нур-61у-О-А1а-61у-ОН/ЯН₂

Ас-Туг-8аг-4Нур-С1у-А1а-С1у-ОН/ХН_;

Ас-О-Туг-8аг-Э-4Нур-61у-П-А1а-61у-ОН/МН₂

Ас-Туг-4Нур-8аг-61у-А1а-61у-ОН/ЙН₂

Ас-О-Туг-О-4Нур-8аг-61у-Э-А1а-61у-ОН/НН₂

Ас-Туг-Рго-8аг-61у -А1а-61у -ОН/Ν!

Ас-1)-Ъ1А)-Рго-8а1<11\-1)-А1а-С11\-ОН/\1Р

Ас-Туг-8аг-Рго-С1у-А1а-С1у-ОН/ХН₂

Ас-О-Туг-8аг-О-Рго-61у-Э-А1а-61у-ОН/НН₂Ас-Туг-8аг-8аг-С1у-А1а-С1у-ОН/ХН_;

Ас-О-Туг-8аг-8аг-61у-Э-А1а-61у-ОН/НН₂

Т£а-Ь-Туг-Ь-Рго-Ь-4Нур-61у-Ь-А1а-61у-ОН,

Т£а-О-Туг-О-Рго-П-4Нур-61у-Э-А1а-61у-ОН,

Т£а-Туг-Рго-4Нур-61у-А1а-61у-ОН ТГа-Туг-Рго-4Нур-С1у-А1а-С1у-ХН₂

Т1а-1)-Ъ1Ч)-Рго-1)-41Р]»С1Р-1)-А1а-С11\-\1Р

ТГа-Туг-Рго -Рго-61у -А1а-61у -ОН/Ν!

Т1а-1)-Ъ1Ч)-Рго-1)-Рго-С11\-1)-А1а-С11\-ОН/\1Р

ТГа-Туг-4Нур-Рго-С1у-А1а-С1у-ОН/ХН₂

Т1а-1)-Ъ1А)-41Р]»1)-Рго-С11\-1)-А1а-С11\-ОН/\1Ь

Т£а-Туг-4Нур-4Нур-61у-А1а-61у-ОН/ЫН₂

Т1а-1)-Ъ1Ч)-41Рр-1)-41Рр-С11\-1)-А1а-С11\-ОН/\1Р ТГа-Туг-8аг-4Нур-С1у-А1а-С1у-ОН/ХН_;

Т£а-О-Туг-8аг-П-4Нур-61у-О-А1а-61у-ОН/ЯН₂

Т£а-Туг-4Нур-8аг-61у-А1а-61у-ОН/ЯН₂

Т£а-О-Туг-О-4Нур-8аг-61у-Э-А1а-61у-ОН/МН₂ТГа-Туг-Рго-8аг-С1у-А1а-С1у-ОН/ХН_;

Т£а-О-Туг-О-Рго-8аг-61у-Э-А1а-61у-ОН/НН₂

Т£а-Туг-8аг-Рго-61у-А1а-61у-ОН/ЯН₂

Т£а-О-Туг-8аг-О-Рго-61у-Э-А1а-61у-ОН/НН₂Т£а-Туг-8аг-8аг-61у-А1а-61у-ОН/ЯН₂

Т£а-О-Туг-8аг-8аг-61у-О-А1а-61у-0Н/ЯН2 4НРР-О-Рго-П-4Нур-61у-О-А1а-61у-ОН/ЯН₂4НРРА-Рго-4Нур-61у-А1а-61у-ОН/МН₂4НРРА-О-Рго-О-4Нур-61у-Э-А1а-61у-ОН/НН₂4НМРА-Рго-4Нур-61у-А1а-61у-ОН/МН₂

- 8 007792

4ΗΜΡΑ-Ό-ΡΓθ-Ό-4Ηγρ-61γ-Ό-Α1Η-61γ-ΟΗ/ΝΗ2 4НРА-Рго-4Нур-61у-А1а-61у-ОН/МН₂4ΗΡΑ-Ό-ΡΓθ-Ό-4Ηγρ-61γ-Ό-Α13-61γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΒΟ-ΡΓΘ-4Ηγρ-Ο1γ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΒΟ-Ο-ΡΓθ-Ω-4Ηγρ-Ο1γ-Ο-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡ-ΡΓΘ-ΡΓΘ-Ο1γ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡ-Ο-ΡΓθ-Ω-ΡΓθ-Ο1γ-Ο-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡΑ-ΡΓΘ-ΡΓΘ-Ο1γ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡΑ-Ο-ΡΓθ-Ω-ΡΓθ-Ο1γ-Ο-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΜΡΑ-ΡΓΘ-ΡΓΘ-Ο1γ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΜΡΑ-υ-ΡΓ0-υ-ΡΓ0-61\-υ-Α1α-61\-ΟΗ/ΝΗ; 4ΗΡΑ-ΡΓΘ-ΡΓΘ-Ο1γ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΑ-Ω-ΡΓθ-Ο-ΡΓθ-Ο1γ-Ο-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΒΟ-ΡΓθ-ΡΓθ-Ο1γ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΒΟ-Ω-ΡΓθ-Ο-ΡΓθ-Ο1γ-Ο-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡ-4Η\·ρ-4Η\·ρ-61\·-Α1;·ι-6Κ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡ-Ο-4Ηγρ-Ω-4Ηγρ-Ο1γ-Ο-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡΑ-4Η\·ρ-4Η\ρ-61\·-Α1;·ι-6Κ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡΑ-Ο-4Ηγρ-Ω-4Ηγρ-Ο1γ-Ο-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΜΡΑ-4Η\·ρ-4Η\·ρ-61\·-Α1;·ι-61.ν-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΜΡΑ-Ο-4Ηγρ-Ω-4Ηγρ-Ο1γ-Ο-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΑ-4Η\·ρ-4Η\·ρ-61\·-Α1;·ι-6Κ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΑ-Ω-4Ηγρ-Ο-4Ηγρ-Ο1γ-Ο-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΒ6-4Η\·ρ-4Η\·ρ-61\·-Α1;·ι-6Κ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΒΟ-Ο-4Ηγρ-Ο-4Ηγρ-Ο1γ-Ο-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡ-4Ηγρ-ΡΓθ-Ο1γ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡ-Ο-4Ηγρ-Ο-ΡΓθ-Ο1γ-Ο-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡΑ-4Ηγρ-ΡΓθ-Ο1γ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡΑ-Ω-4Ηγρ-Ο-ΡΓθ-Ο1γ-Ο-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΜΡΑ-4Ηγρ-ΡΓθ-Ο1γ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4Η\11ΡΑ-Ι)-4ΙΡρ-Ι)-ΡΓ0-(.ι1\-Ι)-Α1;ι-(.ι1\-(ΟΗ/\1Ρ 4ΗΡΑ-4Ηγρ-ΡΓθ-Ο1γ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΑ-Ω-4Ηγρ-Ο-ΡΓθ-Ο1γ-Ο-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΒΟ-4Ηγρ-ΡΓθ-Ο1γ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΒΟ-Ο-4Ηγρ-Ω-ΡΓθ-Ο1γ-Ο-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡ-8αΓ-ΡΓθ-Ο1γ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ_;4ΗΡΡ-8αΓ-Ο-ΡΓθ-Ο1γ-Ο-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ_;4ΗΡΡΑ-8αΓ-ΡΓθ-Ο1γ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ_;4ΗΡΡΑ-8αΓ-Ω-ΡΓθ-Ο1γ-Ο-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΜΡΑ-8αΓ-ΡΓθ-Ο1γ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂

Ι\1ΡΑ-Η;ιι~-Ι7-Ριο-Οί1ν-12-Α1;ι-€.ί1ν-ΟΙ Ι/ΝΙΙ₂4ΗΡΑ-8αΓ-ΡΓθ-Ο1γ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΑ-8αΓ-Ω-ΡΓθ-Ο1γ-Ο-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΒΟ-8αΓ-ΡΓθ-Ο1γ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΒΟ-8αΓ-Ω-ΡΓθ-Ο1γ-Ο-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡ-ΡΓθ-8αΓ-Ο1γ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡ-Ω-ΡΓθ-8αΓ-Ο1γ-Ο-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡΑ-ΡΓθ-8αΓ-Ο1γ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ_;4ΗΡΡΑ-Ο-ΡΓθ-8αΓ-Ο1γ-Ο-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ_;4ΗΜΡΑ-ΡΓθ-8αΓ-Ο1γ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ_;4ΗΜΡΑ-Ω-ΡΓθ-8αΓ-Ο1γ-Ο-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΑ-ΡΓθ-8αΓ-Ο1γ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΑ-Ω-ΡΓθ-8αΓ-Ο1γ-Ο-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΒΟ-ΡΓθ-8αΓ-Ο1γ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΒΟ-Ο-ΡΓθ-8αΓ-Ο1γ-Ο-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡ-8αΓ-4Ηγρ-Ο1γ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡ-8αΓ-Ω-4Ηγρ-Ο1γ-Ο-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡΑ-8αΓ-4Ηγρ-Ο1γ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡΑ-8αΓ-Ο-4Ηγρ-Ο1γ-Ρ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΜΡΑ-8αΓ-4Ηγρ-Ο1γ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΜΡΑ-8αΓ-Ο-4Ηγρ-Ο1γ-Ρ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΑ-8αΓ-4Ηγρ-Ο1γ-Α1α-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂

- 9 007792

4НРА-8аг-О-4Нур-С1у-0-А1а-С1у-ОН/КН₂4НВ6-8аг-4Нур-61у-А1а-61у-ОН/ЯН₂4НВС-8аг-О-4Нур-С1у-Э-А1а-С1у-ОН/ПН₂4НРР-4Нур-8аг-С1у-А1а-С1у-ОН/ПН₂4НРР-О-4Нур-8аг-С1у-Э-А1а-С1у-ОН/ПН₂4НРРА-4Нур-8аг-С1у-А1а-С1у-ОН/ПН₂4НРРА-О-4Нур-8аг-61у-О-А1а-61у-ОН/ЯН₂4НМРА-4Нур-8аг-С1у-А1а-С1у-ОН/ПН₂4НМРА-О-4Нур-8аг-61у-О-А1а-61у-ОН/ЯН₂4НРА-4Нур-8аг-С1у-А1а-С1у-ОН/ПН₂4НРА-О-4Нур-8аг-С1у-П-А1а-С1у-ОН/ЫН₂4НВС-4Нур-8аг-С1у-А1а-С1у-ОН/НН₂4НВС-О-4Нур-8аг-С1у-Э-А1а-С1у-ОН/НН₂4НРР-8аг-8аг-С1у-А1а-С1у-ОН/ПН₂4НРР-8аг-8аг-С1у-Э-А1а-С1у-ОН/ПН₂4НРРА-8аг-8аг-С1у-А1а-С1у-ОН/НН_;4НРРА-8аг-8аг-С1у-Э-А1а-С1у-ОН/ПН₂4НМРА-8аг-8аг-С1у-А1а-С1у-ОН/ПН₂4НМРА-8аг-8аг-61у-О-А1а-61у-ОН/ЯН₂4НРА-8аг-8аг-61у-А1а-61у-ОН/ЫН2 4НРА-8аг-8аг-С1у-О-А1а-С1у-ОН/ЫН2 4НВС-8аг-8аг-С1у-А1а-С1у-ОН/НН2 4НВС-8аг-8аг-С1у-Э-А1а-С1у-ОН/НН2 Ас-Туг-Рго-4Нур-8аг-А1а-8аг-ОН/ЫН₂

Ас -Ό -Туг-Ό -Рго -Ό -4Нур-8аг-Э-А1а-8аг-ОН/ПН₂Ас-Туг-Рго -Рго -8аг-А1а-8аг-ОН/ПН₂Ас-П-Туг-П-Рго-О-Рго-8аг-Э-А1а-8аг-ОН/НН₂Ас-Туг-4Нур-Рго-8аг-А1а-8аг-ОН/ЫН₂

Ас -Ό -Туг-Ό -4Нур-О-Рго-8аг-О -А1а-8аг-ОН/ЯН₂Ас-Туг-4Нур-4Нур-8аг-А1а-8аг-ОН/ЯН₂Ас-О-Туг-О-4Нур-О-4Нур-8аг-О-А1а-8аг-ОН/ПН₂Ас-Туг-8аг-4Нур-8аг-А1а-8аг-ОН/ЯН₂Ас-0-Туг-8аг-0-4Нур-8аг-О-А1а-8аг-ОН/ЫН₂Ас-Туг-4Нур-8аг-8аг-А1а-8аг-ОН/ЯН₂Ас-0-Туг-О-4Нур-8аг-8аг-О-А1а-8аг-ОН/ЫН₂Ас-Туг-Рго-8аг-8аг-А1а-8аг-ОН/МН₂

Ас-О-Туг-О-Рго-8аг-8аг-О-А1а-8аг-ОН/НН_;

Ас-Туг-8аг-Рго-8аг-А1а-8аг-ОН/МН₂Ас-0-Туг-8аг-О-Рго-8аг-0-А1а-8аг-ОН/ПН₂ТГа-Туг-Рго-4Нур-8аг-А1а-8аг-ОН/НН_;

Т£а-О-Туг-О-Рго - О-4Нур-8аг-Э -А1а-8аг-ОН/ПН₂Т£а-Туг-Рго-Рго-8аг-А1а-8аг-ОН/ЯН₂

Т£а-О-Туг-О-Рго-Э-Рго-8аг-0 -А1а-8аг-ОН/ПН₂Т£а-Туг-4Нур-Рго-8аг-А1а-8аг-ОН/ПН₂Т£а-О-Туг-П-4Нур-О-Рго-8аг-О-А1а-8аг-ОН/ЯН₂Т£а-Туг-4Нур-4Нур-8аг-А1а-8аг-ОН/ЯН₂Т£а-О-Туг-О-4Нур-О-4Нур-8аг-О-А1а-8аг-ОН/ЯН₂Т£а-Туг-8аг-4Нур-8аг-А1а-8аг-ОН/ЫН₂Т£а-0-Туг-8аг-О-4Нур-8аг-0-А1а-8аг-ОН/ЯН₂Т£а-Туг-4Нур-8аг-8аг-А1а-8аг-ОН/ЯН₂Т£а-О-Туг-О-4Нур-8аг-8аг-О-А1а-8аг-ОН/ЯН₂ТГа-Туг-Рго-8аг-8аг-А1а-8аг-ОН/НН_;

Т£а-О-Туг-О-Рго-8аг-8аг-О-А1а-8аг-ОН/ПН₂Т£а-Туг-8аг-Рго-8аг-А1а-8аг-ОН/ЫН₂Т£а-О-Туг-8аг-О-Рго-8аг-О-А1а-8аг-ОН/НН₂4НРР-Рго-4Нур-8аг-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРР-О-Рго-О-4Нур-8аг-О-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРРА-Рго-4Нур-8аг-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРРА-О-Рго-О-4Нур-8аг-О-А1а-8аг-ОН/ПН₂4НМРА-Рго-4Нур-8аг-А1а-8аг-ОН/НН₂4НМРА-0-Рго-0-4Нур-8аг-О-А1а-8аг-ОН/ЫН₂4НРА-Рго-4Нур-8аг-А1а-8аг-ОН/1\1Н₂

- 10 007792

4НРА-О-Рго-Э-4Нур-8аг-П-А1а-8аг-ОН/МН₂4НВ6-Рго-4Нур-8аг-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НВ6-О-Рго-О-4Нур-8аг-О-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРР-Рго-Рго-8аг-А1а-8аг-ОН/ЫН₂4НРР-О-Рго-О-Рго-8аг-Э -А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРРА-Рго-Рго-8аг-А1а-8аг-ОН/НН₂4НРРА-О-Рго-О-Рго-8аг-Э-А1а-8аг-ОН/НН₂4НМРА-Рго-Рго-8аг-А1а-8аг-ОН/ХН₂4НМРА-Э-Рго -Ό -Рго-8аг-Э-А1а-8аг-ОН/ХН₂4НРА-Рго -Рго -8аг-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРА-Э -Рго -Ό -Рго -8аг-Э -А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НВС-Рго-Рго-8аг-А1а-8аг-ОН/ЫН₂4НВС-О-Рго-П-Рго-8аг-Э-А1а-8аг-ОН/НН₂4НРР-4Нур-4Нур-8аг-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НРР-О-4Нур-О-4Нур-8аг-П-А1а-8аг-ОН/ЫН₂4НРРА-4Нур-4Нур-8аг-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НРРА-О-4Нур-О-4Нур-8аг-Э-А1а-8аг-ОН/ХН₂4НМРА-4Нур-4Нур-8аг-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НМРА-О-4Нур-О-4Нур-8аг-Э-А1а-8аг-ОН/ХН₂4НРА-4Нур-4Нур-8аг-А1а-8аг-ОН/ЫН2 4НРА-О-4Нур-О-4Нур-8аг-О-А1а-8аг-ОН/ЫН₂4НВ6-4Нур-4Нур-8аг-А1а-8аг-ОН/ЯН2 4НВС-О-4Нур-П-4Нур-8аг-Э-А1а-8аг-ОН/ХН₂4НРР-4Нур-Рго-8аг-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРР-О-4Нур-Э-Рго-8аг-П-А1а-8аг-ОН/ХН₂4НРРА-4Нур-Рго-8аг-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРРА-О-4Нур-О-Рго-8аг-Э-А1а-8аг-ОН/ХН₂4НМРА-4Нур-Рго-8аг-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НМРА-О-4Нур-О-Рго-8аг-Э-А1а-8аг-ОН/ХН₂4НРА-4Нур-Рго-8аг-А1а-8аг-ОН/1\1Н₂4НРА-О-4Нур-О-Рго-8аг-О-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НВ6-4Нур-Рго-8аг-А1а-8аг-ОН/ЯН2 4НВ6-О-4Нур-П-Рго-8аг-О-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРР-8аг-Рго-8аг-А1а-8аг-ОН/ХН₂4НРР-8аг-О-Рго-8аг-Э-А1а-8аг-ОН/ХН₂4НРРА-8аг-Рго-8аг-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРРА-8аг-О-Рго-8аг-Э-А1а-8аг-ОН/ХН₂4НМРА-8аг-Рго-8аг-А1а-8аг-ОН/ХН₂4НМРА-8аг-П-Рго-8аг-Э-А1а-8аг-ОН/ХН₂4НРА-8аг-Рго-8аг-А1а-8аг-ОН/ХН₂4НРА-8аг-П-Рго-8аг-О-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НВ6-8аг-Рго-8аг-А1а-8аг-ОН/ЫН2 4НВС-8аг-О-Рго-8аг-Э-А1а-8аг-ОН/НН2 4НРР-Рго-8аг-8аг-А1а-8аг-ОН/ХН₂4НРР-О-Рго-8аг-8аг-Э-А1а-8аг-ОН/ХН₂4НРРА-Рго-8аг-8аг-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРРА-Э-Рго -8аг-8аг-Э-А1а-8аг-ОН/ХН₂4НМРА-Рго -8аг-8аг-А1а-8аг-ОН/ХН₂4НМРА-Э-Рго -8аг-8аг-Э-А1а-8аг-ОН/ХН₂4НРА-Рго-8аг-8аг-А1а-8аг-ОН/ХН₂4НРА-Э -Рго-8аг-8аг-Э -А1а-8аг-ОН/ХН₂4НВ6-Рго-8аг-8аг-А1а-8аг-ОН/ЯН2 4НВС-О-Рго-8аг-8аг-Э-А1а-8аг-ОН/МН2 4НРР-8аг-4Нур-8аг-А1а-8аг-ОН/ЫН2 4НРР-8аг-П-4Нур-8аг-О-А1а-8аг-ОН/ЯН2 4НРРА-8аг-4Нур-8аг-А1а-8аг-ОН/1\1Н2 4НРРА-8аг-О-4Нур-8аг-Э-А1а-8аг-ОН/ХН2 4НМРА-8аг-4Нур-8аг-А1а-8аг-ОН/МН₂4НМРА-8аг-П-4Нур-8аг-О-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРА-8аг-4Нур-8аг-А1а-8аг-ОН/1\1Н₂4НРА-8аг-О-4Нур-8аг-П-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НВ6-8аг-4Нур-8аг-А1а-8аг-ОН/ЯН2

- 11 007792

4ΗΒ6-§ηγ-Ό-4Ηυρ-§ηγ-Ό-Α1η-8ηγ-ΟΗ/ΝΗ2 4НРР-4Нур-8аг-8аг-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4ΗΡΡ-Ό-4Ηυρ-8ηγ-8ηγ-Ό-Α1η-8ηγ-ΟΗ/ΝΗ₂4НРРА-4Нур-8аг-8аг-А1а-8аг-ОН/ИН₂4ΗΡΡΑ-Ο-4Ηνρ-8;·ΐΓ-8;·ΐΓ-Ο-Α1;·ι-8;·ΐΓ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΜΡΑ-4Η\·ρ-8;·ΐΓ-8;·ΐΓ-Α1;·ι-8;·ΐΓ-ΟΗ/ΝΗ₂4НМРА-Э-4Нур-8аг-8аг-П-А1а-8аг-ОН/КН₂4НРА-4Нур-8аг-8аг-А1а-8аг-ОН/1МН2 4НРА-П-4Нур-8аг-8аг-П-А1а-8аг-ОН/1\1Н2 4НВ6-4Нур-8аг-8аг-А1а-8аг-ОН/1МН2 4НВС-О-4Нур-8аг-8аг-О-А1а-8аг-ОН^Н_;4ΗΡΡ-8;·ιγ-8;·ιγ-8;·ιγ-Α1;·ι-8;·ιγ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡ-8;·ιγ-8;·ιγ-8;·ιγ-Ο-Α1;·ι-8;·ιγ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡΑ-8;·ιγ-8;·ιγ-8;·ιγ-Α1;·ι-8;·ιγ-ΟΗ/ΝΗ₂4НРРА-8аг-8аг-8аг-П-А1а-8аг-ОН^Н₂4НМРА-8аг-8аг-8аг-А1а-8аг-ОН^Н_;4НМРА-8аг-8аг-8аг-О-А1а-8аг-ОН^Н_;4НРА-8аг-8аг-8аг-А1а-8аг-ОН^Н2 4НРА-8аг-8аг-8аг-О-А1а-8аг-ОН^Н_;4НВС-8аг-8аг-8аг-А1а-8аг-ОН^Н_;4НВ6-8аг-8аг-8аг-П-А1а-8аг-ОН/1МН2 Ас-Туг-Рго-4Нур-8аг-А1а-С1у-ОН^Н_;Ас-^-Ту^-^-Р^ο-^-4Нур-8а^-^-А1а-61у-ОН/NН₂Ас-Туг-Рго -Рго -8аг-А1а-61у -ΟΗ/ΝΗ₂Ас -Ό -Туг-Ό -Рго -Ό -Рго-8аг-Э -А1а-С1у-ОН^Н_;Ас-Туг-4Нур-Рго -8аг-А1а-61у -ΟΗ/ΝΗ₂Ас-^-Ту^-^-4Нур-^-Р^ο-8а^-^-А1а-61у-ОН/NН₂Ас-Туг-4Нур-4Нур-8аг-А1а-61у-ОН/яН₂Ас-1)-Т\1Ч)-4Н\р-1)-4Н\р-8аг-1)-А1а-С11\-О11/\11; Ас-Туг-8аг-4Нур-8аг-А1а-61у-ОН/ХН₂Ас-О-Туг-8аг-О-4Нур-8аг-Э-А1а-61у-ОН/КН2 Ас-Туг-4Нур-8аг-8аг-А1а-61у-ОН/Кн₂Ас-О-Туг-О-4Нур-8аг-8аг-Э-А1а-61у-ОН/КН2 Ас-Туг-Рго-8аг-8аг-А1а-61у-ОН/КН₂Ас-П-Туг-П-Рго-8аг-8аг-Э-А1а-61у-ОН/КН₂Ас-Туг-8аг-Рго-8аг-А1а-61у-ОН/Кн₂

Ас -Ό -Туг-8аг-Э -Рго -8аг-Э-А1а-61у-ОН/ХН₂Т£а-Туг-Рго-4Нур-8аг-А1а-61у-ОН/ХН₂ТГа-О-Туг-О-Рго-О-4Нур-8аг-О-А1а-С1у-ОН^Н_;Т£а-Туг-Рго-Рго-8аг-А1а-61у-ОН/КН₂ТГа-Э-Туг-Э-Рго -О-Рго-8аг-Э -А1а-61у -ΟΗ/ΝΗ₂Т£а-Туг-4Нур-Рго-8аг-А1а-61у-ОН/хН₂ТГа-П-Т\г-П-4Н\р-П-Рго-8аг-П-А1а-61\-ОН/\Н; ТГа-Туг-4Нур-4Нур-8аг-А1а-61у-ОН/МН2 Т£а-О-Туг-О-4Нур-О-4Нур-8аг-О-А1а-61у-ОН/ХН₂ТГа-Туг-8аг-4Нур-8аг-А1а-61у-ОН/МН2 ТГа-О-Туг-8аг-О-4Нур-8аг-О-А1а-С1у-ОН^Н_;ТР1-Т\г-4Н\р-8аг-8аг-А1а-61\-ОН/\Н_;

ТГа-О-Туг-О-4Нур-8аг-8аг-О-А1а-С1у-ОН^Н_;Т£а-Туг-Рго-8аг-8аг-А1а-61у-ОН/ХН₂Т£а-О-Туг-О-Рго-8аг-8аг-О-А1а-61у-ОН/КН₂Т£а-Туг-8аг-Рго-8аг-А1а-61у-ОН/ЙН₂Т£а-О-Туг-8аг-О-Рго-8аг-О-А1а-61у-ОН/КН₂4НРР-Рго-4Нур-8аг-А1а-61у-ОН/МН₂4НРР-О-Рго-О-4Нур-8аг-О-А1а-61у-ОН/ХН₂4НРРА-Рго-4Нур-8аг-А1а-61у-ОН/МН₂4НРРА-О-Рго-О-4Нур-8аг-О-А1а-61у-ОН/ХН₂4НМРА-Рго-4Нур-8аг-А1а-61у-ОН/МН₂4НМРА-О-Рго-Э-4Нур-8аг-П-А1а-61у-ОН^Н₂4НРА-Рго-4Нур-8аг-А1а-61у-ОН/МН₂4НРА-О-Рго-О-4Нур-8аг-Э-А1а-61у-ОН/КН₂4НВ6-Рго-4Нур-8аг-А1а-61у-ОН^Н₂

- 12 007792

4НВ6-О-Рго-О-4Нур-8аг-П-А1а-61у-ОН/ЯН₂4НРР-Рго-Рго-8аг-А1а-61у-ОН/МН₂4НРР-О-Рго-О-Рго-8аг-О-А1а-С1у-ОН/МН₂4НРРА-Рго-Рго-8аг-А1а-С1у-ОН/НН₂4НРРА-О-Рго-О-Рго-8аг-Э-А1а-С1у-ОН/НН₂4НМРА-Рго-Рго-8аг-А1а-С1у-ОН/НН₂4НМРА-О-Рго-О-Рго-8аг-Э-А1а-С1у-ОН/НН₂4НРА-Рго-Рго-8аг-А1а-С1у-ОН/НН₂4НРА-О-Рго-О-Рго-8аг-О-А1а-С1у-ОН/МН₂4НВС-Рго-Рго-8аг-А1а-С1у-ОН/ЫН₂4НВС-О-Рго-П-Рго-8аг-Э-А1а-С1у-ОН/НН₂4НРР-4Нур-4Нур-8аг-А1а-61у-ОН/МН₂4НРР-О-4Нур-О-4Нур-8аг-П-А1а-С1у-ОН/ЫН₂4НРРА-4Нур-4Нур-8аг-А1а-61у-ОН/МН₂4НРРА-О-4Нур-О-4Нур-8аг-Э-А1а-С1у-ОН/МН₂4НМРА-4Нур-4Нур-8аг-А1а-61у-ОН/МН₂4НМРА-О-4Нур-О-4Нур-8аг-Э-А1а-С1у-ОН/МН₂4НРА-4Нур-4Нур-8аг-А1а-61у-ОН/ЯН₂4НРА-О-4Нур-О-4Нур-8аг-О-А1а-С1у-ОН/ЫН₂4НВС-4Нур-4Нур-8аг-А1а-С1у-ОН/ДН_;4НВС-О-4Нур-П-4Нур-8аг-Э-А1а-С1у-ОН/МН₂4НРР-4Нур-Рго-8аг-А1а-61у-ОН/ЯН₂4НРР-О-4Нур-О-Рго-8аг-П-А1а-С1у-ОН/МН₂4НРРА-4Нур-Рго-8аг-А1а-61у-ОН/МН₂4НРРА-О-4Нур-Э-Рго-8аг-П-А1а-С1у-ОН/МН₂4НМРА-4Нур-Рго-8аг-А1а-61у-ОН/МН₂4НМРА-О-4Нур-Э-Рго-8аг-П-А1а-С1у-ОН/МН₂4НРА-4Нур-Рго-8аг-А1а-61у-ОН/МН₂4НРА-О-4Нур-О-Рго-8аг-П-А1а-61у-ОН/ЯН₂4НВ6-4Нур-Рго-8аг-А1а-61у-ОН/ЯН₂4НВС-О-4Нур-О-Рго-8аг-П-А1а-С1у-ОН/МН₂4НРР-8аг-Рго-8аг-А1а-С1у-ОН/ДН_;4НРР-8аг-О-Рго-8аг-Э-А1а-С1у-ОН/МН₂4НРРА-8аг-Рго-8аг-А1а-61у-ОН/ЯН₂4НРРА-8аг-О-Рго-8аг-О-А1а-61у-ОН/ЯН₂4НМРА-8аг-Рго-8аг-А1а-С1у-ОН/ДН_;4НМРА-8аг-П-Рго-8аг-Э-А1а-С1у-ОН/МН₂4НРА-8аг-Рго-8аг-А1а-С1у-ОН/ДН_;4НРА-8аг-П-Рго-8аг-О-А1а-61у-ОН/ЯН₂4НВС-8аг-Рго-8аг-А1а-С1у-ОН/ДН_;4НВ6-8аг-О-Рго-8аг-О-А1а-61у-ОН/ЯН₂4НРР-Рго-8аг-8аг-А1а-С1у-ОН/ДН_;4НРР-О-Рго-8аг-8аг-П-А1а-С1у-ОН/МН₂4НРРА-Рго-8аг-8аг-А1а-61у-ОН/ЯН₂4НРРА-О-Рго-8аг-8аг-О-А1а-61у-ОН/ЯН₂4НМРА-Рго-8аг-8аг-А1а-С1у-ОН/ДН_;4НМРА-О-Рго-8аг-8аг-Э-А1а-С1у-ОН/МН₂4НРА-Рго-8аг-8аг-А1а-С1у-ОН/ДН_;4НРА-О-Рго-8аг-8аг-Э-А1а-С1у-ОН/МН₂4НВ6-Рго-8аг-8аг-А1а-61у-ОН/ЯН₂4НВС-О-Рго-8аг-8аг-О-А1а-С1у-ОН/ЯН₂4НРР-8аг-4Нур-8аг-А1а-61у-ОН/МН2 4НРР-8аг-П-4Нур-8аг-О-А1а-С1у-ОН/ЫН₂4НРРА-8аг-4Нур-8аг-А1а-61у-ОН/1\1Н2 4НРРА-8аг-О-4Нур-8аг-Э-А1а-С1у-ОН/МН₂4НМРА-8аг-4Нур-8аг-А1а-61у-ОН/ЯН₂4НМРА-8аг-П-4Нур-8аг-О-А1а-61у-ОН/ЯН₂4НРА-8аг-4Нур-8аг-А1а-61у-ОН/МН2 4НРА-8аг-О-4Нур-8аг-О-А1а-С1у-ОН/ДН_;4НВ6-8аг-4Нур-8аг-А1а-61у-ОН/ЯН₂4НВ6-8аг-О-4Нур-8аг-О-А1а-61у-ОН/ЯН₂4НРР-4Нур-8аг-8аг-А1а-61у-ОН/МН2

- 13 007792

4НРР-О-4Нур-8аг-8аг-О-А1а-С1у-ОН/ИН₂4НРРА-4Нур-8аг-8аг-А1а-61у-ОН/ИН₂4НРРА-О-4Нур-8аг-8аг-О-А1а-С1у-ОН/ИН₂4НМРА-4Нур-8аг-8аг-А1а-61у-ОН/ИН₂4НМРА-О-4Нур-8аг-8аг-О-А1а-61у-ОН/ЯН₂4НРА-4Нур-§аг-§аг-А1а-61у-ОН/ИН2 4НРА-О-4Нур-8аг-8аг-П-А1а-С1у-ОН/ЫН₂4НБ6-4Нур-§аг-§аг-А1а-61у-ОН/ИН2 4НВ6-О-4Нур-8аг-8аг-О-А1а-61у-ОН/ЯН2 Ас-Туг-Рго-4Нур-С1у -А1а-8аг-ОН/ЯН₂Ас-О-Туг-П-Рго-О-4Нур-61у-О-А1а-8аг-ОН/ЯН₂Ас-Туг-Рго-Рго-С1у-А1а-8аг-ОН/ЫН₂Ас-О-Туг-П-Рго-О-Рго-С1у-Э-А1а-8аг-ОН/НН₂Ас-Туг-4Нур-Рго-С1у-А1а-8аг-ОН/ЫН₂

Ас-0 -Туг-Ό -4Нур-Э -Рго-С1у - О-А1а-8аг-ОН/ЯН₂Ас-Туг-4Нур-4Нур-С1у-А1а-8аг-ОН/ИН₂Ас-О-Туг-П-4Нур-О-4Нур-С1у-О-А1а-8аг-ОН/ИН₂Ас-Туг-8аг-4Нур-С1у-А1а-8аг-ОН/ИН₂Ас-О-Туг-8аг-О-4Нур-С1у-О-А1а-8аг-ОН/ИН2 Ас-Туг-4Нур-8аг-61у-А1а-8аг-ОН/ЯН₂Ас-О-Туг-О-4Нур-8аг-С1у-О-А1а-8аг-ОН/ИН2 Ас-Туг-Рго-8аг-61у-А1а-8аг-ОН/ЯН₂

Ас -Ό -Туг-Ό -Рго -8аг-С1у-Э -А1а-8аг-ОН/ЯН₂

Ас-Туг-8аг-Рго-61у-А1а-8аг-ОН/ЯН₂

Ас -Ό -Туг-8аг-Э - Рго -С1у-Э -А1а-8аг-ОН/ИН₂

Ас-Туг-8аг-8аг-С1у-А1а-8аг-ОН/ЫН₂Ас-О-Туг-8аг-8аг-С1у-О-А1а-8аг-ОН/ИН₂ТГа-Туг-Рго-4Нур-С1у-А1а-8аг-ОН/ИН₂ТГа-О-Туг-О-Рго-П-4Нур-С1у-Э-А1а-8аг-ОН/МН₂ТГа-Туг-Рго -Рго-С1у -А1а-8аг-ОН/ИН₂

ТГа-Э-Туг-Э-Рго-Э-Рго-С1у-0 -А1а-8аг-ОН/ИН₂ТГа-Туг-4Нур-Рго-С1у-А1а-8аг-ОН/ИН₂ТГа-О-Туг-О-4Нур-О-Рго-61у-О-А1а-8аг-ОН/ЯН₂ТГа-Туг-4Нур-4Нур-61у-А1а-8аг-ОН/ИН2

ТГа-О-Туг-П-4Нур-О-4Нур-61у-О-А1а-8аг-ОН/ЯН₂

ТГа-Туг-8аг-4Нур-61у-А1а-8аг-ОН/ЯН₂ТГа-О-Туг-8аг-П-4Нур-61у-О-А1а-8аг-ОН/ЯН₂ТГа-Туг-4Нур-8аг-61у-А1а-8аг-ОН/ЯН₂ТГа-О-Туг-П-4Нур-8аг-С1у-О-А1а-8аг-ОН/ИН2 ТГа-Туг-Рго-8аг-С1у-А1а-8аг-ОН/ИН₂ТГа-О-Туг-О-Рго-8аг-С1у-О-А1а-8аг-ОН/ИН₂ТГа-Туг-8аг-Рго-С1у-А1а-8аг-ОН/ИН₂ТГа-О-Туг-8аг-П-Рго-С1у-П-А1а-8аг-ОН/ИН₂ТГа-Туг-8аг-8аг-61у-А1а-8аг-ОН/ЯН₂ТГа-О-Туг-8аг-8аг-61у-О-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРР-Рго-4Нур-61у-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРР-О-Рго-П-4Нур-61у-О-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРРА-Рго-4Нур-61у-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НРРА-О-Рго-О-4Нур-С1у-О-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НМРА-Рго-4Нур-61у-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НМРА-О-Рго-П-4Нур-С1у-П-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НРА-Рго-4Нур-61у-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРА-О-Рго-О-4Нур-С1у-П-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НВ6-Рго-4Нур-61у-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НВ6-О-Рго-О-4Нур-61у-О-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРР-Рго-Рго-С1у-А1а-8аг-ОН/НН₂4НРР-О-Рго-О-Рго-С1у-Э-А1а-8аг-ОН/НН₂4НРРА-Рго-Рго-С1у-А1а-8аг-ОН/ЫН₂4НРРА-О-Рго-О-Рго-С1у-Э-А1а-8аг-ОН/НН₂4НМРА-Рго-Рго-С1у-А1а-8аг-ОН/НН₂4НМРА-О-Рго-О-Рго-С1у-О-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НРА-Рго-Рго-С1у-А1а-8аг-ОН/ЫН₂

- 14 007792

4НРА-О-Рго-О-Рго-61у-Э-А1а-8аг-ОН/НН₂4НВ6-Рго-Рго-61у-А1а-8аг-ОН/ЫН₂4НВ6-О-Рго-П-Рго-61у-Э-А1а-8аг-ОН/НН₂4НРР-4Нур-4Нур-61у-А1а-8аг-ОН/ЫН₂4НРР-О-4Нур-О-4Нур-61у-П-А1а-8аг-ОН/ЫН₂4НРРА-4Нур-4Нур-61у-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НРРА-О-4Нур-О-4Нур-61у-О-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НМРА-4Нур-4Нур-61у-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НМРА-О-4Нур-О-4Нур-61у-О-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НРА-4Нур-4Нур-61у-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРА-О-4Нур-О-4Нур-61у-О-А1а-8аг-ОН/ЫН₂4НВ6-4Нур-4Нур-61у-А1а-8аг-ОН/МН2 4НВ6-О-4Нур-О-4Нур-61у-О-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРР-4Нур-Рго-61у-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРР-О-4Нур-О-Рго-61у-О-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРРА-4Нур-Рго-61у-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРРА-О-4Нур-О-Рго-61у-О-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НМРА-4Нур-Рго-61у-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НМРА-О-4Нур-О-Рго-61у-О-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НРА-4Нур-Рго-61у-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НРА-О-4Нур-О-Рго-61у-П-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НВ6-4Нур-Рго-61у-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НВ6-О-4Нур-О-Рго-61у-Э-А1а-8аг-ОН/МН₂4НРР-8аг-Рго-61у-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НРР-8аг-О-Рго-61у-О-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НРРА-8аг-Рго-61у-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРРА-8аг-П-Рго-61у-О-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НМРА-8аг-Рго-61у-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НМРА-8аг-П-Рго-61у-П-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НРА-8аг-Рго-61у-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НРА-8аг-О-Рго-61у-О-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НВ6-8аг-Рго-61у-А1а-8аг-ОН/МН2 4НВ6-8аг-О-Рго-61у-О-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРР-Рго-8аг-61у-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НРР-О-Рго-8аг-61у-О-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НРРА-Рго-8аг-61у-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРРА-О-Рго-8аг-61у-О-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НМРА-Рго-8аг-61у-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НМРА-О-Рго-8аг-61у-О-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НРА-Рго-8аг-61у-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРА-О-Рго-8аг-61у-О-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НВ6-Рго-8аг-61у-А1а-8аг-ОН/МН2 4НВ6-О-Рго-8аг-61у-О-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРР-8аг-4Нур-61у-А1а-8аг-ОН/ЫН2 4НРР-8аг-П-4Нур-61у-О-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРРА-8аг-4Нур-61у-А1а-8аг-ОН/ИН2 4НРРА-8аг-О-4Нур-61у-О-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НМРА-8аг-4Нур-61у-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НМРА-8аг-П-4Нур-61у-П-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НРА-8аг-4Нур-61у-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НРА-8аг-П-4Нур-61у-О-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НВ6-8аг-4Нур-61у-А1а-8аг-ОН/МН2 4НВ6-8аг-О-4Нур-61у-О-А1а-8аг-ОН/ЯН2 4НРР-4Нур-8аг-61у-А1а-8аг-ОН/ЫН2 4НРР-О-4Нур-8аг-61у-П-А£а-8аг-ОН/ИН₂4НРРА-4Нур-8аг-61у-А1а-8аг-ОН/ИН2 4НРРА-Э-4Нур-8аг-61у-О-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НМРА-4Нур-8аг-61у-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НМРА-О-4Нур-8аг-61у-О-А1а-8аг-ОН/ЯН₂4НРА-4Нур-8аг-61у-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НРА-Э-4Нур-8аг-61у-П-А1а-8аг-ОН/ИН₂4НВ6-4Нур-8аг-61у-А1а-8аг-ОН/МН2

- 15 007792

4ΗΒ6-Ό-4Ηγρ-8αΓ-61γ-Ό-Ά1α-8αΓ-ΟΗ/ΝΗ2 4НРР-8аг-8аг-61у-А1а-8аг-ОН/ИН₂4ΗΡΡ-8αΓ-8αΓ-61γ-Ό-Α1α-8αΓ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡΑ-8а^-8а^-61у-Α1а-8а^-ΟΗ/NΗ₂4ΗΡΡΑ-8а^-8а^-61у-^-Α1а-8а^-ΟΗ/NΗ2 4ΗМΡΑ-8а^-8а^-61у-Α1а-8а^-ΟΗ/NΗ2 4ΗМΡΑ-8а^-8а^-61у-^-Α1а-8а^-ΟΗ/NΗ2 4ΗΡΑ-8а^-8а^-61у-Α1а-8а^-ΟΗ/NΗ2 4ΗΡΑ-8а^-8а^-61у-^-Α1а-8а^-ΟΗ/NΗ2

4^6^^-6^^^^/4¾ Αс-Ту^-Ρ^о-4Ηуρ-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/N¾ Αс-^-Ту^-^-Ρ^о-^-4Ηуρ-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/NΗ₂Ас-Туг-Рго -Рго-61у-А1Ь-61у -ΟΗ/ΝΗ₂Αс-^-Ту^-^-Ρ^о-^-Ρ^о-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/NΗ₂Αс-Ту^-4Ηуρ-Ρ^о-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/NΗ₂Αс-^-Ту^-^-4Ηуρ-^-Ρ^о-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/NΗ₂Αс-Ту^-4Ηуρ-4Ηуρ-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/NΗ₂Αс-^-Ту^-^-4Ηуρ-^-4Ηуρ-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/NΗ₂Αс-Ту^-8а^-4Ηуρ-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/N¾ Αс-^-Ту^-8а^-^-4Ηуρ-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/N¾ Ас-Туг-4Иур-8аг-61у -А1Ь-61у -ΟΗ/ΝΗ₂Αс-^-Ту^-^-4Ηуρ-8а^-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/N¾ Ас-Туг-Рго -8аг-61у -А1Ь-61у -ΟΗ/ΝΗ₂

Ас -Ό -Туг-Ό -Рго-8аг-61у-А Φ-61γ-ΟΗ/ΝΗ₂Ас-Туг-8аг-Рго -61у -А1Ь-61у -ΟΗ/ΝΗ₂

Ас -Ό -Туг-8аг-Э -Рго -61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/NΗ₂Αс-Ту^-8а^-8а^-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/N¾ Αс-^-Ту^-8а^-8а^-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/N¾ 4ΗΡΡ-Ρ^о-4Ηуρ-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/NΗ₂Тίа-Ту^-Ρ^о-4Ηуρ-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/N¾ Тίа-^-Ту^-^-Ρ^о-^-4Ηуρ-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/N¾ Т£а-Туг-Рго -Рго-61у -Α^Ь-61у-ΟΗ/NΗ₂Т£а-^-Ту^-^-Ρ^о-^-Ρ^о-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/NΗ₂Тίа-Ту^-4Ηуρ-Ρ^о-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/N¾ Тίа-^-Ту^-^-4Ηуρ-^-Ρ^о-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/N¾ Т£а-Ту^-4Ηуρ-4Ηуρ-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/NΗ₂Тίа-^-Ту^-^-4Ηуρ-^-4Ηуρ-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/N¾ Тίа-Ту^-8а^-4Ηуρ-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/N¾ Т£а-^-Ту^-8а^-^-4Ηуρ-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/NΗ₂Тίа-Ту^-4Ηуρ-8а^-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/N¾ Тίа-^-Ту^-^-4Ηуρ-8а^-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/N¾ Тίа-Ту^-Ρ^о-8а^-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/N¾ Тίа-^-Ту^-^-Ρ^о-8а^-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/N¾ Тίа-Ту^-8а^-Ρ^о-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/N¾ Тίа-^-Ту^-8а^-^-Ρ^о-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/N¾ Тίа-Ту^-8а^-8а^-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/N¾ Тίа-^-Ту^-8а^-8а^-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/N¾ 4ΗΡΡ-^-Ρ^о-^-4Ηуρ-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/NΗ₂4ΗΡΡΑ-Ρ^о-4Ηуρ-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/NΗ₂4ΗΡΡΑ-^-Ρ^о-^-4Ηуρ-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/NΗ₂4ΗМΡΑ-Ρ^о-4Ηуρ-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/NΗ₂4ΗМΡΑ-^-Ρ^о-^-4Ηуρ-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/NΗ₂4ΗΡΑ-Ρ^о-4Ηуρ-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/NΗ₂4ΗΡΑ-^-Ρ^о-^-4Ηуρ-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/NΗ₂4ΗΒ6-Ρ^о-4Ηуρ-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/NΗ₂4ΗΒ6-^-Ρ^о-^-4Ηуρ-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/NΗ₂4ΗΡΡ-Ρ^о-Ρ^о-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/NΗ₂4ΗΡΡ-^-Ρ^о-^-Ρ^о-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/NΗ₂4ΗΡΡΑ-Ρ^о-Ρ^о-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/NΗ₂4ΗΡΡΑ-^-Ρ^о-^-Ρ^о-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/NΗ₂4ΗМΡΑ-Ρ^о-Ρ^о-61у-Α^Ь-61у-ΟΗ/NΗ₂

- 16 007792

4ΗΜΡΛ-Ό-ΡΓ0-Ό-ΡΓ0-61γ-Αίϋ-61γ-ΘΗ/ΝΗ₂4ΗΡΑ-ΡΓ0-ΡΓ0-61γ-Αίϋ-61γ-ΘΗ/ΝΗ₂4ΗΡΑ-Ό-ΡΓ0-Ό-ΡΓ0-61γ-Αίΐ>-61γ-ΘΗ/ΝΗ₂4ΗΒ6-ΡΓ0-ΡΓ0-61γ-Αίϋ-61γ-ΘΗ/ΝΗ₂4ΗΒ6-Ό-ΡΓ0-Ό-ΡΓ0-61γ-Αίϋ-61γ-ΘΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡ-4Ηγρ-4Ηγρ-Ο1γ-Αίϋ-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡ-Ό-4Ηγρ-Ό-4Ηγρ-61γ-Αίΐ>-61γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡΑ-4Ηγρ-4Ηγρ-61γ-Αίΐ>-61γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡΑ-Ό-4Ηγρ-Ό-4Ηγρ-61γ-Αίΐ>-61γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΜΡΑ-4Ηγρ-4Ηγρ-Ο1γ-Αίϋ-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΜΡΑ-Ό-4Ηγρ-Ό-4Ηγρ-Ο1γ-Αίϋ-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΑ-4Ηγρ-4Ηγρ-Ο1γ-Αίϋ-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΑ-Ό-4Ηγρ-Ό-4Ηγρ-Ο1γ-Αίϋ-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΒΟ-4Ηγρ-4Ηγρ-Ο1γ-Αίϋ-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΒ6-Ό-4Ηγρ-Ό-4Ηγρ-61γ-Αίΐ>-61γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡ-4Ηγρ-ΡΐΌ-Ο1γ-Αίϋ-Ο1γ-ΘΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡ-Ό-4Ηγρ-Ό-ΡΓ0-61γ-Αίΐ>-61γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡΑ-4Ηγρ-ΡΓθ-Ο1γ-Αίϋ-Ο1γ-ΘΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡΑ-Ό-4Ηγρ-Ό-ΡΓ0-61γ-Αίϋ-61γ-ΘΗ/ΝΗ₂4ΗΜΡΑ-4Ηγρ-ΡΓθ-Ο1γ-Αίϋ-Ο1γ-ΘΗ/ΝΗ₂4ΗΜΡΑ-Ό-4Ηγρ-Ό-ΡΓθ-Οίγ-Αίϋ-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΑ-4Ηγρ-ΡΓθ-Ο1γ-Αίϋ-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΑ-Ό-4Ηγρ-Ό-ΡΓθ-61γ-Αίϋ-61γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΒΟ-4Ηγρ-ΡΓθ-Ο1γ-Αίϋ-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΒ6-Ό-4Ηγρ-Ό-ΡΓθ-61γ-Αίϋ-61γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡ-δαΓ-ΡΓ0-61γ-Αίΐ>-61γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡ-δαΓ-Ό-ΡΓ0-61γ-Αίϋ-61γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡΑ-δατ-ΡΓ0-61γ-Αίΐ>-61γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡΑ-δαΓ-Ό-ΡΓ0-61γ-Αίΐ>-61γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΜΡΑ-δ;·ΐΓ-ΡΐΌ-61ν-Αίό-61ν-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΜΡΑ-δαΓ-Ό-ΡΓ0-61γ-Αίϋ-61γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΑ-δαΓ-ΡΓθ-Ο1γ-Αίό-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΑ-δαΓ-Ό-ΡΓ0-61γ-Αίϋ-61γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΒΟ-δαΓ-ΡΓθ-Ο1γ-Αίό-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΒΟ-δαΓ-Ό-ΡΓθ-Ο1γ-Αίϋ-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡ-ΡΓ0-δαΓ-61γ-Αίΐ>-61γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡ-Ό-ΡΓ0-δαΓ-61γ-Αίΐ>-61γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡΑ-ΡΓ0-δαΓ-61γ-Αίΐ>-61γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡΑ-Ό-ΡΓ0-δαΓ-61γ-Αίϋ-61γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΜΡΑ-ΡΓ0-δατ-61γ-Αίΐ>-61γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΜΡΑ-Ό-ΡΓ0-δαΓ-61γ-Αίϋ-61γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΑ-ΡΐΌ-δ;·ΐΓ-61ν-Αίό-61ν-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΑ-Ό-ΡΓ0-δαΓ-61γ-Αίϋ-61γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΒ6-ΡΐΌ-δ;·ΐΓ-61ν-Αίό-61ν-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΒ6-Ό-ΡΓ0-δαΓ-61γ-Αίϋ-61γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡ-δαΓ-4Ηγρ-Ο1γ-Αίό-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡ-δαΓ-Ό-4Ηγρ-Ο1γ-Αίϋ-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡΑ-δαΓ-4Ηγρ-Ο1γ-Αίό-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ_;4ΗΡΡΑ-δαΓ-Ό-4Ηγρ-Ο1γ-Αίϋ-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΜΡΑ-δαΓ-4Ηγρ-Ο1γ-Αίό-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ_;4ΗΜΡΑ-δαΓ-Ό-4Ηγρ-Ο1γ-Αίϋ-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΑ-δαΓ-4Ηγρ-Ο1γ-Αίό-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΑ-δαΓ-Ό-4Ηγρ-Ο1γ-Αίϋ-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΒΟ-δαΓ-4Ηγρ-Ο1γ-Αίό-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΒ6-δαΓ-Ό-4Ηγρ-61γ-Αίΐ>-61γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡ-4Ηγρ-δαΓ-Ο1γ-Αίό-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡ-Ό-4Ηγρ-δαΓ-Ο1γ-Αίϋ-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡΑ-4Ηγρ-δαΓ-Ο1γ-Αίό-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΡΑ-Ό-4Ηγρ-δαΓ-Ο1γ-Αίϋ-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΜΡΑ-4Ηγρ-δαΓ-Ο1γ-Αίό-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ_;4ΗΜΡΑ-Ό-4Ηγρ-δαΓ-Ο1γ-Αίϋ-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂4ΗΡΑ-4Ηγρ-δαΓ-Ο1γ-Αίό-Ο1γ-ΟΗ/ΝΗ₂

- 17 007792

4НРА-Э-4Нур-8аг-С1у-А1Ь-С1у-ОН/ИН₂4НВС-4Нур-8аг-С1у-А1Ь-С1у-ОН/ИН₂4НВС-Э-4Нур-8аг-С1у-А1Ь-С1у-ОН/ИН₂4НРР-8аг-8аг-61у-А1Ь-61у-ОН/ЯН₂4НРРА-8аг-8аг-С1у-А1Ь-С1у-ОН/ИН₂4НМРА-8аг-8аг-61у-А1Ь-61у-ОН/ЯН₂4НРА-8аг-§аг-61у-А1Ь-61у-ОН/ИН2 4НВС-8аг-8аг-С1у-А1Ь-С1у-ОН/НН2 Ас-Туг-Рго -4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ИН₂Ас-О-Туг-П-Рго-О-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЫН₂Ас-Туг-Рго -Рго -8аг-А1Ь -8аг-ОН/ЯН₂Ас-0 -Туг-Ό -Рго -Ό -Рго -8аг-А1Ь -8аг-ОН/ИН₂Ас-Туг-4Нур-Рго -8аг-А1Ь -8аг-ОН/ЯН₂Ас-О-Туг-П-4Нур-О-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂Ас-Туг-4Нур-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂Ас-О-Туг-П-4Нур-О-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂Ас-Туг-8аг-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЫН₂Ас-О-Туг-8аг-О-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂Ас-Туг-4Нур-8аг-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЫН₂Ас-О-Туг-О-4Нур-8аг-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂Ас-Туг-Рго-8аг-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ИН₂Ас-П-Туг-П-Рго-8аг-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ИН₂Ас-Туг-8аг-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ИН₂Ас-О-Туг-8аг-О-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂Ас-Туг-8аг-8аг-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂Ас-О-Туг-8аг-8аг-8аг-А1Ь-8аг-0Н/ИН₂Т£а-Туг-Рго-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂ТГа-Э-Туг-Э-Рго -О-4Нур-8аг-А1Ь -8аг-ОН/ИН₂Т£а-Туг-Рго - Рго -8аг-А1Ь -8аг-ОН/ЯН₂ТГа-Э-Туг-Э-Рго - О- Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂Т£а-Туг-4Нур-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂Т£а-Э-Туг-0-4Нур-0 -Рго -8аг-А1Ь -8аг-ОН/ИН₂Т£а-Туг-4Нур-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ИН₂Т£а-О-Туг-О-4Нур-О-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂Т£а-Туг-8аг-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ИН₂Т£а-О-Туг-8аг-О-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЫН₂Т£а-Туг-4Нур-8аг-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ИН₂Т£а-О-Туг-О-4Нур-8аг-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ИН₂Т£а-Туг-Рго-8аг-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ИН₂Т£а-О-Туг-О-Рго-8аг-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ИН₂Т£а-Туг-8аг-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂Т£а-О-Туг-8аг-П-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ИН₂Т£а-Туг-8аг-8аг-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂Т£а-Э-Туг-8аг-8аг-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ИН₂4Н РР-Рго-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/НН₂4НРР-О-Рго-О-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НРРА-Рго-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НРРА-О-Рго-О-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НМРА-Рго-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НМРА-Э-Рго -Ό -4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НРА-Рго-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НРА-О-Рго-О-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НВ6-Рго-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ИН₂4НВС-О-Рго-О-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ИН₂4НРР-Рго-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ИН₂4НРР-О-Рго-О-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ИН₂4НРРА-Рго-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ИН₂4НРРА-О-Рго-О-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ИН₂4НМРА-Рго-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НМРА-Э -Рго-О-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЫН₂4НРА-Рго - Рго -8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЫН₂4НРА-Э - Рго -Ό -Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ИН₂

- 18 007792

4НВС-Рго-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НВС-О-Рго-П-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/НН₂4НРР-4Нур-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НРР-О-4Нур-О-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ХН₂4НРРА-4Нур-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НРРА-О-4Нур-О-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/НН₂4НМРА-4Нур-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НМРА-О-4Нур-О-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/НН₂4НРА-4Нур-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НРА-О-4Нур-О-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ХН₂4НВС-4Нур-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЫН2 4НВС-О-4Нур-П-4Нур-§аг-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НРР-4Нур-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НРР-О-4Нур-О-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/НН₂4НРРА-4Нур-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЫН₂4НРРА-О-4Нур-О-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/НН₂4НМРА-4Нур-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/НН₂4НМРА-Э -4 Нур-Ό -Рго -8аг-А1Ь -8аг-ОН/ЯН₂4НРА-4Нур-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НРА-О-4Нур-О-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/НН₂4НВС-4Нур-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НВС-О-4Нур-О-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/НН₂4НРР-8аг-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/КН₂4НРР-§аг-П-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЫН₂4НРРА-§аг-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЫН₂4НРРА-8аг-О-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/НН₂4НМРА-8аг-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/КН₂4НМРА-8аг-П-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/НН₂4НРА-§аг-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/КН₂4НРА-8аг-П -Рго -8аг-А1Ь -8аг-ОН/ЯН₂4НВС-8аг-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЫН2 4НВС-8аг-О-Рго-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ХН2 4НРР-Рго-8аг-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ХН₂4НРР-Э -Рго-8аг-8аг-А1Ь -8аг-ОН/ЯН₂4НРРА-Рго-8аг-§аг-А1Ь-8аг-ОН/ЫН₂4НРРА-О-Рго-8аг-8аг-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НМРА-Рго -8аг-8аг-А1Ь -8аг-ОН/ХН₂4НМРА-Э -Рго-8аг-8аг-А1Ь-8аг-ОН/НН₂4НРА-Рго-8аг-8аг-А1Ь-8аг-ОН/НН₂4НРА-Э -Рго -8аг-8аг-А1Ь -8аг-ОН/ЯН₂4НВС-Рго-8аг-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЫН2 4НВС-П-Рго-8аг-§аг-А1Ь-8аг-ОН/ЫН2 4НРР-8аг-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/МН2 4НРР-8аг-О-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/МН2 4НРРА-8аг-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/МН2 4НРРА-8аг-О-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ХН₂4НМРА-8аг-4Нур-§аг-А1Ь-8аг-ОН/НН₂4НМРА-8аг-П-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НРА-8аг-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НРА-8аг-О-4Нур-§аг-А1Ь-8аг-ОН/НН₂4НВС-8аг-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ЫН2 4НВС-8аг-П-4Нур-8аг-А1Ь-8аг-ОН/МН2 4НРР-4Нур-8аг-8аг-А1Ь-8аг-ОН/МН2 4НРР-О-4Нур-8аг-§аг-А1Ь-8аг-ОН/НН2 4НРРА-4Нур-8аг-8аг-А1Ь-8аг-ОН/МН2 4НРРА-О-4Нур-8аг-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ХН₂4НМРА-4Нур-8аг-§аг-А1Ь-8аг-ОН/НН₂4НМРА-О-4Нур-8аг-8аг-А1Ь-8аг-ОН/ХН₂4НРА-4Нур-8аг-8аг-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НРА-О-4Нур-8аг-§аг-А1Ь-8аг-ОН/НН₂4НВС-4Нур-8аг-8аг-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НВС-О-4Нур-8аг-§аг-А1Ь-8аг-ОН/НН2

- 19 007792

4НРР-Заг-Заг-Заг-А1Ь-Заг-ОН/ИН₂4НРРА-Заг-Заг-Заг-А1Ь-Заг-ОН/КН₂4НМРА-Заг-Заг-Заг-А1Ь-Заг-ОН/ИН₂4НРА-Заг-Заг-Заг-А1Ь-Заг-ОН/ИН₂4НВ6-Заг-Заг-Заг-А1Ь-Заг-ОН/ИН₂Ас-Туг-Рго -4Нур-Заг-А1Ь-61у -ОН/ИН₂Ас-П-Туг-П-Рго-Э-4Нур-Заг-А1Ь-61у-ОН/КН₂Ас-Туг-Рго -Рго -Заг-А1Ь-61у -ОН/ИН₂Ас-0 -Туг-Ό - Рго -Ό - Рго -Заг-А1Ь-61у -ОН/ИН₂Ас-Туг-4Нур-Рго -Заг-А1Ь-61у -ОН/ИН₂Ас-0 -Туг-Ό -4Нур-Э -Рго -Заг-А1Ь-61у -ОН/ИН₂Ас-Туг-4Нур-4Нур-Заг-А1Ь-61у-ОН/КН₂Ас-О-Туг-П-4Нур-Э-4Нур-Заг-А1Ь-61у-ОН/КН₂Ас-Туг-Заг-4Нур-Заг-А1Ь-61у-ОН/ИН₂Ас-О-Туг-Заг-О-4Нур-Заг-А1Ь-61у-ОН/ИН₂Ас-Туг-4Нур-Заг-Заг-А1Ь-61у-ОН/ИН₂Ас-Э-Туг-П-4Нур-Заг-Заг-А1Ь-61у-ОН/КН₂Ас-Туг-Рго-Заг-Заг-А1Ь-61у-ОН/ЙН₂Ас-П-Туг-П-Рго-Заг-Заг-А1Ь-61у-ОН/ЫН₂Ас-Туг-Заг-Рго-Заг-А1Ь-61у-ОН/ИН₂Ас-О-Туг-Заг-Э-Рго-Заг-А1Ь-61у-ОН/МН₂Ас-Туг-Заг-Заг-Заг-А1Ь-61у-ОН/КН₂Ас-О-Туг-Заг-Заг-Заг-А1Ь-61у-ОН/КН₂4НРР-Рго-4Нур-Заг-А1Ь-61у-ОН/МН₂Т£а-Туг-Рго-4Нур-Заг-А1Ь-61у-ОН/ИН₂ТГа-О-Туг-О-Рго-П-4Нур-Заг-А1Ь-61у-ОН/ИН₂ТГа-Туг-Рго - Рго -Заг-А1Ь-61у-ОН/КН₂ТГа-Э-Туг-Э-Рго -Ό-Рго-Заг- А1Ь-61у-ОН/КН₂ТГа-Туг-4Нур-Рго -Заг-А1Ь-61у -ОН/ИН₂ТГа-О-Туг-О-4Нур-О-Рго-Заг-А1Ь-61у-ОН/ИН₂Т£а-Туг-4Нур-4Нур-Заг-А1Ь-61у-ОН/ИН2 ТГа-О-Туг-О-4Нур-Э-4Нур-Заг-А1Ь-61у-ОН/КН₂Т£а-Туг-Заг-4Нур-Заг-А1Ь-61у-ОН/ИН2 Т£а-О-Туг-Заг-Э-4Нур-Заг-А1Ь-61у-ОН/НН2 Т£а-Туг-4Нур-Заг-Заг-А1Ь-61у-ОН/ЫН2 ТГа-Э-Туг-П-4Нур-Заг-Заг-А1Ь-61у-ОН/КН₂ТГа-Туг-Рго-Заг-Заг-А1Ь-61у-ОН/ЙН₂ТГа-Э-Туг-Э-Рго -Заг-Заг-А1Ь-61у -ОН/ИН₂ТГа-Туг-Заг-Рго-Заг-А1Ь-61у-ОН/ИН₂ТГа-Э -Туг-Заг-Э-Рго-Заг-А1Ь -61у-ОН/ИН₂ТГа-Туг-Заг-Заг-Заг-А1Ь-61у-ОН/КН₂ТГа-О-Туг-Заг-Заг-Заг-А1Ь-61у-ОН/КН₂4НРР-О-Рго-О-4Нур-Заг-А1Ь-61у-ОН/НН₂4НРРА-Рго-4Нур-Заг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРРА-О-Рго-О-4Нур-Заг-А1Ь-61у-ОН/НН₂4НМРА-Рго-4Нур-Заг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НМРА-О-Рго-О-4Нур-Заг-А1Ь-6Гу-ОН/НН₂4НРА-Рго-4Нур-Заг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРА-О-Рго-О-4Нур-Заг-А1Ь-61у-ОН/НН₂4НВ6-Рго-4Нур-Заг-А1Ь-61у-ОН/ИН₂4НВ6-О-Рго-О-4Нур-Заг-А1Ь-61у-ОН/ИН₂4НРР-Рго-Рго-Заг-А1Ь-61у-ОН/ИН₂4НРР-О-Рго-О-Рго-Заг-А1Ь-61у-ОН/ИН₂4НРРА-Рго-Рго-Заг-А1Ь-61у-ОН/ИН₂4НРРА-О-Рго-О-Рго-Заг-А1Ь-61у-ОН/ИН₂4НМРА-Рго-Рго-Заг-А1Ь-61у-ОН/ЫН₂4НМРА-О-Рго-О-Рго-Заг-А1Ь-61у-ОН/ИН₂4НРА-Рго-Рго-Заг-А1Ь-61у-ОН/ЫН₂4НРА-О-Рго-О-Рго-Заг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НВ6-Рго-Рго-Заг-А1Ь-61у-ОН/ИН₂4НВ6-О-Рго-П-Рго-Заг-А1Ь-61у-ОН/НН₂4НРР-4Нур-4Нур-Заг-А1Ь-61у-ОН/ИН₂

- 20 007792

4НРР-П-4Нур-П-4Нур-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРРА-4Нур-4Нур-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРРА-П-4Нур-П-4Нур-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НМРА-4Нур-4Нур-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НМРА-П-4Нур-П-4Нур-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРА-4Нур-4Нур-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРА-П-4Нур-П-4Нур-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НВ6-4Нур-4Нур-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НВ6-П-4Нур-П-4Нур-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРР-4Нур-Рго-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРР-П-4Нур-П-Рго-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРРА-4Нур-Рго-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРРА-П-4Нур-П-Рго-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НМРА-4Нур-Рго-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НМРА-П-4Нур-П-Рго-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРА-4Нур-Рго-8аг-А1Ь-61у-ОН^Н₂4НРА-П-4Нур-П-Рго-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НВ6-4Нур-Рго-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НВ6-П-4Нур-П-Рго-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРР-8аг-Рго-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРР-8аг-Э-Рго-8аг-А1Ь-61у-ОН^Н₂4НРРА-8аг-Рго-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРРА-8аг-П-Рго-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НМРА-8аг-Рго-8аг-А1Ь-61у-ОН^Н₂4НМРА-8аг-П-Рго-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРА-8аг-Рго-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРА-8аг-П-Рго-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НВ6-8аг-Рго-8аг-А1Ь-61у-ОН^Н2 4НВ6-8аг-П-Рго-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРР-Рго-8аг-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРР-П-Рго-8аг-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРРА-Рго-8аг-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРРА-П-Рго-8аг-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НМРА-Рго-8аг-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НМРА-П-Рго-8аг-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРА-Рго-8аг-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРА-П-Рго-8аг-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НВ6-Рго-8аг-8аг-А1Ь-61у-ОН^Н₂4НВ6-П-Рго-8аг-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРР-8аг-4Нур-8аг-А1Ь-61у-ОН/]\1Н₂4НРР-8аг-П-4Нур-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРРА-8аг-4Нур-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРРА-8аг-П-4Нур-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НМРА-8аг-4Нур-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НМРА-8аг-П-4Нур-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРА-8аг-4Нур-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРА-8аг-П-4Нур-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НВ6-8аг-4Нур-8аг-А1Ь-61у-ОН^Н₂4НВ6-8аг-П-4Нур-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРР-4Нур-8аг-8аг-А1Ь-61у-ОН/]\1Н₂4НРР-П-4Нур-8аг-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРРА-4Нур-8аг-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРРА-П-4Нур-8аг-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НМРА-4Нур-8аг-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НМРА-П-4Нур-8аг-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРА-4Нур-8аг-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРА-П-4Нур-8аг-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НВ6-4Нур-8аг-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН2 4НВ6-П-4Нур-8аг-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НРР-8аг-8аг-8аг-А1Ь-61у-ОН/]\1Н₂4НРРА-8аг-8аг-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН₂4НМРА-8аг-8аг-8аг-А1Ь-61у-ОН/МН2

- 21 007792

4НРА-8АК-8аг-8аг-А1Ь-С1у-ОН^Н₂4НВС-8аг-8аг-8аг-А1Ь-С1у-ОН/МН₂Ас-Ту^-Р^о-4Нур-С1у-А^Ь-8а^-ОН/NН₂Ас-Ό -Туг-Ό -Рго-Э-4Нур-С1у -А1Ь -Заг-ОН/Ν^

Ас-Ту^-Р^о-Р^о-С1у-А^Ь-8а^-ОН/NН₂Ас-Ό -Туг-Ό -Рго -Ό - Рго-С1у -А1Ь-8аг-ОН^Н₂Ас-Туг-4Нур-Рго-С1у -А|Ь-8аг-ОН^Н₂Ас-Ό -Туг-Ό -4Нур-0 - Рго-С1у -А1Ь-8аг-ОН^Н₂Ас-Ту^-4Нур-4Нур-С1у-А^Ь-8а^-ОН/NН₂Ас-О-ТугЮ-4Нур-О-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂Ас-Туг-8аг-4Нур-С1у-А|Ь-8аг-ОН^Н₂Ас-О-Туг-8аг-О-4Нур-С1у-А|Ь-8аг-ОН^Н₂Ас-Туг-4Нур-8аг-С1у-А1Ь-8аг-ОН^Н₂Ас-^-Ту^-^-4Нур-8а^-С1у-А^Ь-8а^-ОН/NН₂Ас-Туг-Рго-8аг-С1у-А|Ь-8аг-ОН^Н₂Ас-О-Туг-О-Рго-8аг-С1у-А|Ь-8аг-ОН^Н₂Ас-Туг-8аг-Рго-С1у-А|Ь-8аг-ОН^Н₂Ас -Ό -Туг-8аг-0 - Рго-С 1у-А|Ь-8аг-ОН^Н₂Ас-Туг-8аг-8аг-С1у-А|Ь-8аг-ОН^Н₂Ас-О-Туг-8аг-8аг-С1у-А|Ь-8аг-ОН^Н₂4НРР-Рго-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂ТГа-Туг-Рго-4Нур-С1у-А|Ь-8аг-ОН^Н₂Т£а-О-ТугЮ-Рго-О-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂ТГа-Туг-Рго - Рго-С1у -А1Ь-8аг-ОН^Н₂Т£а-О-Туг-О-Рго-О-Рго-С1у-А1Ь-8аг-ОН^Н₂ТГа-Ту^-4Нур-Р^о-С1у-А^Ь-8а^-ОН/NН₂Т£а-О-Туг-О-4НурЮ-Рго-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂Т£а-Туг-4Нур-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂Т£а-О-Туг-О-4НурЮ-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂

Т£а-Туг-8аг-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂Т£а-О-Туг-8агЮ-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂

Т£а-Туг-4Нур-8аг-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂Т£а-О-ТугЮ-4Нур-8аг-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂

ТГа-Туг-Рго-8аг-С1у-А|Ь-8аг-ОН^Н₂ТГа-О-Туг-О-Рго -8аг-С1у -А|Ь-8аг-ОН^Н₂

ТГа-Туг-8аг-Рго-С1у-А|Ь-8аг-ОН^Н₂Тίа-^-Ту^-8а^-^-Р^о-С1у-А^Ь-8а^-ОН/NН₂

ТГа-Туг-8аг-8аг-С1у-А|Ь-8аг-ОН^Н₂ТГа-О-Туг-8аг-8аг-С1у-А|Ь-8аг-ОН^Н₂4НРРЮ-Рго-О-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НРРА-Рго-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НРРАЮ-Рго-О-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НМРА-Рго-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НМРАЮ-Рго-О-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НРА-Рго-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН^Н₂4НРАЮ-Рго-О-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НВС-Рго-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НВС-О-Рго-О-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НРР-Рго-Рго-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НРРЮ-Рго-О-Рго-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НРРА-Рго-Рго-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НРРАЮ-Рго-О-Рго-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НМРА-Рго-Рго-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НМРАЮ-Рго-О-Рго-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НРА-Рго-Рго-С1у-А1Ь-8аг-ОН^Н₂4НРАЮ-Рго-О-Рго-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НВС-Рго-Рго-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НВС-О-Рго-О-Рго-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НРР-4Нур-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НРРЮ-4Нур-О-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НРРА-4Нур-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НРРАЮ-4Нур-О-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂

- 22 007792

4НМРА-4Нур-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ХН₂4НМРА-О-4Нур-О-4Нур-61у-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НРА-4Нур-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ХН₂4НРА-О-4Нур-Э-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ХН₂4НВ6-4Нур-4Нур-61у-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НВС-О-4Нур-О-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ЫН₂4НРР-4Нур-Рго-61у-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НРР-О-4Нур-О-Рго-61у-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НРРА-4Нур-Рго-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ЫН₂4НРРА-О-4Нур-П-Рго-61у-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НМРА-4Нур-Рго-61у-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НМРА-О-4Нур-П-Рго-61у-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НРА-4Нур-Рго-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ЫН₂4НРА-О-4Нур-О-Рго-61у-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НВ6-4Нур-Рго-61у-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НВС-О-4Нур-Э-Рго-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ХН₂4НРР-8аг-Рго-61у-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НРР-8аг-О-Рго-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ЫН₂4НРРА-8аг-Рго-61у-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НРРА-8аг-О-Рго-61у-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НМРА-8аг-Рго-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ЫН₂4НМРА-8аг-П-Рго-61у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НРА-8аг-Рго-61у-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НРА-8аг-П-Рго-61у-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НВС-8аг-Рго-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ЫН₂4НВС-8аг-Э-Рго-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ХН₂4НРР-Рго-8аг-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ХН₂4НРР-О-Рго-8аг-61у-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НРРА-Рго-8аг-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ЫН₂4НРРА-О-Рго-8аг-61у-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НМРА-Рго-8аг-61у-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НМРА-О-Рго-8аг-61у-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НРА-Рго-8аг-61у-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НРА-О-Рго-8аг-61у-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НВ6-Рго-8аг-61у-А1Ь-8аг-ОН/ЫН2 4НВС-Э-Рго-8аг-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ХН₂4НРР-8аг-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ХН₂4НРР-8аг-П-4Нур-61у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НРРА-8аг-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ХН₂4НРРА-8аг-Э-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ХН₂4НМРА-8аг-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ХН₂4НМРА-8аг-П-4Нур-61у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НРА-8аг-4Нур-61у-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НРА-8аг-П-4Нур-61у-А1Ь-8аг-ОН/МН₂4НВ6-8аг-4Нур-61у-А1Ь-8аг-ОН/ЫН2 4НВС-8аг-Э-4Нур-С1у-А1Ь-8аг-ОН/НН2 4НРР-4Нур-8аг-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ХН₂4НРР-Э-4Нур-8аг-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ХН₂4НРРА-4Нур-8аг-61у-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂4НРРА-Э-4Нур-8аг-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ХН₂4НМРА-4Нур-8аг-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ХН₂4НМРА-Э-4Нур-8аг-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ХН₂4НРА-4Нур-8аг-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ХН₂4НРА-Э-4Нур-8аг-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ХН₂4НВ6-4Нур-8аг-61у-А1Ь-8аг-ОН/НН2 4НВС-Э-4Нур-8аг-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ХН2 4НРР-8аг-8аг-61у-А1Ь-8аг-ОН/1\1Н2 4НРРА-8аг-8аг-61у-А1Ь-8аг-ОН/ЯН2 4НМРА-8аг-8аг-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ХН₂4НРА-8аг-8аг-С1у-А1Ь-8аг-ОН/ХН₂4НВ6-8аг-8аг-61у-А1Ь-8аг-ОН/ЯН₂

- 23 007792 и их зеркальные отображения, их ретроаналоги, и их производные, которые выбираются из группы, в состав которой входят фармацевтически приемлемые соли; сложные эфиры алкила, арила и аралкила; моно- и двузамещенные амиды, где заместитель выбирается из группы, в состав которой входит алкил, арил и аралкил; гидразиды; и спирты.

В соответствии с другим предпочтительным вариантом настоящего изобретения формула I представляет циклический пептид, при этом А-В выбираются из группы, в состав которой входит Баг-Баг, БагНур. Нур-Баг, Рго-Баг, Баг-Рго, Рго-Нур, Рго-Рго, Нур-Рго и Нур Нур, где Рго и Нур независимо друг от друга могут иметь форму Ь или форму Ό, а Нур предпочтительно является 4-гидроксипролином. Еще лучше, чтобы А-В был незамещенным Е-Рго-Ь-4Нур, Е-4Нур-Ь-Рго, О-Рго-Ь-4Нур или И-4Нур-И-Рго.

X является единичным аминокислотным остатком, предпочтительно Ь-Туг или Ό-Туг, произвольно замещаемым галогеновой группой, фенильной группой, гидроксигруппой, ΝΉ₂, и С(1-6)алкилом, произвольно замещаемым галогеном в его ароматическом кольце, если Υ является пептидной последовательностью из 3 или 4 аминокислотных остатков, независимо имеющих форму Ь или форму Ό, С-концевой участок которой предпочтительно включает Акр или С1ц, но еще лучше, если Υ является пептидной последовательностью, выбираемой из группы, в состав которой входит

61у-Ь-А1а-Ь-Акп,

С1у -И -А1а-Ь-Акп,

61у-Ь-А1а-61у-Ь-Акп, 61у-Ь-А1а-61у-Э-Акп,

О1у-Ь-А1а-Ь-О1п,

О1у-Ь-А1а-О1у-Ь-О1п,

О1у-Ь-А1а-О1у-В-О1п,

С1у-О-А1а-Э-Акп,

С1у -И -А1а-С1у -И-Акп,

61у-0-А1а-61у-Ь-Акп,

С1у-О-А1а-Э-С1п,

61у-И-А1а-61у-И-61п,

61у-И-А1а-Ь-61п, 61у-И-А1а-61у-И-61п,

61у-Ь-А1а-Ь-Акр,

61у-0-А1а-Ь-Акр, 61у-Ь-А1а-61у-Ь-Акр, 61у-Ь-А1а-61у-0-Акр, 61у-Ь-А1а-Ь-61ц,

О1у-Ь-А1а-О1у-Ь-О1и,

61у-Ь-А1а-61у-И-61ц,

С1у-О-А1а-Э-Акр,

С1у-О-А1а-С1у-Э-Акр, 61у-0-А1а-61у-Ь-Акр, С1у-Э-А1а-О-С1ц,

С1у-Э-А1а-С1у-О-С1ц, 61у-0-А1а-Ь-61ц,

С1у-О-А1а-С1у-Э-С1ц.

Или X является пептидной последовательностью, предпочтительно выбираемой из группы, в состав которой входит

61у-Ь-А1а-Ь-Акр,

61у-Ь-А1а-61у-Ь-Акр,

61у-Ь-А1а-Ь-61ц,

О1у-Ь-А1а-О1у-Ь-О1и,

61у-И-А1а-0-Акр, 61у-И-А1а-61у-0-Акр, 61у-И-А1а-И-61и, 61у-И-А1а-61у-И-61и, если Υ является единичным аминокислотным остатком, предпочтительно Ь-Туг или Ь-Туг, произвольно замещаемым галогеном, типа С1, в его ароматическом кольце.

Формула I может представлять циклическую пептидную последовательность, включающую все Ь-формы, все И-формы или последовательность смешанных Ь- и Ό-форм аминокислотных остатков. На фиг. 1 показана общая схема семи различных циклических структур в пределах объема настоящего изобретения.

Примерами циклических структур по формуле I являются цикло(Ь-Туг-Ь-Рго-Ь-4Нур-61у-Ь-А1а-Ь-Акп) (химическое соединение 4), цикло(Ь-Туг-Ь-Рго-Ь-4Нур-61у-Ь-А1а-Ь-Акп),

- 24 007792 цикло(Ь-Туг-Ь-Рго-Ь-4Нур-С1у-Ь-А1а-Ь-А8р), цикло(Ь-Туг-Ь-Рго-Ь-4Нур-С1у-Ь-А1а-С1у-Ь-А8п) (химическое соединение 3), цикло(Ь-Туг-Ь-Рго-Ь-4Нур-С1у-Ь-А1а-С1у-Ь-А8р), циклоо(О-Туг-Ь-Рго-Ь-4Нур-61у-Ь-А1а-61у-Ь-А8р), цикло (Ό -Тут-Ό -Рго - О-4Нур-С1у -О-А1а-0-А§п), цикло (Ό -Туг-Ό -Рго - О-4Нур-С1у -О-А1а-0-А§р), цикло(О-Туг-Ь-Рго-Ь-4Нур-61у-П-А1а-О-А8р), цикло(О-Туг-П-Рго-О-4Нур-61у-О-А1а-61у-Э-А8п), цикло(О-Туг-Ь-Рго-Ь-4Нур-61у-П-А1а-61у-Ь-А8п), цикло(О-Туг-П-Рго-О-4Нур-61у-О-А1а-61у-Э-А8р), цикло(Ь-Туг-Ь-Рго-Ь-4Нур-С1у-Ь-А1а-Ь-С1п), цикло(Ъ-Туг-Ь-Рго-Ь-4Нур-С1у-О-А1а-Ь-С1п), цикло(Ь-Туг-Ь-Рго-Ь-4Нур-С1у-Ь-А1а-Ь-С1и), цикло(Ь-Туг-Ь-Рго-Ь-4Нур-С1у-Ь-А1а-С1у-Ь-С1п), цикло(Ь-Туг-Ь-Рго-Ь-4Нур-С1у-Ь-А1а-С1у-Ь-С1и), цикло(О-Туг-Ь-Рго-Ь-4Нур-С1у-Ь-А1а-С1у-Ь-С1и), цикло (Ό -Туг-Ό -Рго-О-4Нур-С1у - О-А1а-О-С1п), цикло (Ό -Туг-Ό -Рго-О-4Нур-С1у - О-А1а-О-С1и), цикло(О-Туг-Ь-Рго-Ь-4Нур-С1у-О-А1а-0-С1и), цикло(0-Туг-0-Рго-0-4Нур-С1у-0-А1а-С1у-0-С1п), цикло(О-Туг-Ь-Рго-Ь-4Нур-С1у-О-А1а-С1у-Ь-С1п), цикло(0-Туг-0-Рго-0-4Нур-С1у-0-А1а-С1у-0-С1и), цикло(-Туг-А1а-8ег-А1а-С1у-А5п-) (химическое соединение 44) цикло(-Туг-С1у-А8п-Туг-С1у-А8п-) (химическое соединение 45) цикло(-Туг-С1у-А8п-Туг-А1а-С1у-А8п-) (химическое соединение 46) цикло(-Туг-Уа1-8ег-С1у-А1а-С1у-А5п-) (химическое соединение 47) и их зеркальные отображения, их ретроаналоги, и их производные типа фармацевтически приемлемых солей и амидов.

Другим предпочтительным вариантом формулы I по настоящему изобретению является циклическое соединение, где группы X и Υ связаны через аминокарбонильную связь, алкоксисвязь, эфирную связь, восстановленную амидную связь или дисульфидную связь. Ниже перечислены примеры химических соединений, где X и Υ связаны через алкоксисвязь, имеющую линкер Ь по формуле

О' где как К¹ так и К представляют водород или низший алкил и/или низший арил, предпочтительно метил и фенил цикло(О-С(К',К)-Тут-Рто-4Нур-С1у-А1а-С1у) цикло(О-С(К',К)-Тут-4-Нур-Рго-С1у-А1а-С1у) цикло(О-С(К',К)-Туг-4-Нур-4-Нур-С1у-А1а-С1у) цикло(О-С(К',К)-Тут-Рго-Рто-С1у-А1а-С1у) цикло(О-С(К',К)-Тут-8ат-8ат-С1у-А1а-С1у) цикло(О-С(К', К'')-Туг-8ат-Рго-С1у-А1а-С1у) цикло(О-С(К',К)-Тут-4-Нур-8ат-С1у-А1а-С1у) цикло(О-СН₂-Тут-Рто-8аг-С1у-А1а-С1у) цикло (О-С(метил, фенил)-Тут-8ат-4-Нур-С1у-А1а-С1у) включая их зеркальные отображения, их ретроаналоги, и их производные типа фармацевтически приемлемых солей и амидов.

Примерами химических соединений, где X и Υ связаны через аминокарбонильную связь, имеющую линкер Ь по формуле являются цикло(НЛС(О)-Туг-Рго-4Нур-С1у-АГа-С1у) цикло(НПС(О)-Туг-4-Нур-Рго-С1у-А1а-С1у) цикло(ННС(О)-Туг-4-Нур-4-Нур-С1у-А1а-С1у) цикло(НПС(О)-Туг-Рго-Рго-С1у-А1а-С1у) цикло(ННС(О)-Туг-8ат-8аг-С1у-А1а-С1у) цикло(ННС(О)-Туг-8ат-Рго-С1у-А1а-С1у)

- 25 007792 цикло(НХС(О)-Тут-4-Нур-8аг-С1у-А1а-С1у) цикло(НЫС(О)-Туг-Рго-8аг-С1у-А1а-С1у) цикло(НЫС(О)-Туг-8аг-4-Нур-С1у-А1а-С1у) и их зеркальные отображения, их ретроаналоги, и их производные типа фармацевтически приемлемых солей и амидов.

Примерами химических соединений, где X и Υ связаны через эфирную связь, имеющую линкер Ь по формуле 'К В

где как К.¹ так и К представляют водород или большее число низкий алкил и/или большее число низкий арил, предпочтительно метил и фенил, предпочтительно К' Ф К, являются цикло(О-С(К',К)С(О)-Тут-Рто-4Нур-С1у-А1а-С1у) цикло(О-С(К',К)С(О)-Туг-4-Нур-Рто-С1у-А1а-С1у) цикло(О-С(К',К)С(О)-Тут-4-Нур-4-Нур-С1у-А1а-С1у) цикло(О-С(К',К)С(О)-Туг-Рто-Рго-С1у-А1а-С1у) цикло(О-С(К' ,К'' )С(О)-Тут-8ат-8ат-С1у-А1а-С1у) цикло(О-С(К',К)С(О)-Тут-8аг-Рто-С1у-А1а-С1у) цикло(О-С(К',К)С(О)-Тут-4-Нур-8ат-С1у-А1а-С1у) цикло(О-С(К' ,К'' )С(О)-Тут-Рго-8ат-С1у-А1а-С1у) цикло(О-С(фенил, метил)С(О)-Тут-8ат-4-Нур-С1у-А1а-С1у) и их зеркальные отображения, их ретроаналоги, и их производные типа фармацевтически приемлемых солей и амидов.

Когда эфирная связь является частью основы циклических соединений по настоящему изобретению, Ь может быть получено из оксикарбоновой кислоты, типа гидрокси-С(3-6)алкилкарбоновой кислоты. В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения Ь получено из αгидроксикарбоновой кислоты, общая формула которой имеет следующий вид: НО-С(К1)(К2)-СООН, где К1 и К2 независимо друг от друга являются Н, С(1-6)-алкилом, С(2-6)-алкенилом, арилом, арил-С(1-4)алкилом, гетероарилом или гетероарил-С(1-4)-алкилом; или К1 и К2 вместе с атомом углерода, с которым они связаны, образуют циклопентильное, циклогексильное, или циклогептильное кольцо; где алкильная или алкенильная группа может замещаться заместителями числом от одного до трех, выбираемыми из группы, в состав которой входит аминогруппа, цианогруппа, галогеновая группа, изоцианогруппа, изотиоцианогруппа, тиоцианогруппа, сульфамильная группа, С(1-4)-алкилтиогруппа, моно- или ди-С(1-4)-алкиламиногруппа, гидроксигруппа, С(1-4)-алкоксигруппа, арильная группа, гетероарильная группа, арилоксигруппа, карбоксигруппа, С(1-4)-алкоксикарбонильная группа, С(1-4)алкилкарбокнилоксигруппа, аминокарбонильная группа, моно- или ди-С(1-4)-алкиламинокарбонильная группа, моно- или ди-С(1-4)-алкиламиногруппа, моно- или ди-С(1-4)-алкиламино-С(1-4)-алкильная группа, С(1-4)-алкилкарбониаминогруппа, сульфоно-, и сульфиногруппа; и где арильная или гетероарильная группа могут замещаться заместителями числом от одного до трех, выбираемыми из группы, в состав которой входит С(1-4)-алкил, С(2-4)-алкенил, нитрогруппа, аминогруппа, цианогруппа, галогеновая группы, изоцианогруппа, изотиоцианогруппа, тиоцианогруппа, сульфамильная группа, С(1-4)алкилтиогруппа, моно- или ди-С(1-4)-алкиламиногруппа, гидроксигруппа, С(1-4)-алкоксигруппа, арилоксигруппа, карбоксигруппа, С(1-4)-алкоксикарбонильных, С(1-4)-алкилкарбокнилоксигруппа, аминокарбонил, моно- или ди-С(1-4)-алкиламинокарбонильная группа, моно- или ди-С(1-4)-алкил-амино, моно- или ди-С(1-4)-алкил-амино-С(1-4)-алкил, С(1-4)-алкилкарбониламино, сульфоно-, и сульфиногруппа. В другом варианте по настоящему изобретению Ь получают из гидроксиарил-С(3-6)-алкилкарбоновой кислоты, или Ь получают из гидрокси-С(2-6)-алкенилкарбоновой кислоты, или Ь получают из гидрокси-С(3-6)алкилкарбоновой кислоты. Желательно, чтобы К1 и К2 представляли различные группы.

В циклических соединениях по настоящему изобретению, где циклизация образуется в виде эфирной связи и количество аминокислотных остатков равно 5, группа А-В выбирается из группы, в состав которой входит 8ат-Нур, Нур-8ат, Рго-Нур, Рго-Рго, Нур-Рго, и Нур Нур, где Рго и Нур независимо друг от друга могут иметь форму Ь или форму Ό, а Нур предпочтительно является 4-гидроксипролином. Еще лучше, чтобы А-В было незамещенным соединением Е-Рго-Ь-4Нур, Е-4Нур-Ь-Рго, О-Рго-Э-4Нур или Ό4Нур-О-Рто.

Примерами химических соединений по настоящему изобретению являются цикло(О-(СН2)₅С(О)-Туг-Рто-4-Нур-С1у-А1а-С1у) и цикло(О-(СН2)₅С(О)-Тут-4-Нур-Рто-С1у-А1а-С1у), где Ь - гидрокси-С(3-6)алкилкарбоновая кислота, и цикло(О-(4-гидроксиметилбензоил)С(О)-Тут-Рто-4-Нур-С1у-А1а-С1у) и

- 26 007792

11и1<ло((>(4-1и/цхп<симети.10ензоил )С(())-'1 уг-4-Ι Ινρ-ΡΓ0-('.ϊ1ν-Α1α-('.ϊ1ν). где Ь - арил-С-гидрокси-(1-4) алкилкарбоновая кислота, и их зеркальные отображения, их ретроаналоги, и их производные типа фармацевтически приемлемых солей и амидов.

Циклические соединения по настоящему изобретению, где циклизация формируется серином:

О η₂ν-οηο— сн₂

I----------------------------------------------------------------------1

Н-5ег(0)-Туг-Рго-4Нур-С1у-А1а-С1у

I---------------------------------------------------------------------------------₍

Ас-5ег(О)-Туг-Рго-4Нур-С1у-А!а-С1у и Треонином:

О

Η,Ν-СНС—

СНОСН₃

I I

Н-Тйг(О)-Туг-Рго-4Нур-С!у-А)а-С1у

I !

Ас-ТЬг(О)-Туг-Рго-4Нур-С1у-А1а-С1у

Примерами циклических соединений по настоящему изобретению, имеющих дисульфидную связь, являются

Н-Су5-С1у-Нур-Рго-Туг-Су5-МН₂/ОН Химическое соединение 21 из примера 21

I-------------------------------------------------------1

Н-Суз-Туг-Рго-4Нур-С1у-Суз-ОН/МН₂, сГ. Сотроипй 20 οΐ Ех. 20

I-----------------------------------------------------)

Н-Суз-Туг-Рго-4Нур-Су5-ОН/ЫН₂

О

НЫ-СНС-ОН ^Ζ СН₂ Химическое соединение 20 из примера 20 —С-СН—Ν-^-η

II о

I!

К-С(О)-Суз-Туг-Рго-4Нур-61у-А1а-С1у-Су5-ОН/1МН₂

II

Я-С(О)-Суз-Туг-Рго-4Нур-61у-А1а-Суз-ОН/НН₂

Я-С(0)-Суз-Туг-Рго-4Нур-61у-Суз-0Н/Ь1Н₂

I1

Я-С(О)-Суз-Туг-Рго-4Нур-Суз-ОН/МН₂ включая химические соединения, имеющие комбинации из Ь и Ό аминокислот, аминокислоты, замещенной 8аг и другими Ν-замещенными природными аминокислотами, и их зеркальные отображения, их ретроаналоги, и их производные типа фармацевтически приемлемых солей и амидов.

- 27 007792

Примерами химических соединений, где X и Υ связаны через восстановленную амидную связь, имеющую линкер Б по формуле

являются цикло(\/СИ₂ХН)-Туг-Рго-4Нур-С1у-А1а-С1у) цикло(\/СИ₂ХН)-Туг-4-Нур-Рго-С1у-А1а-С1у) цикло(\/СИ₂ХН)-Туг-4-Иур-4-Иур-С1у-А1а-С1у) цикло(\/СН₂ХИ)-Туг-Рго-Рго-С1у-Л1а-С1у) 11и1<ло(\|/С11Л11)-Ί\τ-Υιι·-Υιι·-(.ι1ν-Λ1η-(.ι1ν) цикло(ψСН₂NН)-Ту^-8а^-Р^ο-^1у-А1а-^1у) цикло^СНМНрТуг^-Нур-Заг-Иу-АЦ-Иу) цикло^СНМНрТуг-Рго-Заг-Иу-АЦ-Иу) цикло^СНМНрТуг-ЗаМ-Нур-Иу-АЦ-Иу) и их зеркальные отображения, их ретроаналоги, и их производные, типа фармацевтически приемлемых солей и амидов.

ОН ι

являются цикло(ψСΉ(ОН)NИ)-Ту^-Р^ο-4Нур-С1у-Λ1а-С1у) цикло(ψСН(ОН)NН)-Ту^-4-Нур-Р^ο-^1у-А1а-^1у) цикло(ψСΉ(ОН)NИ)-Ту^-4-Нур-4-Нур-С1у-Λ1а-С1у) цикло(ψСИ(ОИ)NИ)-Ту^-Р^ο-Р^ο-С1у-Λ1а-С1у)

11и1кзо(\|/С11(О11)Х11++-1--831--831--(.1+-/(+-(.1+) цикло(ψСН(ОН)NН)-Ту^-8а^-Р^ο-^1у-А1а-^1у) цикло(ψСН(ОН)NН)-Ту^-4-Нур-8а^-^1у-А1а-^1у) цикло(ψСН(ОН)NН)-Ту^-Р^ο-8а^-^1у-А1а-^1у) цикло(ψСН(ОН)NН)-Ту^-8а^-4-Нур-^1у-А1а-^1у) и их зеркальные отображения, их ретроаналоги, и их производные типа фармацевтически приемлемых солей и амидов.

В частности, изобретение относится к пептидам и производным пептидов по формуле I

[М 4_ сн-^с—т	[Λ?	О II	и	Я
СН—С---N	—сн—с—	•Ν—СН-	-с-

< Н	н	Г ΗΊ
-сны-с \ о	—СН-Ν— 1	С-СН-Ν· ¹¹ 1 о 1
В!	Я\| ч	1 Кь

(I) представляющей пептидную последовательность, где аминокислотные остатки могут иметь форму Ώ и/или форму Б с Ν-концевым участком Ν* и С-концевым участком С* и обладать цикличностью благодаря ковалентной связи между Ν* и С*, как показано пунктирной линией, или между Щ и С*, как показано пунктирной линией И; и где X является Ν-концевым участком типа фотозонда, способного связываться с аминоконцевым участком Ν*, или ацильной группой, полученной из С(2-22)алкилкарбоновой кислоты, типа уксусной кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты, а также из жирных кислот типа бегеновой кислоты, произвольно замещаемой одним или большим числом заместителей, выбираемых из группы, в состав которой входит гидроксигруппа, галогеновая группа, С(1-6)алкильная группа, нитрогруппа и цианогруппа; или X является водородом;

К₇ является ОН, ХН₂, ΝΉΝΚ₂ или ОК₈, если связь между Ν* и С* отсутствует, или К₇ отсутствует, если связь между Ν* и С* существует;

К₈ является Н или прямой или разветвленной С(1-6)алкильной группой, арильной или аралкильной группой.

- 28 007792

К_а является боковой аминокислотной цепью Нур или Рго;

К_Ь является боковой аминокислотной цепью Нур или Рго;

К_с является боковой аминокислотной цепью С1у, 8аг, ароматической боковой аминокислотной цепью, произвольно замещаемой одной группой или большим числом гидроксигрупп, галогеновых групп или нижних алкокси групп в ароматическом кольце или К_с;

является боковой аминокислотной цепью А1а, С1у, С1и, Акр, ЭаЬ. Пара, Ьук, Аки, С1п, От, или Сук;

К_е является боковой аминокислотной цепью А1а;

Кг является боковой аминокислотной цепью А1а, 8аг или С1у;

К_д представляет любую боковую аминокислотную цепь кроме боковой цепи Ь-4Нур или части по Формуле Ζ или Ζа;

К, является боковой аминокислотной цепью А1а, или К|, является частью формулы Ζ или Ζа, предпочтительно Рго;

К₁ является боковой аминокислотной цепью С1у, или К₁ представляет ароматическую аминокислоту, произвольно замещаемую одной галогенной группой или большим числом галогеновых групп в ароматическом кольце, предпочтительно Туг, Р1е, Тгр или №1;

К является Акп, С1и, Акр, С1и, Сук, или Туг;

и каждый из индексов _), к, ί, т, п, р и ς независимо друг от друга принимает значение 0 или 1;

и к ретроформам всех форм Ό, или ретроформам всех форм Ό пептидной последовательности по формуле I, и к их солям и амидам.

В соответствии с предпочтительными вариантами формулы I X выбирается из группы, в состав которой входят фотозонды типа А8АЬ, произвольно йодированные на позиции 5, типа 2-гидрокси-4-азидо5-йодобензоила, и АВ, и ацильная группа типа Ас. Желательно, чтобы на месте К₇ было ΝΉ₂, а на месте К_а - боковая аминокислотная цепь Рго, на месте К_Ь - боковая аминокислотная цепь Нур, на месте К_с - боковая аминокислотная цепь С1у или Туг, на месте Ка - боковая аминокислотная цепь С1у, Акр, С1и, Пара, или ЭаЬ, на месте К_е - А1а, на месте К_г - аминокислотная боковая цепь С1у или А1а, на месте К, - боковая аминокислотная цепь Акп, С1у, Э-4Нур или Ь-Ю-Рго, если формула I представляет линейный пептид, а если формула I представляет пептид циклизированный между Ν* и С*, то К₈ является боковой аминокислотной цепью Ь-/П-4Нур или Ь-Ю-Рго. К, является боковой аминокислотной цепью А1а, если и отсутствует, или К, является Рго или Нур, если и присутствует. К₁ является Туг, Р1е, Тгр, Nа1 произвольно замещаемыми в ароматическом кольце одной группой или большим числом гидроксигрупп или галогеновых групп, предпочтительно Р или С1. Желательно, чтобы на месте К, была боковая аминокислотная цепь Акр или С1и, а на месте К_д - Н, бензил, трет-бутил или СН₃.

Желательно, чтобы _) и к принимали значение 0, если и присутствует, и значение 1, если и отсутствует, и формула I представляет циклический пептид, желательно, чтобы т принимало значение 0, если и отсутствует, р - значение 1, если и присутствует, и с.| - значение 0, если и присутствует. Желательно, чтобы нециклические или линейные пептиды по формуле I имели ретроформу всех Ό форм. Если формула I представляет циклический пептид, то желательно, чтобы пептид состоял из аминокислотных остатков числом от 3 до 9, еще лучше от 3 до 7.

Специалистам ясно, что химические соединения, подобные пептиду, имеющие формулу, сопоставимую с формулой I, но с одним или большим числом пептидных связей, измененных на ковалентную связь, выбираемую из группы, в состав которой входит, например, дисульфидная связь, эфирная связь, восстановленная амидная связь, алкоксисвязь, оксикарбонильная связь и ацилоксиалкоксисвязь, были бы полезны для лечения тех же самых состояний и болезней, как и химические соединения по настоящему изобретению.

Предпочтительный вариант по настоящему изобретению относится к химическим соединениям, соответствующим общей формуле (II):

Х-(6')а - А- 6' - (Рх)2-(¥')ь-К7 (II), задающей пептидную последовательность, в которой аминокислотные остатки могут иметь форму Ь и/или форму Ό, и где

X является Н или Ас; а если все аминокислотные остатки имеют форму Ь, то X является Ас;

С' является остатком глицина или аналогом глицина типа 8аг, С' является предпочтительно глицином;

А является аланином;

Рх является аминокислотным остатком по формуле Ζ или Ζа типа Нур или Рго, предпочтительно пролином;

Υ' является тирозином или фенилаланином, произвольно замещаемым в фенильном кольце галогеновой группой или гидроксигруппой; желательно, чтобы Υ' был тирозином;

а и Ь - независимо друг от друга принимают значение 0 или 1;

К₇ является ОН, ΝΠ₂, ΝΉΝΕ^ Акη-NН₂, или 61η-ΝΉ₂;

- 29 007792 и к их ретроформам, представленным формулой 11а: Х-(¥')_Ь-(Рх)₂-6'-А-(6')_а-К₇, где все аминокислотные остатки предпочтительно имеют форму Ό, и где все символы имеют то же самое значение, что и в Формуле II;

и к пептидным соединениям по формуле II, где по крайней мере один остаток Рх является Ό-аминокислотой, а остальное - Ь-аминокислотами;

и к циклическим последовательностям по формуле II, где X является Н, К₇ является Азп или 61п с ковалентной связью с Υ ', Ь равно 1, и а равно 1;

к₂ и к их солям.

Желательно, чтобы циклическими пептидными соединениями по формуле I были соединения, имеющие одну из общих формул III или IV:

|1НХ

Ц- η

ΗΝ /С-4-Ν—СН—Ο-+-ΝΙ ,сн \ I /р / ^г п(НгС) ^н\ с/ХсН-й—с—СН-Ν/ II \ /

Кв о к₅*

III где

X является Н или частью Ν-концевого участка типа фотозонда, способного образовывать ковалентную связь с Ν-концевой аминогруппой или ацильной группой, полученной из С(2-22)алкилкарбоновой кислоты, типа уксусной кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты, а также из жирных кислот типа бегеновой кислоты, произвольно замещаемой одним или большим числом заместителей, выбираемых из группы, в состав которой входит гидроксигруппа, галогеновая группа, С(1-6)алкильная группа, нитрогруппа и цианогруппа;

Кц является Н или СН₃, предпочтительно Н;

К₂ и К₃ отличаются друг от друга или идентичны, и являются любой возможной боковой аминокислотной цепью, предпочтительно Н или СН3;

.....возможная связь;

К₅ и К4 - любая возможная боковая аминокислотная цепь, или, если существует возможная связь, то К₅ и К₄ вместе с присоединенными атомами С и Ν представляют из себя пролиновое кольцо, которое произвольно замещается на ОН, предпочтительно в позиции 4, или К₅ и К4 вместе с присоединенными атомами С и Ν представляют часть формулы Ζ или Ζа, приведенной выше, предпочтительно Рго или ^Ηγρ;

К₆ является боковой ароматической аминокислотной цепью, предпочтительно бензилом, произвольно замещаемой в фенильном кольце одним или большим числом заместителей, выбираемых из группы, в состав которой входит галогеновая группа, нитрогруппа и гидроксигруппа, предпочтительно К₆ является Туг;

р равно 0 или 1;

п равно 1, 2, 3 или 4; предпочтительно п равно 1;

и их соли.

Типичными химическими соединениями по формуле III являются

Н-С1у-Рара-61у-Нур-Рго-Туг-|

Н-61у-Р-Рара-61у-Р-Нур-Р-Рго-Р-Туд

Н-С1у

Н-61у-Р-РаЬ-(51у-Р-Нур-Р-Рго-Р-Туг|

и их соли.

- 30 007792 к₈о

«5

ΗΝ

IV где К₈ соответствует тому, о чем говорилось выше, и предпочтительно является Н;

Кб является Н или СН₃, предпочтительно Н;

К4 и К₅ отличаются друг от друга или идентичны и являются любой возможной боковой аминокислотной цепью, предпочтительно С1у или А1а;

-----возможная связь;

К₂ и К₃ - любая возможная боковая аминокислотная цепь, или, если существует возможная связь, то К₂ и К₃ вместе с присоединенными атомами С и N представляют пролиновое кольцо, которое произвольно замещается на ОН, предпочтительно в позиции 4, или К₂ и К₃ представляют часть формулы Ζ или 7а;

Κι является боковой ароматической аминокислотной цепью, предпочтительно боковой цепью Туг; р равно 0 или 1;

η равно 1, 2, 3 или 4; предпочтительно η равно 1;

и их соли.

Типичными химическими соединениями по формуле IV являются

Р Туг-Рго-Нур-61у-С1и-С1у-ГЩ₂

Туг-Рго-Нур-61у-А5р-61у-МН₂ |- Туг-Рго-Нур-С1у-А1а-А5р-61у-МН₂

I_______________________________________________________________________________________I г-Туг-Рго-Нур-С1у-А1а-С1и-С1у-Л1Н₂

I________________________________________________________________________ι |~ Р-Туг-Р-Рго-Р-Нур-61у-Р-<^1и-С1у-МН₂

Г Р-Туг-Р-Рго-Р-Нур-61у-Р-^р-61у-ЦН₂

Г Р-Туг-Р-Рго-Р-Нур-61у-Р-А1а-Р-А5р-61у-МН₂

Г Р-Туг-Р-Рго-Р-Нур-С1у-Р-А1а-Р-С1и-61у^Н₂

Кроме того, неожиданно было обнаружено, что замещение остатка аспарагина или глутамина на последовательность Нур-Рго в ААР 10 приводит к образованию нового антиаритмического пептида (химическое соединение 21 из примера 21). Таким образом, предпочтительный вариант настоящего изобретения относится к пептидному соединению, в котором аминокислотные остатки могут быть формы Ώ и/или формы Г, и быть представлены общей формулой V

V Яг-АагАГАаг-Аг-Вг

I I

I 4 где К, является возможной амидной связью между Ν-концевым и С-концевым участками пептида, Н или Ас;

Аа1 является пептидной последовательностью, состоящей предпочтительно из 0-4 аминокислотных остатков, если Аа1, является пептидной последовательностью из 1-4 аминокислотных остатков, то Аа1, предпочтительно выбирается из группы, в состав которой входит А1а, С1у-А1а, С1у-А8п-Туг, и С1у-АзпТуг-А1а;

А1 является аминокислотным остатком, выбираемым из группы, в состав которой входит С1у, бета Алании и 8аг;

Аа₂ является аминокислотным остатком, выбираемым из группы, в состав которой входит Азп, С1п, С1у, Туг, или химические соединения типа оксикислоты, аминосульфокислоты, фосфорнокислой группы или углеводородной цепи, соединяющей С и Аг посредством 4 ковалентных связей;

- 31 007792

Аг является ароматическим аминокислотным остатком, типа Туг, Ττρ, ΡΗβ, Ηίδ, или Να1, произвольно замещаемым одним или большим числом галогенов, типа Е, С1, Βγ, I, ОН, ΝΟ₂, ΝΗ₂, СООН, СΟNΗ;

К₂ является ОН, ΝΗ₂ или отсутствует;

и к ретроаналогам, ретроаналогам всех Ό форм (обратные ретроаналоги) и к их солям.

Типичными химическими соединениями по формуле V являются: химическое соединение 39 Η-Ο1ν-Α1;·ι-Ο1ν-Α5η-ΤνΓ-ΝΗ₂химическое соединение 44 цикло (-Туг-Л1а^ег-Л1а-61у-Л8п-) химическое соединение 45 цикло (-Τντ-Α1α сеρа-Л1а-61у-Л8η-) химическое соединение 46 цикло(-Τу^-61у-Л8п-Τу^-Л1а-61у- Αδη-) химическое соединение 47 цикло(-Τν^-Vа1-δе^-С1у-Α1а-С1у-Αδη-) химическое соединение 40 Α^Ο1ν-Αδη-ΤνΓ-ΝΗ₂химическое соединение 41 Η-Ο1ν-Αδη-ΤνΓ-ΝΗ₂химическое соединение 42 Α^Α1α-Ο1ν-Αδη-ΤνΓ-ΝΗ_; химическое соединение 43 Η-Α1α-Ο1ν-Αδη-ΤνΓ-ΝΗ_; и их соли.

Фото/термолабильные производные пептида

Аффинное мечение - часто используемая методика изучения взаимодействия биологически активных молекул. Для исследования используется фото- или термолабильный аналог химического соединения.

Фотолабильный аналог исследуемого химического соединения, которое устойчиво в темноте, при освещении преобразуется в химически активное промежуточное химическое соединение, которое может участвовать в реакциях вставки. Это, путем создания ковалентной связи, стабилизирует взаимодействие, основанное на биологическом сродстве. Ароматические азиды и устойчивые диазохимические соединения, используемые в качестве фотозондов, при фотолизе производят химически очень активные и неспецифичные промежуточные химические соединения - нитрены и карбены, способные соответственно к участию в реакциях вставки. Таким образом, фотоаффинное мечение с применением в качестве фотозондов арилазид и устойчивых диазохимических соединений может выполняться на любом связующем сайте, который содержит углерод-водородные связи, и не требует наличия на связующем сайте специфической химически активной функциональной группы. Поэтому специфичность мечения зависит исключительно от специфического связывания лиганда с рецептором, за которым затем следует неспецифичная реакция, в результате которой образуется ковалентная связь, которая гарантирует мечение связующего сайта. Фотоаффинные зонды особенно полезны для мечения сайтов рецепторов гормона, где химически активные функциональные группы не могут присутствовать, но которые, безусловно, содержат углеродводородные связи. Особенно полезны для фотоактивной функциональности азидо, диазирино, α-диазокетоны, тиа- и селенодиазолы, бензофенон, нитрофенил. Процесс мечения с использованием арилазид включает фотолиз при λ„ = 300 - 320 нм в течение приблизительно 0,5 -2 ч при комнатной температуре водного раствора, содержащего фотолабильный аналог пептида и рецептор.

Термолабильное соединение содержит химически активную группу, которая может образовывать ковалентную связь в тепловой управляемой реакции со специфичностью к амино- или меркаптогруппам. В качестве термозондов могут использоваться алифатические галогены особенно йод и бром, активные сложные эфиры типа Ν-гидроксисукцинимид, кислые хлориды, пиридилдисульфиды, изоцианаты, изотиоцианаты, карбодиимиды и мелеймидо.

Метки для применения ίη νίΐΓΟ наиболее часто выбираются из радиоактивных изотопов типа йода125 и -131, С-14 и трития, или из флюоресценных зондов, или биотинов, или гаптенов. Для того, чтобы поддерживать сродство рецепторов необходимо исследовать влияние метки на связывающую активность лиганда. Йод-125 часто используется в качестве радиоактивной метки для применения ίη νίίτο, ввиду того, что период его полураспада составляет 60 дней и ввиду того, что он испускает низкоэнергетические фотоны. Большой период полураспада обеспечивает возможность приготовления и хранения меченых светочувствительных аналогов и получаемых меченых белковых продуктов в течение длительного времени перед использованием или анализированием. Йод (1-125) можно легко включить в пептидные лиганды, если, например, в пептидной последовательности присутствует тирозин или гистидин. Для поддержания биологической активности необходимо исследовать влияние мечения пептида на биологическую активность лиганда. Деин (ΌΙκίη) и др. в работе ΧΫΟ96/21674 показали, что производное ААР10, где фенильное кольцо из остатков Τντ содержит заместитель из йода-125, обладает биологической активностью. Однако использование упомянутого ААР10 в качестве аффинного зонда не возможно вследствие обратимого связывания с возможным лигандом или рецептором. Фотоаффинное мечение с использованием арилазид приводит обычно к тому, что 50-60% пептидных лиганд необратимо присоединяется к целевому протеину (рецептору). Таким образом, целью настоящего изобретения также является получение антиаритмического пептида, соответственно, модифицированного фото- или термо-зондом, а радиоактивная метка, может использоваться в пробах для идентификации возможных лигандов или рецепторов для антиаритмического пептида. Упомянутая цель достигается путем использования химического соединения по формуле I, II или 9, полученного с помощью одного из вышеупомянутых фотозондов,

- 32 007792 предпочтительно 4-азидосалицилоила (А8АЬ) и АВ (4-азидобензоил). Желательно, чтобы упомянутое полученное химическое соединение также замещалось радиоактивной меткой типа йода-125.

Типичными химическими соединениями, модифицированными фотозондом, и с радиоактивной меткой по формуле I, или 9 являются:

химическое соединение 31 А8АЬ-Рго-Нур-О1у-А1а-О1у-ХН₂, химическое соединение 32 А8АЬ (3-1)-Рго-Нур-О1у-А1а-О1у-КН₂, химическое соединение 32а А8АЬ (6-1)-Рго-Нур-О1у-А1а-О1у-КН₂, химическое соединение 33 АВ-Туг-Рго-Нур-О1у-А1а-О1у-ХН₂, химическое соединение 34 АВ-Туг (3,5-ди-1)-Рго-Нур-О1у-А1а-О1у-КН₂и их соли (см. примеры синтеза 31-34).

Кроме того, настоящее изобретение относится к пептидным соединениям, выбираемым из группы соединений, соответствующих общей формуле:

2: Н-ОАО-(Ра)₂-ХН₂, где Ра - любой аминокислотный остаток или часть формулы Ζ или 2а; по крайней мере один из Ра является аминокислотой Ό; предпочтительно, чтобы Ра являлся Нур, Р, О или А;

3: Η-ΟΑΟ-(Ρχ)₂-Υ-ΝΗ₂, где Рх является частью формулы Ζ или Ζа, где один Рх является частью формулы II, 11а, а другой Рх является Р или Нур;

4: Α^Υ'-(Ρχ)₂-ΟΑΟ-ΟΗ, где Υ' является Υ или Р, а Рх является Р или Нур;

5: Суз(Аст)-ААР10*-Су8(Аст) или Суз(Аст)-реТроААР10*-Су8(Аст), где Аст является ацетамидометиловым радикалом, а ААР 10* является последовательностью ААР 10 или ее усеченной последовательностью;

6: Χ-Ό-Υ-(Ό-Ρχ)₂-Ο-Ό-Α-Ο-ΝΗ₂ или его ретроформа, Χ-Ο-Ό-Α-Ο-(Ό-Ρχ)₂-Ό-Υ-ΝΗ₂ или Χ-Ο-Ό-Α-Ο(Ό-Ρχ)₂-Ό-Υ-Ό-(Αδη)-ΝΗ₂, где X является Н или Ас; Рх является частью формулы Ζ или Ζа, предпочтительно Нур или Р; а (Азп) является необязательным, при этом обе формулы произвольно имеют один или большее число изотопов С или Ν;

7: Η-(Ρχ)_η-Υ(Ν^)Ο-ΑΟ-(Ρχ)^-ΝΗ₂, где Рх является Р, или Нур, η равно 1 или 2, а т равно 0 или 1, предпочтительно т = 0, если η = 2, и т = 1, если η = 1;

8: Η-Ο'-Α-Ο'-(Ρχ)₂-Υ-ΝΗ₂, где О' является 8аг или О1у, и по крайней мере один О' является 8аг, а Рх является Р или Нур;

9: Χ-(Υ)_ρ-(Ρχ)₂-ΟΑΟ-ΝΗ₂, где X является А8АЬ или АВ, р равно 0 или 1, и фенильное кольцо Υ имеет произвольно один или большее число галогеновых заместителей, предпочтительно I, а Рх является Р или Нур;

10: цикло(-ОАО-(Рх)₂^-№^-), где Рх является Р или Нур;

11: цикло(^-(Рх)₂-ОА-(О)_д-№^-), где ς равно 0 или 1, фенильное кольцо Υ имеет произвольно один или большее число галогеновых заместителей, предпочтительно I, а Рх является Р или Нур;

12: Χ-Ζά-Ο(Ν^)Υ-ΝΗ₂, где Ζά - последовательность из 0, 1 или 2 аминокислотных остатков, выбираемых из П или А, а X является Н или Ас;

и их солям.

К химическим соединениям по настоящему изобретению относятся соединения, имеющие общую формулу VI

К1: Н, Ас, НАА, ТНАА (тиогидроксиуксусная кислота), ТГа, ароил, ацетил;

К2:Н;

КЗ: боковая цепь О, А, Ν, К, С;

К4: О, ΝΟ₂, галоген (Р, С1, Вг, I) ΝΗ₂ или Н;

К5: (4 гидроксифенил, или 4-нитрофенил, или 4-фторфенил, или 4-хлорофенил, или 4-бромофенил, или 4-йодофенил, или 4-аминофенил, или 4-алкоксифенил, или Н);

К6: ОН, ΝΟ₂, галоген (Р, С1, Вг, I) ΝΗ₂ или Н;

К7: ОН, ΝΟ₂, галоген (р, С1, Вг, I) ΝΗ₂ или Н;

з: 0 или 1;

ΐ: 0 или 1 и их соли.

К химическим соединениям по настоящему изобретению относятся соединения, имеющие общую формулу VII, которым отдается предпочтение при использовании по способу по настоящему изобретению (VII)

где

К1 является Н или ацетилом (Ас);

К2 является боковой цепью одной из аминокислот С, Υ, Ό-Υ, Р и Ό-Ρ;

К3 является О или Н;

К4 является любой аминокислотной боковой цепью;

К5 является О или Н;

К6 является С(1-4)алкильной группой типа СН₂, (СН₂)₂, (СН₂)₃ и (СН₂)₄;

К7 является О или Н;

К8 является О или Н;

К9 является боковой цепью одной из аминокислот С, Υ, Ό-Υ, Р и Ό-Ρ;

К10 является ОН или ΝΉ₂ и

8, Т, и, V и Ζ - целые числа, принимающие следующие значения:

8: 0, 1 или 2;

Т: 0, 1 или 2;

И: 0 или 1;

V: 0 или 1;

Ζ: 0 или 1;

и их соли.

В частности к химическим соединениям по настоящему изобретению относятся соединения, имеющие формулу VIII

К1-Х1-Х2-Х3-К2, (VIII) где

Х1 равно 0 или является А1а, С1у, р-А1а, Туг, Ό-Тут, Акр, НАА;

Х2 равно 0 или является А1а-С1у-Т4с-Рго; А1а-8аг-Нур-Рго; А1а-6-членный цикл-; А1а-Акп; О-Акп-ЭА1а; Ό-Акп;

γ АЬи; С1у, А1а; Э-А1а; ; β- А1а; РатЬ; Акп; или НАА;

Х3 является Туг; Ό-Тут; С1у, РатЬ, или РЬе; и

К1 является Н или Ас, при условии, что Х1 и Х2 - не оба равны 0;

и их соли.

В соответствии с одним из вариантов настоящего изобретения формулы VII или VIII представляют следующие специфические химические соединения (таблица 1) и их соли:

Таблица 1. Химические соединения по формулам VII и VIII.

С1у-А1а-(6-членный цикл)-Туг,

С1у-А1а-Акп-Туг,

П-Тут-О-Аки-О-А1а-С1у,

П-Тут-О-Аки-С1у,

С1у^АЬи-Тут,

С1у^АЬи-О-Тут,

С1у-С1у-Туг,

С1у-А1а-Туг,

П-Тут-П-А1а-С1у,

С1у-О-Акп-Туг

С1у-вА1а-Туг, вА1а-вА1а-Туг,

С1у^АЬи-Тут, вА1а^АЬи-Тут, вА1а^АЬи-О-Тут,

С1у-вА1а-РЬе,

С1у-РатЬ-Туг,

С1у-РатЬ-О-Тут,

П-Туг-РатЬ-С1у,

РА1а-РатЬ-Туг,

- 34 007792

РА1а-РатЬ-И-Туг,

С1у-Акп-РЬе,

С1у-А1а-С1у-РатЬ,

Акп-Туг,

Ас-С1у-Туг,

Ас-А1а-Туг,

АС-НАА-Υ,

НАА-ΝΥ,

НАА-СУ

АС-НАА-СУ (восстановленныйС1у)-С1у-Туг(Н2Н-СН₂-СН₂-ХН-СН₂-С(О)-Туг),

Химическое соединение С1у-А1а-(6-членный цикл)-Туг имеет следующую формулу:

Желательно, чтобы химические соединения по настоящему изобретению использовались в форме фармацевтически приемлемой соли, сложного алкилового эфира, амида, алкиламида, диалкиламида или гидразида, образованного функцией С-концевого участка карбоновый кислоты химического соединения с нормальной цепью или свободной функцией карбоновой кислоты (если имеется) циклического химические соединения. Амиды и нижние алкиламиды соединений с нормальной цепью относятся к тем соединениям по настоящему изобретению, которым отдается предпочтение. Соли включают фармацевтически приемлемые соли типа кислых солей и основных солей. Примерами кислых солей являются соли хлоргидрата, поваренные соли, соли кальция, калийные соли и т.д. Примерами основных солей являются соли, где катион выбирается из группы, в состав которой входят щелочные металлы типа натрия и калия, щелочно-земельные металлы типа кальция, и ионы аммония ^(К³)^⁴), где К³ и К⁴ независимо друг от друга являются произвольно замещаемым С_1-6-алкилом, произвольно замещаемым С_2-6-алкенилом, произвольно замещаемым арилом или произвольно замещаемым гетероарилом. Другими примерами фармацевтически приемлемых солей являются, например, соли, описанные в Фармацевтических Науках Ремингтона 17-е изд. Редактор Алфонсо Р. Дженнаро, Истон, США, 1985 г. (Кетшдоп'к РЬагтасеийса1 8аепсек 17. Еб. А1Гопко К. Сеппаго (Еб.), Магк РиЬНкЫпд Сотрапу, Еак1оп, РА, И.8.А., 1985) и в более поздних издания, и в Энциклопедии Фармацевтической Технологии.

Определения

На протяжении всего описания и формулы изобретения для обозначения природных аминокислот используется трехбуквенный код, а также общепринятые трехбуквенные коды для других «-аминокислот, например саркозин (8аг), α-амино-изобутановая кислота (А1Ь), нафтилаланин (Иа1), включая 1-нафтилаланин (ГЫа1) и 2-нафтилаланин (2№1), фенилглицин РЬд, 2,4-диаминобутановая кислота (ИаЬ), 2,3-диаминопропановая кислота (Иара), и гидроксипролин (Нур). Там, где нет никаких указаний, Нур является 4-гидроксипролином. Природные или основные аминокислоты являются аминокислотами белков. Ароматические аминокислоты - РЬе, Туг, Тгр, Ша1, 2Nа1 и Н1к. Там, где форма не указана (Ь или И), следует понимать, что рассматриваемая аминокислота имеет природную форму Ь, см. Фундаментальная и прикладная химия (Риге & Арр1. СЬет.), т. 56 (5) стр. 595-624 (1984 г.). Там, где нет указаний, следует понимать, что аминокислота С-концевого участка химического соединения по настоящему изобретению существует в виде свободной карбоновой кислоты, на что может также указывать -ОН. Аминокислота С-концевого участка химического соединения по настоящему изобретению может иметь функцию концевого участка -ОН/ИН₂, что означает, что есть две предпочтительные формы химического соединения: свободная карбоновая кислота и амидированное производное. Соединения гексапептида по настоящему изобретению, включающего последовательность А1а-С1у-Нур и имеющего ИН₂-группу на Сконцевом участке, не содержат РЬе или Туг С-концевого участка или их производные с замещением галогена в фенильном кольце.

Под функциональными аналогами антиаритмических пептидов понимается любая химическая структура или любое химическое соединение, которое имеет структурную конформацию и/или свойства связывания, которые являются достаточно сходными со свойствами эндогенного ААР для обеспечения одного или большего количества полезных антиаритмических или антитромбических свойств эндогенных ААР.

Термин гетероарил является общим для 5- или 6-членных ароматических моноциклических гетероциклических групп, включающих 1-4 гетероатома, которые выбираются из азота, кислорода и серы, типа пирролила, фурила, пиразолила, имадазолила, оксазолила, изохазолила, тиазолила, изотиазолила,

- 35 007792 оксадиазолила, тиадиазолила, триазолила, пиридила и ароматических бициклических гетероциклических групп, включающих 1-6 гетероатомов, которые выбираются из азота, кислорода и серы, типа хинолинила.

Термин ретроаналог означает пептид, последовательность которого обратна последовательности названного пептида.

Термин галоген относится к Р, С1, Вг и I, при этом предпочтение отдается Р и I.

Термин алкил относится к одновалентным группам, полученным из алканов путем удаления атома водорода от любого атома углерода: С_пН_2п+1. Группы, полученные путем удаления атома водорода от конечного атома углерода неразветвелнных алканов, образуют подкласс групп нормального алкила (ηалкил): Н[СН₂]_П-. Группы КСН_2-, К₂СН-(К не равно Н) и К₃С-(К не равно Н) являются первичными, вторичными и третичными алкильными группами соответственно. С(1-22)алкил относится к любой алкильной группе с числом атомов углерода от 1 до 22 и включает С(1-6)алкил, типа метила, этила, пропила, изо-пропила, бутила, пентила и гексила, и все их возможные изомеры. Под термином нижний алкил следует понимать С(1-6)алкил, предпочтительно С(1-4) алкил, еще лучше - метил и этил.

Термин алкенил относится к углеводородной группе, содержащей одну или большее число двойных углерод-углеродных связей, с неразветвленной, или разветвленной, или циклической цепью. С(2-22) алкенил относится к любой алкенильной группе с числом атомов углерода от 1 до 22 и включает С(2-6) алкенил, винил, аллил, 1-бутенил и т.д.

Термин аралкил относится к арил-С(1-22)алкилу, а под термином арил следует понимать фенил или нафтил.

НРР означает гидроксифенилпропионил;

4НРР означает 3- (4 гидроксифенил)пропионил;

2НРР означает 3- (2 гидроксифенил)пропионил;

НАА означает гидроксиуксусную кислоту;

4НРРА означает 4-гидроксифеноксиуксусную кислоту;

2НРРА означает 2-гидроксифеноксиуксусную кислоту;

4НМРА означает 4-(гидроксиметил)феноксиуксусную кислоту;

4НРА означает 4-гидроксифенилуксусную кислоту;

3НРА означает 3-гидроксифенилуксусную кислоту;

2НРА означает 2-гидроксифенилуксусную кислоту;

4НВС означает Ы-(4-гидроксибензоил)аминоуксусную кислоту;

3НВС означает Ы-(3-гидроксибензоил)аминоуксусную кислот;

2НВС означает Ы-(2-гидроксибензоил)аминоуксусную кислоту;

4НРС означает Ν- (4 гидроксифенил)аминоуксусную кислоту;

Ас означает радикальный ацетил;

Рс или РС означает радикал Ь-пипеколиновой кислоты;

ТГа означает радикал трифторацетил;

Т4с означает радикал Г-тиазолидин-4-карбоновой кислоты;

АЗАЬ означает радикал 4-азидосалицилоила;

АВ означает радикал 4-азидобензоила;

НОВ! означает 1-гидроксибензотриазол;

НОА1 означает 1-гидрокси-7-азабензотриазол;

Аст означает радикал ацетамидометила;

Рй(РРН₃)₄ означает тетракис(трифенилфосфии)палладий(0);

ΌΝΓ означает динитрофенил;

РатН означает 4-амино-6-метилгептановую кислоту;

РатЬ означает 4-аступкуилбензойную кислоту;

ОВР означает 2-аминоэтил-6-дибензопропионовую кислоту;

6-членный цикл используется для 3-амино-1-карбоксиметилвалеролактама;

уАЬи означает гамма-аминомасляную кислоту.

Под выражением аминокислотный остаток следует понимать природную, а также неприродную единичную аминокислоту, которая здесь обозначается с помощью общепризнанного трехбуквенного кода, например аминокислота саркозин (Заг), альфа-Амино-изо-бутановая кислота (А1Ь), нафтилаланин (№1). включая 1-нафтилаланин (1Νι1) и 2-нафтилаланин (2Νι1), фенилглицин РНд, 2,4-диаминобутановая кислота (ЭаЬ), 2,3-диаминопропановая кислота (Эара) и гидроксипролин (Нур), и бета-А1а для бетааланина. При этом там, где нет никаких указаний Нур или 4Нур является 4-гидроксипролином. Природные или эфирные аминокислоты являются аминокислотными составляющими белков и могут обозначаться в виде общепризнанного трехбуквенного кода. РНе, Туг, Тгр, 1Νι1, 2Νι1 и Н18 являются ароматическими аминокислотами. Если не определена форма (Ь или Ό), то следует понимать, что рассматриваемая аминокислота имеет природную форму Ь (см. Фундаментальная и прикладная химия (Риге & Арр1. СНет.), т. 56 (5) стр. 595-624 (1984 г.). Если нет никаких указаний, то следует понимать, что аминокислота С-концевого участка химического соединения по настоящему изобретению существует как свободная

- 36 007792 карбоновая кислота и может также обозначаться в виде -ОН. Можно показать, что аминокислота С-концевого участка химического соединения по настоящему изобретению выполняет функцию концевого участка -ОН/NН₂, что означает, что есть две предпочтительные формы химического соединения: свободная карбоновая кислота и амидированное производное. Следует понимать, что это определение аминокислотных остатков включает такие химические соединения, как ΌΒΕ, Т4с, Рс, ЭНР и 3-амино-1карбоксиметилвалеролактам, который подобен аминокислоте. Функции ПНР как гаптена для распознавания антител, и химических составов по настоящему изобретению, которые содержат участок ПНР, желательно использовать в качестве инструментальных средства исследования.

Термин псевдосимметричный пептид относится как к пептидным химического соединениям, так и к непептидным. Цель состоит в том, чтобы помимо создания псевдосимметричных пептидов создать клеточные составы, которые могут заменить основу пептида. Предполагается, что вторичные амидные связи в пептидах ответственны за неустойчивость и возможно плохие свойства пептида по транспортировке через клеточные мембраны. Соответствующее звено из боковых аминокислотных цепей с адекватными траекториями рассматривается как ключевая тактика проекта в псевдосимметричных пептидах, обеспечивающая биологическую активность. Модификации основы включают восстановленные амидные связи и алкилированные амидные связи и использование изостерических связей типа тиоамидных связей, СН₂-СН₂, СН=СН и т.д.

Термин пептоид относится к химическим соединениям, для которых характерно топологическое подобие структурной формулы пептоида и материнского пептида. Таким образом, пептоид может быть химическим соединением, состоящим из пептид-подобных аминокислотных цепей с боковыми цепями, отходящими от базового атома азота, а не от алфа-углерода как в истинных псевдосимметричных пептидах и пептоиды могут содержать единичные аминокислоты с модифицированными боковыми цепями типа №1к ЭаЬ и Пара, или они могут содержать Ό-аминокислоты. В работе авторов Эль-Таяр Н. и др. (Е1 Тауаг, Ν.) (Аминокислоты (1995 г.) 8: 125-139) описаны различные модификации структуры пептида и псевдосимметричного пептида.

Термины химическое соединение, способствующее межклеточной коммуникации, химическое соединение, способствующее щелевому соединению, химическое соединение, способствующее коммуникации по щелевому соединению и вещество, открывающее щелевые соединения и т.д. относятся к химическому соединению, которое способствует или обеспечивает МКЩС независимо от специфики механизма, который обеспечивает, в конце концов, улучшенную или нормализованную МКЩС. В частности, термин вещество, открывающее щелевые соединения может относиться к веществу, которое помимо стимуляции клетки, которая экспрессирует коннексины, обеспечивает повышенную проводимость канальца щелевого соединения, что, в свою очередь, приводит к повышенному обмену молекулами, которые могут проходить по щелевому соединению между внеклеточным и внутриклеточным пространствами и/или к улучшенной МКЩС.

Термин агонист относится к эндогенному веществу или лекарственному средству, которое может взаимодействовать с рецептором и инициировать его ответную физиологическую или фармакологическую характеристику (сокращение, расслабление, секреция, активация фермента и т.д.). В зависимости от определенного биологического механизма независимо от влияния химического соединения антиаритмический агонист рецептора пептида или ААР-К агонист, как используется здесь, может или не может быть эквивалентом вещества, открывающего щелевые соединения.

Общие предпосылки по щелевому соединению

В многоклеточном организме координация между клетками имеет важное значение. Среди различных средств клеточного взаимодействия щелевые соединения обеспечивают самый прямой путь. Щелевые соединения являются одним типом соединительного комплекса, образованного между смежными клетками и состоят из агрегированных канальцев, которые напрямую связывают внутренние объемы (цитоплазму) соседних клеток. Щелевые соединения найдены в большинстве типов клеток взрослого млекопитающего за исключением только элементов циркуляции крови.

Структурной единицей канальца щелевого соединения является коннексон или полуканальцев. Каждый коннексон состоит из шести полипептидов коннексина (Сх), которые олигомеризируют с образованием поры с водой, которая перекрывает единственную плазматическую мембрану. С целью образования завершенного канальца щелевого соединения два коннексона смежных клеток совмещаются и стыкуются друг с другом с образованием непрерывного канальца, связывающего цитоплазму этих двух клеток.

Коннексины, образующие каналец щелевого соединения, включают многогенное семейство по крайней мере с четырнадцатью коннексинами млекопитающего, обнаруженными к настоящему времени. Экспрессия коннексина является специфичной по отношению к ткани и клетке, при этом некоторые клетки экспрессируют множественные изоформы коннексина. На основе экспериментальных данных предполагается, что возможны две различные гибридные конфигурации: гетеротипические межклеточные канальцы, в которых каждый коннексон или полуканалец состоит из специфичной изоформы коннексина; или гетерометрические канальцы, где каждый коннексон является смесью различных изоформ

- 37 007792 коннексина, экспрессированных в специфическом типе клетки. Коннексины экспрессируют специфически по отношению к клетке, ткани и развитию.

О структуре гена коннексина известно сравнительно мало. Результаты, представленные для Сх43 мыши, показали, что Сх43 содержит два экзона и интрон, расположенные в нетранслированной области 5'. Дальнейший анализ показал, что транскрипция Сх43 начинается в стартовой точке как в тканях эмбриона, так и взрослого человека. В проксимальном промоторе 5' были идентифицированы несколько предполагаемых сайтов связывания факторов транскрипции. 1п уйго исследование показало, что проницаемые канальцы могут быть получены из полуканальцев, состоящих из различных пар коннексинов. Например, из Сх43 можно получить функциональные канальцы с Сх32, Сх37 и эндогенным Сх овоцитов (Сх38), но не с Сх26 овоцитов. Однако очень мало известно об их свойствах, а также о регуляции проницаемости этих гетероканальцев. Сх экспрессированы в огромном большинстве тканей, и одиночные клетки способны экспрессировать несколько различных Сх. Проницаемые щелевые соединения могут образовываться между клетками, которые экспрессируют различные типы Сх. Таким образом, межклеточная коммуникация по щелевому соединению (МКЩС) в тканях, очевидно, является очень важной для сохранения целостности ткани. Очевидно, что несколько генов создают эквивалентные продукты для предотвращения потери МКЩС вследствие мутации в одном гене.

Как отмечалось, диаметр поры канальца щелевого соединения составляет от 0,8 до 1,4 нм. Щелевые соединения относительно не избирательны и позволяют проходить молекулам массой приблизительно до 1000 Да. Такими веществами являются, например, ионы, вода, сахара, нуклеотиды, аминокислоты, жирные кислоты, пептиды малой массы, лекарства и канцерогенные вещества. Для прохода канальца АТФ не требуется и проход осуществляется за счет пассивной диффузии. Этот поток материалов между клетками через канальцы щелевых соединений известен как межклеточная коммуникация по щелевому соединению (МКЩС), которая играет важную роль в регуляции метаболизма клетки, пролиферации и межклеточной передаче сигналов. С точки зрения физиологии для МКЩС очень важно, чтобы клетки ткани, купированные с помощью щелевых соединений, были бы не отдельными дискретными объектами, а были бы объединены со своими соседями. Это свойство способствует гомеостазу и обеспечивает также быструю, прямую передачу вторичных мессенджеров между клетками для координации клеточных реакций внутри ткани.

Процесс МКЩС регулируется рядом механизмов, которые могут подразделяться на две основные категории. При одном типе регуляции количество клеток щелевых соединений регулируется путем влияния на экспрессию, деградацию, клеточный перенос коннексинов к плазматической мембране, или на сборку коннексинов в функциональные щелевые соединения. Ухудшенная МКЩС, вызванная понижением регуляции экспрессии коннексина, например, в клетках опухоли, является примером этого способа регуляции. Другой тип регуляции вообще не включает никакого изменения клеточных уровней щелевых соединений или коннексинов, но вызывает отпирание или запирание (регуляция запирания канальцев) существующих щелевых соединений. К этому типу регуляции могут привести внеклеточные растворимые факторы, типа митогенов (например, ДДТ), гормонов (например, катехоламины), обезболивающих средств (например, галотан), внутриклеточных биомолекул (например, цАМФ), и стресс клетки (например, механический или метаболический стресс). Кроме того, МКЩС регулируется в процессе клеточного цикла и во время миграции клетки.

Для щелевых соединений, особенно для щелевых соединений, состоящих из Сх43 изучался способ регуляции МКЩС или регуляция запирания канальцев соединений. Некоторые факторы оказывают свое ингибирующее влияние на МКЩС косвенно, например, путем изменения среды липида и текучести клеточной мембраны, при этом другие ингибиторы МКЩС включают онкогены, факторы роста и промоторы опухоли, которые вызывают различные модификации Сх43. Для стимуляции определенных биологических функций последней группы может быть необходимо разрушение проницаемости щелевых соединений. Эти агенты инициируют сложные сигнальные пути, включающие активацию киназ, фосфатаз и взаимодействие белков. Понимание механизмов действия модуляторов МКЩС не только позволит определить их соответствующие сигнальные пути, ответственные за регуляцию щелевых соединений, но также предоставит инструментальные средства эксперимента для получения характеристик биологических функций МКЩС и коннексинов.

Изменения цитоплазматического домена карбоксиконцевого участка Сх43 при фосфорилировании специфических сайтов оказываются кардинальными для открытия и закрытия щелевого канальца. Фосфорилирование домена карбоксиконцевого участка также может быть важным для процесса переноса полукомплекса щелевого канальца Сх43 к клеточной мембране, интернализации и деградации. Периоды полураспада коннексинов (часы) намного короче периодов полураспада большинства белков плазматических мембран (сутки), например период полураспада Сх43 сердца крысы меньше 1,5 ч. Таким образом, регулирование интенсивности метаболизма было бы важным фактором в регуляции МКЩС.

Домен карбоксиконцевого участка содержит предположительно сайты фосфорилирования многочисленных протеинкиназ (РКА, РКС, РКС, МАРК, СаМкП и тирозинкиназа). Фосфорилирование этих сайтов домена карбоксиконцевого участка приводит к смыканию канальцев щелевого соединения, и различные ингибиторы Сх43 канальцев щелевого соединения используют различные сигнальные пути, что

- 38 007792 бы вызвать фосфорилирование домена карбоксиконцевого участка. По типу клетки и специфичности ингибитора определяют, какие сигнальные пути должны использоваться, а тип включенной протеинкиназы указывает на используемую внутриклеточную систему мессенджера. Таким образом, для активации РКА требуется участие системы вторичного мессенджера цАМФ, в то время как для РКС требуется участие внутриклеточной сигнальной системы фосфоинозитола.

Другие механизмы, регулирующие запирание канальцев, включают внутриклеточные уровни водорода и ионов кальция, транссоединительное напряжение и свободные радикалы. Пониженный уровень рН или рСа вызывает закрытие канальца специфическим для клетки и коннексина образом.

Помимо регуляции роста МКЩС выполняет и другие многочисленные физиологические функции.

Гомеостаз: МКЩС обеспечивает быстрое приведение в равновесие питательных веществ, ионов и жидкости между клетками. Это могло бы быть самой древней, широко распространенной и важной функцией для этих канальцев.

Электрическое купирование: щелевые соединения служат электрическими синапсами в электрически возбудимых клетках типа кардиомиоцит, клеток гладкой мускулатуры и нейронов. В этих тканях электрическое купирование обеспечивает более быструю межклеточную передачу потенциалов действия, чем химические синапсы. Это обеспеивает их синхронное сокращение кардиомиоцитов и клеток гладкой мускулатуры.

Реакция ткани на гормоны: МКЩС может усилить чувствительность тканей к внешним стимулам. Вторичные мессенджеры типа циклических нуклеотидов, кальция и фосфатов инозитола достаточно малы, чтобы пройти от гормонально активизированных клеток до статических клеток через канальцы щелевых соединений и активизировать их. Такой эффект может усилить реакцию ткани на агониста.

Регуляция зародышевого развития: щелевые соединения могут служить межклеточными проводящими путями для химиката и/или электрических сигналов развития в эмбрионах и для определения границ групп развития. МКЩС в зародышевых клетках осуществляется определенными способами, и ухудшение МКЩС вызывает аномалии развития и тератогенные эффекты многих химических веществ.

Межклеточная коммуникация обеспечивает координацию функционирования отдельных клеток и интегрирует это функционирование в динамику рабочей ткани, обслуживающей организм, в котором она установлена. Поэтому нет ничего удивительного в том, что многие самые разнообразные патологические состояния были связаны с ухудшением МКЩС.

Фармакология

Кардиальные показания

Как подчеркивалось в предпосылках разработки настоящего изобретения, имеется много данных, которые говорят о важной роли МКЩС в кардиомиоцитах в нормальных и патологических состояниях. Ниже рассмотрены специфические кардиальные состояния, связанные с ухудшенной МКЩС, а ίη νίίτο и ίη νίνο данные представлены, чтобы продемонстрировать, что химические соединения, которые усиливают МКЩС в тканях сердца, применяются для профилактики и/или лечения ряда патологических состояний сердца.

Аритмии, вызванные циркуляцией возбуждения

Аритмии сердца вызваны либо патологией в инициировании импульса, либо патологией в проведении импульса. Среди аритмий с патологией в проведении импульса самыми серьезными являются аритмии, вызванные механизмом циркуляции возбуждения.

Циркуляция возбуждения в желудочке

Циркуляция возбуждения является основной причиной стойкой фибрилляции желудочка и смерти от внезапной остановки сердца. Циркуляция возбуждения происходит, если распространяющийся импульс не затухает после полной активации сердца, но сохраняется, чтобы повторно возбудить сердце после окончания рефрактерного периода. Индуцирование циркуляции возбуждения упрощается ввиду замедленной проводимости, повышенной дисперсии реполяризации, неоднородной анизотропии и однонаправленной блокады проводимости. Основной болезнью, ответственной за большинство случаев циркуляции возбуждения в желудочке, является ишемический порок сердца (например, острый инфаркт миокарда, хронический инфаркт миокарда, устойчивая стенокардия и неустойчивая стенокардия). Во время острой ишемии канальцы щелевого соединения закрываются, что приводит к рассоединению соседних клеток. Гетерогенные изменения в ионном канальце и изменения функции щелевого соединения приводят к увеличенной дисперсии продолжительности действия потенциала и эффективного рефрактерного периода особенно в зоне границы, разделяющей область ишемии и нормального миокарда. Как известно увеличенная дисперсия продолжительности действия потенциала способствует индукции фибрилляции желудочка¹²³’¹. Обычно в хорошо соединенных клетках различие в продолжительности действия потенциала сглажено вследствие электрического купирования. Однако рассоединение предотвращает это сглаживание и вносит вклад в обнаружение дисперсии продолжительности действия потенциала и рефрактерного периода¹²'¹¹. Если ишемия носит продолжительный характер, то можно наблюдать снижение степени экспрессии Сх43 и измененную структуру распределения. Закрытие канальцев щелевого соединения во время острой ишемии, а также изменения экспрессии и структуры распределения при хронической ишемии может приводить к замедленной проводимости, увеличенной дисперсии, неодно

- 39 007792 родной анизотропии и однонаправленной блокаде проводимости, и таким образом стимулировать аритмии, вызванные циркуляцией возбуждения. Таким образом, экспериментальное исследование показало корреляцию между сайтом измененной экспрессии коннексина и распределения, и местоположением контура тахикардии в желудочке при циркуляции возбуждения¹-²⁵-¹. Состояния, которые благотворно влияют на развитие циркуляции возбуждения, то есть обеспечивают развитие медленной проводимости, увеличенной дисперсии реполяризации, неоднородной анизотропии и однонаправленной блокады проводимости характерны в разной степени для большого количества других сердечных болезней. Таким образом, при инфекционной или автономной кардиомиопатии воспаление, которое происходит, может приводить к депонированию волокнистой ткани в миокарде, создавая, таким образом, очаги медленной проводимости, увеличенной дисперсии и возможно однонаправленной блокады проводимости. Гипертрофическая кардиомиопатия (например, вследствие артериальной гипертензии, аортального стеноза, врожденных болезней) может приводить к аритмиям, вызываемым циркуляцией возбуждения, вследствие несоответствий между большим количеством миокардиальной ткани и относительно малым количеством проводящей ткани, что может приводить к замедленной проводимости, увеличенной дисперсии и однонаправленной блокаде проводимости. Врожденные болезни (например, продолжительный ОТ синдром) и препараты, которые продлевают ОТ-интервал (например, антиаритмические препараты, антипсихотические препараты, антигистамины, противобактериальные препараты и т.д.) также увеличивают дисперсию продолжительности действия потенциала возможно вследствие гетерогенности распределения ионных канальцев по различным слоям миокарда и являются основной причиной внезапной смерти молодых пациентов¹²⁶¹, вызванной циркуляцией возбуждения.

Циркуляция возбуждения в предсердии

Фибрилляция предсердия - самая общая сердечная аритмия - также бывает вызвана механизмом циркуляции возбуждения. В этом случае через предсердие проходят многократные небольшие волны и повторно возбуждают ткань, которая больше не является рефрактерной. Фибрилляция предсердия может сохраняться годами и, в конечном счете, приводить к коррекции предсердий. Важной частью процесса коррекции являются изменения в распределении щелевых соединений. Таким образом, структура распределения Сх40 становится все более и более гетерогенной.

Продолжительность изменений в распределении и содержании щелевых соединений

Сх40 коррелирует с увеличением стабильности и сложности фибрилляции предсердия и предполагает, что коррекция щелевого соединения Сх40 могла бы включиться в патогенез длительно сохраняющейся фибрилляции предсердия¹-²⁷-¹. Кроме того, несколько линий доказательств поддерживают мнение о том, что во время состояний, связанных с замедленной проводимостью или проводимостью предсердий, чувствительность к фибрилляции предсердия повышается.

Альтернанс реполяризации

Проявление альтернанса электрокардиографической Т-волны с повышенной частотой сердечных сокращений или метаболическим инсультом наблюдалось почти в течение столетия. Макроскопический альтернанс Т-волны часто отмечается как предвестник внезапной смерти от аритмии. В недавней работе предложен общий механизм, который может связать наличие несогласованного альтернанса реполяризации с инициацией разнообразных аритмий, вызванных циркуляцией возбуждения, в зависимости от анатомии основы¹-²⁸-¹. При хронотропном или метаболическом напряжении фаза реполяризации потенциала действия миокарда приводит к альтернации в морфологии и продолжительности. При дополнительном напряжении или при наличии структурных барьеров альтернанс реполяризации становится пространственно несогласованным. Несогласованный альтернанс приводит к достаточно большим градиентам реполяризации с получением однонаправленной блокады и циркуляции возбуждения. При отсутствии структурного барьера циркуляция возбуждения функциональна и проявляется как фибрилляция желудочка или полиморфная тахикардия желудочка. При установке структурного барьера циркуляция возбуждения может закрепиться анатомически, что приводит к мономорфной тахикардии желудочка¹²⁷'¹.

Короче говоря, очевидно, что вещество типа химического соединения по настоящему изобретению, которое увеличивает проводимость щелевого соединения и делает анизотропию более однородной, предотвращает однонаправленную блокаду и аритмии, вызванные циркуляцией возбуждения. Такое вещество будет полезно для пациентов с контурами циркуляции возбуждения как предсердного, так и желудочкового происхождения. Пациенты с альтернантом Т-волны склонны к аритмиям, вызванным циркуляцией возбуждения, и вещество, которое усиливает купирование с помощью щелевого соединения и уменьшает анизотропию, может быть полезно при профилактике летальных исходов в результате желудочковых аритмий у этих пациентов.

Брадиаритмии

Брадиаритмии могут быть вызваны замедленной проводимостью или блокадой проводимости синоаурикулярного узла, предсердно-желудочкового узла, предсердно-желудочкового пучка или правого или левого ответвления пучка. Основным коннексином, ответственным за проводимость по всей проводящей системе, является Сх40. Гомозиготные мыши с удаленным геном Сх40 имеют значительно более медленную желудочковую, предсердно-желудочковую проводимость и проводимость Гис-Пуркинье и

- 40 007792 подвержены повышенному риску аритмий и блокировки ответвления пучка¹''^1-61. Таким образом, для поддержания нормального ритма очень важно нормальное функционирование щелевого соединения Сх40.

Вещество, типа химического соединения по настоящему изобретению, которое увеличивает проводимость щелевого соединения, полезно при профилактике и/или лечении замедленной проводимости в сердце.

Пониженная сокращаемость

Пониженная сокращаемость является общей особенностью многих хронических сердечных болезней. При наихудшем сценарии течения болезни (то есть, сердечная недостаточность на конечной стадии), сокращаемость понижается до такой точки, в которой фракция выброса настолько низка, что базальные потребности для перфузии органа больше не могут поддерживаться. Как показывают экспериментальные данные, а также данные клинических исследований, экспрессия и распределение коннексинов в сердце пациентов с конечной стадией сердечной недостаточности меняются. Таким образом, регуляция Сх43 в значительной степени понижена с крайне неравномерным распределением в патологической ткани. Экспрессия Сх45, которая при нормальных условиях очень ограничена, при сердечных недостаточностях значительно увеличивается; однако, свойства проводимости Сх45 хуже свойств проводимости Сх43 и поэтому уменьшение количества Сх43 компенсировать нельзя. Как показывают последние данные, некоторые регулирующие ионные канальцы и рецепторы сконцентрированы на сайтах межклеточного соединения, и поэтому очень вероятно, что изменения экспрессии и распределения Сх43 могут повлиять на связь между сокращением и возбуждением и таким образом на сокращаемость¹-³⁰-¹. Сильным свидетельством связи между функцией щелевого соединения и сокращаемостью является тот факт, что у химерных мышей, которые получены из стволовых зародышевых клеток с нулевыми Сх43, и бластоцистов дикого вида с экспрессией гетерогенных потерь Сх43 развиваются тяжелые дефекты сокращения.

Мы предполагаем, что вещество, которое увеличивает проводимость щелевого соединения, улучшает межклеточную коммуникацию медиаторов, вовлеченных в связь между сокращением и возбуждением, и таким образом улучшает сокращаемость.

Экспериментальный пример 1.

Влияние химического соединения 2 на МКЩС в кардиомиоцитах

Клеточный препарат: клетки выделялись из сердец морских свинок путем перфузии с использованием коллагеназы согласно способу Лангендорфа. Короче говоря, морские свинки были гепаринизированы интраперитонеальной инъекцией гепарина (1000 Межд. ед./кг). Спустя 30 мин животных умерщвляли ударом по шее, после чего в области шеи разрезался позвоночный столб. Вскрывалась грудная клетка и в аорту вставлялась канюля. Затем с помощью лигатуры канюля крепилась на аорте и в течение пары минут выполнялась перфузия с использованием раствора Тиродеса. Состав раствора Тиродеса в мМ: №Г - 135,33, К⁺ - 4, С1⁺ - 145, РΟ₄ ^- - 0,33, Мд²⁺ - 1, Са²⁺ - 2, раствор Иерез - 10, глюкоза - 10, при уровне рН 7,4. Через всю среду перфузии пропускался 100%-й кислород. После этого сердце подвергалось перфузии в течение двух минут с использованием раствора Тиродеса без Са²⁺, после чего в течение двух минут выполнялась перфузия с использованием раствора с высоким содержанием К⁺, в состав которого входил, мМ: №1' - 20, К⁺ - 120, С1^- - 22, глутамат - 120, Мд²⁴ -1, Са²⁺ - 25 мкМ, раствор Через -10, глюкоза - 10, при уровне рН 7,4. Затем сердце подвергалось перфузии с использованием раствора с высоким содержанием К⁺ с концентрацией коллагеназы 0,6 мг/мл, это выполнялось в течение 10-15 мин. Предсердия удалялись, желудочки рубились на части, после чего эти части размешивались в растворе коллагеназы путем пропускания через этот раствор 100%-го кислорода. Затем для отделения освободившихся клеток они пропускались через сито, а коллагеназа удалялась центрифугированием. Затем клетки повторно суспендировались в растворе Тиродеса без Са^2', а содержание Са^2' постепенно увеличивались до 0,65 мМ. Клетки хранились в этом растворе при комнатной температуре до отправки в экспериментальную камеру.

Электрофизиология: Покровные стекла устанавливались в открытой камере на столе инвертационного микроскопа, где клетки сливались с забуференным фосфатным соляным раствором Далбека (РВ8) со скоростью 1 мл/мин при 37°С. Раствор содержит, мМ: №ί -152, К⁺ - 4,2, С1^- - 141,5, РΟ₄ ^3- - 9,5, Са²⁺ 0,9, Мд²⁺ - 0,5 при уровне рН 7,2. Пипетки для пэтч-клампа вытягивались из стеклянных капилляров диаметром 1,5 мм (6С150Е-15, прибор Гарварда) на съемнике микроэлектрода 8п11ег Е1аттд-Вго\\-п Р-87 и полировались огнем до сопротивления 4-6 МОм. Пипетки заполнялись раствором, напоминающим внутриклеточный, с содержанием, мМ: К⁺ - 145, Νη' - 15, С1^- - 5, глюконата - 153, пирувата - 5, ЭДТК - 1, раствора Через - 5, Са²⁺ - 0,42 мМ, Мд²⁺ - 1,6 при уровне рН 7,2. В этот раствор из основного раствора концентрацией 60 мг/мл (растворитель: диметилсульфоксид) вводился амфотерицин В (240 мкм/мл).

Установка для пэтч-кламп состоит из двух синхронизированных дискретных усилителей (электроника 8ЕС-05ЧХ, ЯРЦ и данные переводятся в цифровую форму с использованием интерфейса ЮТ-10 (электроника ОТЦ и панели сбора данных РС1200 (Ыа1юпа1 ИЩиппегИз). Как сигналы тока, так и напряжения фильтруются при 1 кГц с использованием внутренних фильтров усилителей и переводятся в цифровую форму при 10 кГц.

Одна клетка пары приближается к электроду с помощью микроманипулятора Пэтчмэн (Ра1сйМап) 5173 (Эппендорф (Эппендорф (ЕррепйогГ))). При контакте с клеткой (наблюдается в виде внезапного по

- 41 007792 вышения входного сопротивления) применяется всасывание, пока не установится конфигурация Сща зеа1. Затем эта процедура повторяется на другой клетке. Затем мембрана под пипетками разрывается при кратком всасывании, и потенциал внутреннего объема клетки фиксируется на уровне -70 мВ, что близко к спонтанному потенциалу мембраны клеток. В течение каждых 10 с каждая из клеток последовательно гиперполяризуется на 10 мВ в течение 1 с, и конечное изменение тока в другой клетке может использоваться для расчета межклеточной проводимости (О,) по формуле

С, = — = (уравнение 1) ⁷ и_р-и_п ^{1 и} ’ где 1_р._ри1зе и 1_р._гез1 представляют ток в пассивной клетке во время импульса и после импульса соответственно, а и_р и и_а - напряжения в пассивной и активной клетке. Этот вид экспериментов не позволяет проводить сравнения абсолютных значений С] ввиду различий в межклеточном контакте и поэтому в количестве функциональных канальцев щелевого соединения. Однако изменение значения ( в результате стандартного вмешательства, вызванного, например, лекарственным средством, может быть проанализировано путем сравнения относительных изменений значения Су

Результаты: на фиг. 2 показаны результаты девяти успешных экспериментов. На этой фигуре относительные значения ( показаны как функция времени до и во время стимуляции Химическим соединением 2 (10^-8 М). Во всех пяти экспериментах, где клетки обрабатывались Химическим соединением 2, обеспечивалось значительное увеличение значения Су которое достигало стационарного уровня приблизительно после 400 с стимуляции (АС) = +120 ± 46%). Проводимость не изменялась у всех четырех препаратов, обработанных носителем (.АС, = -3 ± 5%).

Эти результаты хорошо согласуются с экспериментами, о которых сообщалось в литературе, с использованием синтетического ААР - аналога ААР 10, что говорит об усиленном электрическом купировании кардиомиоцитов после стимуляции^[32]. Однако в исследовании Мюллера^[32] проводимость щелевого соединения в условиях контроля не была стабильна. Таким образом, в трех из шести экспериментах применение ААР10 не приводило к увеличению проводимости, но предотвращало падение проводимости щелевого соединения, и в двух из шести экспериментах проводимость щелевого соединения фактически увеличивалась во время контроля. В представленных здесь экспериментах применение химического соединения 2 приводило к повышению проводимости щелевого соединения в препаратах с устойчивыми условиями контроля.

Экспериментальный пример 2.

Связывание химического соединения 2 с препаратами из ткани мышиного сердца.

Препарат

Сердца мышей иссекались (Ва1Ь/с1, 20 г), дважды ополаскивались в 0,32 М сахарозы на льду (0°С) и гомогенизировались на льду в 10 объемах сахарозы в гомогенизаторе ультра Турракс (1000 об./мин) в течение 2 мин. Гомогенизированный состав центрифугировался при 1000 д_средн в течение 10 мин при 4°С, и супернатант собирался и фильтровался через 4 слоя марли. Затем фильтрат центрифугировался при 50000 д_средн в течение 45 мин при 4°С и капля осадка повторно суспендировалась в 10 объемах влажной органической фазы ледяной дистиллированной воды и выдерживалась в течение 60 мин при 0 °С, а затем повторно центрифугировалась при 50000 д_средн в течение 45 мин при 4°С. Полученная таким образом капля осадка повторно суспендировалась в 2 объемах влажной органической фазы РВ8 (забуференный фосфатный соляной раствор) и хранилась при - 80°С до использования.

Эксперименты по замещению с использованием химического соединения 240-250 мкг фильтрата или мембранного материала выдерживалось в растворе Э-РВ8 (забуференный фосфатный соляной раствор Далбека, содержащий 1 г/л МдС1₂-6Н₂О и СаС1₂) общим объемом 100 мкл с содержанием 0,8 нМ [¹²⁵1]ААР10 при возрастающей концентрации испытуемых соединений ААР и химического соединения 2. При 10 мкМ ААР 10 (СЕ-2) наблюдалось неспецифическое связывание.

Расчеты

Данные экспериментов по замещению сведены в уравнение £ = (То1а1 - пз)/(1 + з/1С₅₀) + пз, где То1а1 - общая связанная радиоактивность при концентрации з меченого лиганда, пз неспецифическое связывание, а 1С₅₀ - концентрация испытуемого соединения, понижающего специфическое связывание (То1а1 - пз) до 50 % максимального специфического связывания.

Результаты

Таблица 2. Замещение 0,8 нМ [¹²⁵1]ААР10 из препаратов из ткани мышиных сердец

Испытуемые соединения	Фильтрат, 1С₅₀, нМ	Мембраны, 1С₅о, нМ
ААР		не испытано
ААР 10 (СЕ-2)	1,2	не испытано
Химическое соединение 2	3,6	1,2

- 42 007792

Значения, представленные в табл. 2, имеют тот же порядок величины (0,2 нМ), что и значения, представленные для ААР 10 авторами Деин (ΟΙκ'ίη) и др. ^[33] при использовании мембран сердец кроликов.

Способ связывания на месте на интактных клетках Клеточные культуры СНО

СНО клетки высевались в 24-луночные планшеты при плотности 7900 клеток/см² (~ 15000 клеток на лунку) и выращивались в течение 3 дней ίη νίΐτο в 1 мл на лунку питательной смеси Р-12К с добавлением 10%-ной эмбриональной сыворотки теленка (РС8) и 1000 единиц пенициллина/1000 мкг стрептомицина (пен./стреп.) в атмосфере 5%-ной СО2 и при 100%-ной влажности и при 37°С. Затем плотность клеток увеличилась до 295000 клеток/см² (152 пгрго1/клетка ~ 85 мкг_р1ог/лунка).

Предварительная обработка

В день анализа клетки извлекались из термостата, и каждая лунка промывалась дважды 2 мл раствора О-РВ8, который, в зависимости от эксперимента, либо предварительно нагревался (до 37°С), либо охлаждался льдом (до 0°С) с целью удаления сыворотки. Важно, чтобы время, в течение которого клетки оставляют без физиологических растворов, было сведено к минимуму, что позволяет избежать их высыхания во время процедуры промывки. Клетки, промытые холодным раствором, использовались непосредственно для реакции связывания, в то время как клетки, промытые теплым раствором, использовались в экспериментах по исследованию влияния недостатка глюкозы и гипоксии.

Недостаток глюкозы и гипоксия

Клетки выдерживалось в течение 10 мин в атмосфере Ν₂ в растворе Э-РВ8 без глюкозы, (рН 7,2) предварительно сбалансированном по Ν₂ в течение не менее 10 мин при 37°С. Клетки контрольной группы выдерживались также в течение 10 мин при 37°С только в нормальных атмосферных условиях и в растворе Э-РВ8, содержащем глюкозу (6 мМ).

Реакция связывания

Связывание на месте выполняется путем изменения протокола на основе описания Коенига (Коеш§)^[34]. Из клеточной культуры удаляется раствор Э-РВ8 и вводится 0,50 мл раствора [¹²⁵1]ААР10 с немеченым лигандом или без него, или вводится испытуемый состав. Клетки выдерживаются в течение ночи при 4°С, что обеспечивает сбалансированность раствора. Затем каждая лунка по очереди быстро ополаскивается раствором 2x1 мл Э-РВ8 и оставляется сохнуть.

Раствор Тритон-Х-100 объемом 0,25 мл, объемной концентрацией 0,5% вводится в каждую лунку и клетки оставляются по крайней мере на 1 ч до растворения. Экстракт переливается в счетные ампулы, лунки ополаскиваются водой (0,25 мл) и промытый экстракт переливается в соответствующие ампулы. Ампулы считаются в счетчике гамма-квантов.

Таблица 3. Связывание на месте, 1С₅₀ (нМ)

Испытуемое соединение	1С₅₀ (нМ)
ААР (СЕ1)	0,8
ААР10(СЕ-2)	130
Химическое соединение 2	0,5
Химическое соединение 32	0,5
Химическое соединение 24	65

Эти результаты демонстрируют высокое аффинное связывание с клетками СНО с помощью нескольких различных веществ по настоящему изобретению в сравнении с пептидами, применяемыми ранее.

Экспериментальный пример 3.

Влияния химического соединения 2 на формировании цАМФ в клетках СНО

Клеточные культуры СНО

СНО клетки высевались в 96-луночные планшеты при плотности 6000 клеток/см² (~ 2000 клеток на лунку) и выращивались в течение 4 дней ίη νίΐτο в среде для выращивания концентрацией 200 мкл на лунку как описано в предыдущем разделе.

Предварительная обработка

В день анализа клетки извлекались из термостата и промывались дважды 200 мкл предварительно нагретого (до 37°С) раствора Э-РВ8 (рН 7,2) с целью удаления сыворотки. Клетки выдерживались в течение 10 мин в растворе Э-РВ8, который не содержал глюкозы и в атмосфере Ν₂, как описано в предыдущем разделе.

Анализ на эффективность цАМФ

СНО клетки выдерживалось при 37°С в растворе Э-РВ8 (рН 7,2), содержащем 6 мМ глюкозы, 2,0 мМ 1ВМХ (блокатор фосфодиэстераз), 10 мкМ форсколина (стимулирует образование цАМФ) и увеличивающуюся концентрацию испытуемого пептида. Реакция останавливалась через 20 мин путем введения 20 мкл 0,5 М НС1 и раствор оставался в течение по крайней мере 20 мин при комнатной температуре.

- 43 007792

Содержание цАМФ анализировалось путем подмешивания 20 мкл кислого экстракта из клетки в лунки ФлэшПлэйт (ΕΓδΗΡίαΐΌ™) (комплект пробирного анализа ΝΕΝ δΜΡ001), содержащие 180 мкл раствора индикатора [¹²⁵!]цЛМФ. ФлэшПлэйт выдерживались в течение ночи при 4°С и связанная радиоактивность пластины рассчитывалась в Τορί’ουηΐ (Прибор Пакард). Данные рассчитаны, как описано в предыдущем разделе.

Результаты

Ингибирование форсколин-стимулируемого образования цАМФ ААР-подобных соединений в клетке СНО указывает на то, что ААР рецепторы отрицательно соединены с системой второго мессенджера цАМФ. Кроме того, это демонстрирует наличие функциональных ААР рецепторов в клетках СНО.

Таблица 4. Ингибирование форсколин-стимулируемого образования цАМФ в клетке СНО

Испытуемые химические соединения	ЕС₅₀(нМ)
ААР	53
ААР 10 (СЕ-2)	11
Химическое соединение 2	6,2

Экспериментальный пример 4.

Анализ фосфоинозитола в первичных кардиомиоцитах крысы

Культура первичного кардиомиоцита

Используются новорожденные крысы А181аг (1-2 дня). Бескальциевый и безмагниевый сбалансированный солевой раствор Хэнка, буферизированный с помощью 10 мМ раствора Иецез, используется для промывки во время процедуры разделения клеток. Сердца рассекаются, выделяются желудочки и ткань рассекается на малые части. Миокардиальные клетки выделяются пошаговым ферментативным расщеплением с концентрацией коллагеназы 0,05%, как описано в работе^[35]. После повторов центрифугирования и промывки, осажденные клетки повторно суспендировались в культуральной среде Μ199 с солью Эрла, 10% ΝΕδ, пенициллином (75 ед./мл), и стрептомицином (75 ед./мл) и перед посевом в планшеты высевались в чашке Петри на 90 мин. Неприкрепленные клетки собирались в культуральной среде и высевались в многочисленные планшеты с плотностью в 2,5-10⁵ клеток на лунку. Культуры хранятся в водонасыщенном СΟ₂-термостате при 37°С. Спустя 6-7 дней культуры кардиомиоцита используются для анализа.

Анализ метаболизма фосфоинозитола

Для того, чтобы пометить инозитолфосфолипиды культуры кардиомиоцита выдерживались в течение 48 ч в культуральной среде, содержащей 4 мкКи/мл мио[2-³Н]инозитола. В день анализа культуральная среда заменялась буферным раствором, содержащим литий, и выдерживалась при 37°С, как описано у авторов Мейера ^ехег) и других^[3б]. Не менее чем через пять минут этот буферный раствор заменялся буферным раствором того же объема, содержащим испытуемый состав и культуры выдерживались в нем точно в течение 20 мин. Реакция прекращалась путем быстрой замены буферного раствора на хлорную кислоту (РСА) объемной концентрацией 4% с температурой таяния льда, и культура выдерживалась в течение не менее 20 мин при 0°С. Экстракт РСА нейтрализовался и [³Н]инозитолфосфаты отделялись с помощью анионнообменной хроматографии с использованием колонок Ампреп ^ομ^ρ™), содержащих 100 мг четверичного амина δΑΧ. [³Н]инозитолмонофосфаты элюировались и радиоактивность во фракции измерялась жидкостным сцинтилляционным счетчиком.

Недостаток глюкозы и гипоксия

Перед введением испытуемых веществ в культуры, клетки обеднялись по глюкозе и кислороду путем их выдержки в ^-атмосфере в литиевом буферном растворе без глюкозы в течение 10 мин при 37°С. Контрольные клетки выдерживалось точно также только в нормальных атмосферных условиях и в буферном растворе, содержащем глюкозу.

Норадреналин (ΝΑ) стимулирует метаболизм фосфоинозитола в культурах кардиомиоцита в зависимости от концентрации. Однако способность норадреналина (300 нМ ΝΑ) стимулировать метаболизм фосфоинозитола в культурах значительно снижается спустя 10 мин после снижения содержания глюкозы и кислорода, как показано на фиг. 3.

При нормальных атмосферных условиях и условиях питания мы получили значение Е_тах, равное 3852 ± 266 импульсов в минуту и значение ЕС₅₀, равное 203 нМ (δϋκ = 1,2), тогда как в клетках, находящихся в атмосфере Ν₂ и обедненных по глюкозе, значение Е_тах равнялось 2248 ± 702 импульсов в минуту, а значение ЕС₅₀, равнялось 303 нМ (δΏ_κ = 1,7).

Для исследования влияния веществ по настоящему изобретению на вызванное аттенуированным норадреналином повышение метаболизма фосфоинозитола во время напряжения в клетке, вызванное ишемией и глюкозным голоданием, в культуры кардиомиоцита вводилось химическое соединение 2 или ААР10 (СЕ-2). Оба вещества очень сильно усиливали метаболизм фосфоинозитола, при этом Химическое соединение 2 оказалось самым сильным. Как показано в табл. 5, значение ЕС₅₀ для случая с ААР10 (СЕ-2) было в 200 раз больше во время нормальных условий и в 10 раз больше во время метаболического

- 44 007792 напряжения, вызванного гипоксией и снижением содержания глюкозы, чем значение ЕС₅₀ для случая с химическим соединением 2.

Таблица 5. Повышение метаболизма фосфоинозитола во время метаболического напряжения, вызванного гипоксией и глюкозным голоданием, с помощью химического соединения 2 и ААР 10

	ААР 10 (СЕ-2), ЕС₅₀(нМ)	Химическое соединение 2, ЕС₅₀(нМ)
Нормальные условия	2000	10
Снижение содержания глюкозы и кислорода	100	10

Введение химического соединения 2 (100 нМ) не имело никакого дополнительного влияния на норадреналин (300 нМ), вызвавший увеличение метаболизма фосфинозитола в кардиомиоцитах новорожденной крысы при контрольных условиях, но в клетках, испытывающих гипоксию и недостаток глюкозы (метаболическое напряжение), введение химического соединения 2 (100 нМ) + норадреналина (300 нМ) нормализовало ухудшившийся метаболизм фосфоинозитола, как показано на фигуре 4; было получено приблизительно 70 % увеличение, по сравнению со случаем, когда применялся только один норадреналин.

Экспериментальный пример 5.

Модель вызванной кальцием аритмии у мышей

Антиаритмическое влияние химических соединений по настоящему изобретению было испытано с использованием т у1уо модели вызванных кальцием аритмий согласно модели Линча (ЬупсЬ) и других^[37]. Мышам (25-30 г) давался наркоз с помощью нейролептической обезболивающей комбинации (гипнорм (Нурпогт®) - (фентанилцитрат 0,315 мг/мл и фуанизон 10 мг/мл) + мидазолам (5 мг/мл)). Коммерческие растворы гипнорма и мидазолама разбавлялись в пропорции 1:1 в дистиллированной воде, и одна часть разбавленного Гипнорма (Нурпогт ®) смешивалась с одной частью разбавленного мидазолама.

Анестезия вводилась подкожно с дозировкой 0,05-0,075 мкл на 10 г массы мыши. В хвостовую вену вставлялась канюля. Сигнал ЭКГ записывался непрерывно с помощью электродов ЭКГ из нержавеющей стали, установленных на правой передней конечности и левой задней конечности. Заземленный электрод устанавливался на правую заднюю конечность. Сигнал усиливался (х 5,000-10,000) и фильтровался (0,1150 Гц) через электронную модель 689 модулей ЭКГ Хьюго Сачса. Аналоговый сигнал переводился в цифровую форму через панель сбора данных на 12 битов (модель передачи данных ЭТ321) и отбирался при 1000 Гц с использованием программного обеспечения №1осогс1 НЕМ 3.1 для \\1пс.1о\\'к ΝΓ. После 10минутного периода балансировки образец для испытаний лекарственного средства вводился в хвостовую вену. В качестве контрольных использовались мыши, которым предварительно вводился носитель. Объем инъекции составлял 100 мкл во всех экспериментах. Вливание СаС1 (30 мг/мл, 0,1 мл/мин ~ 100 мг/кг/мин (кальциумхлорид-2-гидрат. К1ебе1-бе Наеп, Германия)) начиналось 3 мин спустя после внутривенного введения лекарственного средства или носителя.

Время до начала предсердно-желудочковой-блокады 2-ой степени было определено как время от начала вливания СаС12 до первого случая аритмии. Случай предсердно-желудочковой-блокады 2-ой степени определялся как прерывистый отказ предсердно-желудочковой проводимости, характерной особенностью которой является Р-волна без сопутствующего комплекса кЕ8.

Реакции были выражены относительно времени до случая предсердно-желудочковой-блокады 2-ой степени у мышей с введенным носителем. В Таблице 6 приводятся максимальные эффекты каждого из испытанных веществ.

- 45 007792

Таблица 6. !η νίνο антиаритмическая активность химических составов по настоящему изобретению.

+++ относится к > 60%-ому увеличению во времени до аритмии; ++ относится к увеличению на 3050% во времени до аритмии; + относится к увеличению на 15-29% во времени до аритмии; (+) относится к < 15%-ому увеличению во времени до аритмии

Химическое

Название химического соединения

Ιη νίνο соединение активность

Группа 1

Сравнительные примеры

СЕ-1

Н-О1у-Рго-Нур-О1у-А1а-С1у-ОН (ААР)

СЕ-2

Н-61у-А1а-01у-Нур-Рго-Туг-1ЧН₂ (ААР10)

3-(4-гидроксифенил)пропионил-Рго-Нур-О1у-А1а-О1у-ОН

СЕ-3 (НР5)

Группа 2

Формула 2

с. V

Н-СА6-(Ра)₂-1ЧН₂:Ра является любым аминокислотным остатком или частью Формулы Ζ или га; по крайней мере, одна из Ра является аминокислотой ϋ; предпочтительно, чтобы Ра был Нур, Р, 6 или А;

Н-61у-Л1а-С1у-О-Нур-Рго-Туг-НН₂ и гл., л 1« гди, та η-л тч«- ъгет ιυ-ι ιυ-ι

Н-С1у-А1а-С1у-О-Рго-А1а-Туг-1ЧН₂Н-О1у-А1а-61у-О1у-О-Рго-Туг-1ЧН₂Н-С1у-А1а-С1у-О-Нур-А1а-Туг-ИН₂

Н-01у-А1а-СЛу-0-Нур-0-Рго-Туг-НН₂ нс определено не определено не определено +

Группа 3

Формула 3

Н-0А6 - (Ρχ)₂-Υ-ΝΗ₂: Рх является частью Формулы Ζ или Ζά, где один Рх является частью Формулы II, Па, а другой Рх является Р или Нур

Н-С1у-А1а-61у-НС6-Рго-Туг-МН₂

Н-С1у-А1а-С1у-Т4С-Рго-Туг-ЫН₂

Н-С1у-А1а-61у-АгС-Рго-Туг-МН₂ не определено не определено

- 46 007792

14	Н-61у-А1а-61у-Рс-Рго-Туг->1Н₂	+
Группа 4	Ас-У'-(Рх)₂-ОАО-ОН: Υ' является Υ или Р; Рх является Р или
Формула 4	Нур
1	Ас-Т уг-Рго-Нур-О1у-А1а-О1у-ОН	+
15	Ас-Туг-Рго-Нур-О1у-А1а-61у-ЫН₂	не определено
Группа 5	Суз (Аст)-ААР10суз (Аст) или су8(Аст)ретроААР10Су8
Формула 5	(Лет)
16	Н-Су8(Аст)-61у-А1а-О1у-Нур-Рго-Туг-Су8(Асгп)-РШ₂	+
17	Н-Су8(Аст)-61у-Нур-Рго-Туг-Су8(Аст)-НН₂	не определено
18	Н-Су8(Аст)-Туг-Рго-Нур-С1у-А]а-О1у-Суз(Аст)-МН₂	не определено
19	Н-Суб (Аст)-Туг-Рго-Нур-61у-Су8 (Аст)-ЫН₂	не определено
Группа 6	Χ-Ο-Υ-(Ο-Ρχ)₂-6-Ο-Ά-6-ΝΗ₂ или ее ретро
Формула 6	Χ-Ο-Ο-Α-σ-(Η-Ρχ)₂-Ο-Υ-ΝΗ₂ или Χ-Ο-ϋ-Ά-Ο-(Ο-Ρχ)₂-Ο-Υ-ϋ-

(Α8η)-ΝΗ₂ ' X является Η или Ас; Рх является частью Формулы Ζ или Ίά, предпочтительно Нур или Р; и (Азп) является произвольным, где обе Формулы произвольно имеют один или большее число изотопов С или N

22	Н-С1у-О-А1а-61у-О-Нур-О-Рго-О-Туг-£Ш₂	не определено
23	Н-61у-О-А1а-61у-О-Нур-О-Рго-О-Туг-О-Азр-ОН	не определено
2	Δ г-П-Т \/г-Г)-Ргп-Г)-14\/п-Гт1 ν-Π- Δ 1я-Гт1 ν-ΝΠ-Κ	+++

24	Ас-П-Туг(3,5-ди-1)-П-Рго-Э-Нур-О1у-О-А1а-О1у-КН₂ Ас-О-Туг (фенильное кольцо моно-йодозамещенное)-О-Рго-О-	не определено
25	Нур-С1у-О-Л1а-С1у-1ХН₂ Ас-0-Туг-0-Рго-0-Нур-(1,2'³С,1⁵Н-01у)-0-А1а-	не определено
26	(1, 2¹³С, ^,5Ν-61_Υ)-ΝΗ₂	не определено
Группа 7	Н-(Рх)_п-У(Н/(Д6-АСг-(Рх)_т-МН₂: Рх является Р, или Нур, η
Формула 7	равно 1 или 2; т равно 0 или 1; предпочтительно т = 0, если п=2 и т = 1, если η = 1
27	Н-Рго-Туг-А8п-61у-А1а-61у-Нур-1ЧН₂	не определено

- 47 007792

Н-Нур-Рго-Туг-А8П-61у-А1а-61у-№Н₂

Группа 8

Формула 8

Η-Ο’-Α-Ο’-(Ρχ)_ζ-Υ-ΝΗ₂: О’ является 8аг или О1у, и, по крайней мере, один О является 8аг; Рх является Р или Нур

Н-8аг- А1а-8аг-Нур-Рго-Т уг-ЫН₂

Н-О1у-А1а-8аг-Нур-Рго-Туг-МН₂

Группа 9

Формула 9

Χ-(Υ)_ρ-(Ρχ)₂-ΟΑΟ-ΝΗ₂: X является А8АЬ или АВ; р равно 0 или 1;

фенильное кольцо Υ имеет произвольно один или большиее число галогеновых заместителей, предпочтительно I; Рх является Р или Нур

А8АЬ-Рго-Нур-61у-А1а-О1у-£Ш₂

А8АЬ (моно-йодозамещенный)-Рго-Нур-О1у-А1а-О1у-НН₂

АВ-Туг-Рго-Нур-61у-А1а-О1у-1ЧН₂

АВ-Туг(3,5-ди-1)-Рго-Нур-61у-А1а-61у-МН₂ не определено +++ не определено не определено

Группа 10

Формула

Цикло(-ОАО - (Ρχ)₂-Υ-Ν/0-): Рх является Р или Нур

Цикло(-61у-А1а-О1у-Нур-Рго-Туг-61п-)

Ци кло(-О1у-А1а-О1у-Нур-Рго-Т уг-Азп-)

Цикло(-61у-А1а-О1у-Рго-Рго-Туг-Азп-) не определено

Группа 11

Формула 11

Цикло (-Υ-(Ρχ)₂-ΟΑ-((3)₄-Ν/ζ)-), ц равно 0 или 1, фенильное кольцо Υ имеет произвольно один или большее число галогеновых заместителей, предпочтительно I; Рх является Р или Нур

Цикло(-Туг-Рго-Нур-О1у-А1а-О1у-А8п-)

Цикло(-Туг-Рго-Нур-01у-А1а-А8П-)

Цикло(-Туг(3-1,5-1)-Рго-4Нур-О1у-А1а-61у-А8п) +++ не определено не определено

Группа 12 Формула 12

Χ-Ζά-6(Ν7<3)Υ-ΝΗ₂: Ζά - последовательность 0, 1, или 2 аминокислотных остатков, выбранных из С или А; X является Н, Ас

39	Н-61у-А1а-61у-Азп-Туг-НН₂	+++
40	Ас-О1у-Азп-Т уг-ГШ₂	++
41	Н-О1у-А8П-Туг-№Н₂	++
42	Ас-А1а-(л1у-А8п-Туг-кШ₂	не определено
43	Н-А1а-61у-Азп-Туг-ЫН₂	не определено

- 48 007792

Как может быть замечено из результатов, представленных в табл. 6, широкие пределы новых химических соединений по настоящему изобретению говорят о антиаритмической активности в сравнении с активностью химических соединений ААР, ААР10 и НР5 предшествующего уровня техники.

Экспериментальный пример 6.

Влияние химического соединения 2 на выделенные, подвергнутые перфузии сердца кроликов Принцип методики Лангендорфа

В методике Лангендорфа предлагается способ соблюдения адекватных метаболических требований к выделенному сердцу, обеспечивая, таким образом, ш уйго эксперимент на сердце целиком в течение нескольких часов. На установке Лангендорфа сердце подвергается перфузии ретроградно через канюлю, вставляемую в аорту. Когда раствор перфузии поступает в аорту, давление в аорте закрывает аортальные клапаны, препятствуя, таким образом, жидкости поступать в отделы сердца. Вместо этого раствор перфузии поступает в коронарное кровообращение, снабжающее сердце. В методике Лангендорфа суммарный поток в аорте равняется, таким образом, коронарному потоку. Эксперименты Лангендорфа выполняются с использованием прибора типа 833 АЙЗОЛЭЙТЕД ХАРТ САЙЗ 5, компании Хьюго Сачс Электроник, Германия. Центральным узлом прибора является аортальный блок, к которому с помощью канюли присоединено сердце. Аортальный блок непосредственно связан с искусственным резистором потока, регулируемым вращающейся ручкой, что позволяет таким образом регулировать постнагрузку и, следовательно, давление перфузии. Жидкость перфузии подается на вход аортального блока из резервуаратермостата по трубкам, подсоединенным к насосу. Объем, подаваемый насосом, может регулироваться. Возможны избыточные обратные потоки жидкости от аортального блока в резервуар. Ниже аортального блока находится отдел сердца (термостатичен), который может быть поднят. Эта установка позволяет непрерывно регистрировать коронарный поток, давление в левом желудочке (ЬУР), давление перфузии, ЭКГ с 12 выводами и 8 однофазных потенциалов действия (МАР'Б). Выходные данные этой многократной регистрации анализируются с использованием программного обеспечения NОТОСОΚ^ НЕМ 3,3. Это программное обеспечение обеспечивает расчеты в широких пределах кардиальных электрофизиологических и гемодинамичных параметров.

Методика перфузии и среда перфузии

Эксперименты проводятся в режиме перфузии под постоянным давлением. Насос потока обеспечивает расход 70 мл/мин и постнагрузка установлена на уровне 50 мм рт.ст., что обеспечивает давление перфузии, равное приблизительно 60 мм рт.ст. Сердца, если не определено иначе, подвергались перфузии с использованием предварительно нагретого (38°С) модифицированного раствора КребсаХенселайта (КгеЬк-Непке1ей) следующего химического состава (ммоль/л): №С1: 118, КС1: 4,7, СаС1₂, Н₂О: 2,52, КН₂РО₄: 1,18, Мд₂БО₄, 7Н₂О: 1,64, пировинограднокислый натрий: 2,0, NаНСОз: 24,88, глюкоза: 5,55. Перед использованием раствор фильтруется через фильтр на горлышке бутылки с размером ячейки 45 мкм.

Уровень рН приблизительно 7,4 и адекватное содержание кислорода в растворе получали путем непрерывного барботирования с использованием карбогена (95% О₂/5% СО₂). Объем 2 л или больше позволяет сбалансировать карбоген в течение по крайней мере 20 мин, тогда как объем меньше 1 л позволяют обеспечить баланс в течение 10 мин.

Анестезия, хирургия и экспериментальные процедуры

Использовались самцы кроликов Бкс:СРН (2,5 - 4,0 кг) полученные из компании Хвидестен, Аллерод (Ну14ек1еп, А11егоф Дания. Они успокаивались с помощью внутримышечной инъекции 1,2 мл Гипнорма (Нурпогт®) (фентанилцитрат 0,315 мг/мл и флуанизон 10 мг/мл). Через 10 мин медленно внутривенно вводилось 0,55 мл Дормикума (Ьогткит®) (мидазолам 5 мг/мл). Кроме того, для предотвращения коагуляции внутривенно вводилось 500 ΐυ.

Кроликов укладывали на спину с фиксацией передних лап по бокам, и делался надрез до оголения трахеи. Выполнялась трахеотомия, и кролики вентилировались кислородом с помощью вентилятора для грызунов Уго Басил (дыхательный объем: 18 мл, частота: 60 в мин). Вскрывалась брюшная полость от хвостовой части до мечевидного отростка, и брюшные мускулатуры рассекались с обеих сторон. С целью получения доступа к грудной полости вскрывалась диафрагма за грудиной, и разрез продолжался с двух сторон вдоль реберного изгиба.

Средостение рассекалось насколько можно ближе к грудине, и ребра рассекались с обеих сторон паралльно линии грудины, что позволяло поднимать грудную стенку в направлении черепа. Поднятая стенка грудной клетки фиксировалась над головой кролика для обеспечения полного обзора грудной полости. Вскрывался перикард и открывалась аорта. На аорту накладывалась незатянутая лигатура. Хвостовая полая вена поджималась только краниально к печени, чтобы уменьшить отток к сердцу и к черепной полой вене, и вскрывалась легочная артерия, чтобы уменьшить перегрузку на сердце. Вскрывалась аорта и для обеспечения искусственной перфузии в аорту сразу же вставлялась канюля, соединенная с аортальным блоком с помощью надставленной трубки, заполненной жидкостью перфузии. Лигатура затягивалась, и сердце отсекалось и передавалось в аппарат для перфузии. Время от зажима хвостовой полой вены до вставки канюли составило приблизительно 30 с.

- 49 007792

После передачи сердца на аппарат в левом предсердии делался надрез для вставки наполненного жидкостью баллона (размер 12) в левый желудочек для измерений давления в левом желудочке. Объем баллона регулируется для обеспечения конечного диастолического давления, равного приблизительно 10 мм рт.ст. Электродное кольцо для измерений ЭКГ с помощью 12 выводов размещалось вокруг сердца на уровне коронарной бороздки с вершиной левого предсердия между 5-ым и 6-ым перикардиальными выводами. 8 электродов ΜΑΡ размещались в сердце и напрямую контактировали с эпикардом. МАР5 и МАР6 размещались в правом желудочке, тогда как другие электроды ΜΑΡ равномерно распределялись по левому желудочку. Этот способ подобен способу, которым пользовались авторы Забел (2аЬе1) и др.^[38]. Когда все электроды оказывались на месте, отдел сердца поднимался для погружения сердца в любое время в раствор Кребса-Хенселайта (КгеЬ5-Иеп5е1е11) с температурой 38°С.

Перед началом эксперимента лигатура размещалась вокруг главного ответвления огибающей артерии, снабжающей большую часть левого желудочка. Оба конца лигатуры пропускались через небольшую пластмассовую трубку, обеспечивающую стимуляцию ишемии путем надавливания пластмассовой трубкой на сердце с зажимом концов лигатуры. Перед началом эксперимента всем сердцам дается 15 мин для того, чтобы прийти в равновесное состояние.

График проведения эксперимента:

1. 15 мин перфузии с нормальным буферным раствором Кребса-Хенселайта (КгеЬ5-Иеп5е1ей) (период приведения в равновесие);

2. 15 мин перфузии с введением химического соединения в нормальный буферный раствор КребсаХенселайта (Кге^-Веп^еИ) (нормокалиемический контрольный период; 1=0-15 мин);

3. 15 мин перфузии с введением химического соединения в раствор Кребса-Хенселайта (КгеЬк^η^ΚίΙ) с пониженным содержанием К⁺ (2,5 мМ) (гипокалиемический контрольный период: 1=15-30 мин);

4. Стимуляция региональной ишемии с последующей перфузией в течение 30 мин с введением химического соединения в раствор Кребса-Хенселайта (Кге^-ИепкекИ) с пониженным содержанием К⁺(2,5 мМ) (гипокалиемический период ишемии; 1=30-60 мин).

В конце эксперимента сердца подвергались перфузии с использованием красителя синий Эванс для оценки области риска образования инфаркта. Предсердия и правый желудочек отсекались и оставшийся левый желудочек отделялся в область, окрашенную синим Эвансом, а область, которая не окрашивалась, являлась областью риска. Эти две области промокались насухо с помощью бумажного полотенца и взвешивались с целью определения доли области риска образования инфаркта.

Регистрация параметров

Непрерывно регистрировались следующие параметры: коронарный поток, давление в левом желудочке, давление перфузии, ЭКГ с 12 выводами и 8 ΜΑΡ регистрации. ЭКГ и ΜΑΡ замерялись при 2000 Гц, а параметры давления и потока при 500 Гц. Средняя продолжительность потенциала действия рассчитывалась по 8 регистрациям ΜΑΡ как средняя продолжительность от момента времени максимальной деполяризации (время бУ/б1 Μαχ) до момента реполяризации 90 %. Эта продолжительность упоминается как ΑΡΌ₉₀, и дисперсия ΑΡΌ₉₀ измеряется как среднеквадратичное отклонение 8 замеров ΑΡΌ₉₀,

Результаты

Как показано на фигуре 5, были изучены три группы. Сердца кроликов подвергались перфузии либо только с использованием буферного раствора Кребса-Хенселайта (Кге^-ВещекЦ) (носитель; п = 11 экспериментов), с химическим соединением 2 концентрацией 10^-10 моль/л, (п=10 экспериментов), либо с ААР10 концентрацией 10^-10 моль/л (СЕ-2; п=3 эксперимента). Увеличение дисперсии ΑΡΌ₉₀, наблюдаемой во время гипокалиемической, острой миокардиальной ишемии у кроликов, в сердца которых вводился носитель, предотвращалось введением химического соединения 2 концентрацией 10^-10 моль/л, но не ААР10 (СЕ-2) концентрацией 10^-10 моль/л. Эти результаты демонстрируют, что химическое соединение 2 предотвращает дисперсию электрического сигнала при ишемии и это дает возможность предположить, что антиаритмические свойства химического соединения 2 связаны с этим механизмом. Предварительно сообщалось, что ААР10 (СЕ-2) способен уменьшить дисперсию эпикардиального интервала восстановления активации и уменьшить изменения эпикардиальных структур активации, вызванных региональной ишемией у кролика с максимальным влиянием при концентрации 10^-8 моль/л¹³⁹'¹. В наших экспериментах химическое соединение 2 эффективно предотвращало увеличение дисперсии электрического сигнала во время ишемии при концентрации 10^-10 моль/л, в то время как ААР10 (СЕ-2) при этой же концентрации был неэффективен. Эти различия не обусловлены различиями в размере инфаркта миокарда потому, что уменьшение коронарного потока во время ишемии и область риска были одинаковы у всех групп. Эти результаты указывают на то, что химическое соединение 2 действует сильнее, чем ААР10 (СЕ-2).

Экспериментальный пример 7.

Влияние химического соединения 2 на аритмии, вызванные циркуляции возбуждения в желудочке у собак

Влияние щелевого соединения на аритмии было выяснено в исследованиях влияния коннексина 43 (Сх43) на свойства проводимости желудочка¹³³’¹. У гетерозиготных мышей с дефицитом Сх43 в два раза

- 50 007792 поднималась частота спонтанных тахикардии желудочка при окклюзии коронарной артерии (САО)^[3]. Ишемия регулирует влияние Сх43 после 6 ч у собак с 60%-м уменьшением Сх43 из конца в конец и при 49%-ом уменьшении Сх43 из бока в бок^[40], что, вероятно, вторично по отношению к дефосфориляции. При подострой ишемии у собак эпикардиальная циркуляция возбуждения проще проходит в областях с пониженным содержанием Сх43^[25]. Таким образом, механизмы циркуляции возбуждения могут сильно зависеть от ишемии, понижающей содержание Сх43 и, возможно, устойчивость щелевых соединений, что делает однородность восстановления и свойства проводимости предрасположенными к тахикардии желудочка и фибриляции желудочка.

В исследованиях, описанных ниже, изучалось влияние химического соединения 2 на аритмии, вызванные циркуляцией возбуждения, при миокардиальной ишемии, вызванной окклюзией передней нисходящей коронарной артерии.

Подготовка животных

Исследовались три собаки под наркозом со вскрытой грудной клеткой, что облегчало размещение электродов для картирования. Сначала α-хлоралоза давалась в виде пилюли (200 мг/кг), а затем в виде постоянного вливания при 8 мг/кг/ч (растворенная в полиэтиленгликоле, молекулярная масса=200). Бедренная вена и артерия были канюлированы для введения жидкости и препаратов и для измерения давления в восходящей аорте, соответственно.

Методы электрофизиологии

На синусовый узел надевался зажим и в ушке предсердия размещался программируемый стимулятор с выводами постоянного тока на двойное значение диастолическиго порога. Для управления частотой сердечных сокращений частота электростимуляции составляла > 200 ударов в мин. Для стимуляции желудочка использовался один полюс многополюсной иглы в нормальной зоне анода (из нержавеющей стали площадью 7 см²) в брюшной мышце. Эндокардиальный эффективный рефрактерный период измерялся по стандартной методике экстрастимуляции. Поздний желудочковый диастолический порог измерялся во время каждого вмешательства; ток стимуляции в четыре раза превышал пороговое значение. Регистрация электрограммы

Испытательные сайты выбирались вдоль оси 16-полюсных игл (Дж. Кассел, Файетевиль, шт. Северная Каролина, США (1. Ка§8е11, ЕауейеуШе, ИС)); каждый полюс полностью окружал ось иглы, что предотвращало возможность направить иглу для регистрации сигналов смежной жилы Пуркинье. Шесть биполярных электрограмм (с интервалом 1 мм) были записаны последовательно вниз по оси иглы с усилением до 1000 раз, с фильтрацией в диапазоне 3-1300 Гц и с записью осциллограммы во время стимуляции предсердий. По каждой многополюсной игле записано четыре интрамуральных электрограммы. Эпикардиальные электрограммы активизировались последними на каждой игле. Использовалась матрица из 23 многополюсных электродов, при этом 17 электродов устанавливались в зоне риска образования инфаркта передней нисходящей коронарной артерии, а 6 электродов - в окружающей нормальной зоне, как описано у авторов Ксинга и Мартинса (Хтд и МагЦщ)¹''¹. Расстояние между иглами, измеренное на эпикарде, менялось в пределах 6-10 мм у собак с массой 12-16 кг.

Стимуляция аритмии

Эндокард размещался в основной апикальной перегородке и боковой свободной стенке только вне зоны риска. После определения эффективного рефрактерного периода интервал 81-82 был продлен на 4 мс > эффективного рефрактерного периода, и 83 добавлялось к протоколу первоначально с 82-83 интервалом, равным 50 мс > 81-82. Интервалы были сокращены до отказа при захвате. Если тахикардия желудочка не вызывалась ни на каком сайте стимуляции, то добавлялись третий (84) и четвертый (85) внешний стимулы. С целью исключения артефакта тахикардии желудочка, вызванной массой иглы или ишемией вследствие того, что иглы, препятствуют кровотоку, перед окклюзией коронарной артерии выполнялся полный протокол стимуляции тахикардии желудочка. После подтверждения наличия физиологических газов в крови и адекватной анастезии на окклюзию передней нисходящей коронарной артерии накладывалась лигатура. После 60 мин размер инфаркта составлял почти 75% зоны риска, и дальнейшее расширение зоны инфаркта было незначительным. Затем по крайней мере дважды перед вмешательствами вызывалась тахикардия желудочка. Каждые 20 мин проводились повторные испытания и продолжались до 3 ч после окклюзии коронарной артерии. При каждом вмешательстве регистрировался эффективный рефрактерный период нормальной кардиальной мускулатуры.

Картрирование аритмии

Эпикардиальное картрирование выполнялось с использованием компьютера на основе системы компании ВАКО Е1ес1горйу81о1о§у 1пс. Программное обеспечение принимает 64 канала данных с разрешением 12 битов с частотой опроса 1 кГц/канал. Фильтрование осуществлялось в диапазоне 30-300 Гц. Восьмисекундное окно запускается от внешнего управления, включая до 8 с данных перед сигналом запуска. Эта система используется, чтобы делать записи от внешних 2-3 эпикардиальных двухполюсников на каждом электроде регистрации.

Настроенная система программного обеспечения используется для разрешения сигналов Пуркинье от 3 внутренних двухполюсников на каждом эндокардиальном многополюсном электроде путем опроса на канале 3 кГц. Фильтры включают частоту Пуркинье (3-1300 Гц). Частота опроса составляла 235 кГц.

- 51 007792

ПК был сопряжен с усилителем, состоящим из мультиплексора аналогового сигнала и 64 приборных схем усиления. У каждой схемы был переключаемый коэффициент усиления (до 1000) и блокировка по ширине полосы пропускания. Сбор, обработка и визуализация электрофизиологических данных выполнялись программным обеспечением. Быстродействующий сбор данных обеспечивал сбор данных в течение 14 с, включая до 8 с перед сигналом запуска.

Анализ картрирования

Анализ картрирования выполнялся автономно. Компьютер выбирал моменты активации с использованием первого максимума 6ν/6ΐ. Электрограммы считались неподдающимися толкованию и исключались из карт только, если не воспроизводилась стимуляция; не было никакого исключения, основанного на напряжении электрограмм. Считается, что потенциалы от электроники или далекие полевые потенциалы присутствуют, если происходят существенные потери напряжения и 6ν/6ΐ в комплексе с интервалами соединения, продолжительность которых короче невосприимчивости. Изохроны выполнялись вручную. Механизмы тахикардии желудочка определялись следующим образом. Тахикардия желудочка, вызванная циркуляцией возбуждения, происходит там, где электрод регистрирует самую раннюю активность, которая происходит после того, как однонаправленная блокировка случается в проксимальной части близости от сайта последней активации из предыдущего комплекса, и между комплексами регистрируется диастолическая активность. Циркуляция возбуждения в эпикардии чаще всего регистрируется при острой ишемии, так что наблюдается ретроградная активация (от эпикардиа к эндокардию) стенки.

Протокол эксперимента

После измерений на сердце и одного часа окклюзии коронарной артерии выполнялись протоколы стимуляции для вызова тахикардии желудочка с целью подтверждения либо воспроизводимой индуцируемости (индуцирование дважды тахикардии желудочка с одинаковой морфологией поверхности) или невыполнения индуцируемости (стимуляция всех трех сайтов дважды без тахикардии желудочка более одного часа). У трех собак с реиндуцируемой тахикардией желудочка был идентифицирован механизм циркуляции возбуждения. Этим трем собакам химическое соединение 2 вводилось внутривенно в виде болюсного вливания, затем двум из них постоянно в течении 30 мин делалось вливание трехуровневой дозы, в то время как третьей собаке вводился солевой раствор. Затем испытание внешней стимуляцией повторялось по всему протоколу на всех сайтах с целью определения наличия тахикардии желудочка. Химическое соединение 2 применялось внутривенно на трех уровнях дозы для обеспечения концентрации плазмы, равной 10^-10 М (болюс: 0,1 мкг/кг; вливание: 2 нг/кг/мин), 10^-9 М (болюс: 1,1 мкг/кг; вливание: 21 нг/кг/мин) и 10^-8 М (болюс: 11 мкг/кг; вливание; 210 нг/кг/мин) соответственно.

Результаты

Первое животное (фиг. 6-9) было изучено после того, как стимуляция длительно сохраняющейся мономорфной тахикардии желудочка была вызвана дважды только от бокового сайта стимуляции желудочка с последовательностью через 2 ч и 10 мин и повторилась через 2 ч и 20 мин после окклюзии коронарной артерии. На фиг. 6 представлена карта активации после септальной стимуляции, которая не в состоянии вызвать тахикардию желудочка. Это демонстрирует нормальную структуру активации прямоходячих с ранней активацией сайта стимуляции РИКК, активизированного на 6 мс позже стимуляции, и поздней активацией эпикардиального сайта, активизированного последним на 107 мс. Обратите внимание, что соседние моменты активации на 86 мс непосредственно к востоку и к югу от последней активации на эпикарде представлены кривой Е-8 на фиг. 7. Эпикардиальная активация первого комплекса тахикардии желудочка, который начинается на- 44 мс до начала поверхности фК8 и, который соответствует электрограмме, зарегистрирована как кривая Е-С на фиг. 7.

На фиг. 7 показана длительно сохраняющаяся мономорфная тахикардия желудочка, вызванная стимуляцией на боковом эпикардиальном сайте стимуляции желудочка, и вызывающая циркуляцию возбуждения. Активация возобновляется в двойной петле циркуляци возбуждения с активацией сначала на 17 мс и затем переходит на 57 мс на северо-западной петле. Юго-восточная петля сначала активируется на 2 мс, 31 мс и затем на 57 мс. В соответствии с протоколом, по которому вызывалась тахикардия желудочка: 81-82=150, 81-83=280, 81-84=390, 81-85=490 мс. На фигуре показаны эпикардиальные (Е-) электрограммы, зарегистрированные с поверхностными выводами ЭКГ II и У5К со второго по пятый преждевременные экстра-стимулы (лучше всего видно на Е-Ь) с обеспечением 4 комплексов тахикардии желудочка. Электрограммы зарегистрированы от боковой пограничной зоны (Ь) сайтов стимуляции и с востока (Е), севера (Ν), центра (С), подэпикарда (8Е), ниже Е-С, а также с юга (8) и северо-запада (Ν^), и юго-запада (8\У) от Е-С. Е-С демонстрирует постепенно диссоциированные электрограммы с последним преждевременным показом блока второго компонента (перпендикулярные линии). Соседняя задержка проводимости на Е8 соответствует тому, что проводимость переходит вокруг и идет назад к центральному сайту (ЕС) с циркуляцией возбуждения, продолжающейся между ЕС и Е8 (прямая линия и линия со стрелкой).

На фиг. 8 показана карта активации во время эпикардиальной активации первого комплекса тахикардии желудочка, которая начинается на -44 мс перед началом поверхности фК8 и, которая соответствует электрограмме, зарегистрированной в Е-С на фиг. 7. Активация продолжается в двойной петле циркуляции возбуждения, с активацией сначала на -17 мс, а затем переходит на 57 мс северо-западной пет

- 52 007792 ли. Юго-восточная петля активируется сначала на 2 мс, 31 мс, а затем на 57 мс. Эта карта активации также иллюстрирует ретроградную активацию стенки желудочка во время аритмии, вызванной циркуляцией возбуждения.

Химическое соединение 2 вводилось тремя возрастающими дозами IV, которые не изменяли среднее артериальное давление (МАР = 80 мм рт.ст.). Эффективный рефрактерный период в контроле составлял 150 мс, 154 мс после самой низкой дозы и 148 мс при самой высокой и последней дозе. Тахикардия желудочка, которая была стимулирована, была типичной эпикардиальной циркуляцией возбуждения, показанной на фиг. 7 и 8. После первой дозы химического соединения 2 (болюс: 0,1 мкг/кг; вливание; 2 нг/кг/мин) тахикардия желудочка больше не стимулировалась несмотря на то, что протоколы стимуляции вызывали тахикардию желудочка до введения химического соединения 2; в соответствии с протоколом, который вызывал тахикардию желудочка до введения лекарственного средства: 81-82=150, 8183=280, 81-84=390, 81-85=490 мс и в течение вливания химического соединения 2, интервалы составляли 150, 270, 370 и 470 мс, соответственно. Тахикардия желудочка не стимулировалась до полутора часов после начала вливания самой низкой дозы химического соединения 2. На фиг. 9 показана электрокардиографическая запись после внутривенного введения самой низкой дозы химического соединения 2. Эти результаты демонстрируют, что химическое соединение 2 эффективно блокировало циркуляцию возбуждения тахикардии желудочка у этой собаки.

У второй собаки стимулировалась тахикардия желудочка, на этот раз от двух сайтов стимуляции пограничной зоны, расположенных сбоку и септально. Снова химическое соединение 2 не изменило МАР, которое началось при 90 мм рт.ст. и завершалось при 90 мм рт.ст. Эффективный рефрактерный период в двух сайтах стимуляции оставался на 163 и 144 мс соответственно во время испытательного периода химического соединения 2, который начался 85 мин спустя после окклюзии коронарной артерии и продолжался в течение 2 последующих часов. После самой низкой дозы химического соединения 2 тахикардия желудочка, вызванная от боковой стенки, больше не стимулировалась; механизмом этой тахикардии желудочка была эпикардиальная циркуляция возбуждения, что очень сходно с механизмом, показанным на фиг. 7-9. До введения химического соединения 2 тахикардия желудочка, вызванная со стороны септального сайта, была также эпикардиальной циркуляцией возбуждения, но после внутривенного введения химического соединения 2, эпикардиальная циркуляция возбуждения была полностью блокирована. Таким образом, в этих двух экспериментах тахикардия желудочка, вызванная эпикардиальной циркуляцией возбуждения, стимулировалась до введеня самой низкой дозы химического соединения 2, а после введения вещества циркуляция возбуждения больше не стимулировалась при любой дозе. Наконец, одно дополнительное животное подвергалось электрофизиологическому испытанию в период временного интервала, используемого в двух экспериментах, описанных выше, без введения химического соединения 2, но с введением солевого раствора. Эпикардиальная циркуляция возбуждения была вызвана спустя один час после окклюзии коронарной артерии, спустя 1/2-2½ ч после окклюзии коронарной артерии вызывалась та же самая морфология тахикардии желудочка и механизм циркуляции возбуждения. Таким образом, воспроизводимость тахикардии желудочка, вызванной циркуляцией возбуждения, в управляемом эксперименте на этот раз согласуется с химическим соединением 2, которое является эффективным антиаритмическим химическим соединением в условиях аритмий, вызванных циркуляцией возбуждения.

Эти эксперименты демонстрируют, что химическое соединение 2 эффективно при профилактике и/или лечении аритмий, вызванных циркуляцией возбуждения, с летальным исходом. Таким образом, целью настоящего изобретения являются химические соединения для приготовления лекарственных средств, используемых при профилактике и/или лечении кардиальных аритмий, вызванных циркуляцией возбуждения, или наджелудочкового или желудочкового происхождения. Эта цель достигается с помощью настоящих пептидных соединений, типа соединений по формулам Ι-УШ, формулам 2-12, и химических соединений, представленных в таблицах 1 и 8, в частности химических соединений из примеров синтеза 1-55.

Экспериментальный пример 8.

Влияние веществ, открывающих щелевые соединения, на костные клетки.

Предпосылки

Остеобласты, которые являются формирующими кость клетками, и остеоциты хорошо связаны между собой. В срезах кости, исследованных электронной микроскопией¹-⁴²-¹, были обнаружены связи остеобласт-остеобласт, остеоцит-остеобласт и остеоцит-остеоцит. Так же как и для сердца, самым интересным коннексином для кости оказался Сх43. В костных клетках экспрессия этих белков связана с экспрессией некоторых остеобласт-специфичных белков. Кальциотропные гормоны также могут регулировать экспрессию белков щелевого соединения.

Показано, что остеобласты человека (НОВ) и стромальные клетки, выделяющие костный мозг (ВМ8С), выделяют Сх43 и Сх45. Они функционально связаны, как продемонстрировано в методике переноса красителя Желтый Люцифер¹-⁴³-¹. Линии остеобласта крыс отличаются от первичных культур человека; клетки КО8 17/2,8 экспрессируют только Сх43 и хорошо связаны, тогда как ИМК 106-01 преимущественно экспрессирую Сх45 и слабо купированы красителем¹-^44-. Обе линии остеобласта крыс имеют

- 53 007792 электрические связи. Трансфекция Сх43 в клетки ИМК приводила к получению клеток, хорошо купированных красителем. Таким образом, Сх43 обеспечивает передачу Желтого Люцифера и других еще более больших молекул, тогда как Сх45 не обеспечивает этого. Напротив, введение Сх45 в клетки экспрессирующие Сх43 уменьшает купирование красителем. При дифференцировке остеобласта, экспрессия Сх43 изменялась; таким образом, чем более зрелый остеобласт, тем сильнее экспрессия Сх43^[45].

Исследовалось влияние различных стимулов на костные клетки и их отношение к изменениям коммуникации по щелевому соединению. Известно, что умеренное механическое напряжение в кости увеличивает плотность кости. Для имитации этой ситуации клетки КО8 17/2,8 подвергались циклическому напряжению, которое приводило к усилению купирования красителем. Циклическое напряжение, приложенное к плохо купированным клеткам ИМК 106-01, приводило также к усилению купирования красителем, но не так резко, как в случае с клетками КО8. Не было обнаружено увеличения мРНК для Сх43, но были обнаружены более фосфорилируемые формы Сх43, что указывает на то, что циклическое напряжение на остеобластах усиливает коммуникацию по щелевому соединению между клетками путем модуляции внутриклеточной локализации белка Сх43 щелевого соединения. Та же самая группа показала, что трансфекция Сх43 в плохо купированные клетки ИМК 106-01 не только усиливает купирование красителем^[46], но также и усиливает экспрессию продуктов зрелых остеобластов, остеокальцина и костного сиалопротеина (В8Р). Ухудшает купирование остеобластов (КО8) путем трансфекции Сх45 в клетки уменьшает экспрессию остеокальцина и В8Р, генов, ответственных за формирование костной матрицы и кальциноз. Недавнее изучение показало, что у Сх43 нокаутных мышей имеется дефицит остеогенеза и нарушение развития по сравнению с дикими мышами^[47]. Таким образом, для полного развития дифференцированного остеобластического фенотипа, а также для нормального остеогенеза и метаболизма требуется межклеточная сеть связи. Поэтому недостаточная коммуникация по щелевому соединению может привести к повышенной потере костной ткани.

Показано также, что щелевое соединение должно частично отвечать за распространение межклеточных сигналов кальция в костных клетках. Механическая стимуляция одного остеобласта человека в монослое в культуре клеток ίη νίΐΐΌ вызывает импульс кальция, который распространяется ко множеству окружающих клеток. Распространение этого сигнала включает проход молекулы мессенджера по щелевому соединению с последующей активацией соседних клеток^[48-49]. Эти сигналы вероятно распространяются по всей клеточной сети в кости ίη νί\Ό в ответ на механические стимулы, и могли бы отвечать за увеличенный остеогенез в ответ на механическую нагрузку на кости.

Коммуникация по щелевому соединению и влияние кальциотропных гормонов связаны между собой. Показано, что стимуляция фибробластов кожи человека с помощью 1,25(ОН)₂витминаО₃ усиливает коммуникацию по щелевому соединению, а также увеличивает уровни белка Сх43 и мРНК^[50], но только в присутствии функциональных рецепторов витамина Ό (УЭК). Показано, что потеря Сх43-экспрессии уменьшает чувствительность клеток к РТН без какого-либо изменения числа рецепторов РТН или реакции цАМФ^[51]. В других случаях РТН и РСЕ2 усиливают коммуникацию по щелевому соединению в клеточных культурах остеобласта с использованием двух механизмов: начального быстрого перераспределения Сх43 к мембране клетки, и более поздней стимуляции экспрессии гена Сх43^[52]. Таким образом, модуляция межклеточной коммуникации представляет из себя механизм, с помощью которого остеотропные факторы регулируют активность остеогенных клеток.

Межклеточная коммуникация по щелевому соединению может оказаться одним из самых важных механизмов, с помощью которого костные клетки координируют свои действия и реакцию на механические и гормональные стимулы. Таким образом, если можно было бы фармакологически усилить коммуникацию по щелевому соединению между костными клетками, то можно было бы увеличивать активность остеобласта с усилением остеогенеза ίη νί\Ό.

Кардиальные миоциты также купированы с помощью щелевого соединения, и также как и в остеобластах преобладающим коннексином является Сх43. Были найдены определенные химические соединения, которые усиливают коммуникацию по щелевому соединению между кардиальными миоцитами, из которых лучше всего изучен искусственно синтезируемый ААР10 (СЕ-2). Кардиальные миоциты реагируют на ишемию уменьшением купирования клеток. В экспериментах ίη νίίΐΌ при введении ААР 10 (СЕ2) в кардиальные миоциты, подверженные ишемии, часть потерянных клеточных связей была восстановлена. Если кардиальные миоциты могут реагировать на эту группу химических соединений усилением купирования с помощью щелевого соединения, то остеобласты могут делать то же самое. В этом случае очевидно, что увеличение купирования клеток очень хорошо могло бы сопровождаться увеличением созревания остеобласта и его активности с последующим увеличением остеогенеза. Для изучения этой гипотезы исследовалось влияние химического соединения 2 на МКЩС в остеобластах человека и клетках остеогенной саркомы крысы. Кроме того, изучалось влияние химического соединения 2 на маркер (то есть, щелочную фосфатазу) для активности остеобласта человека и остеогенеза.

Способы

Клеточная культура

Остеобласты человека: клетки выделялись из костного мозга человека, путем пункции в задней подвздошной части позвоночного столба здоровых добровольцев (в возрасте 20-36 лет): 10-15 мл мате

- 54 007792 риала костного мозга собиралось в 15 мл РВ8+Са, Мд (компания Лайф Технолоджис, Кат. № 14040) с 100 ед./мл гепарина (компания Сигма, Кат. № Н-3149). Мононуклеарная фракция костного мозга выделялась на градиенте Ьутрйоргер (компания Никомед Фарма (компания Никомед Фарма), Кат. № 1001967) центрифугированием при 2200 об./мин в течение 30 мин. После сбора клеток, мононуклеарная фракция промывалась один раз в культуральной средой и центрифугировалась при 1800 об./мин в течение 10 мин. Затем клетки считали и высевали в культуральной среде при плотности 8х10⁶ клеток на 100 мм кюветы. Культуральная среда остеобласта человека (все реактивы получены из компании Лайф Технолоджис): МЕМ те/о (Рйеио1 Кеб) феноловый красный те/глутамакс (Кат. № 041-93013) с добавлением 10%-ой убитой теплом эмбриональной сыворотки теленка (Кат. № 10106) и 0,1% пенициллина/стрептомицина (Кат. № 15140). Культуральная среда заменялась на следующий день и клетки культивировались при 37°С в среде 5% ί.’Ο₂ с заменой культуральной среды каждые 7 дней. После 3-4 недель культуры клетки достигли 70%-ой сплошности. Затем в культуральную среду в течение 7 дней добавлялось 100 нМ дексаметазона (компания Сигма, Кат. № Ό-4902). Затем клетки высевались для экспериментов с видеоизображением: 25 мм #1 стеклянное покровное стекло помещалось в кювету размером 35 мм (или в каждую лунку кюветы из 6 лунок), клетки высевались с плотностью 2,5х10⁵ клеток на покровное стекло и культивировались перед использованием в течение 2-3 дней.

Клетки ΚΟ8 17/2,8: клетки культивировались в 100 мм кюветах при 37°С в среде 5%-ой СΟ₂, и культуральная среда заменялась каждые 2-3 дня. Культуральная среда ΚΟ8 (все реактивы получены из компании Лайф Технолоджис): МЕМ (Кат. № 31095) с добавлением 10% убитой теплом сыворотки теленка (Кат. № 16170), 1 % МЕАА (Кат. № 11140), 1%-ый натрий пировинограднокислый (Кат. № 11360), 1 % Ь-глутамин (Кат. № 25030) и 0,1 % пенициллин/стрептомицин (Кат. № 15140). Для экспериментов с видеоизображением клетки высевались на покровные стекла при плотности 2-3х10⁵ клеток на покровное стекло и культивировались перед использованием в течение 2-3 дней.

Измерение волн кальция

Клетки, культивируемые на покровных стеклах, нагружались 5 мкМ фура-2-АМ (компания молекулар пробе, Кат. № Е-1221) в течение 30 мин при 37°С, и выдерживались в свежей культуральной среде в течение 20 мин. Затем покровные стекла крепились к культуральной камере РОМЕ2 (компания Медисал Системе), хранившейся при 37°С в переохлажденном СΟ₂, на микроскопе Цейс Аксиоверт. Межклеточные волны кальция были вызваны механической стимуляцией единственной клетки с использованием микро пипетки из боросиликатного стекла, прикрепляемой к микроманипулятору Эппендорф (ЕррепбогГ) 5171. Изображение выполнялось с использованием системы формирования изображения МетаМорф (Ме1аМогрй) (компания Юниверсал Имаджинг). Свет возбуждения (340 и 380 нм) подавался от монохроматора (компания Фотоникс (Т.ГЬЬ. РйоЮшсз СтЬЧ)). Изображения захватывались камерой на приборах с зарядовой связью (компания Дэйдж МТИ (Иаде МТЦ) и переводились в цифровую форму с помощью платы обработки изображения Матрокс МВП (Ма!гох МVΡ).

Микроинъекция

Клетки, культивируемые на покровных стеклах, размещались в микроскопе, как описано выше. Микроинъекции выполнялись с использованием микроманипулятора Эппендорф (ЕррепбогГ) 5171 и системы Эппендорф Трансджектор 5346 (ЕррепбогГ Тгапз]есЮг). В микропипетку загружалось 10 мМ раствора Желтого Люцифера (компания Сигма, Кат. № Ь-0259). В клетку в мономолекулярном слое в течение 30 с осторожно вводили Желтый Люцифер, микропипетка удалялась из клетки и спустя 30 с считали количество клеток с измененным цветом. Длина волны света возбуждения для Желтого Люцифера составляла 430 нм, и изображения захватывались, как описано выше.

Анализ щелочной фосфатазы

День 1: клетки высевались на 96-луночные планшеты с концентрацией 8000 клеток на лунку или 3000 клеток на лунку (ΚΟ8) в 200 мкл нормальных культуральных сред.

День 2: культуральная среда клеток менялась.

День 4: (день 3 для ΚΟ8): клетки промывались 200 мкл МЕМ, 0,1% В8А (компания Сигма, Кат. № А-9418). 200 мкл МЕМ, 0,1 % В8А, содержащие различные концентрации химического соединения 2 добавлялись к клеткам, и культура оставлялась на 4 дня (2 дня для клеток ΚΟ8).

День 8: (день 5 для ΚΟ8): анализ щелочной фосфатазы (АЬР) - колориметрический способ измерения активности фермента выполнялся с использованием Комплекта щелочной фосфатазы (компания Сигма, Кат. № 104-ЬЬ): клетки промывались один раз с помощью 200 мкл РВ8+Са, Мд. 100 мкл щелочного буферного раствора добавлялось в каждую лунку, и планшет засевался при 37°С в течение 10 мин. 100 мкл раствора субстрата добавлялось в каждую лунку, и планшет выдерживался при 37°С в течение 30 мин. 100 мкл 2,0 Ν ΝιΟΗ добавлялось в каждую лунку, чтобы остановить реакцию. Поглощение измерялось с использованием считывающего устройства для планшеты при длине волны 405 нм.

Влияние химического соединения 2 на МКЩС

Для оценки способности модификаторов щелевого соединения усиливать коммуникацию по щелевому соединению, по которому распространяются межклеточные сигналы кальция, мономолекулярные слои остеобласта человека на стеклянных покровных стеклах были нагружены фура-2. Во время изображения в реальном масштабе времени выполнялась механическая стимуляция с помощью стеклянной

- 55 007792 микропипетки. Очевидно, что увеличение содержания внутриклеточного кальция происходит с последующим распространением сигнала к окружающим клеткам. Среднее количество клеток в волне составляло 6,5. Затем для десенсибилизации ριιπικΓβΚ рецепторов добавлялось 100 мкМ аденозин-трифосфата (АТФ). После десенсибилизации распространение волн кальция зависит исключительно от МКЩС. После стимуляции АТФ увеличение содержания внутриклеточного кальция было замечено в большинстве клеток, попавших в поле зрения. Снова одна единственная клетка стимулировалась механически. Теперь распространение волн было ограничено средним числом, составляющим только 4,5 клетки на волну. К раствору в ванне добавлялось химическое соединение 2 концентрацией 10^-8 моль/л. Увеличение внутриклеточной концентрации кальция было замечено в большинстве клеток, попавших в поле зрения. После 10 мин выдержки с химическим соединением 2 одна единственная клетка стимулировалась механически. Снова стимулируемая клетка увеличила внутриклеточную концентрацию кальция с последующим распространением волны. Теперь волна увеличилась в среднем до 6,2 клеток (фиг. 10), что является значительным увеличением по сравнению с состоянием, предшествующим добавлению химического соединения 2.

Для проверки способности химического соединения восстанавливать подавленное купирование клеток с помощью щелевого соединения, подобные эксперименты выполнялись на линии остеобласта ΚΟδ 17/2,8 (ΚΟδ), но после инкубации клеток в течение 48 ч в гипоксических условиях только с 3-6% Ο₂, что, как известно, ухудшает купирование клеток. Клетки ΚΟδ в мономолекулярных слоях нагружались фура-2, и при тех же самых рассмотренных выше условиях выполнялась механическая стимуляция. Поскольку клетки ΚΟδ не экспрессируют ρππηοΓβΰ: рецепторы, предварительная обработка с использованием АТФ не проводилась. После стимуляции внутриклеточная концентрация кальция в стимулируемой клетке увеличилась, и инициировалась волна, распространяющаяся в среднем на 2,2 клетки (η=18). Затем химическое соединение 2 добавлялось к раствору в ванне с конечной концентрацией 10^-8 М. Спутя 10 мин механическая стимуляция повторялась. Теперь добавлялась волна, распространяемая в среднем на 5,4 клетки (η=18) (фиг. 11), что является значительным увеличением по сравнению с предыдущим химическим соединением. Таким образом, химическое соединение 2 эффективно увеличивает межклеточные волны кальция, которые проходят по щелевому соединению.

Для оценки влияния химического соединения на прямую клеточную связь выполнялись эксперименты по микроинъекции способом, описанным выше. Краситель Желтый Люцифер вводился в один единственный остеобласт человека в мономолекулярном слое. Спустя 30 с оценивалось количество клеток, содержащих краситель. При физиологических условиях краситель распространился в среднем на 14 клеток (η=19). Для подавления купирования клеток они теперь выдерживалось при гипоксии (3-6% Ο₂) в течение 48 ч. Затем купирование клеток оценивалась повторно с помощью микроинъекции Желтого Люцифера, и в этот момент краситель передавался в среднем только на 7 клеток (η=10). Химическое соединение 2 добавлялось к культуральной среде и спустя 10 мин купирование красителем оценивалось снова. Уже после 10 мин выдержки с химическим соединением 2 купирование клеток усиливалось переносом красителя на 9 клеток (η = 11).

Подобные эксперименты выполнялись с клетками ΚΟδ. Основная связь при физиологическом состоянии в клетках ΚΟδ составляла 12 клеток (η=19). После выдержки в течение 48 ч в среде, содержащей 3-6% Ο2, было отмечено сокращение передачи красителя до 9 клеток (η=27). Опять химическое соединение 2 добавлялось к раствору в ванне и купирование клеток фактически восстанавливалось до предгипоксического уровня со средней передачей красителя до 12 клеток (η=27), (фиг. 12). Таким образом, химическое соединение 2 способно увеличивать коммуникацию по щелевому соединению и восстанавливать стимулируемые гипоксией сокращения купирования клеток.

Известно, что метаболическое напряжение, вызванное гипогликемией, ухудшает коммуникацию по щелевому соединению. Поэтому мы хотели оценить, может ли химическое соединение 2 направить в обратную сторону процесс ухудшения купирования клеток, вызванный гипогликемией. Остеобласты человека культивировались в мономолекулярных слоях на стеклянных покровных стеклах и нагружались фура-2. После АТФ-десенсибилизации, описанной выше, одна единственная клетка стимулировалась механически, и регистрировалось количество клеток в волне. В этой серии экспериментов протяженность волны составляла в среднем 3,2 клетки (η=19). Культуральная среда менялась на культуральную среду без глюкозы, и спустя 8 мин выполнялась другая механическая стимуляция. Теперь волна была почти блокирована с распространением волны только из 1,4 клеток (η=20). Химическое соединение 2 добавлялось к культуральной среде с конечной концентрацией 10^-8 М. Выполнялась заключительная стимуляция, и теперь волна была почти восстановлена со средней протяженностью до 2,9 клеток (η=18), (фигура 13). Таким образом, химическое соединение 2 способно восстанавливать стимулированный гипогликемией разрыв купирования клеток.

Наконец, чтобы оценить влияние химического соединения 2 на остеогенез и активность остеобласта, мы измерили влияние химического соединения на клеточную активность, вызванную щелочной фосфатазой (ΑΣΡ). Остеобласты человека стимулировались химическим соединением 2 различных концентраций от 1х10^-13 до 1х10^-6, и сравнивались с необработанными контрольными группами. При нормальном состоянии культуры химическое соединение 2 повышало ΑΕΡ-активность при большинстве

- 56 007792 испытанных концентраций, за исключением самой высокой концентрации (10^-6 моль/л), которая может вызывать токсикоз (фиг. 14). Кроме того, проверялось влияние химического соединения на АЬРактивность при гипоксических состояниях. Остеобласты человека культивировались в течение четырех дней в 5%-ом О₂. Культуральная среда обогащалась химическим соединением 2 разной концентрации, и сравнивалась с реакцией при нормальном состоянии. При гипоксии стимуляция АЬР-активности, вызванная химическим соединением 2, была приблизительно на 15% больше, чем при нормальных условиях и всех концентрациях в диапазоне от 10^-11 до 10^-8 моль/л (фиг. 15).

Короче говоря, эти результаты демонстрируют, что химическое соединение 2 способно нормализовать ослабленную МКЩС между остеобластами человека при гипоксии. Кроме того, химическое соединение 2 стимулирует выработку щелочной фосфатазы, при этом следует исходить из предположения, что химическое соединение 2 способно стимулировать активность остеобластов, и поэтому остеогенез. Таким образом, химическое соединение 2 может быть полезно при лечении костных болезней с нарушенным остеогенезом относительно резорбции кости. Исходя из влияния химического соединения 2 на купирование клеток при гипоксии можно предположить, что вещества по настоящему изобретению могут использоваться при лечении и/или профилактике костных болезней, связанных с недостаточной васкуляризацией, гипоксией и ишемией костной ткани.

По результатам этих экспериментов можно сделать вывод, что вещества по настоящему изобретению, которые усиливают МКЩС, могут использоваться при подготовке лекарственных средств для профилактики и/или лечения остеопороза. В некоторых случаях, остеопороз является проявлением другой болезни типа синдрома Кушинга или несовершенного костеобразования. Однако в большинстве случаев остеопороза не появляются никакие другие болезни. Одна форма встречается у детей или молодежи обоих полов и с нормальной функцией гонад и часто называется идиопатическим остеопорозом, хотя патогенез большинства других форм также неизвестен. Остеопороз типа 1 встречается у женщин в период после менопаузы в возрасте от 51 года до 75 лет и характеризуется ускоренной и непропорциональной потерей массы зрелой костной ткани. Общими осложнениями в этих случаях являются трещины в позвонках и дистальном участке предплечья. Пониженная функция паращитовидной железы может быть результатом компенсации повышенной резорбции кости. Остеопороз типа II встречается у женщин и мужчин в возрасте 70 лет и связан с трещинами шейки бедренной кости, проксимальной части плечевой кости, проксимальной части большой берцовой кости, и таза, участков, которые содержат как корковую, так и трабекулярную кость. Помимо остеопороза, вещества, которые усиливают МКЩС, могут также усиливать остеогенез при нарушении обмена веществ в костной ткани типа рахита и остеомаляции и при остеопорозе вследствие постоянного приема глюкокортикоида или при хронической почечной недостаточности. Таким образом, целью настоящего изобретения являются химические соединения для приготовления лекарственных средств, применяемых при профилактике и/или лечении остеопороза. Эта цель достигается при использовании существующих пептидных соединений типа химических соединений по формулам КУШ, формулам 2-12, и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в частности химических соединений из примеров синтеза 1-55.

Влияние веществ, открывающих щелевые соединения, на хрящ

Суставный хрящ - ткань, предназначенная для работы на сжатие во время движения сустава и ίη У1уо подвергается в широких пределах воздействию механических нагрузок. Было продемонстрировано, что чувствительность к воздействию механических нагрузок влияет на метаболизм хондроцита и гомеостаз хряща. В клетках многих типов механическое стимулирование вызывает увеличение концентрации цитозольного Са²⁺, которая распространяется от клетки к клетке как межклеточная волна Са²⁺. Межклеточная коммуникация по щелевому соединению лежит в основе координации метаболизма и чувствительности ткани к внеклеточным стимулам: проницаемость щелевого соединения для внутриклеточных вторичных мессенджеров позволяет нескольким клеткам пользоваться одними и теми же канальцами передачи сигналов, что, в конечном счете, приводит к скоординированным реакциям ткани. Механически-индуцируемая передача сигналов Са²⁺ исследовалась в хондроцитах, и было продемонстрировано, что коммуникация по щелевому соединению является важной для механически-индуцируемой передачи сигналов Са²⁺ в хондроцитах¹⁵³’¹. Кроме того, механическая стимуляция активизирует фосфолипазу С, обеспечивая, таким образом, увеличение содержания внутриклеточного инозитол-1,4,5-трисфосфата. При проникновении вторичного мессенджера в щелевое соединение происходит стимуляция выхода внутриклеточного Са²⁺ в соседние клетки, и эта система считается очень важной для скоординированной передачи сигналов в хондроцитах во время механической деформации, и это может обеспечить механизм координации метаболической активности при метаболических напряжениях в хондроцитах^[53,54]. Преобладающим коннексином хряща является Сх43 и в дополнение к его роли в межклеточной регуляции метаболизма и передаче сигналов Сх43 важен также и для нормального хондрогенеза^[47-55].

Кроме того, цитоархитектура менисковых клеток частично зависит от коммуникации по щелевому соединению. Волокнистый хрящ мениска, а также структура волокнистого хрящя сухожилий зависит от межклеточной коммуникации. При ранениях вещества открывающие щелевые соединения увеличивают скорость репарации.

- 57 007792

Таким образом, очевидно, что вещества по настоящему изобретению, которые усиливают МКЩС, могут использоваться для профилактики и/или лечения болезней суставов, которые включают нарушенное купирование клеток. Как было продемонстрировано с остеобластами человека, мы предполагаем, что вещества, которые усиливают МКЩС, могут использоваться для профилактики и/или лечения болезней суставов, которые включают метаболическое напряжение. Они включают любую форму артрита, связанного со сниженной васкуляризацией или заживлением треснутой ткани хряща. Влияние химического соединения 2 и химического соединения 40 на ослабление коммуникации по щелевому соединению, вызванной ДДТ в хондроцитах человека, будет проверено точно ниже также, как описано для остеобласта. Испытуемые химические соединения будут использоваться в диапазоне концентрации от 10^-10 до 10^-6моль/кг, и ожидается, что испытуемые химические соединения направят в другую сторону уменьшение коммуникации по щелевому соединению, вызванное промотором опухоли ДДТ. Таким образом, целью настоящего изобретения являются химические соединения для приготовления лекарственных средств, применяемых при профилактике и/или лечении болезней суставов, включая артрит. Эта цель достигается путем использования существующих пептидных соединений, типа химических соединений по формулам I - VIII, формулам 2 - 12, и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в частности, химических соединений из примеров синтеза 1-55.

Вводиться соединения будут перорально, парентерально или внутрисуставно.

Влияние веществ, открывающих щелевые соединения, на рак

Проницаемость щелевого соединения и регуляция МКЩС происходят в клетке на разных уровнях. Ухудшение или отсутствие МКЩС могут быть результатом изменений экспрессии Сх во время транскрипции и трансляции, альтерации посттрансляционного процессинга и альтерации сборки коннексона и вставки в плазматическую мембрану. Необычной особенностью Сх является их короткий период полураспада по сравнению с другими мембранными белками. Оказалось, что коннексины обладают быстрым метаболизмом, который составляет от 1,5 до 2 ч. Было показано, что деградация Сх зависит от фосфорилирования, которое ведет к дестабилизации некоторых подтипов коннексинов. Быстрый метаболизм обеспечивает дополнительный механизм, по которому МКЩС может быстро регулироваться веществами, влияющими на период полураспада мРНК Сх, трансляцию, внутриклеточный перенос и сборку Сх в щелевое соединение. Другим способом регуляции проницаемости щелевого соединения является полное или частичное закрытие канальцев щелевого соединения при некоторых обстоятельствах путем механического скручивания шести субъединиц коннексона. Известно, что на регуляцию запирания щелевых соединений влияют коканцерогенные факторы, которые ухудшают МКЩС. Коканцерогенные факторы это средства, которые усиливают или ускоряют онкогенез, если их давать неоднократно после начала образования опухоли. Механизмы, с помощью которых коканцерогенные факторы модулируют МКЩС, полностью не понятны, но есть данные в поддержку того, что коканцерогенные факторы могут воздействовать на МКЩС альтерацией фосфорилирования Сх и/или ингибирования экспрессии Сх и их сборки. Недавние результаты показали, что опосредованный ретровирусом генный ίη νΐνο перенос коннексина 43 в злокачественных образованиях с низкой пропускной способностью МКЩС значительно уменьшала онкогенность^[56]. Показано, что еще одной поддержкой важной роли нормальной МКЩС в профилактике рака является то, что мыши с дефицитом Сх32 имеют очень высокую частоту спонтанных опухолей печени и повышенную чувствительность к развитию стимулированной химическими веществами опухоли печени^[57]. Кроме того, для активности фенобарбитала по развитию опухоли требуется функциональный Сх32, обеспечивающий развитие опухоли^[58]. Из этого следует предположение, что для онкогенной активности фенобарбитала^[58] важен разрыв МКЩС.

Карценогенез характеризуется прогрессирующим нарушением механизмов регуляции роста, в которые вовлечены факторы роста, онкогены и гены-подавители опухоли. Так как альтерация МКЩС могла бы привести к альтерации регуляции роста, влияние факторов роста и онкогенов на МКЩС могло бы быть критическим для онкогенеза. Было показано, что несколько онкогенов участвуют в низкоуровневой регуляции МКЩС^[59]. Показано, что рр60^¥-8ГС участвует в закрытии щелевого соединения Сх43 через шаровой и цепочный механизм, который включает фосфориляцию остатка серина С-концевого участка с помощью МАР киназы^[59]. Интересно, что в некоторых случаях клетки, трансфицированные онкогеном, могут связываться друг с другом, но испытывают недостаток гетерологичной коммуникации с соседними нормальными клетками.

Проницаемость щелевых соединений в клетках опухоли при использовании анализа передачи красителя была ниже, чем МКЩС в окружающей ткани печени. Интересно, что много опухолей заключены в матрицеподобную внеклеточную структуру и физически отделены от нормальной ткани.

Малигнизация в нормальных тканях человека происходит в результате накопления генетических изменений. Однако общая проблема карциногенеза и онкогенеза - низкоуровневая регуляция МКЩС. Экспрессия различных коннексинов тканеспецифична. Сх43, Сх26, Сх32 были обнаружены в нормальной ткани груди. Был проанализирован ряд случаев рака груди человека для уровня экспрессии Сх43. Щелевые соединения Сх43 не наблюдались в карциномах из эпителия протоков по месту, инфильтрирующих карциномах из эпителия протоков, и инфильтрирующих лобулярных карциномах, и, как оказалось, они независимы от состояния эстрогена, прогестерона и егЬВ2 рецептора. Напротив, линии клеток

- 58 007792 рака груди человека и ткани карциномы молочной железы грызунов показали низкоуровневую регуляцию Сх43 и оказалось, что они находятся на уровне мРНК, предполагая наличие транскрипционного механизма для уменьшения белка Сх43 при раке груди^[60]. Другим примером связи между раком и МКЩС является гепатоцеллюлярная карцинома, у которой выбывание коннексина 32 говорит о специфичности типа рака^[57]. Исследование с овальными клетками показало, что они могут дифференцировать в гепатоциты и что неопластические производные овальных клеток могут вырабатывать как гепатоцеллюлярные неоплазмы, так и неоплазмы желчных путей. Специфичный коннексин, экспрессируемый дифференцирующейся овальной клеткой, определяет, устанавливается ли коммуникация между клеткой и гепатоцитами или эпителиальными клетками желчных путей. Эта коммуникация может быть необходимой для дальнейшей дифференцировки и регулируемого роста дифференцирующихся овальных клеток, а ухудшение МКЩС может внести свой вклад в формирование гепатоцеллюлярных и холангоцеллюлярных неоплазм. Таким образом, МКЩС может быть ключевым фактором при дифференцировке овальных клеток, и блокированная МКЩС может поддержать их малигнизацию. Кроме того, ίΐ'ΐ νίΙΐΌ анализ инвазии опухоли в эндотелиальные клетки легкого крысы, обработанные малотилатом, показал, что малотилат поддерживал развитие межклеточной адгезии посредством щелевого соединения, что приводило к ингибированию инвазии клеток опухоли^[61]. Взятые вместе, эти результаты хорошо поддерживают гипотезу о том, что альтерация МКЩС является критическим случаем в онкогенезе, и что вещества по настоящему изобретению, которые усиливают МКЩС, могли бы быть полезны при терапии рака. Поэтому, еще одной целью настоящего изобретения являются новые химические соединения, которые усиливают МКЩС. Мы предполагаем, что пептидные соединения по формулам КУШ, формулам 2-12, и химические соединения, представленные в табл. 1 и 8, могут быть особенно полезны в качестве лекарственных средств при лечении рака вследствие их низкой эффективной концентрации и, следовательно, низкой токсичности.

Пептиды применяются при следующих состояниях, связанных с раком: прогрессирование опухоли: во время онкогенеза прерывание физиологического взаимодействия нормальных элементов с их соседними клетками, и потеря особенностей дифференцировки являются общим знаменателем в прогрессировании опухоли. Как полагают, альтерация коммуникации щелевого соединения относится к самым ранним изменениям при онкогенезе клетки; в работах авторов: Волбург Х., Ролманн А. Международный обзор цитологии (^о1Ьитд Н, КоЫтапп А. Ш Кеу. Су!о1.) 1995; 157: 315-73; Клаунинг Дж.Е., Руч Р.Дж. (К1аишд ΙΕ, КисЬ КБ) 1990; 135-46; Кюнг-Сан Канг, Джан-Вон Юн, БьюнгСу Юун, Юун-Кю Лим и ЮнгСун Ли (Куипд-8ип Капд, йт-ХУоп Уин В уоипд8и Υ ооп, Υоои-Куи Ыт и Уопд-8ооп Бее) (Письма о Раке (Сапсег Бейегк)) 166 (2001) 147-153, показано, что предварительная и совместная инкубация с СеО₂в эпителиальных клетках печени крыс, обработанных ТРА, исключает низкоуровневую регуляцию МКЩС с помощью ТРА, при этом предполагается, что вещество, которое восстанавливает ингибирование МКЩС, может использоваться при профилактике или ингибировании активации опухоли. Авторы Сузуки Дж., На Х.-К., Упам Б.Л., Чанг С.С. и Троско Дж.Е. (8ιιζι.ι1<ί I, Νι Н-К, ИрЬат ВБ, СЬапд С.С и Тгокко ΙΕ) в работе Питание и Рак, т. 36 № 1, стр. 122-128 показали, что пищевая добавка лямбдакарагена замедляет МКЩС в эпителиальных клетках печени крысы, подобно тому, как это делает хорошо известный сложный эфир форбола промотора опухоли (ТРА), и поэтому может играть роль в карциногенезе как средство активирующее опухоль. Таким образом, химические соединения по настоящему изобретению могут использоваться при профилактике или лечении рака, вызванного промоторами опухоли, типа ТРА и лямбда-карагена.

Устойчивость к чувствительности к лекарственным средствам: улучшенная коммуникация по щелевому соединению улучшает микросреду в опухолях (Каристинос Г.Д., Алаой-джамали М.А., Фиппс Дж., Иен Л., Батист Г. (Сатукйпок СИ, А1аои-)ата11 МА, РЬ1ррк I, Υеи Б, Вайк! С)). Метастаз: потеря межклеточной коммуникации по щелевому соединению связана с высоким метастатическим потенциалом у всех видов рака с метастатическими потенциалами. (Саундерс М.М., Серай М.Дж., Ли 3., Жоу 3., Уинтер СР., Уелч Д.Р., Донахью Х.Дж. (8аипйегк мМ, 8ега) МД Б1 Ζ, ΖΙμι.! Ζ., ХУйИег СК, \Уе1с11 БК, Бопакие НБ) Исследование рака (Сапсег Кек.), 2001 г.; 61: 1765-1767), Николсон Г.И., Дулски К.М., Троско Дж.Е., (№со1коп СД Би1кк1 КМ, Тгокко ГС. Труды Академии Наук США (Ргос. №111. Асай. И8А, 1988 г.; 85: 4736)). Профилактика метастаз выполняется обработкой веществом, открывающим щелевые соединения, которое сохраняет коммуникацию по щелевому соединению в опухолях.

Обработка является дополнением к обычной химиотерапии.

Экспериментальный пример 9.

Влияние химического соединении 2 на ухудшение коммуникации по щелевому соединению, вызванное ДДТ в остеобластах человека

Протокол и результаты

Химическое соединение 1,1-бис(р-хлорофенил)-2,2,2-трихлорэтан, известное также как инсектицид ДДТ, является ингибитором коммуникации по щелевому соединению и обладает способностью активировать опухоль. Оно замедляет межклеточную коммуникацию, путем уменьшения числа и размеров щелевых соединений, а также с помощью пониженных клеточных уровней фосфорилируемых (активных) форм белка Сх43 щелевого соединения, и эти действия считаются стержневыми для онкогенных свойств

- 59 007792 химических соединений ^[62-64]. Таким образом, химические соединения со способностью предотвращать ухудшение МКЩС, вызванное промотором опухоли, могут быть потенциальными кандидатами на использование при защите от активации опухоли и при лечении рака^[65]. Для исследования способности веществ по настоящему изобретению предотвращать ухудшение МКЩС, вызванное промотором опухоли, было исследовано влияние Химического соединения 2 на нарушение купирования остеобластов человека, вызванное ДДТ.

Способы

Клеточная культура

Остеобласты человека: клетки выделялись из костного мозга человека, путем пункции в задней подвздошной части позвоночного столба здоровых добровольцев (В возрасте 20-36 лет): 10-15 мл материала костного мозга собиралось в 15 мл РВ8+Са, Мд (компания Лайф Технолоджис, Кат. № 14040) с 100 ед./мл гепарина (компания Сигма, Кат. № Н-3149). Мононуклеарная фракция костного мозга выделялась на градиенте Ьутрйоргер (компания Никомед Фарма, Кат. № 1001967) центрифугированием при 2200 об./мин в течение 30 мин. После сбора клеток, мононуклеарная фракция промывалась один раз в культуральной среде и центрифугировалась при 1800 об./мин в течение 10 мин. Затем клетки считали и высевали в культуральной среде при плотности 8х10⁶ клеток на 100 мм кюветы. Культуральная среда остеобласта человека (все реактивы получены из компании Лайф Технолоджис): МЕМ т/о феноловый красный т/глутамакс (Кат. № 041-93013) с добавлением 10%-ой убитой теплом эмбриональной сыворотки теленка (Кат. № 10106) и 0,1% пенициллина/стрептомицина (Кат. № 15140). Культуральная среда заменялась на следующий день и клетки культивировались при 37°С в среде 5% СО₂ с заменой культуральной среды каждые 7 дней. После 3-4 недель культуры клетки достигли 70%-ой сплошности. Затем в культуральную среду в течение 7 дней добавлялось 100 нМ дексаметазона (компания Сигма, Кат. № Ό4902). Затем клетки высевались для экспериментов с видеоизображением: 25 мм #1 стеклянное покровное стекло помещалось в кювету размером 35 мм (или в каждую лунку кюветы из 6 лунок), клетки высевались с плотностью 2,5х10⁵ клеток на покровное стекло и культивировались в течение 2-3 дней перед использованием.

Микроинъекция

Клетки культивировались на покровных стеклах и прикреплались к культуральной камере РЭМ1-2 (компания медикал Системе), хранившейся при 37°С в переохлажденном СО₂, на микроскопе Цейс Аксиоверт. Микроинъекции выполнялись с использованием микроманипулятора Эппендорф (ЕррепйогГ) 5171 и системы Эппендорф Трансджектор (ЕррепйогГ Тгапз]есЮг) 5346. В микропипетку загружались 10 мМ раствора Желтый Люцифер (компания Сигма, кат. № Ь-0259). В клетку в мономолекулярном слое осторожно вводился Желтый Люцифер в течение 30 с; микропипетка удалялась из клетки и спустя 30 с считалось количество клеток, которые демонстрировали передачу красителя. Свет возбуждения (340 и 380 нм) подавался от монохроматора (компания Фотоникс (Т.1.ЬЬ. Р1ю1ошсз СтЬН)). Изображения захватывались камерой на приборах с зарядовой связью (компания Дэйдж МТИ (Цаде МТ1)) и переводились в цифровую форму с помощью платы обработки изображения Матрокс МВП (Майох МУР) при использовании программного обеспечения для обработки изображения Ме1аМогр11 (компания Универсал Имаджинг).

Результаты

Для оценки способности модификаторов щелевого соединения предотвращать активацию опухоли, мы хотели проверить, могут ли модификаторы щелевого соединения направить в обратную сторону процесс ухудшения коммуникации по щелевому соединению, вызванный хорошо известным средством активации опухоли ДДТ. Для этого мономолекулярные слои остеобласта человека выдерживалось на стеклянных покровных стеклах при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5%-ую СО₂. ДДТ добавлялось к культуральной среде с конечной концентрацией 13 мкМ и оставлялось на 60 мин.

Для оценки влияния химического соединения 2 на прямое купирование клеток после обработки с использованием ДДТ выполнялись эксперименты по микроинъекции согласно способу, описанному выше. Краситель Желтый Люцифер вводился в один единственный в мономолекулярном слое остеобласт человека. Спустя 30 с оценивалось количество клеток, содержащих краситель. В контрольных условиях (без обработки ДДТ) краситель распространялся в среднем на 14,5 клеток (п=12). Тот же самый эксперимент выполнялся с клетками, обработанными ДДТ. Эти клетки показали ухудшение купирования клеток в среднем до 7 (п=13). Химическое соединение 2 добавлялось к раствору в ванне до конечной концентрации 10^-8 моль/л и после 10 мин выполнялась еще одна микроинъекция. Химическое соединение 2 обеспечивает усиление межклеточной передачи красителя в среднем до 8,3 клеток (фиг. 15). Это увеличение очень важно при выполнении непараметрического статистического испытания Уилконсона (\νί1сохоп) с р <0,01. Таким образом, вещества, открывающие щелевые соединения, способны направить в обратную сторону процесс ухудшения купирования клеток, связанный с активацией опухоли, из чего можно стелать предположение, что вещества по настоящему изобретению могут использоваться в химиопрофилактике и/или лечении рака. Химические соединения по настоящему изобретению полезны при приготовлении лекарственных средств при химиопрофилактике и/или лечении рака. Химические соединения по настоящему изобретению могут также использоваться в комбинированной терапии с другими

- 60 007792 противораковыми средствами. Таким образом, целью настоящего изобретения являются химические соединения для приготовления лекарственных средств, применяемых при профилактике и/или лечении рака. Эта цель достигается путем использования пептидных соединений по настоящему изобретению типа химических соединений по формулам ΐ-νΐΐΐ, формулам 2-12, и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в частности, химических соединений из примеров синтеза 1-55.

Другие фармакологические способы

Полезность пептидов, рассмотренных при описании способов терапевтического лечения, будет ясна из дополнительных примеров.

Влияние веществ, открывающих щелевые соединения, на заживление ран

Рана является нарушением нормальной анатомии, включая кожу, и может быть хирургической или травматической, или она может быть вторичной относительно некоторых болезней типа диабета, атеросклероза, неправильного питания и т. д. Нормальное заживление раны является системным процессом, который осуществляется пошагово и включают гемостаз и воспаление. За этими процессами следует коррекция, которая может длиться в течение многих лет и отвечает за формирование рубцовой ткани. Гемостаз с фибрином отвечают за поверхность, ниже которой происходят перемещения и движения края раны. Сразу начинаются эпителизация, фиброплазия и капиллярная пролиферация в заживающую рану. Ангиогенные капиллярные ростки вторгаются в сгусток фибрина раны, и в течение нескольких дней организуются в капиллярную сеть по всей грануляционной ткани, также состоящей из лейкоцитов и фагоцитарных одноядерных клеток. Между различными компонентами ткани, вовлеченными в процесс заживления раны, происходит очень динамичное взаимодействие. Для успешного заживления раны очень важен ангиогенный процесс. Межклеточная коммуникация по щелевому соединению важна для создания фибробластов и пролиферации капиллярной сети. Для роста различных компонентов ткани необходимо нормальное распределение коннексина 43.

Некоторые местные факторы, часто наблюдаемые при патологических состояниях, типа отека, ишемии, низкого кислородного потенциала и инфекции, могут задерживать процесс заживления раны. Заживление раны включает взаимодействия многих типов клеток, и, как полагают, межклеточная коммуникация, осуществляемая по щелевому соединению, играет важную роль в координации клеточного метаболизма во время роста и развития тканей и органов ^[66-68].

Мы предполагаем, что вещества по настоящему изобретению, которые усиливают МКЩС, могут использоваться при лечении ран и, в частности, ускорять заживление ран. С учетом экспериментов на ткани сердца и костной ткани можно предположить, что эти вещества обладают повышенной эффективностью при метаболических напряжениях (например, гипогликемии, гипоксии, ишемии), и можно сделать вывод, что эти вещества могут быть особенно полезны при лечении ишемических язв. Таким образом, целью настоящего изобретения являются химические соединения для приготовления лекарственных средств, применяемых при лечении ран и специфических ишемических язв. Эта цель достигается с помощью пептидных соединений по настоящему изобретению типа химических соединений по формулам ΐ-νΐΐΐ, формулам 2-12, и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в частности, химических соединений из примеров синтеза 1-55.

Ранозаживляющие процессы

Процессы заживления - это ряд перекрывающих друг друга фаз, начинающихся с гемостаза (коагуляция). Второй фазой процесса заживления является каскад воспалительных реакций, в которых микробактериофаги накапливаются на стороне раны, и начинается образование грануляционной ткани, включая, помимо других компонентов, фибробласт и лимфоциты. Затем от границы раны с захватом всей площади начинается миграция эпителиальных клеток. Для доставки питательных веществ, кислорода и различных клеток происходит также прорастание капилляров из нормальной ткани в рану. Все клетки и капиллярные клетки эндотелия имеют живую межклеточную коммуникацию через щелевые соединения (Абдулла К.М., Лутра Г., Билски Дж.Дж., Абдулла С.А., Рейнолдс Л.П., Гразул-Билска А.Т. (АЬ4и11ай К.М., ЬиШга Г., В11кк1 Ό., АЬйиНаБ Б.А., Куепокк Ь.Р., Сгахи1-ВПкка В.), эндокринология. 1999 г.; 10: 3541). В областях с плохим снабжением кислорода и/или высокой концентрацией свободных радикалов, наблюдаемых в ранах с некротической тканью при диабете, при артериосклерозе, в хирургических ранах, при отеке, инфекции, ожоговых ранах и при венозной недостаточности, происходит ухудшение коммуникации по щелевому соединению (Наги Дж.И., Хоссайн М.З., Линн Б.Д., Куперн Г.Е., Янг С., Турлей Е.А. (№ду Л., Ноккат М.2., Ьупп В.Ь., Сирегп С.Е., Уапд Б., Тиг1еу Е.А.) Дифференциация роста клетки. 1996 г.; 7: 745-51)).

Влияние вещества, открывающего щелевые соединения, проверялось ίπ νίΙΐΌ в культуре фибробласта. Фибробласт отбирался из десны человека как описано у авторов Арора К.К., Ли у., МкКуллок С. (Агога КК, Ьее ^, МсСи11оск С.) Американский журнал физиологии. Физиология клетки, 2000 г.; 279: 147-57. Клеточная культура подвергалась воздействию 10^-10-10^-8 нМ вещества, открывающего щелевые соединения, и при этом наблюдался значительно более быстрый рост клеток. Рост клеток проверялся обычными способами, с помощью измерения включения ядром тимидина во времени.

До и после воздействия химического соединения изучалась стимуляция роста эндотелиальных клеток и формирования эндотелиальной трубы с помощью веществ, открывающих щелевые соединения, как

- 61 007792 описано у авторов: Аштон А.У., Йокота Р., Джон Г., Жао С., Суадикани С.О., Спрей Д.С. Уаре Дж.А. (АкШоп АЛУ., Υокоΐа К., 1оЬп С., Ζ^ 8., 8иабюаш 8.О., 8ргау И.С., \Уаге ГА.) Биохимический журнал (1 Вю1 СЬет.) 1999 г.; 274: 35562-70).

Вещества, открывающие щелевые соединения, стимулируют процессы заживления ран в слизистой оболочке рта. Авторы Хара А. (Нага А) и другие. (Журнал гастроэнтерологии (1. Сак1гоеп1его1), февраль 1999 г., 34:1-6) идентифицировали коннексины 26 и 32 в слизистой оболочке рта человека как показатели наличия щелевых соединений в этой ткане. Однако иммунофлюоресцентные исследования не выявили никаких значительных различий в экспрессии коннексинов у пациентов с афтозным стоматитом и пациентов контрольных групп. Ирзогладин малеат, который усиливает межклеточную коммуникацию по щелевому соединению ш νίΐΐΌ, был эффективен при лечении транзитарного и рецидивирующего афтозного стоматита, а также симптоматического и лекарственного афтозного стоматита. Он также оказался полезен для профилактики эпизодов рецидивирующего афтозного стоматита с ежедневным введением препарата, предотвращающего рецидив стоматита. Таким же образом пептиды по настоящему изобретению могут использоваться для ускорения процесса заживление раны в слизистой оболочке рта путем усиления межклеточной коммуникации по щелевому соединению в клетках слизистой оболочки рта; и пептиды по настоящему изобретению также полезны при лечении и профилактике афтозного стоматита.

Для обследования раны, заживающей ш νίνΌ, мышам от двух до четырех раз в день местно (диапазон концентраций 10^-9-10^-6 моль/л в водном геле) и парентерально (10^-10-10^-6 моль/кг) вводилось химическое соединение 2 и химическое соединение 40. Ниже рапшси1ик сагпокик с помощью 6-мм пункционной биопсии на коже спины каждой мыши выполнялись две круглые эксцизиционные раны. После 5-дневной обработки химическим соединением 2 и химическим соединением 40 с помощью микроскопии биопсий производилась гистологическая оценка воздействия препаратов на кожу, и путем измерения диаметра раны ежедневно измерялось заживление раны. Мы считаем, что химическое соединение 2 и химическое соединение 40 по одиночке не воздействуют на структуру кожи, но оба химических соединения вместе ускоряют заживление ран после биопсий.

Мы полагаем, что обработка с помощью вещества, открывающего щелевые соединения, обеспечит наилучшую коммуникацию по щелевому соединению между различными клетками, и будет играть важную роль в сложном процессе репарации, и таким образом улучшит заживление раны. Химическое соединение будет применяться парентерально, местно, системно или перорально.

Влияние веществ, открывающих щелевые соединения, на заживление язвы желудка и язвы двенадцатиперсной кишки

Щелевые соединения также играют важную роль в межклеточной коммуникации, пролиферации и дифференцировке клеток слизистой оболочки желудка. Вещество, открывающее щелевые соединения, будет стимулировать регенеративные процессы после образования поражения (Эндо К., Ватанабе С., Нагахара А., Хиросе М., Сато Т. (Епбо К., \Уа1апаЬе 8., №даЬага А., Нйоке М., 8аЮ Ν.), Журнал Гастроэнтерологии и Гепатологии (1 Сак!гоеп1его1 Нера1о1), 1995 г.; 10: 589-94).

Авторы Майн (Маш) и другие продемонстрировали, что нормальная слизистая оболочка желудка человека содержит и коннексин 32 и коннексин 43^[69;70]. Напротив, слизистая оболочка желудка, вокруг хронических язвенных поражений желудка, содержит меньшее количество коннексина 32 и коннексина 43. В работе Майна и других исследовалась зависимость между появлением коннексинов и заживлением язвы. При наблюдении за заживлением язвы было отмечено, что количество коннексинов 32 и 43, которое уменьшалось на активной фазе язвы, почти вернулось на уровень, характерный для нормальной слизистой оболочки желудка. Эти данные говорят о том, что исчезновение как коннексина 32, так и коннексина 43 тесно связано с этапом поражений, вызванных хронической язвой желудка. Кроме того, при использовании модели хронической язвы желудка крысы, вызванной уксусной кислотой, та же группа исследователей продемонстрировала, что клиническое влияние циметидина, как противоязвенного лекарственного средства, тесно связано с повторным появлением коннексина 32^[69].

Щелевые соединения играют важную роль в системе защиты слизистой оболочки желудка и реституции от поражения, вызванного кислотой. Согласно работе авторов: Такахаши Н., Джо Т., Йокояма И., Сено К., Номура Т., Охара X., Уеда Ф., Ито М. (ТакаЬакЫ Ν., 1оЬ Т., Υокоуата Υ., 8епо К., Копшга Т., ОЬага Н., Иеба Р., ЙоЬ М.), Журнал лабораторной и клинической медицины (1 ЬаЬ С1ш Меб) 2000 г.; 136 (2):93-9, по мере накопления данных, становилось очевидно, что межклеточная коммуникация по щелевому соединению (МКЩС) определяла возможность участия МКЩС в процессе реституции в слизистой оболочке желудка. Мужских особей крыс (Спраг-Долей - 8ргадие Эа\\'1еу) не кормили и держали под наркозом. Поражение желудка вызывалось перфузией раствором люминала с 0,2Ν НС1 в течение 10 мин. Целостность слизистой оболочки желудка непрерывно контролировалась путем измерения выведения этилендиаминэтетрауксусной кислоты, меченой хромом-51, которая использовалась для анализа восстановления при повреждении. Перфузия 0,25% октанолом (ОСТ; ингибитор МКЩС) начиналась после поражения кислотой с целью оценки его влияния на реституцию. Исследовалось также влияние ирзогладина (1 г; активатор МКЩС). МКЩС в слизистой оболочке желудка оценивалась иммуногистохимически с помощью моноклонального антитела белка щелевого соединения (коннексин 32). Восстановление после поражения слизистой оболочки кислотой происходило быстро, если прекращалась перфузия ки

- 62 007792 слотой (приблизительно в течение 60 мин). Октанол, который не вызывал никакого поражения нормальной слизистой оболочки желудка, значительно замедлял реституцию. 1С менял направление процесса ингибирования на обратное в зависимости от введенной дозы. В иммуногистохимическом исследовании было продемонстрировано вызванное октанолом поражение щелевого соединения, но не после предваригельной обработки Ю. Исходя из этих данных можно предположить, что МКЩС может играть критическую роль в реституции в слизистой оболочке желудка крыс, и пептиды по настоящему изобретению полезны при лечении язв, типа язвы желудка и двенадцатиперсной кишки. Для обоснования этого утверждения можно провести эксперименты на крысах с использованием общего экспериментального проекта Такахаши Н. (ТакайакЫ Ν) и других 2000-го года, на который ссылались выше, в котором крысам вводилось химическое соединение 2 и химическое соединение 40, которые были стабильны в кислом растворе при концентрациях в диапазоне 10^-11-10^-7 М. Как ожидается, эти эксперименты покажут содействующее влияние химического соединения 2 и химического соединения 40 на купирование клеток с помощью щелевого соединения и противодействие влиянию церулеина, что приводит к заживлению язвы желудка.

Вводиться пептиды будут перорально или парентерально, например внутривенно.

Поэтому вещества по настоящему изобретению, которые усиливают МКЩС, могут содействовать заживлению язвы желудка и язвы двенадцатиперсной кишки. Таким образом, целью настоящего изобретения являются химические соединения для приготовления лекарственных средств, применяемых при лечении язвы желудка и язвы двенадцатиперсной кишки. Эта цель достигается с помощью пептидных соединений по настоящему изобретению типа химических соединений по формулам Ι-νΐΙΙ, формулам 212, и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в частности, химических соединений из примеров синтеза 1-55.

Роль щелевых соединений в сосудистой биологии

Координация клеточных реакций на границе эндотелия между кровью и подлежащими тканями опосредована множественными механизмами передачи сигналов, включая прямую межклеточную коммуникацию по щелевому соединению. Среди функций, в которые вовлечена эндотелиальная межклеточная коммуникация по щелевому соединению, - миграционное поведение эндотелиальных клеток после поражения, ангиогенеза, эндотелиального роста и старения, и координация вазомоторной реакции .

Регуляция кровотока в широком динамическом диапазоне требует скоординированных реакций резистентности и питающих артерий. Такая координация между сосудами может быть достигнута с помощью сосудистых эффектов касательного напряжения, вызываемого кровотоком, или с помощью прохождения вазомоторных сигналов по клеткам сосудистой стенки. В действительности, местное применение некоторых вазоактивных химических соединений типа ацетилхолина (АС11) или норэпинефрина (ΝΕ) вызывало не только местное расширение или сужение, но также и вазомоторные реакции в нескольких миллиметрах выше и ниже по течению^Г71]. Вазомоторные реакции могут также проходить от капилляров до артериол и, могут вносить свой вклад в баланс между потребностью ткани и кровоснабжением. Это было продемонстрировано следующим образом: когда отдельные волокна мускулатуры стимулировались на сокращение, артериолы выше по течению капилляров, снабжающие эти волокна, расширялись^Г72-.

Высокая скорость проводимости совместима с электронной передачей сигнала по стенке сосуда. Фактически было продемонстрировано, что локально вызванная гиперполяризация и деполяризация, проходили в нескольких миллиметрах выше по течению в эндотелиальных клетках и сосудистых клетках гладкой мускулатуры. Для прохождения электрического сигнала требуется купирование клеток сосудов посредством щелевых соединений, которые создают каналы низкого электрического сопротивления между клетками. Сосудистая ткань экспрессирует не менее трех различных коннексинов (Сх) белков (Сх37, Сх40 и Сх43), которые образуют щелевые соединения. Очевидно, что Сх40 является преобладающей изоформой коннексина в аортальных эндотелиальных клетках, тогда как гладкая мускулатура в изобилии экспрессирует Сх43.

Исследование мышей с дефицитом Сх40 (Сх40-/-) продемонстрировало, что распространение вазодилации, вызванной местным применением ацетилхолина или брадикинина, сильно ослаблено у животных с Сх40^-/- по сравнению с нормальными дикими животными (Сх+/+)^Г73]. Кроме того, у животных с Сх40^-/- значительно повышено внутриартериальное кровяное давление по сравнению с давлением у нормальных диких мышей (Сх+/+). Эти результаты подтверждают, что Сх40 играет важную роль в сосудистой межклеточной коммуникации, и показывают, что нарушенная коммуникация по щелевому соединению в стенке сосуда связана с ухудшенной передачей зависимой от эндотелия реакции на сосудорасширяющие лекарственные средства, которые, в свою очередь, усиливают резистентность сосудов и вызывают артериальную гипертензию. Недавние ш у1уо исследования показали, что для регуляции кровяного давления^Г74- чрезвычайно важны нормальные колебания давления в почке. Таким образом, вазомоторные реакции, ослабленные вследствие слабого купирования клеток, могут вносить свой вклад в развитие артериальной гипертензии у животных с дефицитом Сх40.

Низкоуровневая регуляция уровня Сх43 мРНК и содержания белка в стареющих эндотелиальных клетках предполагает, что нарушенная межклеточная коммуникация по щелевому соединению могла бы играть определенную роль в процессе старения сосудов^Г75-.

- 63 007792

Исходя из доступной информации относительно роли щелевых соединений в реакциях сосудов можно предположить, что фармакологический состав, который улучшает купирование клеток с помощью щелевого соединения в стенке сосуда, может способствовать проводимым реакциям сосудов и улучшать кровоснабжение при состояниях, для которых требуется усиленный обмен веществ (например, физические упражнения, тахикардия) и при ишемии. Кроме того, такое вещество, вероятно, предотвратит и/или излечит артериальную гипертензию. Поэтому другой целью настоящего изобретения являются химические соединения, которые увеличивают купирования клеток с помощью щелевого соединения и/или МКЩС в стенке сосуда и, таким образом, полезны для профилактики или лечения артериальной гипертензии. Эта цель достигается с помощью пептидных соединений по настоящему изобретению типа химических соединений по формулам Ι-νΐΙΙ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в Таблицах 1 и 8, в частности химических соединений из примеров синтеза 1-55.

Экспериментальная методика

Во всех экспериментах по изолированной резистентности использовались артерии (внутренний диаметр приблизительно 200 мм) брыжеечки крыс. Это артерии 3-го порядка ветвления брыжеечной артерии были вырезаны из брыжеечки 14-18-недельных мужских особей крыс ^151аг. Артерии установлялись в миографе для измерений изометрической силы и пассивно натягивались с целью получения максимальных усилий. Ванночка с тканью была разделена на две части и артерия устанавливалась в каждой из этих двух половин. Артерии находились в физиологическом забуференном бикарбонатном солевом растворе и, если не оговаривалось иначе, в атмосфере 5% ί.’Ο₂ при 21% Ο₂.

Для оценки сосудодвигательной реакции артерии активизировались с помощью норадреналина с концентрацией близкой к максимальной. Это делалось после удаления эндотелия и с увеличивающимися концентрациями цГМФ, который, как известно, усиливает сосудодвигательную реакцию и межклеточную коммуникацию.

Для оценки эндотелиальной функции артерии активизировались норадреналином с концентрацией близкой к максимальной, и релаксировали в присутствии норадреналина с увеличивающимися концентрациями ацетилхолина, который, как известно, расслабляет артерии с участием эндотелия в этих артериях, при частичном участии ΝΟ и при частичном участии ΕΌΗΕ.

Влияние химического соединения 2 и химического соединения 40 концентрацией 10^-8 М и 10^-6 М оценивалось по сосудодвигательной реакции и по реакциям на ацетилхолин. В случае присутствия лекарственного средства применялась предварительная выдержка в течение не менее 5 мин.

При оценке сосудодвигательной реакции одна артерия в ванночке с тканью является контрольной, а другая артерия обрабатывается либо химическим соединением 2, либо химическим соединением 40.

В экспериментах с гипоксией ткани перед экспериментом подвергались воздействию 5% СО₂ в Ν₂ в течение не менее 5 мин. Эта процедура снижает давление РО₂ в ванночке приблизительно до 5 мм рт.ст.

Мы ожидаем, что химические соединения по настоящему изобретению усилят вазодилацию и сосудодвигательную реакцию, вызванные ацетилхолином. Следовательно, эти вещества будут полезны при лечении артериальной гипертензии и сосудистых болезней, связанных с вазоконстрикцией. Способ введения будет пероральный или парентеральный.

Влияние веществ, открывающих щелевые соединения, на нервную ткань

Центральная нервная система экспрессирует восемь различных коннексинов (Сх 26, 30, 32, 37, 40, 43, 45, 46). Кроме того, Сх36 очевидно преимущественно экспрессируется в нейронах. Различные коннексины обеспечивают коммуникацию между разными совокупностями клеток или выделяются клетками в изолированные группы согласно их структуре экспрессии коннексина. Границы групп, в которых гетеротипическая связь могло бы иметь функциональную актуальность, проходит между олигодендроцитами (Сх32, Сх45) и астроцитами (Сх43, Сх45, Сх40, Сх30) или нейронами (Сх26, Сх32, Сх43)^[76].

Возможно, что определенные наборы коннексинов обеспечивают функциональное преимущество в специфических группах мозга; то есть более высокая или более низкая единичная проводимость могла бы функционально облегчать или ограничивать синхронизацию невральных входов или скорость проводимости.

В незрелых нейробластах и постнатальных нейронах было зарегистрировано¹-^{76 77]} расширенное купирование клеток с помощью щелевого соединения. Постнатальное увеличение нейронных щелевых соединений и их корковая организация заставляют задуматься о важной роли этих соединений в морфогенетических событиях, лежащих в основе критической фазы кортикогенеза. Участие щелевых соединений в нейронном переносе усилено тем фактом, что нейромедиаторы способны модифицировать купирование с помощью щелевого соединения.

Поэтому, мы предполагаем, что вещества по настоящему изобретению, которые, как известно, усиливают МКЩС, могут ускорять репарацию после поражения нерва или при пересадке незрелых клеток (клеток предшественника) в ткань мозга. Среди технологий, которые в настоящее время проходят экспериментальную оценку для клеточной репарации в центральной нервной системе, имеется пересадка клеток предшественника, эмбриональной ткани, и вирусных векторов, которые используются для лечения болезней типа болезни Паркинсона, болезни Хантингтона и других нейродегенеративных болезней мозга.

- 64 007792

Повреждение аксона быстро активизирует микроглиальные и астроглиальные клетки близкие аксотомизированным нейронам. После поражения двигательного аксона, астроциты повышали регуляцию коннексина-43 щелевого соединения в течение часа (часов) и в течение одного дня глиального фибриллярного кислого белка (СЕАР). Одновременно, микроглиальные клетки распространяются и мигрируют к аксотомизированным нейронам перикарионов. Гипотетическая схема активации глиальных клеток при поражении аксона подразумевает, что сначала поврежденные нейроны посредством МКЩС взаимодействуют с соседними астроцитами. Затем актвизируются соседние покоящиеся микроглиальные клетки. Эти глиальные реакции усиливаются паракринными и аутокринными механизмами, в которых цитокины, очевидно, являются важными посредниками. Специфические функциональные свойства активизированных глиальных клеток определяют их влияние на выживание нейронов, регенерацию аксона, и синаптическую пластичность. Поэтому управление индукцией и ходом этих реакций, вероятно, является критическим для исхода, например, при травме нервной системы, ишемии мозга и хронических нейродегенеративных болезнах^-78-.

Как полагают, щелевые соединения обеспечивают молекулярную связь для скоординированной долгосрочной передачи сигналов среди отдельных членов глиальной группы. Точно также, астроциты идеально подходят для метаболической поддержки нейронов, так как они функционально поляризованы и их один край касается сосудистого слоя, а другой полюс подходит к нейронной паренхиме^-76-. Таким образом, неправильное функционирование таких поддерживающих механизмов может явиться причиной неправильного функционирования объединенных проводящих путей нейронов и таким образом результатом болезней центральной нервной системы. Поэтому, мы предполагаем, что вещества по настоящему изобретению, которые, как было продемонстрировано, усиливают МКЩС, могут предотвращать ишемическое поражение мозга путем увеличения метаболического обеспечения между глиальными клетками и нейронами. Кроме того, вещества по настоящему изобретению могут иметь большое значение для больных с органическими психозами, которые могут проявляться в виде депрессии, беспокойства, нарушений обучаемости и памяти, фобий и галлюцинаций. Таким образом, целью настоящего изобретения являются химические соединения для приготовления лекарственных средств, применяемых при профилактике ишемического поражения мозга и при лечении органических психозов, включая депрессию, беспокойство, нарушения обучаемости и памяти, фобии и галлюцинации. Эта цель достигается с помощью пептидных соединений по настоящему изобретению, если они выбираются или составляются с таким расчетом, чтобы быть доступными для центральной нервной системы.

Нервная ткань

Известно, что микроглия является основным иммунным эффектором центральной нервной системы, и что она активизируюется в ответ на широкий диапазон повреждений, которые вызывают мозговые воспалительные реакции, включая черепно-мозговую травму и ишемию, нейродегенеративные болезни, аутоиммунные болезни, инфекционные болезни, прионные болезни, и опухоли мозга. Активизированная микроглия мигрирует к пораженным областям центральной нервной системы, где клетки делятся и постепенно удаляют осколки клеток. Авторы Юдженин (Еидешп) и др. показали, что клетки микроглии могут связываться друг с другом по щелевым соединениям, которые индуцируются воспалительными цитокинами (Юдженин Е.А., экардт Д., Теис М., Уиллеке К., Беннетт М.В.Л. и Саез Дж.С. (Еидешп Е.А., Ескагб! Ό, ТНей М., ШШеске К., ВеппеИ. М.У.Б. и 8аех. ГС.). Микроглия в мозговых колотых ранах экспрессирует коннексин 43 и ίη νίίΐΌ формирует функциональные щелевые соединения после обработки гамма интерфероном и альфа-фактором некроза опухоли, Труды Академии Наук США (Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А, т. 98, 4190-4195, 2001 г.). Это было продемонстрировано в следующих экспериментах. В мозговых колотых ранах микроглия прогрессивно накапливалась в течение нескольких дней и формировала агрегаты, которые часто показывали иммунореактивность Сх43 на границах клеток. В первичной культуре микроглия показывала низкие уровни Сх43, определяемые вестерн-блоттингом, диффузную внутриклеточную иммунореактивность Сх43, и низкую частоту купирования красителем. Обработка только иммуностимулирующим бактериальным липополисахаридом (ЬР8) или только гамма интерфероном цитокинов (ΙΝΕ-гамма) или только альфа-фактором некроза опухоли (ΤΝΕ-альфа) не увеличивала частоту купирования красителем. Однако микроглия, обработанная ΙΝΕ-гамма совместно с ЬР8 показала драматическое усиление купирования красителем, которое предотвращалось при совместном применении антитела против ΤΝΕ-альфа, что предполагало высвобождение и аутокринное действие ΤΝΕ-альфа. Совместная обработка с помощью ΙΝΕ-гамма и ΤΝΕ-альфа также значительно увеличила частоту купирования красителем и уровни Сх43 с транслокацией Сх43 к межклеточным контактам. Индуцированное цитокином купирование красителем снова ингибировались с помощью 18-глицирретиновой кислоты - блокатором щелевого соединения. Культивируемая микроглия мыши также экспрессировала Сх43 и показывала купирование красителем после обработки цитокинами, но микроглия от гомозиготных Сх43-дефицитных мышей не проявляла значительного купирования красителем после совместной обработки либо ΙΝΕгамма и ЬР8, либо ΙΝΕ-гамма и ΤΝΕ-альфа.

Вследствие активации коммуникации по щелевому соединению с помощью химического соединения 2 и химического соединения 40 ожидается, что эти химические соединения будут способствовать межклеточной коммуникации микроглии и таким образом увеличат или ускорят процессы заживления

- 65 007792 при вышеупомянутых болезнях (воспалительные реакции мозга, включая черепно-мозговую травму и ишемию, нейродегенеративные болезни, аутоиммунные болезни, инфекционные болезни, прионные болезни и опухоли мозга).

Для обоснования этого утверждения можно провести эксперименты на культурах микроглии с применением общего экспериментального проекта Юдженина (Еидешп) и др., 2001 г., рассмотренного выше, с введением в поврежденную микроглию химического соединения 2 и химического соединения 40 в концентрациях 10^-11 - 10^-8 М. Как ожидается, эти эксперименты покажут, что химическое соединение 2 и химическое соединение 40 способствуют купированию с помощью щелевого соединения и противодействуют влиянию 18-альфа-глицирретиновой кислоты. Соединения по настоящему изобретению могут также использоваться в модели ίη νίίΐΌ, описанной авторами Наги Дж.И. (Наду Л.) и Ли У.И. (Б1 XV.Е.) Европейский журнал евронауки (Еиг 1 №иго8с1), декабрь 2000 г.; 12 (12):4567-72, для изучения, например, действия ишемии на регуляцию астроцитароного щелевого соединения.

Легочная ткань - альвеолярные клетки

Альвеолярная межклеточная коммуникация по щелевому соединению между альвеолярными клетками важна для осуществления ионного переноса, механохимической передачи сигнала, регуляции роста клеток и выделения фактора поверхностно-активного вещества (Ашино Ю., Инг X., Доббс Л.Г., Баттачаря Дж. (АкЫпо Υ, Υίη§ X, ЭоЬЬх БС, ВНайасНагуа 1.) Американский журнал физиологии легкого и молекулярной физиологии (Ат 1 Р11у5ю1 Бипд Мо1 Р11у5ю1)2000 г.; 279: Б5-Б13). Ιη νί\Ό репарация после острого и хронического воспалительного поражения альвеолярной области легкого включает формирование фибронектина как части внеклеточной матрицы (Чараш У.Е., винсент П.А., Саба Т.М., Миннеар Ф.Л., Мк-Кеоун-Лонго П.Дж., Миглиоззи Дж.А., Льюис Е., Гиунта С. (СНагакН νΕ, Утсеп1 РА, 8аЬа ТМ, Мшлеат РБ, Мс-Кео^п-Бопдо Р1, М|дНох/1 1А, Бе\\'15 Е, Сшп1а С. Американское обозрение респираторных болезней (Ат Кем Кекрй Όίδ) 1993 г.; 148: 467-476) и Ториката С, виллигер Б., Чарлес Кун И., МкДональд Дж.А. (Топка1а С; Уййдег В, СНаг1е8 КиНл I, МсОопаИ 1А) Лабораторные исследования (БаЬ ΙηνΌδΙ) 1985 г.; 52: 399-408). Исследование альвеолярной эпителиальной клеточной культуры продемонстрировало увеличение количества щелевых соединений параллельно увеличению внеклеточной концентрации фибронектина (Алфорд А.И., Раннелс Д.Е. (А1Гогй А1, Каплей ΌΕ) Американский журнал физиологии легкого и молекулярной физиологии, 2001 г.; 280:Б680-Б688). При ίη νί\Ό исследованиях на животных было обнаружено уменьшение количества щелевых соединений после тяжелого воспаления легких, стимулированного двуокисью азота, как в альвеолярной ткани, стенках оконечных бронхиол, альвеолярных каналах, так и в перибронхиолярных альвеолах. Эти результаты зависели от дозы. Однако предварительное введение таурина предотвращало эту потерю щелевых соединений и уменьшало воспалительные реакции. После облучения легкого крысы и после обработки химиотерапевтическим соединением (Блеомицином) были получены одинаковые результаты.

Таким образом, сохранение коммуникации по щелевому соединению в ткани легкого, очевидно, важно для предотвращения фиброза легкого, и пониженное количество коннексинов наблюдается как реакция на воспалительные процессы, на различные токсические стимулы, типа газовой ингаляции, деструктивных веществ, переносимых по воздуху, и на радиацию. Предварительная обработка химическим соединением, которое способствует открытию щелевого соединения или коммуникации по щелевому соединению, будет показана до терапевтического облучения легких, например при раке легкого, при лечении рака груди, щитовидной железы и желудка.

В способах лечения по настоящему изобретению может использоваться одно или большее число химических соединений, описанных здесь, как единственное активное средство. Желательно использовать одно из химических соединений. При желании такие химические соединения могут использоваться для профилактики, то есть, для предотвращения специфических проявлений или состояний или для уменьшения степени их проявления. В другом случае эти химические соединения могут использоваться в сочетании с признанным терапевтическим подходом. При использовании облучения желательно, чтобы такой способ лечения был дополнительным, то есть, сочетался с признанной терапией для лечения данного состояния. Такие дополнительные способы лечения по настоящему изобретению могут применяться при необходимости одновременно с признанной терапией или в разное с ней время. Принятые терапевтические подходы для ряда болезней и болезненных состояний были описаны, например, в работах Принципы Харрисона при лечении внутренних органов НаггБоп'х Рг1пс1р1ек оГ 1п1егпа1 МеФсше (1991 г.) 12 издание; издательство МкГро-Хилл (МсСга^-НШ, 1пс.) и Фармакологическое основание терапии (1996 г.) Гудман, Луи С. 9-е издание, Пергаммон Пресс, которые включены в данном случае в качестве ссылок.

Обработка химическим соединением, которое способствует открытию щелевого соединения или участвует в нем, предотвращает дальнейшее ухудшение функции легкого при эмфиземе, асбестозе, силикозе, фиброзе легкого, пневмониях, фиброзе легкого, вызванном лекарственным средством и у больных, подвергаемых воздействию токсичных для легких газов типа диоксида азота. Желательно, чтобы такая обработка была дополнением к обычному лечению этих состояний.

Химические соединения могут быть проверены ίη νίΙΐΌ в клеточной культуре альвеолярного эпителия, выделяемой из легкого крысы (Раннелс СР., Раннелс Д.Е. (Каплей 8.К., Каплей Ό.Ε.) (Цитобиология

- 66 007792 клетки. Лабораторный справочний, редактор Селис Дж.Е. (Се11к ДЕ) Сан-Диего, шт. Калифорния, США,: издательство Академик, 1994 г., стр. 116-123), Абрахам В., Чоу М.Л., Деболт К.М., Ковал М. (ДЬгаНат V., СНои М.Л., ОеБоН Κ.Μ., Кονа1 Μ. (Американский журнал физиологии легкого и молекулярной физиологии 1999 г.; 276: Ь825-Ь834)) или из коммерчески доступной линии клеток человека. Клетки могут культивироваться в стандартной покрытой коллагеном пластиковой чашке с культуральной тканью в минимально эссенцифальной среде Эрла, содержащей антибиотики и эмбриональную бычую сыворотку. Клетки растут до образования сплошного слоя. Коммуникация по щелевому соединению измеряется непосредственно с помощью 4% раствора Желтый Люцифер при введении 150 мМ Ь1С1 в клетку с помощью микроинъекции. Флуоресцентный индикатор заполняет клетки посредством простой диффузии в течение 3 мин. После инъекции пипетка удаляется и считается количество флуоресцентных клеток. Количество флуоресцентных клеток считается при действии различных ингибиторов щелевых соединений при обработке различными дозами (или без таковой) веществ (пептидов), способствующих коммуникации по щелевому соединению в диапазоне 10^-10-10^-7 М.

Предпочтительное в данном случае вещество, открывающее щелевые соединения типа Химического соединения 2, будет также испытываться ίη νίνο на экспериментальных животных во время фиброза легких, вызванного лекарственным средством, и фиброза легких, вызванного облучением. Животные подвергаются действию индуктора, и результат оценивается и сравнивается с результатом, полученным на животных, предварительно обработанных химическим соединением 2. Дозировки будут находиться в диапазоне 10^-10 до 10^-7 моль/кг в зависимости от биологической кинетики химического соединения, например, как определено при модельной аритмии, вызванной хлоридом кальция. Химическое соединение может применяться перорально, парентерально, через нос или как ингаляция в легкие.

Гладкая мускулатура

Сосудистая система. Межклеточная коммуникация через канальцы щелевого соединения играет фундаментальную роль в регуляции и модуляции тонуса миоцита сосудов по всему сосудистому дереву (Крист Г.Л., Спрей Д.С., Мор Л.К., Эль-Саббан М.Е., Бринк П.Р., (СНпк! О.Ь., δρίΌν О.С., ΜοοίΌ Ь.К., Е1δаЬЬаη Μ.Ε., Βπη1< Ρ.Κ.) Исследование кровообращения (Спс Кек), 1996 г.; 79: 631-646). Другая важная роль, которую играет коммуникация по щелевому соединению состоит в распространении гиперполяризации среди клеток гладкой мускулатуры, участвующих в реакции расслабления сосудов (Бенни Дж. Л., Пайца С. (Βеηηу 1.Ь., Ρ;·ιί^;·ι С.) Американский журнал физиологии; Физиология сердечно-сосудистой системы 1994 г.; 266: Н1465-72). Для обеспечения специализированных функций эндотелия необходима межклеточная коммуникация по щелевому соединению между клетками эндотелия в пределах мономолекулярного слоя и между эндотелием и другими клетками стенки сосуда. В нескольких исследованиях была зарегистрирована коммуникация по щелевому соединению между этими различными типами клеток в коронарных капиллярах, а также во всех других сосудах. Было также продемонстрировано участие в адаптивном артериогенезе (Цаи У-Дж., Котлаи С, Коцис Е., Сколц Д., Шапер У., Шапер Дж. (Са1 ЭД-1, Ко11а1 С, Коск1к Е, δ6ιο1ζ Ό, δйаρе^ ЭД, δс11аρе^ 1) Журнал молекулярной и клеточной кардиологии, (1 Μο1 Се11 Сагбю1)2001 г.; 33: 957-67), Ванг, Х.-З., Дэй Н., Валцис М., Хси К., Серелс С, Бринк П.Р. Крист Г.Дж. (ЭДамд Η-Ζ, Эау Ν, ν;·ιΚκ Μ., ИкаеН К, δе^е1κ С, Еппк ΡΚ, СНпк1 61) Американский журнал физиологии; Физиология клетки, 2001 г.; 281: С75-88, Шустер А., Ойши X., Бенни Дж.-Л., Стергиопулос Н., Мейсатер Дж.-Дж. (+с11ик1ег Α, Οίκΐιί Η, Βеηηу 1-Ь, δ^Γ§ίοριι1οκ Ν, Μе^κаΐе^ 1-1) Американский журнал физиологии; Физиология сердечно-сосудистой системы, 2001 г.; 280: Η1088-96).

В различных патофизиологических ситуациях с разрывом эндотелиального мономолекулярного слоя сосудов в результате гиперхолестеринемических поражений, вызванных питанием, коммуникация по щелевому соединению гладкой мускулатуры сосудов ухудшается (Полацек Д., Бех Ф., МкКинзи Дж.Ф., Давис П.Ф. (Ρο1асек Ό, ЕесН Ρ, Μ6<ίη^ν I?, Эау1ек ΡΡ) Журнал сосудистых исследований (1 ν;·ι^ Кек), 1997 г.; 34: 19-30). Во время венозного застоя и при развитии тромбофлебита наблюдалось повреждение клеточного слоя эндотелия. Авторы Квак Б.Р., Пеппер М.С., Грос Д.Б., Меда П. (Кхуак ΒΚ, Ρеρρе^ Μδ, 6гок ΌΒ, Μеάа Ρ) (Молекулярная биология клетки (Μο1 Βίο1 Се11), 2001 г.; 12: 831-845, продемонстрировали, что коммуникация по щелевому соединению служит для координации клетки во время миграции в процессе эндотелиальной репарации, а также играет важную роль для прорастания капилляров во время ангиогенеза.

Обработка химическими соединениями, которые способствуют коммуникации по щелевому соединению, улучшает нарушенную внутриклеточную коммуникацию в поврежденных сосудистых областях, и особенно полезна при ишемии органа, например с1аиб1сайо ίη^ηηίΐ^ηκ и инфаркте миокарда.

Однако после повреждений баллонным катетером сонной артерии крысы процесс заживления сосуда характеризуется улучшенной коммуникацией по щелевому соединению - Ие Х.И., Лупу Ф., Дюпон Е., Северс Н.Дж. (УеН Ш, Ευρυ Ρ, Όυροηΐ Е, δеνе^κ Ν1) Артериосклероз, тромбоцитоз, сосудистая биология, 1997 г.; 17:3174-84. Химическое соединение вводится перед вмешательством с применением баллона и предпочтительно является дополнительной терапией к обычному лечению этого состояния. Состав вводится парентерально.

Это влияние будет проверяться на ткани, отбираемой до и через разное время после повреждения баллонным катетером. Более быстрое заживление эндотелиальной поверхности будет наблюдаться с по

- 67 007792 мощью обычного микроскопа. Будет наблюдаться также усиление коммуникации по щелевому соединению.

(Артериосклероз, тромбоцитоз, сосудистая биология, 1997 г.; 17:3174-84). Обработка веществами, открывающими щелевое соединение, ускоряет процесс заживления.

Профилактическое влияние обработки веществом, открывающим щелевые соединения, например, Химическим соединением 2 и химическим соединением 40, будет проверяться на экспериментальной установке, как описано у авторов: Ие Х.И., Лупу Ф., Дюпон Е., Северс Н.Дж. (Ае11 Н.Г, Ьири Е., ИироШ Е., 8еуегк N.1.) Артериосклероз, тромбоцитоз, сосудистая биология, 1997 г.; 17:3174-84. Химическое соединение 2 или химическое соединение 40 будет применяться перед вмешательством с использованием баллона с дозировкой в диапазоне от 10^-11 до 10^-8 в зависимости от биологической кинетики химического соединения как определено, например, в модели аритмии, вызванной хлоридом кальция, описанной выше. Ткань отбирается до и в разное время после поражения балонным катетером. Более быстрое заживление эндотелиальной поверхности будет наблюдаться с помощью обычного микроскопа. Будет наблюдаться также усиление коммуникации по щелевому соединению.

Химическое соединение будет вводиться, например, парентерально.

При другом заболевании нарушается коммуникация по щелевому соединению между клетками гладкой мускулатуры. При Согрик сауетокит посредством щелевого соединения образуется синцитальная клеточная сеть, которая критична к эректильной функции, и отвечает за то, чтобы корпоральные и артериальные клетки гладкой мускулатуры полового члена реагировали одинаково и скоординированно: Крист Г.Дж. (С11П81 О) Международный журнал исследований половой слабости (ΊηΙ ΐ Биро! Век), 2000 г.; 12 приложение 4: 815-25; Мелман А., Крист Г.Дж. (Ме1тап А, С’Ннк! О) Урологическая клиника Северной Америки (Иго1од С1ш №г111 Атенса), 2001 г.; 28: 217-31. Нарушение эректильной функции замечено при диабете, артериосклерозе, различных неврологических болезнях и многих хронических болезнях. Исходя из исследований при диабете можно сделать вывод, что обратная корреляция между иннервацией нервов и купированием клеток указывает на потенциальную функциональную пластичность корпоральной среды, хотя не устанавливает функциональную межклеточную коммуникацию по щелевому соединению.

Обработка химическим соединением, которое способствует открытию щелевого соединения, улучшает коммуникацию по щелевому соединению и таким образом подвергает нормализации сложную координацию между клетками гладкой мускулатуры в согрик сауетокит и сосудах. Корпоративные гладкие клетки, которые брались у крыс, устанавливались как описано у авторов: Крист Г. Дж., Морено А.П., Мелман А., Спрей Д.С. (С’1нк1 О, Могепо АР, Ме1тап А, 8ргау ИС) Американский журнал физиологии (Ат 1 Рйукю1), 1992 г.; 263: С373-83. Коммуникация по щелевому соединению измеряется с помощью Желтого Люцифера, или с помощью микроинъекции другого флуоресцентного красителя, как описано выше, или способа ЕАС8, описанного Джаал М.Х. (1ии1 МН) и др. Коммуникация при клеточной адгезии (Се11 АбНек Согптип), 2000 г.; 7 (6); 501-12. Количество флуоресцентных клеток считается при действии различных ингибиторов щелевых соединений при обработке различными дозами (или без таковой) веществ, открывающих щелевые соединения, например, с помощью Химического соединения 2 или Химического соединения 40 в диапазоне 10^-10-10^-8 нМ. После воздействия веществами, открывающими щелевые соединения, упомянутой концентрации идентифицируется улучшение коммуникации по щелевому соединению более чем на 25-50%.

Ш у1уо фармакологическое испытание влияния химических соединений на эректильную функцию крыс (8 недель) будет проводиться спустя 10 недель после диабета, стимулированного срептозотоцином (35 мг/кг внутрибрюшинно), как описано у авторов: Реман Дж., Чевен Е., Бринк П., Петерсеон В., Уалкотт Б., Уен Ю.П., Мелман А., Крист Г. (Вейтаи 1, Сйеуеп Е, Вгтк Р, Ре1егкеон В, Аа1со11 В, Аен ΥΕ, Ме1тап А, С’Ннк! С) Журнал физиологии, 1997 г.; 272: Н1960-71. Рефлексы полового члена и давление внутри каверн измерялись при местном и системном введении различных доз различных веществ, открывающих щелевые соединения, способами, описанными той же самой группой исследователей. Будет наблюдаться усиление рефлексов полового члена и давления внутри каверн на 25% или выше.

Лечение эректильной дисфункции может применяться или локально в пещеристое тело полового члена, в виде подкожной инъекции, или перорально. Лечение будет проводиться либо как монотерапия, либо в виде дополнительного к обычному лечению этого состояния.

Диабетическая ретинопатия может быть диагностирована на очень раннем этапе после начала болезни путем идентификации изменения в скорости кровотока (Бурселл С.-В., Клермон А.С., Шиба Т., Кинг Г.Л. (Вигке11 8-У, С’1егтоп1 АС, 81иЬа Т, Ктд СЬ) Исследования по офтальмологии (Сигг Еуе Век), 1992 г.; 11; 287-95), идентификации распада гематоретинального барьера (Чунха-Ваз Дж.Г., Фариа де Абру Дж.Р., Кампос А.Дж., Фиго Г.М. (СинНа-Уах 1С, Рапа бе АЬги 1В, Сатрок А1, Идо СМ) Британский журнал офтальмологии (Вг 1 ОрйИа1то1), 1975 г.; 59: 649-56), Кармо А., Рамос П., Райс А., Проенца Р., Кунха-Ваз Дж.Г. (Сагто А, Ваток Р, Ве1к А, Ргоенса В, СинНа-Уах 1С) Экспериментальные исследования по офтальмологии (Ехр Еуе Век), 1998 г.; 67; 569-75), и/или идентификации потери саморегуляции (Конер Е.М., Пател В., Рассам С.М.Б. (Койиег ЕМ, Ра!е1 У, Ваккат 8МВ), Диабет (П1аЬе1ек), 1995 г.; 44: 603-607). Как при использовании медода переноса индикатора, так и метода фиксации потенциала

- 68 007792 двойных клеток (пэтч-кламп) авторы Оку X., Кода Т., Сакагами К., Пуро Д.Г. (Оки Н, Коба Т, 8акадат1 К, Риго ЭС). Офтальмологические исследования. Наука о зрении (Рюек! Орй1йа1то1 8с1), 2001 г.; 42: 1915-1920, продемонстрировали наличие обширного купирования клеток. Закрытие канальцев щелевого соединения разрывает многоклеточную организацию микрососуда сетчатки и вносить вклад в диабетическую дисфункцию сосудов сетчатки. Авторы Жоу З.И., Сугавара К., Хаши Р., Муратомо К., Маватари К., Мацукава Т., Лиу З.У., Девадас М., Като С. (Ζΐιοιι Ζ.Υ., 8ида^ага К., НакЫ К., Мигато1о К., Ма\\'а1ап К., Ма18ика\\'а Т., Ьш Ζ.\ν., Эеуабак М., Ка1о 8.), Невронаука (Nеи^οκ^еηсе), 2001 г.; 102: 95967, также продемонстрировали, что химически активный кислород участвует в разрыве купирования клеток с помощью щелевого соединения в сетчатке и при повторном купировании при поступлении глютатиона.

Будет изучаться ίη νίΐτο влияние веществ, открывающих щелевые соединения, на диабетическую ретинопатию модельных крыс с диабетом, вызываемым стрептозотоцином. Только что выделенный ретинальный микрососуд (Сакагами К., Ву Д.М., Пуро Д.Г. (8акадат1 К., Уи Э.М., Риго Э.С.), Журнал физиологии (1 Р11укю1) (Лондон), 1999 г.; 521: 637-50) помещается на покровное стекло, как описано у авторов: Оку X., Кода Т., Сакагами К., Пуро Д.Г. (Оки Н, Коба Т, 8акадат1 К, Риго ОС) Офтальмологические исследования (Рюек! Ор11а1то1 8с1), 2001 г.; 42: 1915-1920. Межклеточная коммуникация между клетками стенки сосуда будет измеряться либо с помощью красителя, либо радиоактивным индикатором. Будет исследоваться влияние различных концентраций веществ, открывающих щелевые соединения (Химическое соединение 2 или Химическое соединение 40) в диапазоне 10^-10-10^-7 М, и в диабетической сетчатке будет наблюдаться значительное усиление межклеточной коммуникации по сравнению с базовой. Подобные улучшения будут наблюдаться и при сравнении с контрольной группой (здоровые животные). Лечение с помощью вещества, открывающего щелевые соединения, остановит или замедлит развитие этого состояния. Лечение будет системно, локально или перорально. Желательно, чтобы данная терапия была дополнением к обычному антидиабетическому лечению.

При обработке веществом, открывающим щелевые соединения, улучшения касаются не только диабетической ретинопатии, но также и других сосудистых нарушений в сетчатке, например, артериосклероза. Было продемонстрировано, что щелевое соединение купирует горизонтальные клетки и отвечает за электрическое купирование нейронов (Равиола Е., Гилула Н.Б. (Ка\ю1а Е, С11и1а ΝΒ.), Труды Академии естественных наук США (Ргос №11 Асаб 8с1 И8А), 1975 г.; 65: 192-222; Равиола Е., Даше Р.Ф. (Каую1а Е., Оасйеих К.Е.), Журнал нейроцитологии (1 №игосу1о1), 1990 г.; 19: 731-36; Шневайс Д.М., Шнапф Дж.Л. (8с1тее\\'е15 О.М., 8с1тарГ 1Ь.), Наука (8с^еηсе), 1995 г.; 268: 1053-56). Кроме того, показана передача скотопических сигналов между палочками и колбочками по щелевому соединению (Блафильд С.А., Даше Р.Ф. (В1ооРе1б 8А, ЭасНеих КЕ), Исследование сетчатки глаза (Ке1та1 Еуе Кек), 2001 г.; 20: 351-384). Поэтому вещество, открывающее щелевые соединения, не только усиливает коммуникацию между нейронами, но способно также и обходить менее витальные палочки или колбочки и все еще переносить скотопический сигнал к глазному нерву.

Влияние веществ, открывающих щелевые соединения, на артериосклеротическую ретинопатию, стимулированную диетой, будет изучен ίη νίΐτο с использованием модели крысы (недиабетической), как описано выше. Межклеточная коммуникация между клетками в стенке сосуда измеряется либо с помощью способа переноса красителя Желтый Люцифер после микроинъекции, либо с помощью способа ЕАС8. Будут испытываться различные концентрации веществ, открывающих щелевые соединения - химического соединения 2 или химического соединения 40, в диапазоне 10^-10-10^-7М, и будет наблюдаться значительное усиление межклеточной коммуникации по сравнению с базовой. Подобное улучшение наблюдается и при сравнении с контрольной группой (здоровые животные).

Химическое соединение будет применяться парентерально.

Гладкая мускулатура мочевого пузыря характеризуется фазовыми сокращениями и демонстрирует спонтанные фазовые сокращения. Однако мочевой пузырь, находящийся в здоровом состоянии, способен вмещать несколько сотен миллилитров мочи, не проявляя при этом роста давления внутри пузаря. В отличие от нормального мочевого пузыря неустойчивые мочевые пузыри проявляют спонтанный рост давления внутри пузыря, что связано с недержанием мочи (Тернер У.Х., Брэйдинг А.Ф. (Титег УН, Вгабтд АВ), Фармакология и терапия (Р1агтасо1 Тйегар), 1997 г.; 75; 77-110). В отличие от желудочнокишечной гладкой мускулатурой, гладкая мускулатуры мочевого пузыря спонтанно не генерирует скоординированные сокращения (Стевенс Р.Дж., Уайнерт Дж.С, Паблковер Н.Г. (8ΐеνеη8 К1, Уешей 18, РнЫсоуег ΝΟ), Американский журнал физиологии (Ат 1 Р1укю1), 199; 2777: С448-60; Хашитани X., Фукута X., Такано X., Клемм М.Ф., Сузуки X. (НакРйаш Н, Еики1а Н, Такано Н, К1етт МЕ, 8ιιζι.ι1<ί Н), Журнал физиологии (1 Р1укю1), 2001 г.; 530; 273-86). Недавно были продемонстрированы как электрические, так и морфологические коммуникации по щелевому соединению между клетками гладкой мускулатуры мочевого пузыря (Хашитани X., Фукута X., Такано X., Клемм М.Ф., Сузуки X. (Накййаш Н, Еики1а Н, Такало Н, К1етт МЕ, 8ιιζι.ι1<ί Н), Журнал физиологии (1 Р1укю1), 2001 г.; 530; 273-86), Уанг Х.-З., Ли С.У., Дэй Н.С., Крист Г.Дж. (Уамд Н^., Ьее 8.У., Эау Ν.8., С1пк1 С.Е), Урология (иго1оду), 2001 г.; приложение 6А: 111). Важность этих щелевых соединений была продемонстрирована специфическим ингибированием коммуникации. По щелевому соединению распространяются волны спонтанно

- 69 007792 го возбуждения гладкой мускулатуры мочевого пузыря. Поэтому неконтролируемое недержание мочи регулируется путем обработки веществом, открывающим щелевые соединения.

Улучшение коммуникации по щелевому соединению после обработки веществом, открывающим щелевые соединения, изучается на примере клеточной культуры гладкой мускулатуры, полученной из мочевого пузыря с использованием анализа ΕΑΟ8. Химическое соединение будет подаваться дозированно с концентрацией в пределах от 10^-10 до 10^-7 М, и значительное усиление коммуникации будет обнаружено в клеточной культуре при низком содержании кислорода или кислородном напряжении.

Давление внутри мочевого пузыря будет измеряться после предварительной обработки и текущей обработки веществом, открывающим щелевые соединения, предпочтительно химическим соединением 2 или химическим соединением 40, нормальных морских свинок и животных с экспериментально нарушенной функцией мочевого пузыря. Животные находятся под наркозом, введенным фенобарбиталом, а мочевой пузырь катетеризован как мочевым катетером, позволяющим воде входить и выходить, так и катетером с датчиком на конце. Вещество, открывающее щелевые соединения, не будет изменять нормальное соотношение объем/давление по мере того как это соотношение будет нормализоваться в возмущенном мочевом пузыре.

Вещество будет вводиться парентерально, перорально или в мочевой пузырь. Вещество будет вводиться дополнительно к лечению препаратами, предназначенными для нормализации сокращений мускулатуры мочевого пузыря.

Миоэпителиальные клетки, находящиеся в протоках подчелюстных желез, в мочеиспускательном канале, в протоках желчного пузыря, панкреатических протоках, протоках слез связаны с щелевыми соединениями, и межклеточная коммуникация важна для синхронизации функции сжатия миоэпителиальных клеток (Таугнер Р., Шиллер Α. (Таидпег К, 8сЫ11ег Α.) Исследование клеточной ткани (Се11 Т155ие Кек), 1980 г.; 206: 65-72). Нарушение сокращаемости этих проток может быть нормализовано обработкой веществом, открывающим щелевые соединения, вводимым либо парентерально, либо перорально.

В кардиотоническом атриовентикулярном узле межклеточная коммуникация поддерживается с помощью щелевых соединений. Понижение функции приводит к снижению проводимости и может приводить к общей атриовентикулярной блокаде. Атриовентикулярная блокада наблюдается при остром инфаркте миокарда, при ишемической болезни сердца, дигиталисной интоксикации, интоксикации блокатором кальциевых каналов, и вещество, открывающее щелевые соединения, улучшает атриовентикулярную проводимость.

Внутривенное вливание СаС1₂ (100 мг/кг/мин) мышам после нейролептанестезии, вызывало атриовентикулярную блокаду 2-й степени. В случае предварительной обработки веществом, открывающим щелевые соединения, вводимым внутривенно в дозах 10^-11-10^-6 моль/кг, доза СаС1₂ значительно увеличивалась до наступления атриовентикулярной блокировки. Другим средством влияния было увеличение нехватки времени на 30-65 %, до тех пор, пока СаС12 не вызывал атриовентикулярную блокаду 2-й степени. Введение атриовентикулярной блокады с помощью СаС1₂ описано в работе авторов: Ронсберг М., Саундерс Т.К., Чан П.С., Червони П. (К0П5Ьегд Μ., 8аипйег5 ТК, СНап Ρ8, Сегу0ш Ρ), Медицинская наука (Уес! δα), 1986 г.; 14; 350-51.

Изменение степени атриовентикулярной блокады, что усиливает коммуникацию по щелевому соединению, нормализует атриовентикулярную проводимость и восстанавливает нормальный синусовый ритм.

Введение вещества, открывающего щелевые соединения, должно выполняться либо парентерально, либо перорально.

Влияние веществ, открывающих щелевые соединения, на катаракту

Хрусталик глаза позвоночных -это твердый пузырь из клеток, который растет в течение всей жизни путем дополнения новых клеток на поверхности. Старшие клетки, захороненные под более новыми поколениями, дифференцируются в длинные, призматические волокна, теряя свои клеточные органеллы и наполняя свои цитоплазмы растворимыми белками, кристаллинами, высоких концентраций. Долговечные волокна хрусталика связаны посредством щелевых соединений как друг с другом, так и с предшествующим слоем простых кубовидных эпителиальных клеток на поверхности хрусталиков. Эта сеть щелевых соединений соединяет клетки хрусталика в соклетие относительно малых молекул, обеспечивающих метаболическую кооперацию: межклеточная диффузия ионов, метаболитов и воды. В контакте с питательными веществами на поверхности хрусталиков эпителиальные клетки удерживают свои клеточные органеллы и способны предоставлять свою энергию метаболизма для сохранения правильных концентраций ионов и метаболитов в пределах цитоплазм волокон хрусталиков так, что кристаллины остаются в растворе и не агрегируют (катаракта). В хрусталике присутствуют три вида коннексинов: Сх43, Сх46 и Сх50 и мутации в каждом из этих белков щелевого соединения связаны с катарактой^179-81]. Эти результаты демонстрируют, что МКЩС играет существенную роль в нормальном метаболизме и функции хрусталика. Поэтому мы предполагаем, что вещества по настоящему изобретению, которые, как известно, усиливают МКЩС, могут использоваться при профилактике и/или лечении катаракты.

Канальцы щелевых соединений, которые формируются коннексинами Сх46 и Сх50, обеспечивают проводящие пути коммуникации между волоконными клетками в нормальном прозрачном хрусталике. У

- 70 007792 нокаутных мышей, которые лишены этих коннексинов, развиваются ядерные катаракты, которые связаны с протеолизом кристаллинов. Это исследование установило важность щелевых соединений в поддержании нормальной прозрачности хрусталика путем предоставления межклеточного канала передачи сигналов или структурного компонента для соответствующей организации мембран хрусталиков и цитоплазматических белков (Гонг (Сопг) и др. Клетка (Се11), 1997 г., 12 декабря; 91 (6):833-43). Повышенная внутриклеточная концентрация кальция - главный стимул для активации кальций-зависимой протеазы цистеина Ьр82, которая является ключевым инициатором процесса катарактогенеза (Баруч (Вагисй) и др., Журнал биологической химии (1 Вю1 Сйет), 2001 г.; 276 (31); 28999-9006). Для исследования способности Химических соединений 2 и 40 по настоящему изобретению предотвращать катаракту, проверялось влияние упомянутых соединений (10^-10-10^-6 моль/л) на модельные культивируемые клетки хрусталика овцы, описанные Черчиллем (СйигсЫ11) и др. Журнал науки о клетке (1 Се11 8а), 1996 г.; 109 (часть 2):355-65. Короче говоря, с использованием Са(2+)-репортера-красителя фура-2 и флюоресценной микроскопии исследовалась межклеточная передача сигналов Са2+ в первичных культурах эпителиальных клеток овцы. Механическая стимуляция отдельной клетки микропипеткой инициирует распространяемое увеличение цитозольного свободного Са2+, который распространяется от стимулируемой клетки через 2-8 уровней окружающих клеток. Мы ожидаем, что химические соединения 2 и 40 по настоящему изобретению усилят купирование волоконных клеток хрусталика и предотвратят катаракту.

Вводиться состав будет местно.

Таким образом, целью настоящего изобретения являются химические соединения для приготовления лекарственных средств, применяемых при профилактике и/или лечении катаракты. Эта цель достигается с помощью пептидных соединений по настоящему изобретению типа химических соединений по формулам Ι-νΙΙΙ, формулам 2-12, и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в частности химических соединений из примеров синтеза 1-55.

Влияние веществ, открывающих щелевые соединения, на болезни ушей

Было обнаружено много различных мутаций Сх32 при наследственном Х-сцепленном синдроме периферической невропатической глухоты Шарко-Мари-Тут (Сйагсо1-Мапе-Тоо£Ь), и несколько мутаций Сх26 и Сх31 были обнаружены при глухоте¹⁸⁰¹. Таким образом, мы предполагаем, что вещества по настоящему изобретению, которые, как известно, усиливают МКЩС, могут использоваться при профилактике и/или лечении некоторых видов глухоты, которые связаны с ухудшенной МКЩС в ухе. Таким образом, целью настоящего изобретения являются химические соединения для приготовления лекарственных средств, применяемых при профилактике и/или лечении глухоты, связанной с ухудшенной МКЩС. Эта цель достигается с помощью пептидных соединений по настоящему изобретению типа химических соединений по формулам Ι-νΙΙΙ, формулам 2-12, и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в частности, химических соединений из примеров синтеза 1-55 и химических соединений из табл. 8, табл. 1 и по фор. Ι-νΙΙΙ.

Роль веществ, открывающих щелевые соединения, в кишечнике

Стенка тонкой кишки^Г82- экспрессирует как Сх43, так и Сх45. Предполагается, что клетки, экспресирующие Сх45 вдоль глубокого мышечного сплетения тонкой кишки, вероятно, действуют как составляющая системы кардиостимулятора, которая может включать систему проводимости путем формирования клеточной сети, работающей через определенные типы щелевых соединений. В тонком кишечнике и в толстом кишечнике интерстициоциты Са_)а1 (ИС) являются клетками кардиостимулятора, расположенными между гладкой мускулатурой кишечника; они генерируют спонтанные медленные волны слоев гладкой мускулатуры и участвуют в нейропередаче. Трехмерная клеточная сеть ИС образует связи с помощью щелевых соединений Сх43 как между ИС, так и между ИС и клетками гладкой мускулатуры¹⁸³’¹. У больных с болезнью Хиршспранга отсутствие экспрессии Сх43 в аганглиозной кишке предполагает, что ослабленная межклеточная коммуникация между ИС и клетками гладкой мускулатуры может частично быть ответственна за дисфункцию подвижности при этом заболевании¹-^83-. У пациентов с болезнью Чагаса (вследствие инфекции трипаносомы Ο'πιζίί) отмечено сокращение экспрессии Сх, которая, как считают, отвечает как за кардиомиопатию, так и за сильно расширенный мегаколон, наблюдаемый у этих пациентов^Г7]. Таким образом, нормальная коммуникация по щелевому соединению между ИС и между ИС и клетками гладкой мускулатуры считается важной для нормальной подвижности тонкого кишечника и толстого кишечника. Поэтому другой целью настоящего изобретения является вещество, которое увеличивает проводимость щелевого соединения в кишечнике и поэтому может быть полезно при лечении нарушений двигательной активности желудочно-кишечного тракта.

Репродуктивные органы и щелевое соединение

Яичники

Щелевые соединения между зернистыми клетками и между яйцеклеткой и окружающими зернистыми клетками играют важную роль при развитии фолликула яичника. При рождении, яичник содержит первичные фолликулы, состоящие из мейотически взвешенных яйцеклеток, окруженных отдельным слоем поддерживающих (зернистых) клеток. Периодически субпопуляции первиных фолликулов проходят дальнейшее развитие, во время которого яйцеклетка увеличивается в размере, и зернистые клетки распространяются, слоятся и развиваются в заполненный жидкостью антральный отдел желудка. После ову

- 71 007792 ляции, яйцеклетки возобновляют мейоз и зернистые клетки, сохраненные в фолликуле, дифференцируются в стероидогенные клетки, формируя таким образом согриз 1и1еит (желтое тело).

Щелевые соединения напрямую соединяют смежные клетки, обеспечивая тем самым диффузионное движение ионов, метаболитов, и других важных молекул, передающих сигналы о потенциале, для регуляции овариального цикла и фертильности женщины. В поддержку важной роли щелевых соединений для обеспечения нормальной функции яичника, было продемонстрировано, что незрелые фолликулы мышей с дефицитом Сх37 (О^ааГϊаη) не могут овулировать и формировать многочисленные неадекватные желтые тела. Кроме того, обеспечена блокировка развития яйцеклетки перед мейотической компетентностью. Таким образом, межклеточная передача сигналов через межклеточные канальцы критически регулирует высоко скоординированный набор клеточных взаимодействий, необходимых для успешного овогенеза и овуляции¹⁸''¹¹.

Фолликулстимулирующий гормон (Р8Н) является главным регулятором роста и развития овариального фолликула. Помимо воздействия на созревание фолликул Р8Н улучшает купирование зернистых клеток, и это усиливает экспрессию гена Сх43 и, возможно, формирование новых щелевых соединений¹-⁸⁵-¹. С другой стороны, лютеинизирующий гормон (ЬН) прерывает межклеточную коммуникацию в пределах овариального фолликула, что приводит к уменьшению концентраций цАМФ внутри яйцеклетки, после чего следует возобновление мейоза^[86].

Эти данные иллюстрируют, что наличие нормальной коммуникации по щелевому соединению через Сх37 и Сх43 является существенным для нормального фолликулярного роста и овуляции. Таким образом, вероятно, что некоторые формы женского бесплодия являются следствием недостаточного купирования клеток в яичниках. Поэтому вещество, которое увеличивает купирование клеток, может использоваться для лечения женского бесплодия у женщин с ослабленной экспрессией и/или нарушенным регуляции овариальной функции щелевого соединения. Химические соединения по настоящему изобретению, способные усиливать МКЩС, полезны при лечении женского бесплодия, которое является следствием ослабленного купирования клеток в яичниках.

Матка

Мощные синхронные сокращения матки при родах зависят от электрического купирования клеток гладкой мускулатуры миометрия с помощью щелевого соединения. У людей и других млекопитающих в миометрии небеременной матки находится недостатоное количество щелевых соединений, но их число становится обильным к сроку и/или с началом родов. Преобладающим белком щелевого соединения, экспрессируемым клетками гладкой мускулатуры миометрита человека, является Сх43, но в миометрии^[87-88] человека были также идентифицированы и Сх26, Сх40 и Сх45.

Вследствие того, что при родах очень важно, чтобы сокращения мускулатуры были скоординированными, другой целью настоящего изобретения является вещество, которое усиливает купирование клеток в миометрии, что, как ожидается, будет иметь положительное влияние на синхронизацию сокращений мускулатуры, и упомянутое вещество может использоваться наряду с окситоцином для стимуляции и облегчения родов. Упомянутая цель достигается с помощью пептидных соединений по настоящему изобретению типа химических соединений по формулам ГЩП, формулам 2-12, и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в частности, химических соединений из примеров синтеза 1-55 и химических соединений из табл. 8, табл. 1, и по формулам ГЩП, и настоящее изобретение также относится к использованию пептидных соединений по настоящему изобретению для приготовления лекарственных средств для стимуляции и облегчения родов.

Авторы Хуидобро-Торо Дж.П., Гонзалез Р., Варас Дж.А., Рамер А., Гонзалез Р. (НшбоЬго-Того 1Р, ΟοηζηΠζ К, ν;·ιπΐ3 1А, КаГтет А, ΟοηζηΠζ К), Обозрение детской медицины (Кет Меб СЫ1), октябрь 2001 г.; 129 (10):1105-12, оценили существование механизмов кардиостимулятора, связанных с ритмичной моторной активностью плацентарных кровеносных сосудов человека, и обнаружили, что блокада щелевых соединений снижает частоту и амплитуду спонтанных сокращений. Они заключили, что ритмичные сокращения в кольцевом слое хориального и пупочного сосудов запускаются клетками кардиостимулятора, расположенными в кольцевом слое гладкой мускулатуры кровеносных сосудов и распространяются по щелевому соединению; они, вероятно, вносят вклад в регуляции кровотока. Таким образом, другой целью настоящего изобретения является вещество, которое усиливает купирование клеток в плацентарных кровеносных сосудах, что, как ожидается, будет иметь положительное влияние на плацентарное кровообращение и развитие плода. Упомянутая цель достигается с помощью пептидных соединений по настоящему изобретению типа химических соединений по формулам ГЩП, формулам 2-12, и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в частности, химических соединений из примеров синтеза 1-55 и химических соединений из табл.8, табл. 1 и по формулам Σ-νΠ и настоящее изобретение также относится к использованию пептидных соединений по настоящему изобретению для приготовления лекарственных средств, используемых при лечении ослабленного плацентарного кровообращения.

Мужские репродуктивные органы

Сх43-самый обильный коннексин в яичке, и интересно, что крыса с пониженной экспрессией Сх43 обладает ослабленным сперматогенезом (еЬо/еЬо, цт-б-/-. Сх43 +/-тке)^[89]. Кроме того, в ранних работах выдвигалось предположение, что у пациентов, страдающих гипосперматогенезом или аспермией, коли

- 72 007792 чество щелевых соединений в яичках уменьшено^[90]. Эти данные поддерживают предложение, что ухудшенное купирование клеток в яичках может приводить к мужскому бесплодию, и поэтому другой целью настоящего изобретения является вещество, которое усиливает купирование клеток и, таким образом, может быть полезно при лечении мужского бесплодия, связанного с ухудшенным купированием клеток.

Роль щелевых соединений поджелудочной железы

Канальцы щелевых соединений, выполненные из Сх43, функционально соединяют чувствительные к глюкозе клетки панкреатических островков и линии клеток инсулиномы крысы^[91]. Напротив, клетки нескольких клеточных линий, выделяющих инсулин неправильно, не экспрессируют Сх43, имеют немного щелевых соединений, и плохо купированы. После исправления этих дефектов стабильной трансфекцией Сх43 цДНК, клетки, экспрессирующие умеренные уровни Сх43 и связи, как наблюдалось в нативных бета-клетках, показали экспрессию гена инсулина и содержание инсулина, которые заметно выше уровня, наблюдаемого как у клеток дикого типа (с нарушенной связью), так и у трансфицированных клеток, экспрессирующих повышенное количество Сх43. Эти результаты показывают, что соответствующее купирование Сх43 необходимо для соответствующего производства и хранения инсулина^[91]. Кроме того, ш νί\Ό стимуляция высвобождения инсулина глибенкламидом связана с повышенной экспрессией Сх43 и усиленным купированием соседних β-клеток в пределах панкреатического островка^[92].

Для исследования влияния химического соединения 2 и химического соединения 40 на инсулиннезависимый сахарный диабет используется 6-16-недельный ЙЬ/ЙЬ. Животные (3 мыши на клетку) находились в контролируемых условиях окружающей среды (20°С, влажность 55-75%) с циклом освещение/затемнение (12/12 ч) с включением света в 6 ч утра. Животные находились на стандартной диете Алтромин № 1324 со свободным доступом к водопроводной воде. Все животные акклиматизировались в течение по крайней мере одной недели и использовались ежедневно в течение двух дней до первого испытания на переносимость глюкозы, вводимой перорально. Кроме того, для снижения резкого увеличения содержания глюкозы, вызванного стрессом, животные подвергнались по крайней мере одному испытанию на переносимость глюкозы, вводимой перорально, без химического соединения как описано ниже до эксперимента.

Пептиды растворялись в забуференном фосфатном соляном растворе (РВ8) концентрацией 0,1 М с 0,1% бычего альбумина, с уровнем рН, доводимым до 7,4, путем добавления 5 М №1ОН. Все растворы приготавливались свежими с утра непосредственно перед экспериментом. Химические соединения вводятся парентерально в дозах 10^-10-10^-6 моль/кг. Животным, которым давался носитель, РВ8 давался только с одним альбумином, концентрацией 0,1%.

Животным не давали есть в течение 17 ч перед испытанием на переносимость глюкозы. Начиная с 9.00 ч из конца хвоста бралась кровь (ΐ = -15 мин) и измерялось содержание глюкозы в крови. Способом иммобилизированной оксидазы глюкозы анализировалась концентрация глюкозы в цельной крови (мМ) (<5 мл, автоанализатор Элит, компания Байер, Дания). Животные с очень высокой концентрацией глюкозы в крови утром в день эксперимента (> 10,5 мМ) исключались из эксперимента. Сразу же после взятия начальной пробы крови животным внутрибрюшинно вводилась инъекция носителя или различных доз химического соединения. Спустя пятнадцать мин после внутрибрюшинного введения вещества в воде (200 мл на 50 массы тела) растворялась доза глюкозы концентрацией 1 г/кг и вводилась перорально или внутрибрюшинно и животные возвращались в свои домашние клетки (ΐ = 0). Уровни содержания глюкозы в крови измерялись через ΐ=30 мин, ΐ=60 мин, ΐ=120 мин и ΐ=240 мин. Животным не давали есть в течение всего периода наблюдения.

Для анализа влияния химических соединений на переносимость глюкозы рассчитывалась абсолютная и относительная разница в содержании глюкозы в крови относительно базового уровня (1=0) для каждого момента времени после нагрузки глюкозой. Область под кривой (АИС) для целого эксперимента (АИС0-240 мин) определялась с использованием способа трапеций. Таким образом, получаем два набора со значением АИС0-240 мин: один на основе абсолютных значений содержания глюкозы в крови (единица: мМ х мин), а другой на основе относительного изменения содержания глюкозы в крови (единица: % х мин).

Мы предсказываем, что химические соединения 2 и 40 по настоящему изобретению снизят повышенный уровень глюкозы в крови в ответ на нагрузку глюкозой у мышей ЙЬ/ЙЬ.

Вводиться соединения будут перорально или парентерально.

В этих наблюдениях показана важная роль купирования панкреатических островных β-клеток с помощью щелевого соединения для продуцирования и высвобождения инсулина. Таким образом, еще одна цель настоящего изобретения состоит в получении вещества, которое усиливает межклеточную коммуникацию по щелевому соединению и/или электрическую проводимость щелевых соединений и, таким образом, улучшает переносимость глюкозы у субъектов с инсулиннезависимым сахарным диабетом. Упомянутая цель достигается с помощью пептидных соединений по настоящему изобретению, типа химических соединений по формулам 1-УШ, формулам 2-12, и химических соединений, представленных в таблицах 1 и 8, в частности, химических соединений из примеров синтеза 1-55.

- 73 007792

Кроме того, авторы Ито Т., Огоши К., Нагано И., Уеда Ф., Сакаи X., Кинджо М., Навата X. (Ио Т, ОдокЫ К, Nакаπо ΐ, иейа Е, Бака1 Н, Кпцо М, Ν;·ι\ν;·ιΙ;·ι Н), Поджелудочная железа (Рапсгеак), октябрь 1997 г., 15:297-303, обнаружили влияние ирзогладина на щелевые соединения при остром панкреатите у крыс, вызванном церулеином. Была обнаружена способность нормальных панкреатических гроздевидных клеток к межклеточной коммуникации по щелевому соединению, и исследована роль межклеточной коммуникации при остром панкреатите у крыс, вызванном церулеином (Сп), при использовании ирзогладина в качестве усиливающего агента межклеточной коммуникации по щелевому соединению. Острый отечный панкреатит вызывался у крыс двумя внутрибрюшинными инъекциями 40 мкг Сп на 1 кг массы. Крысы получали различные дозы (25, 50, или 100 мг на 1 кг массы тела) ирзогладина перорально за 15 и 2 ч до первой инъекции Сп. Нормальная контрольная группа получала только носитель. Степень тяжести панкреатита оценивалась ферментативными и гистологическими исследованиями через 5 ч после первой инъекции Сп. При остром панкреатите, вызванном Сп, ирзогладин значительно понижал уровень амилазы сыворотки крови, массу поджелудочной железы в сыром виде и содержание амилазы и ДНК в поджелудочной железе в зависимости от дозы. В частности, содержание амилазы стало приближено к уровню амилазы у нормальных животных контрольных групп. Как показали гистологические исследования, степень тяжести панкреатита была значительно снижена при применении ирзогладина, и в группе, с применением ирзогладина концентрацией 100 мг на 1 кг массы, не было замечено различий в вакуолизации. Иммунофлуоресцентное окрашивание поджелудочной железы антителом против коннексина 32 (Сх32; белок щелевого соединения) показало, что панкреатические доли были диффузно позитивны к Сх32 в контрольной группе, но количество позитивных к Сх32 зерен в группе с панкреатитом заметно уменьшилось до 19%. При применении ирзогладина концентрацией 100 мг на 1 кг массы количество зерен Сх32 было восстановлено до 70% от нормального значения в контрольных группах. Эти результаты показывают, что межклеточная коммуникация по щелевому соединению при панкреатите, вызванном Сп, нарушается, что может привести к распаду гомеостаза ткани и прогрессированию острого панкреатита.

Таким образом, описанные здесь пептиды полезны при лечении панкреатита. Для обоснования этого утверждения можно выполнить эксперименты на крысах с использованием упомянутого выше общего экспериментального проекта авторов Ито Т. (Ио Т) и др., 2001 г., с введением крысам химического соединения 2 и химического соединения 40 концентрацией в диапазоне 10^-11-10^-8М. Как ожидается, эти эксперименты покажут, что химическое соединение 2 и химическое соединение 40 способствуют купированию клеток с помощью щелевого соединения и противодействуют влиянию церулеина.

Пептиды вводятся внутривенно.

Влияние веществ (антиаритмических пептидов), открывающих щелевые соединения, при тромбозе

Ранее было показано, что два пептида, обладающих антиаритмической активностью, и тесно связанных с веществами по настоящему изобретению, обладают также и антитромбической активностью. Таким образом, авторы Дикшит (ЫккБП) и др.^[15] обнаружили, что пептиды С1у-Рго-Ргр-С1у-А1а-С1у и С1у-Рго-С1у-С1у-А1а-С1у предотвращали развитие легочной эмболии у мышей, при внутривенном введении дозы коллагена и адреналина. В патенте США № 4775743 описан НР5, производное пептида от ААР с последовательностью И-3-(4-гидроксифенил)пропионил-Рго-4Нур-С1у-А1а-С1у-ОН, обладающий активностью против агглютинации тромбоцитов. Химические соединения по настоящему изобретению очень похожи на них, и вероятно, что они также могут демонстрировать подобное влияние на тромбоз. Таким образом, вещества по настоящему изобретению могут использоваться при профилактике тромбоза.

Иммунология

Межклеточные взаимодействия являются критическими для созревания и активации лимфоцитов. Широкий диапазон мембранных молекул гарантирует межклеточную спайку и обеспечивает передачу сигналов между клетками во время миграции и активации клетки в иммунной системе. Циркулирующие лимфоциты Т, В и ИК человека экспрессируют Сх43 и с использованием описаных выше способов окрашивания было показано наличие активных щелевых соединений между клетками. Было также продемонстрировано, что ухудшение купирования клеток с помощью щелевого соединения заметно уменьшает выделение 1§М, ΐ§Ο и 1§А, что указывает на то, что межклеточная передача сигналов по щелевому соединению являются важной составляющей механизмов, лежащих в основе метаболической кооперации в иммунной системе (Овиедо-Орта Е., Хоу Т., Эванс У.Х. (О\зейо-Ог1а Е, Ноу Т, Еуапк ^Н), Иммунология Цттцпокду), 2000 г.; 99: 578-90), Овиедо-Орта Е., Гаск П., Эванс У.Х. (Оу1ейо-ОПа Е, Саксще Р, Еуапк №Н) (ЕАБЕВ. 2001 г.; 15:768-774).

Независимо от этиологии при подостром или хроническом воспалении желательно местное увеличение синтеза иммуноглобулина. Воспаленная ткань часто отличается от нормальной здоровой ткани и низкий кислородный потенциал приводит к разрыву межклеточной коммуникации по щелевому соединению. Исходя из предположения, что кислородный потенциал является универсальным регулятором МКЩС для нескольких различных систем клеток было продемонстрировано, что низкое содержание кислорода имеет существенное значение для нарушения купирования с помощью МКЩС.

При нормальных атмосферных условиях и условиях питания снижение содержания кислорода и глюкозы в первичных культурах кардиомиоцитов желудочков новорожденной крысы приводит к сниже

- 74 007792 нию вызываемой норадреналином стимуляции метаболизма фосфоинозитола приблизительно до уровня 50%. Было показано, что модификатор щелевых соединений - химическое соединение 2, нормализует эту нарушенную, вызываемую норадреналином стимуляцию метаболизма фосфоинозитола при снижении содержания кислорода и глюкозы, и повышает метаболизм фосфоинозитола приблизительно до 90% от нормального уровня. Кроме того, было показано, что химическое соединение 2 не изменяет вызываемый норадреналином уровень метаболизма фосфоинозитола при нормальных атмосферных условиях и нормальном питании (Майер Е., Бек М.М. (Ме1ег, Е и Веск, М М): Ζ842-0123 усиливает вызываемую норэпинефрином метаболизм фосфоинозитола в культивируемых кардиомиоцитах при метаболическом стрессе. Международная Конференция по щелевым соединениям, 4-9 августа 2001, Гавайи, США, реферат № 132). Как в культивируемых культурах остеобласта человека, так и в линии клеток остеогенной саркомы крысы, гипоксия приводит к снижению распространения волн кальция внутри клеток, что было получено измерением переноса красителя после инъекции Желтого Люцифера. Это снижение могло быть полностью изменено на повышение путем обработки химическим соединением 2 (Тиелман С.С., Хенриксен З., Майер Е., Петерсен Дж.С, Соренсен О.Х., и Йорденсен Н.Р. (Тейтапи, С С, Чеппкзеп. Ζ, Ме1ег, Е, Ре1егзеп, 1 С, 8огепзеп, О Н и 1огдепзеп, Ν К): вещество, открывающее щелевые соединения Ζ842-0123, усиливает межклеточную коммуникацию в остеобластах. Международная Конференция по щелевым соединениям, 4-9 августа 2001, Гавайи, США, реферат № 176).

Вследствие разрыва купирования клеток при воспалении вещество, открывающее щелевые соединения, улучшает синтез иммуноглобулинов при воспалении.

Ш νίΙΐΌ испытание влияния веществ, открывающих щелевые соединения, на синтез иммуноглобулинов будет проводиться на стимулируемых и не стимулируемых Т- и В-лимфоцитах, выделяемых из миндалин человека и очищаемых, как описано у авторов: Овиедо-Орта Е., Гаск П., Эванс У.Х. (Ον^ебоΟγΙπ Е, 6азцие Р, Еуапз ^Η), (ЕА8ЕВ. 2001 г.; 15:768-774). Содержание иммуноглобулинов будет измеряться по методике ЕЫ8А, а щелевые соединения будут изучены с помощью анализа ЕАС8. Вещества, открывающие щелевые соединения, будут испытаны при концентрациях от 10^-10 до 10^-7 М. Ь у1уо фармакологические испытания будут выполняться на экспериментальных воспалительных моделях с использованием как не инфицированных, так и инфицированных моделей. Ш у1уо фармакологические испытания могут выполняться экспериментально на целом ряде животных моделей: 1) ингибирование отека задней лапы крысы, вызванного каррагеном (объем лапы), 2) ослабление рекрутмента клеток, вызванного каррагеном, в воздушном мешочке крыс (рекрутмент лейкоцитов и экссудаты объема), 3) ослабление вызванных стенкой клеток стрептококков артритов предплюсневого большеберцового сустава крыс (припухлость голеностопного сустава), и 4) ослабление прогрессирования вызванных коллагеном артритов у крыс (клинические признаки и припухлость сустава).

Авторы Ие П., Чаппл С.С, Кумар Р.К. и Хюнтер Н ^е Р, Сйарр1е СС, Китаг КК, и Чип1ег Н), Журнал патологии, (1 Ра!йо1), 192:58; 2000 г., сентябрь, показали, что наблюдалось сильное сокращение числа коннексинов 26 и 43 в покрове эпителия воспаленной десны, что поддерживает идею о том, что способность эпителия функционировать в качестве эффективного барьера против микробов в тканях сильно скомпрометирована при периодонтите. Таким образом, обработка воспаленной десны веществом, открывающим щелевые соединения, например, в сочетании с антибиотиком, может быть полезной при восстановлении МКЩС и заживлении эпителия.

Периферическая невропатия и нервнопатическая боль

Сообщалось, что периферическая невропатия и боль, наблюдаемые при диабете, во время диализа, при циррозе печени и многих других состояниях, относятся как к соматическим, так и к вегетативным нервам. Точные механизмы поражения периферических нервов при разных состояниях являются все еще гипотетическими, но разрушение нервного окончания, пониженная проводимость, демиелинизация и повышенная воспалительная реакция были описаны. Общим для различных состояний в экспериментах является увеличение числа свободных радикалов, увеличение содержания оксида азота, кислородный стресс и отсутствие акцепторов свободных радикалов, и сокращение коммуникации по щелевому соединению (Питре Д.А., Сайферт Дж.Л., Бауэр Дж.А. (Рйге Э.А., 8е1ГеП кЬ., Ваиег кА.), Письма по нейронауке (№игозс1 Ьей), 2001 г.; 303: 67-71), Боланос Дж.П., Медина Дж.М. (Во1апоз кР., Мебта кМ.), Журнал нейрохимии, (1 Ыеигосйет), 1996 г.; 66: 2019-9, Ло П.А, Никандер К.К. (Боте РА, №скапбег, КК), Диабет (П1аЬе1ез), 1991 г.; 40; 873-7, Леви Д., Хоук А., Зочоне Д.У. (Ьеуу Ό, Чоке А, Ζос1юпе Ό^), Письма по нейронауке (№игозс1 Ьей), 1999 г.; 260: 207-9, Бруззоне Р., Рессот С. (Вгиххопе К, Кеззо1 С), Журнал европейской нейронауки, (1 Еиг Ыеигозс1), 1997 г.; 9: 1-6).

Ш νίΙΐΌ исследования будут выполняться с использованием культур астроцитов крысы или швановских клеток и вещества, открывающие щелевые соединения, типа Химического соединения 2 и химического соединения 40, будут испытываться в клетках, нагруженных оксидом азота, как описано у авторов: Боланос Дж.П., Медина Дж.М. (Во1апоз кР, Мебта кМ), Журнал нейрохимии, (1 Ыеигосйет), 1996 г.; 66: 2019-9; с использованием нитропруссида в качестве донора на основе оксида азота (Бласитс С, Мауне С, Сантос-Сакки Л. (В1азйз 8, Маипе 8, 8ап1оз-8ассЫ Ь.) (1 РЫидегз Агсй), 2000 г.; 440; 710-12). Концентрации химических соединений будут в диапазоне 10^-10 - 10^-7 М, и зависимое от дозы открытие щелевых соединений будет измеряться с использованием анализа ЕАС8.

- 75 007792

Вводиться соединения будут парентерально.

Дефект слуха

Как известно, связаные с продуцированием свободных радикалов потеря слуха, пресбиакузис, вызванные шумом, связаны с замедлением купирования клеток Хенсена (Непкеп) и клеток Дайтерса (Оейегк) из спирального органа улитки с помощью щелевого соединения (Тодт И., Нгезахайо А., Эрнст А., Колб Х.А. (Тоб! I, КдехаНауо А, Егпк! А, Ко1Ь Н-А), Журнал биологии мембран (1 МетЬгапе Вю1), 2001 г.; 181: 107-114), (Бласитс С, Мауне С, Сантос-Сакки Дж. (В1акйк 8, Маипе 8, 8ап1ок-8ассЫ Ь.), (1 Р11идегк Агсй), 2000 г.; 440; 710-12), Лагостенка Л., Ашморе Дж.Ф., Качар Б. (Ьадойепа Ь, Акйтоге 1Е, Касйаг В), Журнал физиологии (1 Рйукю1), 2001 г.; 531: 693-707). Коммуникация по щелевому соединению между этими поддерживающими клетками улитки обеспечивает важный гомеостаз для сенсорных клеток и, таким образом, нормальную нейронную активность внешних волосковых сенсорных клеток (Джонстоун Б.М., Пантуцци Р., Сика Дж., Сикова Е. (1ойпк1опе ВМ, Рап1их/1 К, 8ука 1, 8укονа Е), Журнал физиологии (1 Рйукю1), 1989 г.; 408: 77-92). Эта коммуникация разрывается при окислительном стрессе (Тодт И., Нгезахайо А., Эрнст А., Колб Х.А. (Тоб! I, Кде/аНауо А, Егпк! А, Ко1Ь Н-А), Журнал биологии мембран (1 МетЬгапе Вю1), 2001 г.; 181: 107-114). Приобретенная или возрастная потеря слуха предотвращается при обработке химическим соединением, которое может сохранить коммуникацию по щелевому соединению в якорных клетках.

1п νίΙΐΌ испытание веществ, открывающих щелевые соединения, будет выполняться в клетках Хенсена (Непкеп) морских свинок как описано у авторов Тодт И., Нгезахайо А., Эрнст А., Колб Х.А. (Тоб! I, КдехаНауо А., Егпк! А., Ко1Ь Н.А.), Журнал биологии мембран (1 МетЬгапе Вю1), 2001 г.; 181:107-114). Будут исследованы Химическое соединение 2 или химическое соединение 40 в диапазоне концентрации 10^-10-10^-8 М, а также их влияние на состояния, связанные с кислородным стрессом и механическим стрессом. Химическое соединение будет значительно противодействовать потере купирования клеток с помощью щелевого соединения.

Крысы, получившие внутривенно вливание химического соединения 2, подвергались испытаниям ЭРОАЕ (бЩобюп ргобис! оЮасоикбс епйккюпк - отоакустические эмиссии искажений). Два тона гармонических колебаний близкие по частоте (£1 и 12) подавались к уху одновременно. Звук, испускаемый внутренним ухом, состоит из искажений, производимых внешними волосковыми сенсорными клетками. Частота самых сильных из этих искажений обычно составляет 2£1-£2. Например, если частота используемых тонов составляет 1000 Гц (11) и 1200 Гц (£2), то частота самого сильного искажения будет составлять 2x1000 - 1200, или 800 Гц. Для оценки целостности внешних волосковых сенсорных клеток может использоваться относительная интенсивность искажения (кГц), получаемая при сравнении с этими двумя гармоническими колебаниями.

Меланоциты в области клеток темноты вестибулярного аппарата сообщаются в тяжелых условиях по щелевому соединению и могут играть определенную роль в транспортировке материи между эндолимфой и перилимфой, и также могут играть важную роль в поддержании гомеостаза микросреды во внутреннем ухе (Масуда М., Усами СИ., Ямазаки К., Такуми И., Шинкава X., Курашима К. (Макиба М., икат1 8-!, Υатаζак^ К, Такит1 Υ, 8Ыпкатеа Н, КигакЫта К),

Анатомические исследования (Апа! Кес), 2001 г.; 262; 137-146). Эндолимфатическая водянка связана с различными клиническими состояниями, характеризующимися головокружением и ухудшением слуха Пониженный потенциал коммуникации по щелевому соединению может оказаться важным при регуляции трансмембранного переноса нескольких веществ, выделяемых первично или выделяемых через определенные типы переносчиков.

Возрастная анемия и трансплантация костного мозга

Существование функциональных щелевых соединений между кроветворными клетками предшественника и стромальными клетками кроветворной микросреды было в течение многих лет спорным, но теперь экспериментальным путем доказало существование коммуникации по щелевому соединению у человека (Розендаль М, Греган А., Грин С. (Кокепбаа1 М., Сгедап А, Сгееп С), Клетка Ткани (Т1ккие Се11), 1991 г.; 23: 457-470), Дюриг Дж., Розенталь С, Халмайер К., Виеманн М, Новотны Дж., Бингманн Д., Дюрзен У., Ширмахер К), Энид 1, КокепИа! С, На1£теуег К, \У|етапп М., Nονοίηу 1, Втдтапп Ό, Эигкеп и, 8сЫггтасйег К), Британский журнал гематологии (Вгй 13 Наета!о1), 2000 г.; 111: 416-25). Было также продемонстрировано, что коммуникация является двунаправленной и соответствует гипотезе о том, что стромальные клетки управляют пролиферативным поведением кроветворных клеток предшественника, и к тому же их функциональный статус может регулироваться незрелыми кроветворными клетками (Гупта П., Блазар Б., Гупта К., Верфайллие С. (Сир!а Р, В1ахаг В, Сир!а К, УейшШе С), Кровь (В1ооб), 1998 г.; 91: 3724-3733).

С возрастом функциональность кроветворных тканей снижается и у пожилых людей часто наблюдается анемия.

Пониженный потенциал кроветворных тканей также наблюдался в кроветворных злокачественных образованиях и после химиотерапии. Для предотвращения панцитопении используется трансплантация костного мозга донора.

- 76 007792

Влияние химического соединения, которое способствует коммуникации по щелевому соединению, будет изучаться на крысах, которым предварительно вводились большие дозы циклофосфамида. У этих животных костный мозг больше не производил зрелые кроветворные клетки. Количество ретикулоцитов в различные моменты времени после введения циклофосфамида будет значительно более высоким у животных, которым предварительно вводились вещества, открывающие щелевые соединения - химическое соединение 2, в дозах приблизительно 100 мкл концентрацией 10^-10 М-10^-8 М по сравнению с животными, которым предварительно не вводилось химическое соединение 2.

Лекарственное средство вводится парентерально.

Гипофиз и гипофункция гипоталамуса

Гормоны из передней доли гипофиза показывают циркадное изменение секреции в пределах минут, часов, дней и сезонов. Часть нервной системы, ответственная за циркадный ритм, ограничена парой структур в гипоталамусе, известных как супрахиазмальное ядро. В этом центре индивидуальным клеткам присущи биологические часы. Однако через коммуникацию по щелевому соединению соседним клеткам передается скоординированная электрическая активность (Колуэлл Ц.С. (Со1тее11 С8), Журнал нейробиологии (1 №игоЬю1), 2000 г.; 43: 379-88)). Поскольку также передняя доля гипофиза не имеет прямых иннервации, межклеточная коммуникация по щелевому соединению в пределах железы должна быть обязательной для адекватной межклеточной координации и синхронизации, что необходимо для обеспечения соответствующей и своевременной секреции гормонов (Витале М.Л., Кардин Дж., Гилула Н.Б., Карбаджал М.Е., Пеллетиер Р.-М. (УЬа1е МЛ, Сагбш 1, С11и1а ЯВ, СагЬа)а1 МЕ, Ре11ейег К-М), Доклады по биологии (В1о1 Керого), 2001 г.; 64: 625-633). Герин Н.С., Боннефонт X., Стоекел Л., Моллард П. (Сиег1пеаи ΝΟ, ВоппеГоп! X, 8!оеске1 Ь, Мо11агб Р), Журнал биологической химии (1 Вю1 СЬет), 1998 г.; 273: 10389-95) пришли к заключению, что проявляющие спонтанную активность эндокринные клетки являются либо одиночными нейронами, либо организованы в синхронизированные, связанные по щелевым соединениям, упорядоченные структуры, рассеянные по передней доле гипофиза. Синхронизация спонтанно возбудимых клеток может помочь формированию структуры базальной секреции. Под контролем гормонов, стимулирующих гипоталамус, из передней доли гипофиза синтезируется гормон роста, пролактин, гормон коры надпочечников, гормон щитовидной железы, и гормоны гонадотропина. Поэтому один из механизмов аритмии сложных гипоталамических-гипофизных-эндокринных желез в пределах одной из осей также связан с ухудшенной коммуникацией по щелевым соединениям. Болезни бессимптомный диабет, гипогонадотропный гипогонадизм, микседема, адренокортикоидная гипофункция и карликовость. Обработка веществом, открывающим щелевые соединения, улучшает симптомы.

Кроме того, нейроны в супрахиазмальном ядре гипоталамуса зависят от оптимальной коммуникации по щелевому соединению. На оси, упомянутой выше, вещество, открывающее щелевые соединения, способное действовать в этой области, также полезно пациентам с нарушенным циркадным ритмом (Шинозара К., Фунабаси Т., Мицишиба Д., Кимура Ф. (8ЫпоЬага К, РипаЬакЫ Т, МЬыкЫЬа Ό, К1тига Р), Письма по нейронауке (№игокс1 Ьей), 2000 г.; 286: 107-10).

Вазоренальная гипертензия и нефротоксичность

Специфичные щелевые соединения в почках и эндотелии, которые широко распределены в почке, обнаружены в гломеруле, каналах и сосудистой сети, включая внутригломерулярные капилляры и юкстагломерулярные артериолы (Хаефлигер Дж.-А., Демотц С., Браиссант О., Сутер Е. (НаеШдег 1-А, Эешо1х С., Вга1ккап1 О., 8и1ег Е.), Почка (К1бпеу Ш), 2001 г.; 60; 190-201). В этом исследовании авторы продемонстрировали наличие щелевых соединений, связывающих выделяющие ренин клетки афферентной артериолы. Щелевые соединения могли бы внести вклад в обнаружение и распространение переносимых кровью сигналов, например, сигналов, вызываемых повышенным кровяным давлением. В пределах почки, такие сигналы должны быть преобразованы эндотелиальными клетками афферентной артериолы в аутокринные, паракринные и эндокринные стимулы и переданы выделяющим ренин клеткам. Коммуникация по щелевому соединению играет, таким образом, важную роль в формировании взаимосвязанного юкстагломерулярного аппарата. Быстрый переход канальцев щелевых соединений от открытого к закрытому состоянию также подразумевает быструю реакцию на местные изменения в сосудах, что обеспечивает, таким образом, непрерывную обратную связь, необходимую для согласования гломерулярной и трубчатой функции, а также секреции ренина с физиологическими потребностями. Болезни, характеризующиеся ослабленной почечной коммуникацией по щелевым соединениям, выиграют от применения специфичного вещества, открывающего щелевые соединения, вводимого либо перорально, либо парентерально. Тяжелые металлы являются нефротоксичными и вызывают поражение почек. Было продемонстрировано, что токсичные металлы, например, кадмий (Фукумото М, Куджираока Т., Хара М., Шибасаки Т., Хосоя Т., Йошида М. (РикитоЮ М., Киргаока Т, Нага М., 8ЫЬакак1 Т., Нокоуа Т., УокЫба М.), Науки о жизни (ЫГе 8с1епсек), 2001 г.; 69:247-54), а также ртуть (Йошида М, Куджираока Т., Хара М., Наказавас X., Суми И. ^окЫба М., Киргаока Т., Нага М., №1каха\\'ак Н., 8ит1 Υ.), Достижения токсикологии, (АгсЬ Тох1со1), 1998 г.; 72: 192-96) в первичных клеточных культурах проксимальных каналов крысы нарушают купирование клеток с помощью щелевого соединения и было сделано предположение, что дисфункция почек в обоих случаях связана с ухудшением межклеточной коммуникации.

- 77 007792

В случае отравления тяжелыми металлами обработка веществами, открывающими щелевые соединения, восстанавливает поврежденную ткань и предотвращают прогрессивную девастацию ткани.

На клеточных культурах из клеток канальцев будут проводиться ш ν 11го исследования по предотвращению с помощью химических соединений (химического соединения 2 или химического соединения 40 концентрацией приблизительно 10^-10-10^-7 М) нарушения купирования клеток с помощью щелевого соединения в случае воздействия тяжелыми металлами. Коммуникация по щелевому соединению будет проверена способом окрашивания Желтым Люцифером, как описано выше.

После системного введения тяжелого металла экспериментальным животным (крысам) почечная функция измерялась с помощью 3Н-инсулина в качестве клиренс-маркера скорости клубочковой фильтрации, с помощью меченого 14С тетраэтиламмония в качестве клиренс-маркера почечного плазменного потока, и лития в качестве клиренс-маркера проксимальной тубулярной функции (Петерсен Дж. С., Шалми М., Лам Х.Р., Кристенсен С. (Ре1егкеп 18, 8сЬа1т1 М., Ьат НК, С11пк1епкеп С), Журнал фармакологии и специальной терапии (I. РЬагтасо1. Екр. ТЬег.), 1991 г., 258:1-7) в различные моменты времени до и после длительной обработки тяжелыми металлами. Длительная обработка специфическим веществом, открывающим щелевые соединения, типа химического соединения 2, начинается, когда скомпрометирована почечная функция и будет наблюдаться значительное улучшение почечных функциональных параметров (скорость клубочковой фильтрации и кровяное давление) после обработки.

Состав будет вводиться парентерально.

Неинфекционное воспаление, а также инфекции с различными микробами вызывают значительные неспецифические хронические изменения почечной функции, характеризующиеся также снижением скорости клубочковой фильтрации, снижением выделения электролитов и воды, и изменемиями кровяного давления. Некоторые из этих симптомов будут также лечиться с использованием специфического вещества, открывающего щелевые соединения, и симптомы уменьшаться.

Развитие и коррекция зубов

Авторы Муракуми С. и Мурамацу Т. (Митакат1 8 и Мигата!ки Т), Анатомия эмбриологии (Апа1 ЕтЬгуо1), 2001 г; 203; 367-374, подтвердили, что между одонтобластами существует коммуникация по щелевому соединению, и что через эти межклеточные мосты координируется клеточная активность (Игучи И., Ямамура Т., Ичикава Т., Хашомот О.С., Хоуриучи Т., Шимоно М. ЦдисЫ Υ, Уатати^а Т, !сЫка\а Т, НакЬото! ОС, НоигшсЫ Т, 81итопо М), Достижения биологии рта, (АгсЬ Ога1 Вю1), 1984 г.; 29: 489-497), но в своих последних исследованиях они также продемонстрировали, что эти коммуникации по щелевому соединению существуют на ранней стадии развития зубов (предодонтобласт), а также в одонтобластах молодого и старого возраста. Кроме того, щелевые соединения имеются в клетках пульпы, лежащих под одонтобластами. Эти результаты показывают, что межклеточная коммуникация по щелевому соединению важна и во время развития зубов и в течение всей жизни, когда зубы корректируются.

Обработка веществом, открывающим щелевые соединения, нормализует нарушенное развитие зубов. Такая обработка также способствует коррекции зубов и делает зубы более устойчивыми к кариесу.

Химические соединения по настоящему изобретению, способствующие щелевому соединению, типа химического соединения 2, могут анализироваться ш νίΙΐΌ для определения их влияния на межклеточную коммуникацию одонтобластов, что сопоставимо с описанным здесь анализом остеобласта.

Стволовые клетки

Авторы Лумельски (Ьите1кку) и др. (2001 г.) из стволовых зародышевых клеток мыши получили клетки, экспрессирующие инсулин и другие панкреатические эндокринные гормоны (Надя Лумельски, Оливье Блондел, паскаль Лаенг, Иван Валеско, Реа Равин, Рон МкКей Щайуа Ьите1кку, О1Мет В1опйе1, Ракса1 Ьаепд, Кап АЖексо, Кеа Ка^'т, Коп МсКау), Дифференцировка зародышевых стволовых клеток в сторону структур, выделяющих инсулин, подобным панкреатическим островкам, Наука (8с1епсе), 292,1389-1394, 2001 г.). Клетки сами собираются в трехмерные кластеры, топология которых напоминает нормальные панкреатические островки, в которых панкреатические типы клеток сильно напоминают нейроны. Глюкозой с помощью механизмов, подобных механизмам, применяемым ш νίνΌ, инициируется высвобождение инсулина из этих кластеров. При иъекции мышам с диабетом клетки, производящие инсулин, переносят быструю васкуляризацию и сохраняют кластерную, островковую организацию.

В клиническом контексте эта система на основе зародышевых стволовых клеток может позволить одновременную генерацию и сборку клеток, выделяющих инсулин, и других островковых клеток, которые, как известно, играют важную роль в регуляции выделения инсулина в функциональные структурные единицы. Эти единицы могли бы предоставить материал для оптимизации продуцирования инсулина и анализа точной регуляции гомеостаза глюкозы. Зародышевые стволовые клетки идеальны для такого исследования, потому что генетические инструментальные средства могут использоваться для определения молекулярного основания развития островка и функции. Это привлекательная возможность для терапий на основе клетки для применения с использованием зародышевых стволовых клеток, и зародышевых половых клеток человека и нечеловека. Ткань взрослых индивидуумов может быть также полезным источником функциональных панкреатических клеток. Описанная здесь система дифференцировки может обеспечить источник функциональных панкреатических островков для лечения диабета. Насколь- 78 007792 ко нам известно, это первый отчет, в котором показано, что из зародышевых стволовых клеток ίη νίίΐΌ может быть получено несколько типов клеток эндокринной поджелудочной железы. Хотя панкреатические островки, полученные из трупов, могут функционировать в печени после прививки, проблемы отторжения ткани и эффективности остаются нерешенными. Ясно, что разработка зародышевых стволовых клеток для получения обильного источника иммуносовместимой ткани для трансплантации обязывает преодолеть эту и другие проблемы, связанные с диабетом.

Инфаркт миокарда ведет к потере ткани и ухудшению работы сердца. Оставшиеся миоциты не способны перестроить некротическую ткань, и сердце после инфаркта со временем работает все хуже. Повреждение целевого органа ощущается отдаленными стволовыми клетками, которые мигрируют к сайту поражения и переносят альтернирующую дифференцировку стволовых клеток; эти события поддерживают структурную и функциональную репарацию. Эта высокая степень пластичности стволовой клетки подсказала авторам Орлику (ОгНс) и др. (Орлик В., Кайстура Дж., Чименти С., Яконюк И., Андерсон СМ., Ли Б, Пикел Дж., МкКей Р., Надал-Гинард Б., Бодине Д.М., Лери А и Анверса П. (ОгНс Ό., КаЩига 1., СЫтепй 8., .Такошик I., Апбегзоп 8.М., Ь1 В., Рюке1 1., МсКау К., №ба1-6тагб 1., Вобте Ό. М., Ьег1 А. и Агкегеа Р.): Клетки костного мозга восстанавливают миокард после миокарда, Природа, (№1иге), 410, 701-705 (2001 г.)), проверить, можно ли восстановить мертвый миокард путем пересадки клеток костного мозга у мышей, перенесших инфаркт.

Они сортировали линейно-негативные (Ып-)клетки костного мозга трансгенных мышей, экспрессирующих усиленный зеленый флуоресцентный белок путем активизированной флюоресценцией сортировки клеток на основе с-кб экспрессии. Вскоре после перевязки коронарной артерии, клетки Ып-скбРО8 вводились инъекцией в сокращающуюся стенку на границе с инфарктом. Было обнаружено, что спустя 9 дней после пересадки клеток костного мозга недавно сформированный миокард занимал 68% части желудочка, перенесшего инфаркт. Развивающаяся ткань включала распространяющиеся миоциты и сосудистые структуры. Их исследование показывает, что локально введенные клетки костного мозга могут воспроизводить бе ηоνо миокард, улучшая, таким образом, исход болезни коронарной артерии.

Для получения свойств этих миоцитов измерялась экспрессия коннексина 43. Этот белок отвечает за купирование клеток и электрическое купирование путем генерации канальцев плазматической мембранны между миоцитами; очевидно коннексин 43 был в цитоплазме клетки и на поверхности близко расположенных дифференцирующихся клеток. Эти результаты были совместимы с ожидаемой функциональной компетентностью фенотипа сердечной мышцы.

Так как функциональные клетки произведены от зародышевых стволовых клеток, и так как коннексины действительно экспрессированы этими клетками в сердечной ткани, перенесшей инфаркт, мы утверждаем, что это будет иметь место и в случае с другими клетками, дифференцированными из зародышевых стволовых клеток. Так как коннексины играют доминирующую роль в функции этих тканей (включая панкреатические бета-клетки и клетки сердечной мышцы) мы также утверждаем, что химическое соединение подобное химическому соединению 2 и химическому соединению 40 путем усиления купирования клеток с помощью щелевого соединения усиливает пролиферацию зародышевых стволовых клеток в функциональные клетки в тех органах, куда были имплантированы стволовые клетки.

Таким образом, мы утверждаем, что вещества, открывающие щелевые соединения, подобные химическому соединению 2 и химическому соединению 40, будут стимулировать переход стволовых клеток в функциональные клетки в пересаженных органах типа поджелудочной железы для лечения сахарного диабета, сердца для лечения инфаркта сердца, и базальных ганглий мозга для лечения болезни Паркинсона.

Для обоснования этого утверждения, можно выполнить эксперименты по общему проекту изучения инфаркта миокарда, как описано выше у авторов Орлик (ОгНс) и др. Природа (№1иге), 410, 701 - 705 (2001 г.)), с введением химического соединения 2 и химического соединения 40 неоднократно в течение процесса пролиферации. Как ожидается, эти эксперименты покажут увеличение экспрессии коннексина 43 с помощью химического соединения 2 и химического соединения 40 или более быстрое заживление.

Болезнь, вызванная табаком

Авторы МкКарнс С.Ц., Дулитл Д.Дж. (МсКагпк 8С, ЭооНШе Ό1), Применение фармакологии в токсикологии (^χί^ Арр1 Рйагтасо1), октябрь 1991 г., 111:58-68, изучали влияние конденсата дыма сигареты на межклеточную коммуникацию. Цель исследования состояла в том, чтобы дать количественную оценку и сравнить активность конденсата дыма сигареты от нагрева и сжигания табака, влияющих как на скорость, так и на общий объем межклеточной коммуникации ш νίΙΐΌ. Для оценки токсичности плазматической мембраны использовались пробы поглощения и выделения лактатдегидрогеназы Желтого Люцифера. Межклетоная коммуникация по щелевому соединению (МКЩС) определялась путем количественной оценки перераспределения флюоресценции после фотоотбеливания (РКАР), которая проводилась после воздействия в течение 1 ч конденсата дыма сигареты таких концентраций, которые не были токсичны для плазматической мембраны. Давалась количественная оценка МКЩС в клетках эпителия печени крысы (клетки ШВ) и фибробластах кожи человека (М8И-2 клетки), синхронизированных по фазе С1 клеточного цикла. В каждом из испытуемых типов клетки конденсат дыма сигареты от нагрева табака не замедлял МКЩС при таких концентрациях, когда конденсат дыма сигареты от сжигания

- 79 007792 табака значительно замедлял как общий объем, так и скорость МКЩС. Таким образом, мы утверждаем, что вещества, открывающие щелевые соединения, подобные химическому соединению 2 и химическому соединению 40 или пептиды по формулам 1-У111, и из табл. 1 и 8, предотвращают или смягчают ингибирование МКЩС, вызванное конденсатом дыма сигареты. Болезнь, вызванная табаком, в результате разрыва купирования клеток с помощью щелевого соединения, включает ухудшенное заживление ран, особенно после операции и старения кожи.

Цель настоящего изобретения состоит в получении способов лечения или предотвращения одного или большего числа описанных здесь медицинских признаков или состояний. Обычно такие способы включают введение, по крайней мере, одного из предыдущих химических соединений, предпочтительно того же самого, в количестве, достаточном для лечения, предотвращения, или снижения степени тяжести признаков или состояний. Специфические стратегии введения будут очевидны для специалистов и зависят, например, от пола, массы, общего состояния здоровья и определенных признаков или состояний, которые необходимо вылечить или предотвратить. Как уже обсуждалось, в способах по настоящему изобретению описанные здесь химические соединения могут вводиться как единственное активное средство. В другом случае они могут использоваться в качестве дополнительной терапии. Желательно, чтобы признаки или состояния, которые необходимо вылечить или предотвратить в соответствии с настоящим изобретениемм были связаны с ухудшенной клеточной коммуникацией или ослабленной функцией щелевого соединения. Более специфические признаки и состояния, касающиеся изобретения, были обсуж дены выше.

Было бы хорошо лечить болезни, связанные с нарушением клеточной коммуникации или ухудшением МКЩС, с помощью вещества, которое, в частности, воздействует на функцию щелевого соединения, типа агониста рецептора ААР, который, как ожидается, способствует МКЩС посредством передачи сигнала от рецептора ААР, или вещества или химического соединения, которое по другому способствует выполнению нормальной функции коннексинов и щелевых соединений.

В соответствии с предпочтительными вариантами настоящего изобретения химическое соединение, которое способствует межклеточной коммуникации, выбирается из группы, в состав которой входят группы химических соединений по формуле I

н	Н	г н-ι
-сны-с		-СН-Ν—	С-СН-Ν 1 О \
\ О
К]			1
	А

(I) представляющей пептидную последовательность, где аминокислотные остатки могут иметь форму Ό и/или форму Б с Ν-концевым участком Ν* и С-концевым участком С*, и обладать цикличностью благодаря ковалентной связи между Ν* и С*, как показано пунктирной линией, или между Ка и С*, как показано пунктирной линией ϋ; и где пунктирная линия между Ν* и С*, которая если имеется, то исключает связь и, представляет дополнительную ковалентную связь, и если упомянутой связи нет, то тогда Ν* связано с атомом водорода; когда дополнительная ковалентная связь и между Ка и С* имеется, то тогда К₇ отсутствует, и наличие К₇ исключает связь ϋ; и где X является Ν-концевым участком типа фотозонда, способного связываться с аминоконцевым участком Ν*, или ацильной группой, полученной из С(2-22)алкилкарбоновой кислоты, типа уксусной кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты, а также из жирных кислот типа бегеновой кислоты, произвольно замещаемой одним или большим числом заместителей, выбираемых из группы, в состав которой входит гидроксигруппа, галогеновая группа, С(1-6)алкильная группа, нитрогруппа и цианогруппа; или X является водородом;

К₇ является ОН, NΉ2. NНNΉ2 или ОК₈, если связь между Ν* и С* отсутствует, или К₇ отсутствует, если связь между Ν* и С* существует;

К_с является боковой аминокислотной цепью С1у, 8аг, ароматической боковой аминокислотной цепью, произвольно замещеаемой одной группой или большим числом гидроксигрупп, галогеновых групп или нижних алкоксигрупп в ароматическом кольце или К_с;

- 80 007792

К.,1 является боковой аминокислотной цепью Α1η, О1у, О1и, Ακρ, ЭаЬ. Ώαρα, Ьук, Ακιι О1п, Ογπ. ТНг, 8ег или Сук;

К_е является боковой аминокислотной цепью Α1η;

К_£ является боковой аминокислотной цепью Α1η, 8аг или О1у;

представляет любую боковую аминокислотную цепь кроме боковой цепи ШИу]} или части по Формуле Ζ или Ζη;

является боковой аминокислотной цепью Α1η, или является частью Формулы Ζ или Ζа;

К₁ является боковой аминокислотной цепью О1у, или К, представляет ароматическую аминокислоту, произвольно замещаемую одной галогенной группой или большим числом галогеновых групп в ароматическом кольце;

К является боковой аминокислотной цепью Ακπ, С1п, Ακρ, О1и, Сук, или Туг;

и каждый из индексов _), к, 1, т, п, ρ и с.| независимо друг от друга принимает значение 0 или 1;

и ретроформы всех форм Ό или ретроформы всех Ό форм пептидной последовательности по формуле Ι, и их соли и амиды.

В химических соединениях по формуле Ι желательно, чтобы К7 было представлено в виде ΝΗ2, Ка было представлено в виде боковой аминокислотной цепи Ργ0, К_ь было представлено в виде боковой аминокислотной цепи ^ρ, К_с было представлено в виде боковой аминокислотной цепи О1у или Туг, К,_с выбиралось из группы, в состав которой входит боковая аминокислотная цепь О1у, Ακρ или О1и, Оа]эа и ЭаЬ, К_£ было представлено в виде боковой аминокислотной цепи Α1η или О1у, К_д было представлено в виде боковой аминокислотной цепи Ργ0, Ακπ или О1у, К_д было представлено в виде боковой аминокислотной цепи Ακπ, О1у, Ο-Η\·ρ или Ε-/Ώ-ΡΓ0, если формула I представляет линейный пептид, или, если формула I представляет пептид циклизированный между Ν*, и С* тогда К_д является боковой аминокислотной цепью ^/Ο^^ρ или Ε-/Ό-ΡΓ0, было представлено в виде боковой аминокислотной цепи Α1η, если и отсутствует, или было представлено в виде боковой аминокислотной цепи Ργ0 или ^ρ, если и присутствует, предпочтительно, чтобы К₁ было представлено в виде боковой аминокислотной цепи Туг, Ию, Тг]э, Ыа1 произвольно замещаемых одной гидроксигруппой или большим числом гидроксигрупп, Е или С1, в ароматическом кольце, К, выбиралось из группы, в состав которой входит боковая аминокислотная цепь Ακρ, О1и, и Туг и линейный пептид по формуле I, который является ретроформой всех форм Ό.

Желательно также, чтобы соединение пептида по формуле I состояло из аминокислотных остатков числом от 3 до 9, еще лучше, чтобы оно состояло из аминокислотных остатков числом от 3 до 7, при этом желательно, чтобы _) и к - равнялись 0, если имеется и, чтобы _) и к равнялись 1, если и отсутствует; формула I представляет циклический пептид, при этом желательно, чтобы М равнялось 0, если и отсутствует, чтобы р равнялось 1, если имеется и, и чтобы с.| равнялось 0, если имеется и.

Предпочтительный вариант по настоящему изобретению относится к химическим соединениям, соответствующим общей формуле (II)

Χ-(6')α-Α-6'-(Ρχ)2-(Υ%-Κ₇(Π), задающей пептидную последовательность, в которой аминокислотные остатки могут иметь форму Ь и/или форму Ό, и где

X является Н или Ас;

С является остатком глицина или аналогом глицина типа 8аг;

А является аланином;

Рх является аминокислотным остатком по формуле Ζ или Ζη типа Η\·ρ или Ργ0;

Υ' является тирозином или фенилаланином, произвольно замещаемым в фенильном кольце галогеновой группой или гидроксигруппой;

а и Ь - независимо друг от друга принимают значение 0 или 1,

К₇ является ОН, ΝΗ₂, ΝΗΝΗ₂, Ακτι-ΝΗ^, или ΟΠι-ΝΗ^;

и к их ретроформам, и их солям, при этом желательно, чтобы

X являлось Ас и все аминокислоты имели бы форму Ь, чтобы О' являлось глицином, чтобы Рх являлось Ργ0, чтобы Υ' являлось тиразином, чтобы К₇ являлось ΝΗ₂;

чтобы формула II для ретросоединений имела следующий вид: Χ-(Υ'φ-(Ρχ)₂-6'-Α-(6')_α-Κ-7, где все аминокислотные остатки имеют форму Ό, и где все символы имеют то же самое значение, что и в формуле II;

и к пептидным соединениям по формуле II, где по крайней мере один остаток Рх является Όаминокислотой, а остальное - Ь-аминокислотами;

и к циклическим последовательностям по формуле II, где X является Н, К₇ является Ακί'ΐ или С1п с ковалентной связью с Υ ', Ь равно 1 и а равно 1.

Химическое соединение по формуле 2:

Η-ΟΑΟ - (Ρη)₂-ΝΗ₂ типа

Η-61у-Α1а-61у-^-Ηуρ-Ρ^ο-Ту^-NΗ₂, Η-61у-Α1а-61у-^-Ρ^ο-Ρ^ο-Ту^-NΗ₂,

- 81 007792

Н-О1у-Л1а-О1у-0-Рго-Л1а-Туг-НН₂,

Н-О1у-Л1а-О1у-О1у-0-Рго-Туг-НН2,

Н-Θ1у-Л1а-Θ1у-^-Нур-Л1а-Ту^-NН2, [ 1-С1\--А1а-С1\--1)-[ |ур-1 )-Рго-Т\т-\1 Р или его соль.

Химическое соединение по формуле 3:

Н-САС - (Рх)₂^-КН₂, типа

Н-01у-Л1а-0Iу-Т4С-Р^о-Ту^-NН₂,

Н-О1у-Л1а-О1у-Л2С-Р^о-Ту^-NН2,

Н-О1у-Л1а-О1у-Рс-Р^о-Ту^-NН2, и его фармацевтически приемлемые соли. Химическое соединение по формуле 8: ^0^-0-^)^^2, типа [ 1-5аг-А1а-5аг-1 Ар-Рго-Таг-А! Р,

11-С1у-А1а-%11'-11ур-Рго-Туг-А11₂, и его фармацевтически приемлемые соли.

Химическое соединение по формуле 6:

Х-Э^-(Э-Рх) 2-0-0^-0-^¾ или его ретроформа

Х-С-1 )-А-С-(1 )-Р\р-1 )-Υ-\ΊΡ или

Х-С-[)-А-С-([)-Р\р-[)-У-[)-(А>т-\1 Рчипа

Н-С1х-П-А1а-С1х-П-Нхр-П-Рго-Ю-Ххг-\Н₂, Н-С1у-^-Л1а-С1у-^-Нур-^-Р^о-^-Ту^-^-Л8р-ОН, Лс-^-Ту^-^-Р^о-^-Нур-С1у-^-Л1а-С1у-NН₂, и его фармацевтически приемлемые соли.

Химическое соединение по формуле 10:

цикло(-САС - (РхД-Υ-Ν/ρ-), типа цикло(-С1у-Л1а-С1у-Нур-Р^о-Ту^-С1η-), цикло(-С1у-Л1а-С1у-Нур-Р^о-Ту^-Л8η-), 11икло(>С1у-А1а-С1у-Рго-Рго-Туг-А8п-), и его фармацевтически приемлемые соли.

Химическое соединение по формуле 11: цикло(^-(Рх)2-А-(С) ς-Ν/р-), типа цикло(-Ту^-Р^о-Нур-С1у-Л1а-С1у-Л8η-), цикло(-Ту^-Р^о-Нур-С1у-Л1а-Л8η-), цикло(-Туг (3-1, 5-I)-Р^о-4Нур-С1у-Л1а-С1у-Л8η), и его фармацевтически приемлемые соли. химическое соединение по формуле 12:

Χ-Ζά-Ο (Ν/р) Υ-ΧΊ Р, типа

11-С1у-А1а-С1у-А8п-Туг-Х11₂,

Ас-СА-А8п-Т\т-Х11, Н-СА-АмьТаг-Х'Н,

Ас-А1а-С.11у-А8п-Туг-^ 1₂,

Н-Л1а-Ο1у-Л8η-Ту^-NН₂, и его фармацевтически приемлемые соли.

К циклическим пептидным соединениям по формуле I относятся соединения, имеющие общую формулу III:

(III)

- 82 007792 где X является Н или частью Ν-концевого участка типа фотозонда, способного образовывать ковалентную связь с Ν-концевой аминогруппой или ацильной группой, полученной из С(2-22) алкилкарбоновой кислоты, типа уксусной кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты, а также из жирных кислот типа бегеновой кислоты, произвольно замещаемой одним или большим числом заместителей, выбираемых из группы, в состав которой входит гидрокси-группа, галогеновая группа, С(1-6)алкильная группа, нитрогруппа и цианогруппа;

К1 является Н или СН3, предпочтительно Н;

К2 и К3 отличаются друг от друга или идентичны, и являются любой возможной боковой аминокислотной цепью;

.....возможная связь;

К5 и К4 - любая возможная боковая аминокислотная цепь, или, если существует возможная связь, то К5 и К4 вместе с присоединенными атомами С и Ν представляют пролиновое кольцо, которое произвольно замещается на ОН, предпочтительно в позиции 4, или К₅ и Кд вместе с присоединенными атомами С и N представляют часть формулы Ζ или /а, приведенной выше;

К6 является боковой ароматической аминокислотной цепью, произвольно замещаемой в фенильном кольце одним или большим числом заместителей, выбираемых из группы, в состав которой входит галогеновая группа, нитро-группа и гидроксигруппа;

р равно 0 или 1;

п равно 1, 2, 3 или 4;

а также их соли, желательно, чтобы К являлся Н, чтобы К₂ и К₃ отличались друг от друга или были идентины, являлись бы Н или СН₃, чтобы К₅ и Кд вместе с присоединенными атомами С и N были бы Рго или Нур, а р равнялось бы 1, и п равнялось бы 1.

Типичными химическими соединениями по формуле III являются:

Н-С1у-Рара-С1у-Нур-Рго-Туг-|

Н-С1у-РаЬ-61у-Нур-Рго-Туг -ι

I_______________________________________________________I

Н-61у-РаЬ-А!а-61у-Нур-Рго-Туг -η ι____________________________________________________________________I

Н-61у-р-Рара-61у-Р-Нур-Р-Рго-Р-Туд

Н-61у-Р-РаЬ-61у-Р-Нур-Р-Рго-Р-ТуГ|

Н-61у-Р-РаЬ-Р-А1а-Б1у-Р-Нур-Р-Рго-Р-Ту*|

Н-61у-Р-Рара-Р-А1а-61у-Р-Нур-Р-Рго-Р-Ту| и их фармацевтически приемлемые соли.

К числу предпочтительных химических соединении по формуле I относятся соединения, имеющие общую формулу IV:

где К8 является Н или С(1-6)алкилгруппой;

(IV)

- 83 007792

Кб является Н или СН₃;

Кд и К₅ отличаются друг от друга или идентичны, и являются любой возможной боковой аминокислотной цепью;

.....возможная связь;

К₂ и К₃ - любая возможная боковая аминокислотная цепь, или, если существует возможная связь, то К₂ и К₃ вместе с присоединенными атомами С и N представляют из себя пролиновое кольцо, которое произвольно замещается на ОН, предпочтительно в позиции 4, или К₂ и К₃ представляют часть формулы Ζ или 2а;

К1 является боковой ароматической аминокислотной цепью;

р равно 0 или 1;

п равно 1, 2, 3 или 4;

и их соли.

Типичными химическими соединениями по формуле ΐν являются [ Туг-Рго-Нур-61у-(Э|и-С1у-МН₂

Г Р-Туг-Р-Рго-Р-Нур-С1у-Р-А5р-С1у-ЫН₂ р Р-Туг-Р-Рго-Р-Нур-61у-Р-А1а-Р-А5р-61у-МН₂ р РДуг-Р-Рго-Р-Нур-61у-Р-А1а-Р-(р1и-61у-1ЧН₂ и их фармацевтически приемлемые соли.

Другими предпочтительными химическими соединениями являются пептидные соединения, у которых аминокислотные остатки могут быть формы Ь и/или формы Ό, с общей формулой V

И РгАаг-АЬ-А^-Аг-Яг

1I

II ¹ _ где К1 является возможной амидной связью между Ν-концевым и С-концевым участками пептида, Н или Ас;

Аа1 является пептидной последовательностью, состоящей предпочтительно из 0-4 аминокислотных остатков;

А1 является аминокислотным остатком, выбираемым из группы, в состав которой входит С1у, бета аланин и Баг;

Аа2 является аминокислотным остатком, выбираемым из группы, в состав которой входит Акп, С1п, С1у, Туг, или химические соединения типа оксикислоты, аминосульфокислоты, фосфорнокислой группы или углеводородной цепи, соединяющей А1 и Аг посредством 4 ковалентных связей;

Аг является ароматическим аминокислотным остатком, типа Туг, Тгр, Рйе, Н1к, или Иа1, произвольно замещаемым одним или большим числом заместителей, выбираемых из группы, в состав которой входит галоген, типа Е, С1, Вг, ΐ, ОН, ИО₂, N11₂, СООН, СОИН;

К₂ является ОН, ИН₂ или отсутствует;

и их ретроаналоги, ретроаналоги всех Ό форм (обратные ретроаналоги) и их соли, и желательно, чтобы Аа1 выбиралось из группы, в состав которой входит А1а, С1у-А1а, С1у-Акп-Туг и С1у-Акп-Туг-А1а, при этом А1 является С1у или Баг, Аа₂ является Акп или С1п, а Аг является Туг или Рйе, поизвольно замещаемым одним или большим числом галогенов, например ΐ, а К₂ является ИН₂, если химическое соединение не является циклическим, или К2 отсутствует, если химическое соединение является циклическим.

Типичными химическими соединениями по формуле ν являются

Н-С1у-А1а-С1у-Акп-Туг-ИН₂, цикло(-Туг-А1а-Бег-А1а-С1у-Акп-),

- 84 007792 цикло(-Туг-А1а-Зег-А1а-61у-А8п-), цикло(-Туг-61у-А8п-Туг-А1а-61у-А8п-), цкло(-Туг-Уа1-Зег-61у-А1а-61у-А8п-),

Ас-61у-А8п-Туг-МН₂, Н-61у-А8п-Туг-МН₂,

Ас-А1а-61у-А8п-Туг-МН₂, Н-А1а-61у-А8п-Туг-МН₂, и их фармацевтически приемлемые соли.

Другими химическими соединениями, которые используются в способе по настоящему изобретению, являются антиаритмические пептиды и их функциональные аналоги, типа ААР, ААР10, [Рго⁴]ААР10-ЫН₂, НР5 и новые конъюгаты пептидов

Н-61у-А1а-61у-Нур-Рго-Туг-Ьу8-Ьу8-Ьу8-Ьу8-Ьу8-Ьу8-ОН, Н-61у-А1а-61у-Нур-Рго-Туг-Ьу8-Ьу8-Ьу8-Ьу8-Ьу8-Ьу8-МН₂, 3(4-гидроксифенил)пропионил-Рго-Нур-61у-А1а-61у-Ьу8-Ьу8-Ьу8-Ьу8-Ьу8-Ьу8-ОН и 3(4-гидроксифенил)пропионил-Рго-Нур-61у-А1а-61у-Ьу8-Ьу8-Ьу8-Ьу8-Ьу8-Ьу8-МН₂.

Стабильность

Стабильность химических составов по настоящему изобретению

Помимо всего прочего химические соединения по настоящему изобретению характеризуются устойчивостью к ферментативному расщеплению, и/или устойчивостью к распаду в плазме, и/или более продолжительным периодом полураспада ίη νί\Ό. Желательно, чтобы химические соединения, включая антиаритмические химические соединения по настоящему изобретению, были устойчивы к ферментативному расщеплению и/или устойчивыми в плазме.

Различные производные и химические модификации нативной пептидной последовательности ААР по настоящему изобретению, полученные, например, амидированием или эстерификацией С-концевого участка, при применении Ό-аминокислот и производных природных аминокислот, модификаций Νконцевого участка, и циклических аналогов, каждый из которых представляет модификации, предназначены для повышения стабильности при сохранении существенных антиаритмических и/или антитромбических свойств нативного ААР.

Пептиды обычно очень легко разлагаются протеолитическими ферментами желудочно-кишечной системы, и живыми тканями, и жидкостями организма. Поэтому, в данном случае желательно использовать пептиды, которые были модифицированы и стали обладать повышенной стабильностью. Желательно, чтобы химические соединения, включая антиаритмические химические соединения по настоящему изобретению, были устойчивыми к ферментативному расщеплению и/или устойчивыми в плазме. Желательно, чтобы период полураспада пептидов, применяемых в способе по настоящему изобретению, в растворе при измерениях с применением стандартного анализа стабильности составлял более 50 мин, но желательно, чтобы период полураспада пептидов превышал 4 ч. Как показано в табл. 7 и 8 целый ряд пептидов по настоящему изобретению имеют период полураспада, вызванный расщеплением, превышающий 5 ч при измерениях с применением стандартного анализа стабильности. Для представленных здесь пептидов стабильность является важным параметром, определяющим эффективность лекарственного средства и длительность периода полураспада, и желательно, чтобы Т1/2 превышал 300 мин. Стандартный анализ стабильности относится к ίη νίίΐΌ анализу стабильности плазмы, описанному ниже.

Способ анализа стабильности плазмы ίη νίΐΐΌ

Стабильность пептидов анализировалась в сыворотке и плазме. Пептиды выдерживались в плазме или сыворотке при 37°С и 9 проб, отобранных приблизительно через равные интервалы времени в период от 1=0 до !=156 мин, анализировались методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Для того, чтобы не совпадали времена удержания максимума лекарственного средства и максимумов плазмы оценивались соответствующие условия высокоэффективной жидкостной хроматографии (колонка, растворитель, градиент, и температура). Для этого выполнялись последовательные инъекции лекарственного средства, плазмы и совместная инъекция лекарственного средства и плазмы, после чего следовала оптимизация параметров метода жидкостной хроматографии, пока не было получено удовлетворительного разделения. Для каждого типа плазмы выполнялось три параллельных эксперимента. 100 мл пептида смешивалось с 900 мл плазмы в момент времени ΐ=0 и выдерживалось при 37°С (концентрация смеси лекарственного средства в плазме составляла 0,1 мг/мл). Через равные интервалы времени отбирались образцы смеси плазмы и лекарственного средства емкостью 100 мл и распад останавливался осаждением образца с помощью 10 мл МеСЫ:ТРА объемной концентрацией 50:50. Отбирался также контрольный образец плазмы без лекарственного средства, обработанный таким же образом. Образцы плазмы центрифугировались в течение 15 мин при 12000 об./мин (центрифуга Эппендорфа (ЕррепбогГ)) и при температуре окружающей среды. Получаемый раствор супернатанта подавался в пробирки автоматического пробоотборника емкостью 300 мл и анализировался методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Образцы анализировались следующим образом: контрольная проба, пептид концентрацией 0,1 мг/мл, плазма без пептида, три параллельных пробы для момента времени ΐ=0, три параллельных пробы для момента времени 1=5 мин, три параллельных пробы для момента времени ΐ=10 мин, и т.д. И, наконец, три параллельных пробы для момента времени ΐ=0 анализировались повторно для того, что

- 85 007792 бы удостовериться, что во время исследований не было никакого распада или другого сбоя. Концентрации образцов (высота пика сигнала в тАИ) откладывались на графике как функция времени и получали эмпирическую функцию, описывающую кривую моно экспоненциального затухания. Периоды полураспада (Т1/2) (мин) различных химических соединений по настоящему изобретению в сравнении с периодами полураспада ААР10, ААР и НР5 в плазме человека представлены в табл. 7 как среднее (η=3) ± среднеквадратичное отклонение. Химические соединения 2, 3, 27, 48 и 49 по настоящему изобретению значительно более стабильны в плазме и сыворотке чем ААР 10, период полураспада которого меньше 10 мин, и чем НР5, период полураспада которого меньше 12 мин.

Таблица 7. Результаты ίη νίΐίο испытания на стабильность в плазме и сыворотке, Т1/2, мин и ч

Среда и химические соединения	Плазма, гепарин	Сыворотка
Крыса	Кролик	Человек	Кролик	Человек
ААР		4.4 мин ±12%	7,6 мин ±6%
ААР10	8,2 мин ± 13%	9,5 мин ±12%	-	2,7 мин ±4%	-
НР5		3,7 мин±1%	11,9 мин 11%
Цикло(ретро- ААР-10-Азп)		* >5ч			* >5ч
Ас-ретро(ААР- 10)-( все ϋ)- νη₂		* >5ч	* >5ч		* >5ч
СРзС(О)- ΑΑΡ10-ΝΗ₂		3,8 ч ± 0,5%			3,1 ч± 10%
Цикло(САС- Нур-ΡΥΝ)		30 ч ±8%	9ч± 1%
Цикло(6А6- Нур-РУО)		14 ч ±2%	15 ч± 1%
Η-ϋ-Υ-ϋ-Ν-Ο- νη₂			296 мин ±34%

В представленной ниже табл. 8 показана активность химических соединений у моделей с аритмией, вызванной хлористым кальцием, и периоды полураспада.

ТАБЛИЦА 8	СаС1₂-мыши Ιη νίνο, %	СаС1₂-мыши индекс	Период полураспада в плазме человека, мин
НРР-5-ОН	50+/-11	2	12
НРР-РНурСАСКККККК-ОН	80+/-17	3	2
Η-ΑΑΡ-10-ΝΗ2 (Η-ΟΑΟ-4Ηγρ-ΡΥ-ΝΗ₂)	76 +/- 21	3	13
Н-ААР-Ю-К6-ОН	64 +/-10	3	87*
Цикло(ретро-ААР-10- Αδη)	59 +/- 9	2	>300

- 86 007792

Ас-Ретро(ААР-10)-(все ϋ)-ΝΗ₂	65 +/- 7	3	>300
Ас-Ретро( А А Р-10)-ОН	50 +/- 20	1
СР₃С(О)-ААР10-ЫН₂	48+/-13	3	240
ΗΡΡ-ΡΗγρ6ΑΟΚΚΚΚΚΚ-ΝΗ₂	21 +/-17	1	>300
[Ργο⁴]ΑΑΡ10-ΝΗ₂	62+/-9	3	5
ААР	35 +/- 7	2	8
Η-[ϋ-Ηγρ⁴]ΑΑΡ-10-ΝΗ₂	28+/-10	1
Η-[ϋ-Ρτο⁴, Α13⁵]ΑΑΡ-10-ΝΗ₂	29 +/-12	1
ΑΑΡ-10-Κ6-ΝΗ₂	33 +/-17	2
Н-С(Асш)ОАСгНурРУС(Аст)-1ЧН₂	23 +/-10	1
Η-ΑΑΡ-10-Ακη-ΝΗ₂	31 +/-6	2
Цикло(САСНурРУЫ)	57 +/- 8	2	780
Цикло(бАСНурРУО)	48 +/-14	2	900
Η-ΗγρΡΥΝΟΆΟ-ΝΗ,	34 +/-10	2
Η-6Α6-Τ4ΟΡΥ-ΝΗ₂	32 +/- 6	2
Н-6А-8аг-Нур-РУ-ЫН₂	46+/-11	2
Н-8аг-А-8аг-Нур-РУ-РШ₂	24 +/- 7	1
Η-6Α(}-ΡΟΡΥ-ΝΗ₂	21 +/-11	1
η-οαοορυ-νη₂	32 +/- 9	2
Н-ОАб-ЭНурАУ- ΝΗ₂	29 +/- 9	1
Н-ОАО-ОНур-ОРгоУ- ΝΗ₂	49 +/- 6	2
дес-Нур⁴А8п⁵ААР-10- ΝΗ₂	53 +/-15	2	7
ΑοΟΝΥ	46 +/- 9	2	2140
ΟΝΥ	58 +/-10	2	63
Η-6ΑΝΥ- ΝΗ₂	21 +/- 7	1
Η-ΌΥ-ΌΝ-Ο- ΝΗ₂	25 +/- 9	1	296
η-υνο-νη₂	34 +/- 9	2
Η-Ο6Υ-ΝΗ₂	39 +/- 9	2
Η-Ο-ϋΝ-Υ- ΝΗ₂	37+/-10	2
Η-Υ-ϋΝ-6-ΟΗ	39 +/- 9	2
АС-Υ-ϋΝ-Ο-ΟΗ	44+/-10	2
АС-6-ϋ-Ν-Υ- ΝΗ₂	19+/-8	1
АС-Υ-ϋ-Ν-Ο- ΝΗ₂	17+/-8	1
Η-6Κ(ϋΝΡ)Υ-ΝΗ₂	25 +/- 7	1

- 87 007792

Период полураспада в плазме человека, измеренный в ЭДТК плазмы, НРР относительно радикала 3(4-гидроксифенил)пропионила

Таблица 9	Анализ ίη уИго стабильности плазмы для ААР10 и Химического соединения 2 в стерильных условиях
	Целью исследования является оценка ϊη νίίΓο периода полураспада испытуемых лекарственных средств (пептидов) в плазме различных видов
	Лекарственные средства выдерживаются в стерильных условиях при 37 °С в плазме различных видов и с последующим распадом лекарственных средств. Пробы анализируются методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
	Лекарствен ное средство	Партия №	Молекуляр ная масса (г/моль)	Содержание пептида	Растворитель
	Вх. 24,53 В	575,63	83,47	Μζ)Α
Последовательность	Η-6ΑΟ-4Ηγρ-ΡΥ-ΝΗ₂, Η-ΑΑΡ-10-ΝΗ₂
Среда испытаний	Плазма крысы, гепарин
Группы исследований (п = 3/группа)	Концентрация плазмы	Концентрация Время испытаний пептида
90%	0,2 мМ Т = 0, 1,2, 3, 5, 7, 10, 15 и 20 мин

	Лекарственн ое средство	Партия №	Молекуляр ная масса (г/моль)	Содержание пептида	Растворитель
	Химическое соединение 2	Вх. 20,17В- 2А	617,66	100 %

- 88 007792

Последовательност ь	Ас-О-Туг-О-Рго-О-Нур-61у-О-А1а-61у-14Н₂
Среда испытаний	Плазма крысы, гепарин
Г руппы исследований (п = 3/группа)	Концентрация плазмы	Концентрация пептида	Время испытаний
90%	0,2 мМ	Т = 0, 390, 1370, 1865, 2800, 3240,4242, 4702, и 10007 мин
Среда испытаний	Плазма человека, гепарин
Группы исследований (п = 3/группа)	Концентрация плазмы	Концентрация пептида	Время испытаний
90%	0,2 мМ	Т = 0, 390,1368, 1863, 2798, 3238, 4240, 4700, и 10005 мин
Способ и анализы:	Способ'. Для того, чтобы не совпадали времена удержания максимума лекарственного средства и максимумов плазмы оценивались соответствующие условия высокоэффективной жидкостной хроматографии (колонка, растворитель, градиент, и температура). Для этого выполнялись последовательные инъекции лекарственного средства, плазмы, и совместная инъекция лекарственного средства и плазмы, после чего следовала оптимизация параметров метода жидкостной хроматографии, пока не было получено удовлетворительного разделения. Для каждого типа плазмы выполнялось три параллельных эксперимента в стерильных условиях. 100 мл испытуемых пептидов (2 мМ в МфУ/) смешивалось с 900 мл плазмы в момент времени ί = 0 и выдерживалось при 37 °С (концентрация смеси лекарственного средства в плазме составляла 0,2 мМ). Через равные интервалы времени отбирались образцы смеси плазмы и лекарственного средства емкостью 100 мл и распад останавливался осаждением образца с помощью 10 мл МеСЕЕТЕА объемной концентрацией 50:50. Отбирался также контрольный образец плазмы без лекарственного средства, обработанный таким же образом. Образцы плазмы центрифугировались в течение 15 мин при 12000 об./мин (центрифуга Эппендорфа (Еррепбог!)) и при температуре окружающей среды. Получаемый раствор супернатанта

- 89 007792

	подавался в пробирки автоматического пробоотборника емкостью 300 мл и анализировался методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в стерильных условиях. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии выполняется следующим образом: Детектирование: ΏΑϋΙ, 214,5 мм. Расход: 0,200 мл/мин. Объем инъекции 10 мкл. Температура 30 °С. ААР10: Колонка: Ууёас 218М852, #95, 000517, 250 мм х 2,1 мм. Растворители - А: 0,1 % ТРА в Μζ}\ν; В: 0,1 % ТРА в Мр(У:МеСМ 10:90, Градиент (время; % В): 0;0 2;0 14;25 15; 100 16; 100 17;0 30;0 Файл способа: ΤΙΕ 63.Α.Μ Файл последовательности: 010712Т1 (НРЬС 2) Химическое соединение 2: Колонка: Ьипа Зи, С 18(2), Νο 296440, 150 мм х 2 мм. Растворители - А: 0,2 % НРВА в М()\У; В: 0,2 % НЕВА в М(/УУ:МеиН 10:90, Градиент (время; % В): 0;0 5;30 15;30 16;95 17;95 18;5 35;50 Файл способа: ΤΙΕ123.Α.Μ Файл последовательности: 010723Т2 (НРЬС 2) Образцы анализировались следующим образом: контрольная проба, пептид концентрацией 0,2 мМ, плазма без лекарственного средства, три параллельных пробы для момента времени 1 = 0, три параллельных пробы для момента времени 11, три параллельных пробы для момента времени 12, и т.д. И, наконец, три параллельных пробы для момента времени 1 = 0 анализировались повторно для того, чтобы удостовериться, что во время исследований не было никакого распада или другого сбоя
Расчеты и	Концентрации образцов (высота пика сигнала в шАи) откладывались
статистика	на графике как функция времени и получали эмпирическую функцию, описывающую кривую моно экспоненциального затухания. Периоды полураспада испытуемых лекарственных средств в различных типах плазмы педставлены как среднее ± среднеквадратичное отклонение
Стабильность плазмы Η-ΑΑΡ-10-ΝΗ,	3,8 мин +/- 0,1 мин (крыса); 1,8 мин +/-1,0 мин (человек); выдержка в течение 20 мин
Ас-Ретро(ААР-10)- (все ϋ)-ΝΗ₂	10,3 сут. +/· 1,2 сут. (крыса); 14,1 сут. +/-1,5 сут (человек); выдержка 7 сут.

- 90 007792

Желательно, чтобы химические соединения, используемые в способе по настоящему изобретению, были бы непептидами, которые способствуют МКЩС, как сообщалось в литературе, типа ресвератрола (транс-3,5,4'-тригидроксистилбен и цис-3,5,4'-тригидроксистилбен), включая различные димеры, тримеры, тетрамеры и их производные и структурно связанное с ним химическое соединение - фенилэтиловый сложного эфира кофейной кислоты и его производные; и апорфиноидные алкалоиды болдин и таспин. Влияние ресвератола на МКЩС было исследовано ίη νΐνο на модели с предсердно-желудочковой блокадой, вызываемой СаС1₂. Ресвератрол концентрацией 100 нмоль/кг, вводимый внутривенно (η=6 мышей), увеличивал время до вводимой кальцием блокады у животных, которым вводился носитель (η=7 мышей), (136+9% против 100±7%;р<0,01).

Патент США № 6008260 относится к использованию ресвератрола, вводимого млекопитающим как профилактическое средство против рака, вызываемого химическими средствами (см. также работу авторов Нильсен М., Руч Р.Дж., Ванг О. (N^е1кеη М., Кисй К+ Vаηд О), Исследование по биохимии и биофизике, (Вюсйет Вюрйук Кек Соттиц), 2000 г., сентябрь 7; 275 (3):804-9), где показано, что ресвератрол, который является природным стильбеном/алексином, и особенно транс-ресвератрол (транс-3,5,4'тригидроксистильбен) меняет направление процесса ингибирования межклеточной коммуникации по щелевому соединению, вызванное активатором опухоли, на обратное и предлагает использовать его как средство профилактики рака. Исследование влияния ресвератрола на межклеточную коммуникацию по щелевому соединению (МКЩС) в эпителиальных клетках печени крысы УВ-Е344 проводилось по причине того, что ингибирование МКЩС является важным механизмом активации опухоли. От 17 до 50 мкМ ресвератрола улучшали МКЩС в 1,3 раза по сравнению с контрольными группами, которым вводился стандартный растворитель-носитель, когда клетки УВ-Е344 обрабатывались ресвератролом в течение 6 ч. Большинство активаторов опухоли, включая сложный эфир форбола ТРА и инсектицид ДДТ, блокирует МКЩС. Ресвератрол в количестве 17-50 мкМ также предотвращал низкоуровневую регуляцию МКЩС с помощью ТРА и ДДТ в 2,7 и 1,8 раза соответственно. Это восстановление МКЩС после ингибирования с использованием ТРА частично коррелировалось затрудненным гиперфосфорилированием Сх43. Наконец, было обнаружено, что ресвератрол усиливает МКЩС и противодействует влиянию активаторов опухоли на МКЩС, и этот механизм, вероятно, вносит свой вклад в антиканцерогенные свойства ресвератрола.

В патенте УО 0059466 (ЬУМН Кесйегсйе) описано использование экстракта липида из 8ке1еΐοηета сок1а1ит, который содержит алкалоид болдин, в косметическом составе для улучшения симптомов при старении кожи. Упомянутые экстракт липида и соединение болдина улучшают межклеточную коммуникацию по щелевому соединению в кератиноцитах, фибробластах и преадипоцитах. В изобретении показано, что в зависимости от дозы обработка болдином в целом увеличивает содержание коннексина 43 в кератиноцитах пациентов среднего и пожилого возраста до содержания кератиноцитов у молодых людей, при оптимальной концентрации болдина, равной 50 нМ. Так как увеличение содержания коннексина 43 в клетке должно вносить свой вклад в улучшение межклеточной коммуникации по щелевому соединению, то соединение болдина может быть полезено для настоящего изобретения.

Таким образом, целью настоящего изобретения являются способ уменьшения симптомов при старении кожи, целлюлите и при морщинах, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, такого терапевтически эффективного количества хотя бы одного пептида по формулам КУШ или из таблиц 1-8, которое улучшает межклеточную коммуникацию.

Другие химические соединения, в которых также используется структура болдина, включают апорфиноидные алкалоиды, типа таспина, о котором сообщалось в патенте США № 5,156,847, изданном 20 октября 1992 г., для применения при лечении ран.

Химические составы и химические соединения

Химические составы, содержащие описываемые здесь химические соединения для лечения вышеупомянутых болезней и состояний, могут быть любой подходящей формы, и вводиться при необходимости медицинским персоналом или пациентом. Примерами могут служить химические составы для внутривенной инъекции, химические составы для перорального приема, включая таблетки и капсулы, и свечи. Химические соединения по настоящему изобретению могут вводиться в качестве независимого лекарственного средства или в сочетании с другими лекарственного средствами, подходящими для лечения определенной болезни. Описываемые здесь химические соединения являются пептидами сравнительно небольшой молекулрной массы, с относительно низким бионакоплением во рту, если предпочтительными являются составы не для перорального применения, например химические составы для инъекции, или для введения через носовой, или ректальный эпителий, или через кожу, то дополнительно можно применять, например, ионтофорез.

В терапевтических способах по настоящему изобретению, химическое соединение для лечения может вводиться субъекту любым из нескольких способов, включая внутркорпоральное введение, или местное. Кроме того, желательно, чтобы соединения по настоящему изобретению, например, химическое соединение 3, химическое соединение 2, химическое соединение 40, вводились в качестве профилактического средства с целью предотвращения начала целевого состояния или уменьшения степени его тяже

- 91 007792 сти. В другом случае такие предпочтительные химические соединения могут вводиться в течение целевого состояния, например, для облегчения симптомов.

Химическое соединение для лечения вводится субъекту либо одно, либо в сочетании с одним или большим числом терапевтических средств в качестве фармацевтического соединения в смеси с обычным инертным наполнителем, то есть, фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим веществом-носителем, подходящим для парентерального, энтерального или интраназального применения, которое не дает вредной реакции на активные химические соединения и не вредно для его реципиента. К числу подходящих фармацевтически приемлемых носителей, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, можно отнести воду, солевые растворы, спирт, растительные масла, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремневую кислоту, вязкий парафин, парфюмерное масло, моноглицериды и диглицериды жирных кислот, петроэтральные сложные эфиры жирной кислоты, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т.д. Фармацевтические препараты могут стерилизоваться и при необходимости смешиваться со вспомогательными средствами, например, со смазкой, консервирующими средствами, стабилизирующими средствами, смачивающими веществами, эмульгаторами, солями для того, чтобы влиять на осмотическое давление, буферные вещества, красители, вкусовые добавки и/или ароматизаторы и т.п., которые не дают вредной реакции при взаимодействии с активными химическими соединениями.

Такие химические соединения могут готовиться для введения парентерально, особенно в форме жидких растворов или суспензий; для перорального приема, особенно в форме таблеток или капсул; интраназально, особенно в форме порошков, носовых капель, или аэрозолей; вагинально; местно, например, в форме крема; ректально, например в виде свечей; и т. д.

Фармацевтические средства могут удобно вводиться в единичной дозировке и могут готовиться любым известным в фармацевтике способом, например, как описано в Фармацевтических Науках Ремингтона 17-е изд. Редактор Алфонсо Р. Дженнаро, Истон, США, 1985 г. (Кетт§1оп'к РЬагтасеиИса1 8с1епсек 17. Ей. А1Гопко К. Сеппаго (Ей.), Магк РиЬНкЬтд Сотрапу, Еак!оп, РА, И.8.А., 1985). Химические соединения для парентерального введения могут содержать общие инертные наполнители типа стерилизованной воды или соляных растворов, полиалкиленгликоли типа полиэтиленгликоля, масла растительного происхождения, гидрогенизированные нафталины и т.п. В частности, биологически совместимый, разлагаемый микроорганизмами полимер лактида, сополимер лактида и гликолида, или сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена могут использоваться в качестве инертных наполнителей для контроля за выделением некоторых химических соединений по настоящему изобретению и, в частонсти, химического соединения 3, химического соединения 2, химического соединения 40 и т.д.

Другие потенциально используемые парентеральные системы включают частицы сополимера этилена и винилацетата, осмотические насосы, имплантируемые системы вливания, и липосомы. Химические составы для ингаляции содержат в качестве инертных наполнителей, например, лактозу, или могут быть водными растворами, содержащими, например, эфир полиоксиэтилен-9-лаурила, гликохолат и деоксихолат, или масляные растворы для введения в форме носовых капель, или в виде геля, который будет вводиться назально. Химические составы для парентерального введения могут также включить гликохолат для трансбуккального введения, метокисалицилат для ректального введения, или лимонную кислоту для вагинального введения. Другие системы доставки лекарственных средств вводят терапевтическое средство (средства) непосредственно во время хирургической операции, например при помощи стентов.

Концентрация одного или большего числа химических соединений в терапевтической композиции для лечения сильно зависит от множества факторов, включая дозировку вводимого химического соединения по настоящему изобретению, химические характеристики (например, гидрофобность), применяемого химического соединения, и планируемую форму и способ введения. В общем, одно или больше чем одно из химических соединений по настоящему изобретению и желательно по крайней мере одно из таких соединений, как химическое соединение 3, химическое соединение 2, химическое соединение 40, может вводиться парентерально в составе водного физиологического буферного раствора, содержащего приблизительно от 0,1 до 10% химического соединения в отношении массы к объему.

Следует понимать, что фактические количества активных химических соединений, используемых в данной терапии, будут меняться согласно, например, определенному используемому составляемому химическому соединению, способу введения и характеристикам субъекта, например, в зависимости от вида, к которому относится субъект, его пола, массы, общего состояния здоровья и возраста. Оптимальная интенсивность введения для данного протокола введения может быть установлена специалистами с использованием обычных испытаний по определению дозировки, проводимых относительно предшествующих нормативов. Соответствующие диапазоны дозы могут меняться приблизительно от 1 мг/кг приблизительно до 100 мг/кг массы тела в сутки.

Терапевтические соединения по настоящему изобретению, соответственно, применяются в протонированной и водорастворимой форме, например, в виде фармацевтически приемлемой соли, обычно кислой соли типа неорганической кислой соли, например хлоргидрата, сульфата или фосфорнокислой соли, или в виде органической кислой соли типа ацетата, малеата, фумарата, тартрата, или соли лимон

- 92 007792 ной кислоты. Фармацевтически приемлемые соли терапевтических соединений по настоящему изобретению также могут включить соли металла, особенно соли щелочного металла типа поваренной соли или калийной соли; соли щелочно-земельных металлов типа магния или соли кальция; соли аммония типа аммония или тетраметиламмония; или соли аминокислоты типа лизина, аминоуксусной кислоты, или соли фенилаланина.

Составы

Изобретение также относится к химическим соединениям, включающим фармакологически активный антиаритмический пептид по настоящему изобретению в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем и/или разбавителем. Такие составы могут быть в форме, адаптируемой к пероральному, подкожному, парентеральному (внутривенному, интраперитонеальному), внутримышечному, ректальному, эпидуральному, эндотрахеальному, интраназальному, кожному, вагинальному, трансбуккальному, окулярному, прямому в мозг или легочному введению, предпочтительно в форме, адаптируемой к подкожному, внутривенному или пероральному введению, и такие составы могут готовиться известными способами, например, как описано в Фармацевтических Науках Ремингтона 17-е изд. Редактор Алфонсо Р. Дженнаро, Истон, США, 1985 г. (Кеттд1оп'к РЬагтасеийса1 8аепсек 17. Еб. А1Гопко К. Сеппаго (Еб.), Магк РиЬЬкЫпд Сотрапу, Еак!оп, РА, И.8.А., 1985) и в более недавних изданиях и монографиях Марселя Деккера серии Лекарственные препараты и фармацевтические науки (Эгидк апб РЬагтасеийса1 8аепсек, Магсе1 Эеккег). Составы могут быть обычных форм, например, в виде растворов и суспензий для инъекции, включая концентраты для вливания внутривенно, капсулы и таблетки, предпочтительно в форме энтеральных составов, например, как описано в патенте США № 5350741 для перорального приема.

В качестве фармацевтического носителя или растворителя может использоваться обычный твердый или жидкий носитель. Примерами твердых носителей являются лактоза, фарфоровая глина, сахароза, циклодекстрин, тальк, желатин, агар-агар, пектин, акация, стеарат магния, стеариновая кислота или низшие алкильные эфиры целлюлозы. Примерами жидких носителей являются сироп, арахисное масло, оливковое масло, фосфолипиды, жирные кислоты, амины жирной кислоты, полиоксиэтилен и вода.

Точно так же носитель или растворитель могут включить любой один известный материал длительного высвобождения типа глицерилмоностеарата или глицерилдистеарата, или же данный материал, смешанный с воском.

Если используется твердый носитель для перорального приема, препарат может быть таблетирован, помещен в виде порошка или пилюли в твердую желатиновую капсулу, или может быть в форме пастилки или лепешки. Масса твердого носителя может меняться в широких пределах, но обычно составляет приблизительно от 25 мг до 1 г.

Типичная таблетка, которая может быть приготовлена обычными способами изготовления таблеток, может содержать:

Ядро: активное химическое соединение (в виде свободного химического соединения или его соли) 100 мг; коллоидный диоксид кремния (Аэросил) - 1,5 мг; целлюлоза микрокристаллическая (Авицел) - 70 мг; модифицированная целлюлозная смола (Ас-Э1-8о1) - 7,5 мг; стеарат магния.

Оболочка: НРМС приблизительно 9 мг; *Мутеасей 9-40Т приблизительно 0,9 мг; *ацелированный моноглицерид, используемый как пластификатор для пленочного покрытия.

Если используется жидкий носитель, то препарат может быть в форме сиропа, эмульсии, мягкой желатиновой капсулы или стерильной жидкости для инъекции типа водной или неводной жидкой суспензии или раствора.

Состав может также быть в форме, подходящей для местной или системной инъекции или вливания, и может также состоять из стерилизованной воды, или изотонического солевого раствора, или раствора глюкозы. Составы могут стерилизоваться обычными известными способами стерилизации. Готовые водные растворы могут быть упакованы для применения или отфильтрованы в стерильных условиях и лиофилизированны; перед введением лиофилизированный препарат соединяется со стерильным водным раствором. Состав может содержать необходимые фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, которые приближают свойства его к физиологическому состоянию, типа средств буферизации, средств регуляции тонуса и т.п., например, уксуснокислый натрий, молочнокислый натрий, хлористый натрий, хлористый калий, хлористый кальций и т. д.

Пептидные композиции для внутривенной инъекции

Многодозовые композиции могут быть приготовлены в виде раствора химического соединения по настоящему изобретению в стерильном, изотоническом соляном растворе, который хранится в закрытых пробирках, и в случае необходимости к нему добавляются консервирующие средства (например, бензоаты). Фиксированные дозы композиций могут быть приготовлены в виде раствора химического соединения в стерильном, изотоническом соляном растворе, который хранится в стеклянных пробирках, и в случае необходимости заполняется инертным газом. Каждая доза химического соединения хранится в сухом виде в ампулах или закрытых пробирках и в случае необходимости заполняется инертным газом. Для многодозовых композиций требуется самая высокая степень стабильности химического соединения. Ес

- 93 007792 ли стабильность химического соединения низка могут использоваться композиции фиксированной дозы. Пептид может также готовиться как концентрат для внутривенного вливания.

В случае назального введения препарат может содержать химическое соединение по настоящему изобретению, растворенное или взвешенное в жидком носителе, в частности в водном носителе, для применения в виде аэрозоля. Носитель может содержать добавки типа растворителей, например, пропиленгликоль, поверхностно-активные вещества типа соли желчной кислоты или полиоксиэтилен, высшие спиртовые эфиры, усилители поглощения типа лецитина (фосфатидилхолина) или циклодекстрина, или консервирующие средства типа парабина.

Кроме того, небольшая масса пептидных соединений по настоящему изобретению может явиться преимуществом для перорального и назального введения, так как относительно быстрое поглощение через слизистую оболочку, по сравнению с пептидами большей массы, минимизирует ферментативное расщепление, особенно в двенадцатиперстной кишке и подвздошной кишке.

Приготовление энтеральных таблеток, содержащих химическое соединение 2 400 мг Ь-винной кислоты и 40 мг касторового масла, полученного гидрогенизацией полиэтиленгликоля, растворяли в 5 мл метанола. Раствор помещали в ступку, предварительно нагретую до 30°С. К раствору добавляли 1,5 мг химического соединения 2. Сразу же после добавления химического соединения 2 смесь перемешивалась пестиком под струей горячего воздуха, нагретого до 40°С, и затем помещалась в эксикатор под вакуумом на ночь для удаления растворителя. Получаемая твердая масса превращалась пестиком в порошок и растиралась с 30 мг бикарбоната натрия и небольшого количества 70%-ого этилового спирта. Затем смесь делилась на части и формировалась в таблетки и сушилась. Высушенные таблетки покрывались гидроксипропилметилцеллюлозфталатом с полчением энтеральной таблетки.

Изобретение также относится к фармакологически активному антиаритмическому пептиду или производному пептида, или к его функциональному аналогу и применяется в терапии, и для получения фармацевтического соединения для применения в терапии, например, при лечении аритмий и тромбического осложнения при сердечно-сосудистых заболеваниях типа острой ишемической болезни сердца (например, в случае устойчивой стенокардии, нестабильной стенокардии, острого инфаркта миокарда), застойной сердечной недостаточности (например, систолической, диастолической, гиперсистолической, гипосистолической, левосторонней или правосторонней сердечной недостаточности), врожденного порока сердца, легочного сердца, кардиомиопатии, миокардита, гипертонической болезни сердца и при коронарной реваскуляризации.

В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения для лечения и/или предотвращения брадиаритмий (например, вследствие заболевания синусового узла, предсердно-желудочкового узла, предсердно-желудочкового пучка, левой или правой ветви предсердно-желудочкового пучка) и тахиаритмий, связанных с циркуляцией возбуждения (например, предсердные экстрасистолы, атриовентрикулярные комплексы, желудочковые экстрасистолы, фибрилляция предсердий, трепетание предсердий, пароксимальная наджелудочковая тахикардия, синусовая узловая пароксимальная тахикардия циркуляции возбуждения; предсердно-желудочковая узловая пароксимальная тахикардия циркуляции возбуждения и неустойчивая желудочковая тахикардия) может использоваться либо только один антиаритмический пептид, либо антиаритмический пептид в сочетании с другими антиаритмическими химическими соединениями типа средств класса Ι (например, лидокаин), средств класса ΙΙ (например, метопролол или пропранолол), средств класса III (например, амиодарон или соталол) или средств класса IV (например, верапамил).

В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения для предотвращения тромбозов у больных с заболеваниями стенки сосуда (например, атеросклероз) при повышенном продуцировании тромбоцитов (универсальный эеритроцитоз) и/или пониженном кровотоке (порок сердца, сосудистое заболевание) антиаритмический пептид по настоящему изобретению может использоваться либо один, либо в сочетании с такими ингибиторами как СР ПЬ/Ша (например, с7Е3 ЕаЬ; абциксимаб), циклооксигеназа (например, аспирин), антагонисты тромбоксана А2, производные кумадина (например, варфарин), или синтетический пептид интегрилин.

В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения вследствие влияния на межклеточные канальцы щелевых соединений антиаритмический пептид по настоящему изобретению может использоваться для лечения и/или предотвращения потери костной ткани и усиления заживляемости переломов костей^-93-; для лечения и/или предотвращения заболеваний в тканях хряща и суставах с плохой васкуляризацией ^-94-; для лечения и/или предотвращения катаракты^-81-; для лечения и/или предотвращения васкуляризации роговицы при болезненных состояниях с недостаточным питанием роговицы и для улучшения заживляемости роговицы в случае ее повреждения^-95-; для лечения и/или предотвращения роста и распространения по поверхности раковых клеток, типа раковых клеток линий эпителиальных клеток^-96-; для лечения и/или предотвращения артериальной гипертензии путем увеличения сосудодвига-74тельной реакции ; для предотвращения отторжения организмом имплантатов типа клеток и органов.

- 94 007792

Синтез пептидов

Ниже описана процедура по предпочтительному варианту настоящего изобретения. Однако более детальные описания синтеза твердофазных пептидов можно найти в документе А098/11125, который полностью включен в описание настоящего изобретения.

Оборудование и стратегия синтеза

Синтез пептидов осуществлялся партиями в полиэтиленовом сосуде, оборудованном для фильтрации полипропиленовым фильтром с использованием 9-флуоренилметилоксикарбонила (Ртос) в качестве Ν-α-аминоблокирующей группы и подходящих общих блокирующих групп для функциональных групп боковых цепей.

Растворители

Растворитель ОМЕ (Ν,Ν-диметилформамид, Ридель де-Хаен (В1ебе1 бе-Наеи), Франкфурт, Германия) очищался путем пропускания через колонку с насадкой, содержащей сильную катионообменную смолу (сильная кислота Ье^а!й 8 100 МВ/Н, Байер АС Леверкузен, Германия), и анализировался перед использованием на наличие свободных аминов путем введения 3,4-дигидро-3-гидрокси-4-оксо-1,2,3бензотриазина (ЭНЫ-ОН) до пожелтения (ОНЬ1-ОН^-анион) при наличии свободных аминов. Растворитель ЭСМ (дихлорметан, аналитическая марка, Ридель де-Хаен (В1ебе1 бе-Наен), Франкфурт, Германия) использовался без очистки. Ацетонитрил (марка для метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, Лаб-Скан, Дублин, Ирландия) использовалась без очистки.

Аминокислоты

Аминокислоты с защитой боковых цепей, блокирующие Ртос, закупались в компании Эдвансед КемТек (Абуапсеб СНетТесН). По-другому защищенные аминокислоты (Ртос-С1и(ОН)-ОА11у1; РтосАкр(ОН)-ОА11у1 закупались в компании НоваБиокем (ШуаВюсНет) (Швейцария), а аминокислота Ртос4-Нур(О!Ви)-ОН закупалась в компании Бакем (ВасНет) (Швейцария).

Факторы сопряжения

Фактор сопряжения диизопропилкарбодиимид закупался в компании Ридель де-Хаен (В1ебе1 беНаеи), Франкфурт, Германия, а фактор сопряжения РуВор закупался в компании Эдвансед КемТек (Абуаисеб СНетТесН).

Линкеры (4-гидроксиметилфенокси)уксусная кислота (НМРА) закупалась в компании НоваБиокем (№уаВюсНет), Швейцария; и присоединялась к смоле в виде преформированного сложного эфира 1гидроксибензотриазола (НОВ!), произведенного с помощью диизопропилкарбодиимида.

Твердые подложки

Пептиды синтезировали согласно Ртос-стратегии на смолах ТеЩаСе1 8 - 0,22-0,31 ммоль/г (ТеШаСе1-8-Ж₂; ТегИаСе1 8-Ват, ТеШаСе1 ВАМ-Ьук(Вос)Ртос; производство компании Рапп полимер (Варр ро1утеге), Германия);

Катализаторы и другие реактивы

Дилсопропилэтиламин (ДИЕА) закупался в компании Алдрих (А1бпсН), Германия, а этилендиамин в компании Флука (Р1ика), Швейцария, пиперидин и пиридин в компании Ридель де-Хаен (В1ебе1 беНаей), Франкфурт, Германия. 4-(^№диметиламино)пиридин (ОМАР) закупался в компании Флука (Р1ика), Швейцария, и использовался как катализатор в реакциях сопряжения, включающих симметрические ангидриды. Этандитиол закупался в компании Ридель де-Хаен (В1ебе1 бе-Наеи), Франкфурт, Германия. 3,4-дигидро-3-гидрокси-4-оксо-1,2,3-бензотриазин (ЭНЫ-ОН), 1-гидроксибензотриазол (НОВ!) (НО А!) были получены из компании Флука (Р1ика), Швейцария.

Методика сопряжения

Первая аминокислота была получена сопряжением как симметричный ангидрид в ОМР, произведенном от соответствующей Ν-α-блокированной аминокислоты и диизопропилкарбодиимида. Следующие аминокислоты сопрягались как полученные на месте сложные эфиры НОВ! или НОА!, выполненные из соответствующих Ν-α-блокированных аминокислот и НОВ! или НОА! посредством диизопропилкарбодиимида в ОМР. Ацилирование было проверено с помощью нингидриновой реакции, проведенной при 80°С для предотвращения разблокировки Ртос во время испытания¹-⁹⁷-¹.

Разблокировка Ν-α-аминоблокирующей группы (Ртос)

Разблокировка Ртос группы выполнялась обработкой 20 %-м пиперидином в ОМР (1x5 и 1x10 мин), после чего следовала промывка с использованием ОМР (5x15 мл, по 5 мин каждый раз), пока не обнаруживался желтый цвет после добавления ОНЫ-ОН к слитому ОМР.

Разблокировка Аллила

Раствор из 3 экв. Рб(РРН₃)₄, растворенных в 15-20 мл СНС1₃, АсОН, NММ (37:2:1), добавлялся к пептидной смоле. Обработка продолжалась в течение трех часов при комнатной температуре и сопровождалась пропусканием потока Ν2 через смесь.

Сопряжение НОВ!-сложных-эфиров экв. Ν-α-аминоблокированной аминокислоты растворялись в ОМР вместе с 3 экв. НОВ! и 3 экв. диизопропилкарбодиимида и затем добавлялись к смоле.

- 95 007792

Подготовленный симметричный ангидрид экв. Ν-α-аминоблокированной аминокислоты растворялись в ЭСМ и охлаждались до 0°С. Добавлялся диизопропилкарбодиимид (3 экв.) и реакция продолжалась в течение 10 мин. Растворитель удалялся в вакууме и осадок растворялся в ОМЕ. Раствор сразу же добавлялся к смоле, после чего вводился ОМАР в количестве 0,1 экв.

Циклизация пептида на смоле

1,5 экв. РуВор растворялись в ОМЕ вместе с 1,5 экв. НОВ! и 3 экв. ЯММ добавлялись к пептидной смоле. Реакция продолжалась всю ночь.

Отщепление пептида от смолы кислотой

Пептиды отщеплялись от смол путем обработки 95%-м раствором трифторуксусной кислоты (ТФК, Ридель де-Хаен (К1е6е1 6е-Наеп), Франкфурт, Германия) в воде (в объемном отношении) или 95%-м раствором ТФК и 5%-м раствором этандитиола (в объемном отношении) при комнатной температуре в течение 2 ч. Отфильтрованные смолы промывались 95%-м раствором ТФК в воде и фильтраты выпаривались при пониженном давлении. Остаток промывался эфиром и проходил лиофильную сушку с отделением раствора уксусной кислоты в воде. Сырой (неочищенный) прошедший лиофильную сушку продукт анализировался методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и идентифицировался ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением .

Синтез пептидов партиями на смоле Теп1аСе1 (РЕС-Р8)

Смола Теп1аСе1 (1 г, 0,22-0,31 ммоль/г) помещались в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром. Смола набухала в ОМЕ (15 мл), и обрабатывалась 20%-ым раствором пиперидина в ОМЕ для обеспечения присутствия непротонированных аминогрупп на смоле. Смола сливалась и промывалась ОМЕ до тех пор, пока нельзя было обнаружить желтый цвет после добавки Э11Ы-ОН к слитому ОМЕ. НМРА (3 экв.) сопрягался как преформированный сложный эфир НОВ! (как описано выше), и сопряжение продолжалось в течение 24 ч. Смола сливалась и промывалась ОМЕ (5x5 мл, по 5 мин каждый раз) и ацилирование проверялось нингидриновой реакцией. Первая аминокислота сопрягалась как преформированный симметричный ангидрид, как описано выше. Следующие аминокислоты согласно последовательности сопрягались как преформированные Етос-блокированные сложные эфиры НОВ! (3 экв.), как описано выше. Сопряжения продолжались в течение 2 ч, если не оговаривалось иначе. Смола сливалась и промывалась ОМЕ (5x15 мл, по 5 мин каждый раз) с целью удаления избыточного реагента. Все ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С. После полного синтеза пептидная смола промывалась ОМЕ (3x15 мл, по 5 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и, наконец, диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Условия для высокоэффективной жидкостной хроматографии

Градиент высокоэффективной жидкостной хроматографии анализировался с использованием системы высокоэффективной жидкостной хроматографии Не\\1е11 Раскагб 1100, состоящей из четырехступенчатых насосов НР 1100, автоматических пробоотборников НР 1100, колонковых термостатов НР 1100 и многочисленных спектральных датчиков НР 1100, Для инструментального контроля и сбора данных использовалась Не\\'1е11 Раскагб Сйет8!а!1оп с программным обеспечением ЬС (редакция 06.01).

Использовались следующие колонки и буферная система высокоэффективной жидкостной хроматографии:

Колонка

Кготакй, Рйепотепе\ ООЕ-3033-ЕО, 329889 (новая); 5 мкм С-18, 100А 150 х 4,6 мМ;

Партия №5243-10,

Буферная система: А: 0,1% ТФК в МСК; В: 0,085% ТФК, 10% \1СА/ 90% МеСК

Градиент:

1-1,5 мин 25% В

1.5- 13,5 мин 25-50% В

13.5- 14,5 мин 50-100% В

14.5- 15,5 мин 100% В

15.5- 17,5 мин 100-25% В

17.5- 20 мин 25% В

Расход 1,5 мл/мин

Температура в сушильном шкафу 40°С

Детектирование в ультрафиолетовом спектре: λ = 215 нм

Спектры масс были получены на приборе ЬСТ для микромасс.

Вышеупомянутое детальное описание изобретения приводится в заявке υ88Ν 09/792,286, поданной 22 февраля 2001 г.

Обращаясь к настоящему изобретению можно сказать, что оно может применяться для лечения или профилактики болезней, связанных с ухудшенной или нарушенной межклеточной коммуникацией. Межклеточная коммуникация по щелевому соединению (МКЩС) очень важна для нормального функ

- 96 007792 ционирования клеток и тканей млекопитающих, и закрытие или вентильные действия щелевых соединений часто коррелируют с болезненным состоянием. В литературе приводятся примеры ухудшенной межклеточной коммуникации по щелевому соединению, связанной с болезненным состоянием. В то время как вещества, которые блокируют щелевое соединение, известны, отчеты относительно использования химических соединений, которые способствуют или участвуют в коммуникации по щелевому соединению или усиливают МКЩС при лечении непролиферативных болезней ограничены использованием ирзогладина (6-(2,5-дихлорофенил)-2,4-диамино-1,3,5-триазин), который, как сообщают, активизирует межклеточную коммуникацию по щелевому соединению посредством мускариноподобного рецептора ацетилхолина, при этом МКЩС замедлялась, но только один ирзогладин концентрацией от 10^(-10) до 10^(-6)М не воздействовал на МКЩС (авторы Уеда Ф. (иеба, Е) и др., Журнал фармакологии и экспериментальной терапии, (1 Рйагтасо1 Ехр Тйег), август 1995 г.; 274 (2): 815-9).

Поэтому настоящее изобретение относится также к химическому соединению, способствующему межклеточной коммуникации, используемому для приготовления лекарства и, в частности, к агонисту рецептора ААР предпочтительно по формулам КУЕ К числу дополнительных ингредиентов этого лекарства относится фармацевтически приемлемый носитель или инертный наполнитель выбираемый, например, из упомянутых выше носителей и наполнителей.

Синтез отдельных пептидов

Пример Синтеза 1. Синтез пептида Ас-Туг-Рго-4Нур-С1у-А1а-С1у-ОН (Химическое соединение 1) на смоле Теп1аСе1-8-МН-2; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Первая партия: сухая смола Теп1аСе1-8-МН₂ (0,27 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп!аСе1 до полного сопряжения Ν-концевого Тирозина. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Ртос ангидридом уксусной кислоты (1 мл, 10,5 ммоль) вместе со 100 мкл пиридина, растворенного в 2 мл ЭМЕ, ацетилировалась аминогруппа Ν-концевого участка. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась ОМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Сырой (неочищенный) прошедший лиофильную сушку продукт анализировался методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, и было обнаружено, что чистота продукта составляла более 70%, и идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 619,24, расчетная величина МН⁺ составляла 619,26). Выход сырого (неочищенного) материала составлял 137,7 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 58 мг пептида чистотой выше 95%. Полный выход очищенного пептида составлял 35%.

Вторая партия: сухая смола Теп1аСе1-8-ЫН₂ (0,27 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп!аСе1 до полного сопряжения Ν-концевого Тирозина. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Ртос ангидридом уксусной кислоты (1 мл, 10,5 ммоль) вместе со 100 мкл пиридина, растворенного в 2 мл ЭМЕ, ацетилировалась аминогруппа Ν-концевого участка. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась ОМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Сырой (неочищенный) прошедший лиофильную сушку продукт анализировался методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, и было обнаружено, что чистота продукта составляла более 70%, и идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 619,25, расчетная величина МН⁺ составляла 619,26). Выход сырого (неочищенного) материала составлял 137,3 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 27,9 мг пептида чистотой выше 91%. Полный выход очищенного пептида составлял 15,5%.

Пример синтеза 2. Синтез пептида Ас-О-Туг-О-Рго-О-4Нур-С1у-О-А1а-С1у-ЫН₂ (химическое соединение 2) на смоле Теп1аСе1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Первая партия: сухая смола Теп!аСе1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп!аСе1 до полного сопряжения Ν-концевого ΌТирозина. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Етос ангидридом уксусной кислоты (1 мл, 10,5 ммоль) вместе со 100 мкл пиридина, растворенного в 2 мл ОМЕ, ацетили

- 97 007792 ровалась аминогруппа Ν-концевого участка. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась ОМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3х15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого, прошедшего лиофильную сушку продукта составлял 119,7 мг. Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 618,25, расчетная величина МН⁺ составляла 618,28). После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 42 мг пептида чистотой выше 95%. Полный выход очищенного пептида составлял 30%.

Вторая партия: сухая смола Теп1а6е1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аСе1 до полного сопряжения Ν-концевого ΌТирозина. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Етос ангидридом уксусной кислоты (1 мл, 10,5 ммоль) вместе со 100 мкл пиридина, растворенного в 2 мл ОМЕ, ацетилировалась аминогруппа Ν-концевого участка. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась ОМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного), прошедшего лиофильную сушку продукта составлял 119,7 мг. Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 618,29, расчетная величина МН⁺ составляла 618,28). После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 100 мг пептида чистотой выше 99%. Полный выход очищенного пептида составлял 71%.

Пример синтеза 3. Синтез пептида цикло(Ту^-Ρ^о-4Ηуρ-61у-Α1а-61у-Αзи) (химическое соединение 3) на смоле Теп1а6е1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Первая партия: сухая смола Теп1а6е1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аСе1. Первая аминокислота Етос-Αзρ(ΟΗ)-ΟΑ11 присоединялась к смоле Теп1аСе1-8-Еат через карбоновую кислоту боковой цепи, которая, в конце концов, после расщепления становится амидированной (Азп). Затем до полного сопряжения Ν-концевого Тирозина следовала процедура, описанная как синтез пептидов партиями на смоле Теп1аСе1. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Етос и группы Аллила (согласно описанной выше процедуре), связанный смолой пептид проходил циклизацию с использованием РуВор в качестве фактора сопряжения, как описано выше, и сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80 °С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась ИМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ИСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты; выход продукта составлял 57 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 2,7 мг циклического пептида чистотой выше 95%. Полный выход очищенного пептида составлял 1,3%. Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 673,32, расчетная величина МН⁺ составляла 673,28).

Вторая партия: сухая смола Теп1а6е1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аСе1. Первая аминокислота Етос-АзрЩЩΟΑΗ присоединялась к смоле Теп1аСе1-8-Еат через карбоновую кислоту боковой цепи, которая, в конце концов, после расщепления становится амидированной (Азп). Затем до полного сопряжения Ν-концевого Тирозина следовала процедура, описанная как синтез пептидов партиями на смоле Теп1аСе1. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Етос и группы Аллила (согласно описанной выше процедуре), связанный смолой пептид проходил циклизацию с использованием РуВор в качестве фактора сопряжения, как описано выше, и сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась ИМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ИСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты; выход продукта составлял 57 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 10 мг цикли

- 98 007792 ческого пептида чистотой выше 99%. Полный выход очищенного пептида составлял 7%. Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 673,30, расчетная величина МН+ составляла 673,29).

Пример синтеза 4. Синтез пептида Цикло(Туг-Рго-4Нур-С1у-А1а-Акп) (Химическое соединение 4) на смоле Теп1аСе1-Б-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Первая партия: сухая смола Теп1аСе1-Б-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аСе1.

Первая аминокислота Етос-Акр(ОН)-ОА11 присоединялась к смоле Теп1аСе1-Б-Кат через карбоновую кислоту боковой цепи, которая, в конце концов, после расщепления становится амидированной (Акп). Затем до полного сопряжения Ν-концевого Тирозина следовала процедура, описанная как синтез пептидов партиями на смоле Теп1аСе1. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Етос и группы Аллила (согласно описанной выше процедуре), связанный смолой пептид проходил циклизацию с использованием РуВор в качестве фактора сопряжения, как описано выше, и сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80 °С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась ИМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ИСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты с выходом сырого продукта. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, циклический пептид собирался.

Вторая партия: Сухая смола Теп!аСе1-Б-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аСе1. Первая аминокислота Етос-Акр(ОН)-ОА11 присоединялась к смоле Теп1аСе1-Б-Кат через карбоновую кислоту боковой цепи, которая, в конце концов, после расщепления становится амидированной (Акп). Затем до полного сопряжения Ν-концевого Тирозина следовала процедура, описанная как синтез пептидов партиями на смоле Теп1аСе1. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Етос и группы Аллила (согласно описанной выше процедуре), связанный смолой пептид проходил циклизацию с использованием РуВор в качестве фактора сопряжения, как описано выше, и сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась ИМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ИСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты с выходом сырого продукта 58,6 мг.

После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 5,7 мг циклического пептида чистотой выше 98%. Полный выход очищенного пептида составлял 4,4%. Идентичность пептида подтверждалась ионизационной массспектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 616,25, расчетная величина МН⁺ составляла 616,27).

Пример синтеза 5. Синтез пептида Н-С1у-А1а-С1у-И-Нур-Рго-Туг-ИН₂ (химическое соединение 5) на смоле Теп1аСе1-Б-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Теп!аСе1-Б-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аСе1 до полного сопряжения Ν-концевого глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Етос, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ИМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ИСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 46,6 мг пептида чистотой выше 99%. Полный выход очищенного пептида составлял 28,6%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 576,27, расчетная величина МН⁺ составляла

576,26).

Пример синтеза 6. Синтез пептида Н-С1у-А1а-С1у-И-Рго-Рго-Туг-ИН₂ (химическое соединение 6) на смоле Теп1аСе1-Б-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Теп!аСе1-Б-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром обрабатывалась, как описано выше, при периодическом синтезе пептида на смоле Теп1аСе1 до полного сопряжения Ν-концевого Глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при

- 99 007792

80°С, как описано выше. После разблокировки группы Ртос, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ЭМР (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 26 мг пептида чистотой выше 98%. Полный выход очищенного пептида составлял 16,3%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 560,25, расчетная величина МН⁺ составляла

560,28).

Пример синтеза 7. Синтез пептида Н-61у-А1а-61у-0-Рго-А1а-Туг-МН₂ (химическое соединение 7) на смоле Теп1аСе1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Теп1аСе1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аСе1 до полного сопряжения Ν-концевого глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Ртос, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ЭМР (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 18,9 мг пептида чистотой выше 98%. Полный выход очищенного пептида составлял 12,2%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 534,25, расчетная величина МН⁺ составляла

534,26).

Пример синтеза 8. Синтез пептида Н-С1у-А1а-С1у-С1у-0-Рго-Туг-ХН2 (химическое соединение 8) на смоле Теп1аСе1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Теп1аСе1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аСе1 до полного сопряжения Ν-концевого Глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Ртос, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ЭМР (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 130 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 70,1 мг пептида чистотой выше 94%. Полный выход очищенного пептида составлял 48,2%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 520,25, расчетная величина МН⁺ составляла 520,56).

Пример синтеза 9. Синтез пептида Н-61у-А1а-61у-0-Нур-А1а-Туг-МН₂ (химическое соединение 9) на смоле Теп1аСе1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Теп1аСе1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аСе1 до полного сопряжения Ν-концевого Глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80 °С, как описано выше. После разблокировки группы Ртос, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ЭМР (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 131 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 72,4 мг пептида чистотой выше 92%.

Полный выход очищенного пептида составлял 49%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 550,28, расчетная величина МН⁺ составляла 550,59).

Пример синтеза 10. Синтез пептида Н-61у-А1а-61у-0-Нур-0-Рго-Туг-ЫН₂ (химическое соединение 10) на смоле Теп1аСе1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Теп1аСе1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях

- 100 007792 синтеза пептида патриями на смоле Теп1аОе1 до полного сопряжения Ν-концевого глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80 °С, как описано выше. После разблокировки группы Ет0с, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ΌΜΕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), Οί,'Μ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3χ15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 150,8 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 93,1 мг пептида чистотой выше 99%. Полный выход очищенного пептида составлял 58%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН+ составляла 576,63, расчетная величина МН+ составляла 576,63).

Пример синтеза 11. Синтез пептида Η-61у-Α1а-61у-NС6-Ρ^ο-Ту^-NΗ₂ (химическое соединение 11) на смоле Теп1аСе1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Καρρ ρο1уте^е), Германия.

Сухая смола Теп1аСе1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аОе1 до полного сопряжения Ν-концевого глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Ет0с, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ΌΜΕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), Οί,'Μ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 24,3 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 10,2 мг пептида чистотой выше 91%. Полный выход очищенного пептида составлял 4%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 602,23, расчетная величина МН⁺ составляла 602,32).

Пример синтеза 12. Синтез пептида Η-61у-Α1а-61у-Т4С-Ρ^ο-Ту^-NΗ₂ (химическое соединение 12) на смоле Теп1аСе1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Καρρ ρο1уте^е), Германия.

Сухая смола Теп1аСе1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аОе1 до полного сопряжения Ν-концевого глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Ет0с, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ΌΜΕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), Οί,'Μ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 29,9 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 19 мг пептида чистотой выше 97%. Полный выход очищенного пептида составлял 50%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 578,18, расчетная величина МН⁺ составляла 578,23).

Пример синтеза 13. Синтез пептида Η-61у-Α1а-61у-Α2С-Ρ^ο-Ту^-NΗ₂ (химическое соединение 13) на смоле Теп1аСе1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Καρρ ρο1уте^е), Германия.

Сухая смола Теп1аСе1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аСе1 до полного сопряжения Ν-концевого глицина, сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялись нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Ет0с, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ΌΜΕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), Οί,'Μ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 27,3 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 12,7 мг пептида чистотой выше 97%. Полный выход очищенного пептида составлял 34%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 546,28, расчетная величина МН⁺ составляла 546,55).

Пример синтеза 14. Синтез пептида Η-61у-Α1а-61у-ΡС-Ρ^ο-Ту^-NΗ₂ (химическое соединение 14) на смоле Теп1аСе1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Καρρ ρο1уте^е), Германия.

- 101 007792

Сухая смола ТеШаСеРЗ-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле ТейаОе1 до полного сопряжения Ν-концевого глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Ртос, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ΌΜΓ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3χ15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 23,4 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 13,5 мг пептида чистотой выше 97%. Полный выход очищенного пептида составлял 34,6%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 574,32, расчетная величина МН⁺ составляла

574,29).

Пример синтеза 15. Синтез пептида Ас-Туг-Рго-Нур-С1у-А1а-С1у-ХН₂ (химическое соединение 15) на смоле ТегИаСеРЗ-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола ТегИаСеРЗ-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле ТетаСе!' до полного сопряжения Ν-концевого тиразина. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Ртос аминогруппа Ν-концевого участка ацетилировалась ангидридом уксусной кислоты (1 мл, 10,5 ммоль) вместе со 100 мкл пиридина, растворенного в 2 мл ΌΜΓ. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась ΌΜΓ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. После разблокировки группы Ртос, Νконцевой аминогруппы пептидная смола промывалась ОМР(3х15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 89,9 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 80,1 мг пептида чистотой выше 99%. Полный выход очищенного пептида составлял 58,9%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 618,30, расчетная величина МН⁺ составляла

618,28).

Пример синтеза 16. Синтез пептида Н-Суз(Аст)-С1у-А1а-С1у-Нур-Рго-Туг-Суз(Аст)-№Н₂ (химическое соединение 16) на смоле ТеШаСеРЗ-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола ТегИаСеРЗ-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле ТейаСе1 до полного сопряжения Ν-концевого цистина (Аст). Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Ртос, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ЭМР (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 47,3 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 29,1 мг пептида чистотой выше 97%. Полный выход очищенного пептида составлял 12,9%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 924,50, расчетная величина МН⁺ составляла 924,36).

Пример синтеза 17. Синтез пептида Н-Суз (Аст)-С1у-Нур-Рго-Туг-Суз (Аст)-№Н₂ (химическое соединение 17) на смоле ТейаСе1-З-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола ТегИаСеРЗ-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле ТейаСе1 до полного сопряжения Ν-концевого цистина (Аст). Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80 °С, как описано выше. После разблокировки группы Ртос, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ЭМР (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого

- 102 007792 (неочищенного) материала составлял 45,67 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 29,15 мг пептида чистотой выше 94%. Полный выход очищенного пептида составлял 14,9%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 796,25, расчетная величина МН⁺ составляла

796,30).

Пример синтеза 18. Синтез пептида Н-Суз^ст+Туг-Рго-Нур-Су-АП-Су-Суз^ст+МЩ (химическое соединение 18) на смоле Теп!аСе1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Теп1аСе1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аСе1 до полного сопряжения Ν-концевого цистина (Аст). Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Ртос, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ЭМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Сырой (неочищенный) прошедший лиофильную сушку продукт анализировался методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, затем очищался и так же, как и в случае с химическим соединением 17 снимались его характеристики.

Пример синтеза 19. Синтез пептида Н-Суз^ст+Туг-Рго-Нур-Су-Суз^ст+КЩ (химическое соединение 19) на смоле Теп1аСе1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Теп1аСе1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аСе1 до полного сопряжения Ν-концевого цистина (Аст). Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Ртос, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ЭМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 2,76 мг пептида чистотой выше 94%. Полный выход очищенного пептида составлял

17,9 %.

796,30).

Пример синтеза 20. Синтез пептида.

(химическое соединение 20) мг пептида Н-Суз-Ту^-Р^ο-Нур-С1у-Суз-NΉ₂ окислялось путем растворения пептида в 1,5 мл (5%-ая уксусная кислота в воде и диметилсульфоксиде 4:1 (в объемном отношении) рН ~6). Смесь помещалась в морозильник на 6 дней.

После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 91 мг пептида чистотой выше 97%. Полный выход очищенного пептида составлял 47%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 652,29, расчетная величина МН⁺ составляла 652,21)

Пример синтеза 21. Синтез пептида.

(химическое соединение 21).

мг пептида Н-Суз-С+ЦНур-Рго-Туг-Суз-НЩ окислялось путем растворения пептида в 1,5 мл (5%-ая уксусная кислота в воде и диметилсульфоксиде 4:1 (в объемном отношении) рН ~6). Смесь помещалась в морозильник на 6 дней.

После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 6,13 мг пептида чистотой выше 99%. Полный выход очищенного пептида составлял 3%.

- 103 007792

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 652,23, расчетная величина МН⁺ составляла 652,21).

Пример синтеза 22. Синтез пептида Н-С1у-О-А1а-С1у-О-Нур-О-Рго-О-Туг-ХН_; (химическое соединение 22) на смоле Теп1аСе1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Теп1аСе1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аСе1 до полного сопряжения Ν-концевого глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Гтос, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ΌΜΕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ИСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 47 мг пептида чистотой выше 94%. Полный выход очищенного пептида составлял 30%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 576,26, расчетная величина МН⁺ составляла

576,26).

Пример синтеза 23. Синтез пептида Н-С1у-О-А1а-С1у-О-Нур-О-Рго-О-Туг-И-А5п-ОН (химическое соединение 23) на смоле Теп1аСе1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Теп1аСе1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аСе1 до полного сопряжения Ν-концевого глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Гтос, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ΌΜΕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ИСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 93,7 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 60,7 мг пептида чистотой выше 93%.

Полный выход очищенного пептида составлял 47,5%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 690,32, расчетная величина МН⁺ составляла

690,30).

Пример синтеза 24. Синтез пептида Лс-^-Ту^(3,5-ди-I)-^-Р^о-^-Нур-С1у-^-Л1а-С1у-NН₂ (химическое соединение 24).

40.6 мг (64 мкмоль) пептида (химическое соединение 2) растворялось в 10 мл 0,1 М забуференного фосфатного соляного раствора с уровнем рН 6,5 (раствор А).

75.6 мг ΚΊ (400 мкмоль) растворялось в 10 мл забуференного фосфатного соляного раствора с уровнем рН 6,5 и добавлялось 120 йодогранул (ЙОДОГРАНУЛЫ, Ν-хлоробензенсульфонамид. Окислительная способность 0,55 мкмоль/гранула; РГЕКСЕ, 28665ΖΖ) и раствор оставляли при комнатной температуре на 10 мин (раствор В).

Растворы А и В объединялись и осторожно перемешивались в течение 15 мин. Йодированный пептид выделялся и очищался с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше; было собрано 39,5 мг пептида чистотой выше 90%. Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 870,09, расчетная величина МН⁺ составляла 870,08).

Пример синтеза 25. Синтез пептида Ас-О-Туг(моно-йодо)-О-Рго-О-Нур-С1у-О-А1а-С1у-ХН₂ (химическое соединение 25).

40.6 мг (64 мкмоль) пептида (химическое соединение 2) растворялось в 10 мл 0,1М забуференного фосфатного соляного раствора с уровнем рН 6,5 (раствор А).

Растворы А и В объединялись и осторожно перемешивались в течение 15 мин. Йодированный пептид выделялся и очищался с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше; было собрано 3,3 мг пептида чистотой выше 90%. Идентичность пеп

- 104 007792 тида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 744,19, расчетная величина МН⁺ составляла 744,18).

Пример синтеза 26. Синтез пептида Ас-^-Τу^-^-Р^о-^-4Нур-(1,2¹³С,1⁵N-61у)-^-А1а-(1,2¹³С,1⁵NС1у)-№Н₂ (химическое соединение 26) на смоле Τеηΐа^е1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Τеηΐа^е1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Τеηίа^е1 до полного сопряжения Ν-концевого Ό-тирозина. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Ртос ангидридом уксусной кислоты (1 мл, 10,5 ммоль) вместе со 100 мкл пиридина, растворенного в 2 мл ОМ^, ацетилировалась аминогруппа Ν-концевого участка. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась ЭМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 142,4 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 79,7 мг пептида чистотой выше 99 %. Полный выход очищенного пептида составлял 50%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 624,25, расчетная величина МН⁺ составляла

624,26).

Пример синтеза 27. Синтез пептида Н-Р^о-Τу^-А8η-61у-А1В-61у-Нур-NН₂ (химическое соединение

27) на смоле Τеηίа6е1-8-Кат; Производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Τеηΐа^е1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Τеηΐа^е1 до полного сопряжения Ν-концевого пролина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Ртос, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ЭМБ (3x15 мл /1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 135,7 мг пептида чистотой выше 98%. Полный выход очищенного пептида составлял 82,7%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 690,38, расчетная величина МН⁺ составляла

690,31).

Пример синтеза 28. Синтез пептида Н-Нур-Р^о-Τу^-А8η-61у-А1а-61у-NН₂ (химическое соединение

28) на смоле Τеηίа6е1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Τеηίа^е1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) Помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Τеηΐа^е1 до полного сопряжения Ν-концевого 4-гидрокси-пролина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Ртос, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ОМК (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 127 мг пептида чистотой выше 98%. Полный выход очищенного пептида составлял 69,8%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 690,25, расчетная величина МН⁺ составляла

690,31).

Пример синтеза 29. Синтез пептида Н-8а^-А1а-8а^-Нур-Р^о-Τу^-NН₂ (Химическое соединение 29) на смоле Τеηίа6е1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Τеηΐа^е1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Τеηίа^е1 до полного сопряжения Ν-концевого Саркозина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Ртос, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ОМК (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как

- 105 007792 описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 150 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 85,5 мг пептида чистотой выше 93%. Полный выход очищенного пептида составлял 57%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 604,33, расчетная величина МН⁺ составляла

604,30).

Пример синтеза 30. Синтез пептида 4-^^13-8:4-4)-1:)^0^4^42 (Химическое соединение 30) на смоле ТеШаСе^-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Те1'ИаСе1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле ТейаСеГ до полного сопряжения Ν-концевого глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Ешос, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ОМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 124 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 64,8 мг пептида чистотой выше 96%. Полный выход очищенного пептида составлял 41,6%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 590,19, расчетная величина МН⁺ составляла

590,29).

Пример синтеза 31. Синтез пептида А8Л^-Р^ο-Нур-С1у-А1а-С1у-NН₂ (химическое соединение 31) на смоле ТегиаСе1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Те1'ИаСе1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле ТейаСеГ до полного сопряжения Ν-концевого пролина. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Етос аминогруппа Ν-концевого участка ацетилировалась азидосалициловой кислотой с использованием стандартной процедуры сопряжения, как описано выше. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась ОМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 15,9 мг пептида чистотой выше 94%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 575,23, расчетная величина МН⁺ составляла 575,56).

Пример синтеза 32. Синтез пептида А8Л^(моно-йодо)-Р^ο-Нур-С1у-А1а-С1у-NН₂ (химическое соединение 32).

10,3 мг пептида (Химическое соединение 31) растворялось в 2,5 мл 0,1М забуференного фосфатного соляного раствора с уровнем рН 6,5 (раствор А).

18,9 мг К (100 мкмоль) растворялось в 2,5 мл забуференного фосфатного соляного раствора с уровнем рН 6,5 и добавлялось 30 йодогранул (ЙОДОГРАНУЛЫ, Ν-хлоро-бензенсульфонамид. Окислительная способность 0,55 мкмоль/гранула; РГЕКСЕ, 28665ΖΖ) и раствор оставляли при комнатной температуре на 10 мин (раствор В).

Растворы А и В объединяли и осторожно перемешивали в течение 1 ч. Йодированный пептид выделялся и очищался с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше; было собрано 4,4 мг пептида чистотой выше 99%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 701,13, расчетная величина МН⁺ составляла 701,46).

Пример синтеза 33. Синтез пептида ЛВ-Ту^-Р^ο-Нур-С1у-А1а-С1у-NН₂ (химическое соединение 33) на смоле ТегиаСе1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Те1'ИаСе1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле ТейаСеГ до полного сопряжения Ν-концевого тирозина. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Етос аминогруппа Ν-концевого участка ацетилировалась Азидобензойной кислотой с использованием стандартной процедуры сопряжения, как описано выше. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой

- 106 007792 реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась ЭМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 20,5 мг пептида чистотой выше 90%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 721,28, расчетная величина МН⁺ составляла

721,26).

Пример синтеза 34. Синтез пептида АВ-Туг(3,5-ди-йодо)-Рго-Нур-С1у-А1а-С1у-ХН₂ (химическое соединение 34).

10,3 мг пептида (химическое соединение 34) растворялось в 2,5 мл 0,1М забуференного фосфатного соляного раствора с уровнем рН 6,5 (раствор А).

18,9 мг К! (100 мкмоль) растворялось в 2,5 мл забуференного фосфатного соляного раствора с уровнем рН 6,5 и добавлялось 30 йодогранул (ЙОДОГРАНУЛЫ, Ν-хлоро-бензенсульфонамид. Окислительная способность 0,55 мкмоль/гранула; РГЕКСЕ, 28665ΖΖ) и раствор оставляли при комнатной температуре на 10 мин (раствор В).

Растворы А и В объединяли и осторожно перемешивали в течение 1 ч. Йодированный пептид выделялся и очищался с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше; было собрано 1,2 мг пептида чистотой выше 90 %. Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 973,08, расчетная величина МН⁺ составляла 973,46).

Пример синтеза 35. Синтез пептида цикло(-С1у-А1а-С1у-Нур-Рго-Туг-С1п-) (химическое соединение

35) на смоле Теп!аСе1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Теп!аСе1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп!аСе1. Первая аминокислота Етос-С1и(ОН)-ОА11 присоединялась к смоле Теп!аСе1-8-Кат через карбоновую кислоту боковой цепи, которая, в конце концов, после расщепления становится амидированной (С1п). Затем до полного сопряжения Ν-концевого Глицина следовала процедура, описанная как синтез пептидов партиями на смоле Теп!аСе1. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Етос и группы Аллила (согласно описанной выше процедуре), связанный смолой пептид проходил циклизацию с использованием РуВор в качестве фактора сопряжения, как описано выше, и сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась ОМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 135,3 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 19,1 мг пептида чистотой выше 98%. Полный выход очищенного пептида составлял 6,6%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 687,38, расчетная величина МН⁺ составляла

687,32).

Пример синтеза 36. Синтез пептида цикло(-С1у-А1а-С1у-Нур-Рго-Туг-Акп-) (Химическое соединение

36) на смоле Теп!аСе1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Теп!аСе1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещался в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп!аСе1. Первая аминокислота Етос-Акр(ОН)-ОА11 присоединялась к смоле Теп!аСе1-8-Кат через карбоновую кислоту боковой цепи, которая, в конце концов, после расщепления становится амидированной (Акп). Затем до полного сопряжения Ν-концевого глицина следовала процедура, описанная как синтез пептидов партиями на смоле Теп!аСе1. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Етос и группы аллила (согласно описанной выше процедуре), связанный смолой пептид проходил циклизацию с использованием РуВор в качестве фактора сопряжения, как описано выше, и сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась ОМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 63,4 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 13,2 мг пептида чистотой выше 97%. Полный выход очищенного пептида составлял 6,2%.

- 107 007792

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 673,38, расчетная величина МН⁺ составляла

673.30) .

Пример синтеза 37. Синтез пептида цикло(-С1у-А1а-С1у-Рго-Рго-Туг-Акп-) (химическое соединение

37) на смоле Теп1аСе1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Теп1аСе1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещался в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аСе1. Первая аминокислота Ртос-Акр(ОН)-ОА11 присоединялась к смоле Теп1аСе1-8-Кат через карбоновую кислоту боковой цепи, которая, в конце концов, после расщепления становится амидированной (Акп). Затем до полного сопряжения Ν-концевого Глицина следовала процедура, описанная как синтез пептидов партиями на смоле ТеШаСеГ. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Ртос и группы аллила (согласно описанной выше процедуре), связанный смолой пептид проходил циклизацию с использованием РуВор в качестве фактора сопряжения, как описано выше, и сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась БМР (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), БСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 85,1 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 9,8 мг пептида чистотой выше 98%. Полный выход очищенного пептида составлял 3,5%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 657,38, расчетная величина МН⁺ составляла

657.31) .

Пример синтеза 38. Синтез пептида цикло(Туг(3,5-дийодо)-Рго-4Нур-С1у-А1а-С1у-Акп) (химическое соединение 38).

10.8 мг пептида (химическое соединение 3) растворялось в 2,5 мл 0,1М забуференного фосфатного соляного раствора с уровнем рН 6,5 (раствор А).

18.9 мг КГ (400 мкмоль) растворялось в 2,5 мл забуференного фосфатного соляного раствора с уровнем рН 6,5 и добавлялось 30 йодогранул (ЙОДОГРАНУЛЫ, Ν-хлоро-бензенсульфонамид. Окислительная способность 0,55 мкмоль/гранула; РШКСЕ, 28665ΖΖ) и раствор оставляли при комнатной температуре на 10 мин (раствор В).

Растворы А и В объединяли и осторожно перемешивали в течение 2 ч. Йодированный пептид выделялся и очищался с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше; было собрано 9,8 мг пептида чистотой выше 95%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 925,10, расчетная величина МН⁺ составляла

925,30).

Пример синтеза 39. Синтез пептида Н-С1у-А1а-С1у-Акп-ТугЖН_; (химическое соединение 39) на смоле Теп1аСе1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Теп1аСе1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аСе1 до полного сопряжения Ν-концевого глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80 °С, как описано выше. После разблокировки группы Ртос, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась БМР (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), БСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 124 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 26,5 мг пептида чистотой выше 96%. Полный выход очищенного пептида составлял 20,5%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 480,24, расчетная величина МН⁺ составляла 480,50).

Пример синтеза 40. Синтез пептида Ас-С1у-Акп-ТугЖН_; (химическое соединение 40) на смоле Теп1аСе1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Теп1аСе1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аСе1 до полного сопряжения Ν-концевого глицина. После разблокировки группы Ртос аминогруппа Ν-концевого участка ацетилировалась ангидридом уксусной кислоты (1 мл, 10,5 ммоль) вместе со 100 мкл пиридина, растворенного в 2 мл БМР. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как

- 108 007792 описано выше. После ацилирования аминогруппы Ν-концевого участка пептидная смола промывалась ОМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 90,4 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 63,4 мг пептида чистотой выше 99%. Полный выход очищенного пептида составлял 65,1%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 394,16, расчетная величина МН⁺ составляла 394,20).

Пример синтеза 41. Синтез пептида Н-б^-Акп-Туг-МЩ (химическое соединение 41) на смоле Теп!а0е1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Теп!а0е1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп!а0е1 до полного сопряжения Ν-концевого глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Етос, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ОМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 91,4 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 62,1 мг пептида чистотой выше 95 %. Полный выход очищенного пептида составлял 54,5 %.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 352,16, расчетная величина МН⁺ составляла 352,18).

Пример синтеза 42. Синтез пептида Ас-А1а-01у-А8η-Ту^-NН₂ (химическое соединение 42) на смоле Теп!а0е1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Теп!а0е1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп!а0е1 до полного сопряжения Ν-концевого аланина. После разблокировки группы Етос ангидридом уксусной кислоты (1 мл, 10,5 ммоль) вместе со 100 мкл пиридина, растворенного в 2 мл ОМЕ, ацетилировалась аминогруппа Ν-концевого участка Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После ацилирования аминогруппы Ν-концевого участка пептидная смола промывалась ОМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 105 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 52 мг пептида чистотой выше 98%. Полный выход очищенного пептида составлял 45%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 465,22, расчетная величина МН⁺ составляла

465,30).

Пример синтеза 43. Синтез пептида 4^13-01)^511^4^42 (химическое соединение 43) на смоле Теп!а0е1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Теп!а0е1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп!а0е1 до полного сопряжения Ν-концевого Аланина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Етос, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ОМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 104,5 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 77,8 мг пептида чистотой выше 96%. Полный выход очищенного пептида составлял 58,8%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 423,19, расчетная величина МН⁺ составляла 423,28).

Пример синтеза 44. Синтез пептида цикло(-Туг-А1а-8ег-А1а-01у-Акп-) (химическое соединение 44) на смоле Теп!а0е1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

- 109 007792

Сухая смола Теп!аСе1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аСе1. Первая аминокислота Етос-Акр(ОН)-ОА11 присоединялась к смоле Теп!аСе1-8-Кат через карбоновую кислоту боковой цепи, которая, в конце концов, после расщепления становится амидированной (Акп). Затем до полного сопряжения Ν-концевого тирозина следовала процедура, описанная как синтез пептидов партиями на смоле Теп1аСе1. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Етос и группы аллила (согласно описанной выше процедуре), связанный смолой пептид проходил циклизацию с использованием РуВор в качестве фактора сопряжения, как описано выше, и сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась ОМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 60,2 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 5,0 мг пептида чистотой выше 87%. Полный выход очищенного пептида составлял 4,3 %.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 564,25, расчетная величина МН⁺ составляла 564,57).

Пример синтеза 45. Синтез пептида цикло(-Туг-С1у-Акп-Туг-С1у-Акп-) (химическое соединение 45) на смоле Теп!аСе1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Теп1аСе1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аСе1. Первая аминокислота Етос-Акр(ОН)-ОА11 присоединялась к смоле Теп!аСе1-8-Кат через карбоновую кислоту боковой цепи, которая, в конце концов, после расщепления становится амидированной (Акп). Затем до полного сопряжения Ν-концевого тирозина следовала процедура, описанная как синтез пептидов партиями на смоле Теп1аСе1. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Етос и группы аллила (согласно описанной выше процедуре), связанный смолой пептид проходил циклизацию с использованием РуВор в качестве фактора сопряжения, как описано выше, и сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась ОМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 79,1 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 20 мг пептида чистотой выше 90%. Полный выход очищенного пептида составлял 14,0%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 569,25, расчетная величина МН⁺ составляла 569,67).

Пример синтеза 46. Синтез пептида цикло(-Туг-С1у-Акп-Туг-А1а-С1у-Акп-) (химическое соединение

46) на смоле Теп!аСе1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 58,9 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 15,9 мг пептида чистотой выше 98 %. Полный выход очищенного пептида составлял 11%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 740,31, расчетная величина МН⁺ составляла 740,75).

- 110 007792

Пример синтеза 47. Синтез пептида цикло(-Туг-уа1-8ег-С1у-Л1а-С1у-Акг1-) (химическое соединение

47) на смоле Тей;1Се1-8-Ват; производство компании Рапп полимер (Варр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Те1'ИаСе1-8-Ват (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле ТейаСе1. Первая аминокислота Ртос-Лкр(ОН)-ОЛН присоединялась к смоле Те1'ИаСе1-8-Ват через карбоновую кислоту боковой цепи, которая, в конце концов, после расщепления становится амидированной (Акп). Затем до полного сопряжения Ν-концевого тирозина следовала процедура, описанная как синтез пептидов партиями на смоле ТейаСе1. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Ртос и группы аллила (согласно описанной выше процедуре), связанный смолой пептид проходил циклизацию с использованием РуВор в качестве фактора сопряжения, как описано выше, и сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80 °С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась ЭМР (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 54,1 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 19,6 мг пептида чистотой выше 95%. Полный выход очищенного пептида составлял 15%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 649,10, расчетная величина МН⁺ составляла 649,68).

Пример синтеза 48. Синтез пептида Н-С1у-Р^о-Нур-С1у-Л1а-С1у-ОН (химическое соединение СЕ-1) на смоле ТеШаСе^-Ж^; производство компании Рапп полимер (Варр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Теη!аСе1-8-NН-2 (0,27 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле ТейаСе1 до полного сопряжения Ν-концевого глицина. Сопряжении продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80 °С, как описано выше. После разблокировки группы Ртос, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ЭМР (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 16,9 мг пептида чистотой выше 92%. Полный выход очищенного пептида составлял 10,1%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 471,22, расчетная величина МН⁺ составляла 471,21).

Пример синтеза 49. Синтез пептида 4-^^13-^--45-13-014^4^42 (химическое соединение СЕ-2) на смоле ТейаСе1-8-Ват; производство компании Рапп полимер (Варр ро1утеге), Германия.

Сухая смола ТейаСе1-8-Ват (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле ТейаСе1 до окончания связи Ν-концевого участка Глицин. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Ртос, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ОМР (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 159 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 101 мг пептида чистотой выше 98%. Полный выход очищенного пептида составлял 60%.

576,26).

Пример синтеза 50. Синтез пептида 3-(4-гидроксифенил)пропионил-Р^о-Нур-С1у-Л1а-С1у-NН₂ (химическое соединение СЕ-3) на смоле ТейаСе1-8-Ват; производство компании Рапп полимер (Варр ро1утеге), Германия.

Сухая смола ТейаСе1-8-Ват (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле ТейаСе1 до полного сопряжения Ν-концевого пролина. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Ртос аминогруппа Ν-концевого участка ацетилировалась 3-(4-гидроксифенил)пропионовой кислотой с использованием стандартной процедуры сопряжения, как описано выше. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось

- 111 007792 нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась ЭМР (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в гакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого (неочищенного) материала составлял 143 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 73,7 мг пептида чистотой выше 95%. Полный выход очищенного пептида составлял 50%.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 561,30, расчетная величина МН⁺ составляла 561,24).

Синтез химических соединений по настоящему изобретения

Пример 51. Синтез удлиненных пептидов К6.

Синтез пептида Н-С1у-А1а-С1у-Нур-Рго-Туг-Ьуз-Ьуз-Ьуз-Ьуз-Ьуз-Ьуз-ОН (химическое соединение

48) на смоле ТеηίаСе1-8-NΉ₂; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола ТетаСе^-ИЩ (0,27 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аСе1 до полного сопряжения Ν-концевого глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи и проверялись нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Ртос, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ОМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 1344,7, расчетная величина МН⁺ составляла 1344.82). После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 121 мг пептида чистотой выше 99%.

Синтез пептида 3 (4-гидроксифенил)пропионил-Рго-Нур-С1у-А1а-С1у-Ь.уз-Ьуз-Ьуз-Ьуз-Ьуз-Ьуз-ОН (химическое соединение 49) на смоле ТетаСе^-ЯШ; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола ТеηΐаСе1-8-NΉ₂ (0,27 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аСе1 до полного сопряжения Ν-концевого пролина. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Ртос аминогруппа Ν-концевого участка ацетилировалась 3-(4-гидроксифенил)-пропионовой кислотой с использованием стандартной процедуры, как описано выше. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась ЭМР (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по I мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 1329,88, расчетная величина МН⁺ составляла 1329.81). После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 99,7 мг пептида чистотой выше 98%.

Синтез пептида Н-С1у-А1а-С1у-Нур-Р^ο-Ту^-^уз-^уз-^уз-^уз-^уз-^уз-NΉ₂ (химическое соединение 50) на смоле Теп!аСе1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Теп1аСе1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аСе1 до полного сопряжения Ν-концевого глицина. Сопряженп продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После разблокировки группы Ртос, Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ЭМР (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ЭСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 1343,6, расчетная величина МН⁺ составляла 1343.84). После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 84,7 мг пептида чистотой выше 98%.

Синтез пептида 3(4-гидроксифенил)пропионил-Р^ο-Нур-С1у-А1а-С1у-^уз-^уз-^уз-^уз-^уз-^уз-NН₂(химическое соединение 51) на смоле Теп1аСе1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

- 112 007792

Сухая смола Теп!аСе1-Б-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аСе1 до полного сопряжения Ν-концевого пролина. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Етос аминогруппа Ν-концевого участка ацетилировалась 3-(4-гидроксифенил)-пропионовой кислотой с использованием стандартной процедуры, как описано выше. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась ИМЕ (3x15 мл, 1 мМ каждый), ИСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Выход сырого, прошедшего лиофильную сушку продукта составлял 299 мг.

Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 1328,9, расчетная величина МН⁺ составляла 1329,1). После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной роматографии, как описано выше, было собрано 155 мг пептида чистотой выше 94%.

Пример 52. Синтез Н-С1у-\/(СН_;-НН)-Акп-Туг-ОН xТЕА (химическое соединение 52).

1) Вос-Акп-Туг (!Ви)-О!Ви.

Вос-Акп-ОН (3,5 г, 15 ммоль) растворялся в дихлорметане (100 мл амилена, стабилизированного без спирта) и к нему добавлялся НОВ! (2,24 г в сухом виде, 16,5 ммоль). Смесь охлаждалась при температуре таяния льда, и к ней добавлялся диизопропилкарбодиимид (2,45 мл, 16 ммоль). Смесь реагировала в течение 20 мин. НОВ! в придонной области вступает в реакцию, и образуется осадок ИШ (в верхней части). Н-Туг (!Ви)-О!Ви x НС1 (5,1 г, 15,4 ммоль) растворяется в ИМЕ (30 мл в сухом виде). Смесь дихлорметана, содержащая активизированный сложный эфир, отделяется на фильтре от ИШ и направляется непосредственно в раствор ИМЕ. Объединенная смесь охлаждается мри температуре таяния льда, и к ней добавляется ИММ (1,75мл, 15,8 ммоль). Смесь реагирует в течение ночи. Растворители удаляются в вакууме. Добавляется 200 мл этилацетата и удаляется осадок и раствор промывается лимонной кислотой (2x50 мл, 10%), кислым карбонатом натрий (2x50 мл, насыщенный раствор) и соляным раствором (2x50 мл). Раствор сушится сульфатом магния, и растворитель удаляется в вакууме при давлении 0,2 мбар в течение 30 мин. Сырой (неочищенный) продукт суспендируется в пентане (40 мл) и и отфильтровывается от осадка ИШ. Пентан удаляется в вакууме с выходом всего химического соединения.

2) Акп-Туг х ТФК.

Вос-Акп-Туг (!Ви)-О!Ви (7,1 г, 14 ммоль) растворялся в ТФК/ЕИТ 19/1 (30 мл) и оставлялся на 2 ч. ТФК удалялась в вакууме и для осаждения продукта добавлялся эфир (200 мл). Эфир отделялся декантацией от продукта, который промывался эфиром (3x100 мл). Затем изделие сушится в вакууме с выходом продукта, который может использоваться без дальнейшей очистки.

3) Вос-С1у-\/(СН2-НН)-Акп-Туг-ОН.

Акп-Туг x ТФК (5,6 г, 13,7 ммоль) и уксусная кислота (1 мл) растворялись в метаноле (100 мл сухой) и к расвору добавлялся Вос-глицинал (2,72 г, 17 ммоль). Смесь перемешивалась в течение 10 мин, затем добавлялся цианоборогидрид натрия (2,15 г) более чем на 30 мин. Смесь перемешивалась еще в течение 2 ч. Большая часть метанола удалялась в вакууме. Добавлялся этилацетат (200 мл), и комплекс бора гидролизовался встряхиванием с насыщенным раствором бикарбоната натрия (100 мл) в течение 15 мин. Этилацетат промывался насыщенным раствором бикарбоната натрия (100 мл). С помощью этилацетата (100 мл) извлекались смешанные водные фазы. Смешанные органические фазы промывались соляным раствором (2x50 мл) и просушивались сульфатом магния. Этилацетат удалялся в вакууме с выходом необходимого продукта.

4) Н-С1у-\/(СН₂-НН)-Акп-Туг-ОН x ТФК.

Также как и в случае 2) все начинается с Вос-С1у-\/(СН_;-НН)-Акп-Туг-ОН (5,20 г, 11,9 ммоль). Выход (ожидаемый) готового продукта составляет приблизительно 5,37 г (100%). Аналитически чистый образец получают путем очистки 1 г сырого продукта методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Ожидаемый выход составляет приблизительно 90 %. Чистота> 98%.

Пример 53. Твердофазный синтез Ас-С1у-Акп-Туг-ИН₂ (химическое соединение 53), цикло(Туг-Рго4Нур-С1у-А1а-С1у-Акп) (химическое соединение 54), Ас-О-Туг-О-Рго-О-4Нур-С1у-О-А1а-С1у-ХН₂ (химическое соединение 55), Ас-Акп-Туг-ИН₂ (химическое соединение 56), Ас-С1у-Туг-ИН₂ (химическое соединение 57), гидроксиацетил-Акп-Туг-ЫН₂ (химическое соединение 58), Н-С1у(УСН_;НН)-С1у-Туг-НН₂(Химическое соединение 59) и Н-С1у-Акп-Р11е(рНО₂)-НН_; (химическое соединение 60).

Об общих способах твердофазного синтеза сообщалось в заявке РСТ/иБ01/19113 озаглавленной Новые конъюгаты пептидов, авторы Ларсен (Ьагкеп, В.И.) и др.

Синтез пептида цикло(Туг-Рго-4Нур-С1у-А1а-С1у-Акп) (химическое соединение 54) на смоле Теп!аСе1-Б-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

- 113 007792

Первая партия: сухая смола Теп1а6е1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аСе1.

Первая аминокислота Етос-Азр^^^АЙ присоединялась к смоле Теп1а6е1-8-Кат через карбоновую кислоту боковой цепи, которая, в конце концов, после расщепления становится амидированной (Азп). Затем до полного сопряжения Ν-концевого Тирозина следовала процедура, описанная как синтез пептидов партиями на смоле Теп1аСе1. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Етос и группы Аллила (согласно описанной выше процедуре), связанный смолой пептид проходил циклизацию с использованием РуВор в качестве фактора сопряжения, как описано выше, и сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80 °С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась ОМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ИСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Вторая партия: Сухая смола Теп1а6е1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аСе1. Первая аминокислота Етос-Азр^^^АЙ присоединялась к смоле Теп1аСе1-8-Еат через карбоновую кислоту боковой цепи, которая, в конце концов, после расщепления становится амидированной (Азп). Затем до полного сопряжения Ν-концевого Тирозина следовала процедура, описанная как синтез пептидов партиями на смоле Теп1аСе1. Сопряжения продолжались в течение ночи. После разблокировки группы Етос и группы аллила (согласно описанной выше процедуре), связанный смолой пептид проходил циклизацию с использованием РуВор в качестве фактора сопряжения, как описано выше, и сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80 °С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась ИМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ИСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты; выход продукта составлял 57 мг. После очистки с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше, было собрано 10 мг циклического пептида чистотой выше 99 %. Полный выход очищенного пептида составлял 7%. Идентичность пептида подтверждалась ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением (экспериментально полученная величина МН⁺ составляла 673,30, расчетная величина МН⁺ составляла 673,29).

Синтез пептида Ас-Азп-Туг-ΝΗ (химическое соединение 56) на смоле Теп1а6е1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Теп1а6е1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1аСе1 до полного сопряжения Ν-концевого аспарагина. После разблокировки группы Етос аминогруппа Ν-концевого участка ацетилировалась ангидридом уксусной кислоты (1 мл, 10,5 ммоль) вместе со 100 мл пиридина, растворенного в 2 мл ИМЕ. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После ацилирования Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ИМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ИСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Синтез пептида Ас-СК-Туг-НШ (химическое соединение 57) на смоле Теп1а6е1-8-Кат; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Теп1а6е1-8-Кат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп1а6е1 до полного сопряжения Ν-концевого глицина. После разблокировки группы Етос аминогруппа Ν-концевого участка ацетилировалась ангидридом уксусной кислоты (1 мл, 10,5 ммоль) вместе со 100 мл пиридина, растворенного в 2 мл ИМЕ. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После ацилирования Ν-концевой аминогруппы пептидная смола промывалась ИМЕ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ИСМ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

- 114 007792

Синтез пептида гидроксиацетил-Лκη-Τу^-NН₂ (химическое соединение 58) на смоле Τеηΐа6е1-δКат; производство компании Рапп полимер (Κ·ιρρ ρο1уте^е), Германия.

Сухая смола Τеηΐа6е1-δ-Κат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Τеηίа6е1 до полного сопряжения Ν-концевого аспарагина. После разблокировки группы Етос аминогруппа Ν-концевого участка ацетилировалась гидроксиуксусной кислотой с использованием стандартной процедуры сопряжения, как описано выше. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После ацилирования аминогруппы Ν-концевого участка пептидная смола промывалась ΌΜΡ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ΩΟΜ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Синтез пептида Η-61ν(ΥΟΗ₂ΝΗ)-61ν-ΤνΓ-ΝΗ₂ (химическое соединение 59) на смоле Τеηΐа6е1-δКат; производство компании Рапп полимер (Κ·ιρρ цо^утеге), Германия.

Сухая смола Τеηΐа6е1-δ-Κат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Τеηΐа6е1 до полного сопряжения С-концевого тирозина. После разблокировки группы Етос аминогруппа Ν-концевого участка ацетилировалась бромуксусной кислотой с использованием стандартной процедуры сопряжения, как описано выше. Сопряжение продолжалось в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После ацилирования аминогруппы Ν-концевого участка пептидная смола обрабатывалась избыточным количеством этилендиамина, растворенного в ΌΜΡ. Реакция продолжалась в течение ночи. Затем пептидная смола промывалась ΌΜΡ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ΩΟΜ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Синтез пептида Η-61у-Лκη-ΡЬе(ρNΟ₂)-NΗ₂ (химическое соединение 60) на смоле Τеηίа6е1-δ-Κат; производство компании Рапп полимер (Κ·ιρρ ρο1уте^е), Германия.

Сухая смола Τеηΐа6е1-δ-Κат (0,23 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Τеηΐа6е1 до полного сопряжения Ν-концевого глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80 °С, как описано выше. После разблокировки группы Етос пептидная смола промывалась ΌΜΡ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), ΩΟΜ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пример 54. Синтез пептида 61у-(^ΒЕ)-Τу^-NΗ₂ x ТФК (химическое соединение 61).

Общие способы твердофазного синтеза рассмотрены в заявке ΡСΤ/υδ01/19113 озаглавленной Новые конъюгаты пептидов, авторы Ларсен Б. Д. (Ваткет Β.Ό.) и др. при следующих изменениях.

Синтез пептидов партиями на смоле Τеηίа6е1-δ-ΚΑΜ (ΡΕ6-Ρδ)

Смола Τеηΐа6е1 (1 г, 0,22-0,31 ммоль/г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром. Смола набухала в ΌΜΡ (15мл), и удалялась группа Етос (см. разблокировку Ν-α-аминоблокирующей группы (Етос)). Следующие аминокислоты согласно последовательности сопрягались как преформированные Етос-блокированные сложные эфиры ΗΟΒΐ (3 экв.), как описано выше. Сопряжения продолжались в течение 2 ч, если не оговаривалось иначе. Смола сливалась и промывалась ΩΜΒ (5x15 мл, по 5 мин каждый раз) с целью удаления избыточных реактивов. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С. После полного синтеза пептидная смола промывалась ΩΜΒ (3x15 мл, по 5 мин каждый раз), ΩΟΜ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и, наконец, диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Аминокислота

4-(Етос-2-аминоэтил)-6-дибензофуранпропионовая кислота (Втос-ΩΒΒ-ΟΗ) закупалась в компании Неосистем (№окук!ет), Страсбург, Франция.

Аналитический метод высокоэффективной жидкостной хроматографии

Колонка: νΥΩΑί.’ 238ΤΡ5415 150x4,6 мм мономерный ΚΡ С18 5 мкм 300 А

Расход: 1,00 мл/мин

Температура: 40°С

Детектирование 215 нм

- 115 007792

Градиент 1:

0-1,5 мин 1,5-25 мин 25-30 мин 30-35 мин 35-40 мин 40-45 мин

А Линейный градиент до 50% В Линейный градиент до 100% В В Линейный градиент до А А

Отщепление пептида от смолы кислотой

Пептиды отщеплялись от смол путем обработки 95%-м раствором трифторуксусной кислоты (ТФК, Ридель де-Хаен (К1ебе1 бе-Наеп), Франкфурт, Германия) в воде (в объемном отношении) или 95%-м раствором ТФК и 5%-м раствором этандитиола (в объемном отношении) при комнатной температуре в течение 2 ч. Отфильтрованные смолы промывались ТФК. Фильтраты и детергенты выпаривались до 5-10% объема при пониженном давлении. Для осаждения пептида к остатку добавлялся эфир в десятикратном количестве; пептид промывался отфильтрованным на фильтре из пористого стекла, промывался эфиром и сушился в вакууме в эксикаторе в Р₂О₅. Сырой (неочищенный) продукт анализировался методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и идентифицировался ионизационной масс-спектрометрией с электрораспылением.

Синтез пептида О^^ВРуТуг-КНдкТРЛ (химическое соединение 61) Смола Теп1аОе1-8-КАМРМОС (0,23 ммоль/г, 1,02 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп!аОе1-8-КАМ до полного сопряжения Ν-концевого Глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ршос-ОВР-ОН плохо растворим в БМР, и суспензия этой защищенной аминокислоты и НОВ! в БМР нагревылись до 50°С и перед реакцией с диизопропилкарбодиимидом добавлялось 10% ЫМР. Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше с выходом 101,3 мг (70 %). Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии показал 93%-ую чистоту.

Очистка выполнялась с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии на Вюсаб с автоматизированным сбором фракций.

Колонка: Кготазй КР С8; К 100-10-С8 250x50,8 мм.

Температура окружающей среды, приблизительно 20°С.

Расход: 35 мл/мин.

Детектирование: ультрафиолетовый диапазон при 215 нм и 280 нм.

Буфер А: 0,10% ТФК в воде. Буфер В: 0,10% ТФК, 9,9% воды, 90% ацетонитрила.

Градиент: Начало чистого А. Крутой градиент до 20% В через 5 мин, затем градиент до 60% В через 50 мин. Фракции, содержащие чистый продукт, объединялись и проходили лиофильную сушку с выходом 79,4 мг (55% загрузки по смоле) белого материала чистотой 99% согласно методу высокоэффективной жидкостной хроматографии. Время удержания 10,2 мин (Аналитический градиент 1). Массспектрометрия показала ожидаемую моноизотопную массу, равную 502,21.

Химическое соединение представлено следующей формулой:

Описание РСТ/И801/19113 дается в данном случае в качестве ссылки.

Пример 55. Синтез пептида О1у-Оара-О1у-Нур-Рго-Туг (химическое соединение 62) на смоле Теп!аОе1-8-НН₂; производство компании Рапп полимер (Карр ро1утеге), Германия.

Сухая смола Теп!аОе1-8-НН₂ (0,27 ммоль/г, 1 г) помещалась в полиэтиленовый сосуд, оборудованный для фильтрации полипропиленовым фильтром, и обрабатывалась, как описано выше, в условиях синтеза пептида патриями на смоле Теп!аОе1 до полного сопряжения Ν-концевого Ртос-глицина. Сопряжения продолжались в течение ночи. Ацилирование проверялось нингидриновой реакцией, проводимой при 80°С, как описано выше. После полного синтеза пептидная смола промывалась ЭМР^^ мл,

- 116 007792 по 1 мин каждый раз), Οί,'Μ (3x15 мл, по 1 мин каждый раз), диэтиловым эфиром (3x15 мл, по 1 мин каждый раз) и сушилась в вакууме.

Пептид отщеплялся от смолы, как описано выше, и с помощью лиофильной сушки отщеплялся от уксусной кислоты. Бт0с-защищенный пептид растворялся в ΌΜΕ и циклизировался с использованием РуВОР® (бензотриазол-1-илоки-трисфосфониумгексафторфосфат) как фактора сопряжения, как описано выше. Циклизация продолжалась в течение ночи. Циклизированный пептид осаждался после введения эфира и выделялся фильтрацией. Сырой циклизированный пептид промывался эфиром (трижды) и затем растворялся в 20%-ом растворе пиперидина в ΌΜΕ (в объемном отношении) с целью удаления Ν’концевой Бт0с-группы. После введения эфира сырой разблокированный пептид выделялся фильтрацией. Осадок растворялся в уксусной кислоте и проходил лиофильную сушку. Сырой пептид очищался с использованием препаративного метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, как описано выше.

Список литературы [1.] А. Л. Уалдо, А. Дж. Камм, X. деРеутер, П. Л. Фридман, Д. Дж. МакНайл, Дж. Ф. Паулс, Б. Питт, Ц.М. Пратт, П. Дж. Шварц, Е. П. Велтри, Ланцет 1996, 348 7-12.

(Α. Ь. ^а1Й0, Α. 1. Сатт, Η. СеКиу1ег, Ρ. Ь. Бпейтап, Ό. 1. Μ;·κ№ί1,1. Б. Ραυ1κ, В. Ρ111, С. М. Ριή11, Ρ. 1. 8сН\уагШ, Ε. Ρ. Vе1ΐπ, Ьапсе1 1996, 348 7-12).

[2.] П. А. Гуерреро, Р. Б. Шуесслер, Л.М. Давис, Е. С. Бейер, Ц.М. Джонсон, К. А. Йамада, Дж. Е. Саффиц. Журнал клинических исследований 1997, 99 1991-1998.

(Ρ. Α. биеггего, К. В. 8сЬие881ег, Ь Μ. Οανίκ, Е. С. Веуег, С. М. .10^0^ К. Α. Υатаάа, 1. Ε. 8аГЙх, 1 С1ш Шуей 1997, 99 1991-1998).

[3.] Д.Л. Лернер, К. А. Йамада, Р. Б. Шуесслер, Дж. Б. Саффиц. Кровообращение 2000, 101 547552.

(Ό. Ь. Ьетег, К. Α. УатаСа, К. В. δΟιικκκΕΓ, 1. В. 8аГЙх, С1гси1а1юп 2000,101 547-552).

[4.] А. Хагендорф, Б. Шумахер, С. Кирхоф, Б. Лудериц, К. Виллеке. Кровообращение 1999,99 1508-1515.

(Α. Ηадеπάο^ΓΓ. В. 8сНитасНег, 8. К йсЫюГГ, В. Ьийегйг, К. ^Шеске, Спси1а1юп 1999, 99 1508-1515).

[5.] С. Кирхоф, Е. Неллес, А. Хагендорф, О. Крюгер, О. Трауб, К. Виллеке. Современная биология 1998, 8 299-302.

(8. КагсЫюГГ, Ε. №1Κκ, Α. Ηадеπάο^ГГ. О. Кгидег, О. ТгаиЬ, К. ^Шеске, Сигг Вю1 1998, 8 299-302).

[6.] Α. Μ. Симон, Д. А. Гудэнаф, Д. Л. Паул, Современная биология 1998, 8 295-298. (А. М. 81т0п, Ό. Α. б00Йеп0идй, Ό. Ь. Ραυ1, Сигг Вю1 1998, 8 295-298).

[7.] А. С. де Карвало, М. О. Масуда, X. Б. Танвиц, М. Виттнер, Р. С. Голденберг, Д. С. Спрей, Журнал сердечно-сосудистой электрофизиологии 1994, 5 686-698.

(А. С. Се Сагуа1Й0, М. О. ΜακυΙα, Н. В. Тап0гйх, Μ. ХУШпег, К. С. С01йепЬегд, Ό. С. 8ρ^ау, 1 СагС10Уа8с £^4013+-401 1994, 5 686-698).

[8.] Ρ. Ρ. Каприлиан, М. Гуннинг, Е. Дюпон, М. Н. Шеппард, С. М. Ротери, Р. Андевуд, Д.

Дж. Пеннел, К. Фокс, Дж. Пеппер, П. А. Пуль-Уилсон, Н. Дж. Северс, Кровообращение 1998, 97 651-660.

(К. К. [¢1131++111, Μ. Сипшпд, Ε. Ои|30п(, Μ. Ν. 8Неρρа^ά. 8. Μ. К0!йегу, К. ипйегг00Й, Ό. 1. Ρеηие11, К. Бοx, 1. Ρеρρе^, Ρ. Α. Ροο1е-\V^1κοп. Ν. 1. 8еуега, Спси1а1юп 1998, 97 651-660).

[9.] Η. С. Петерс, С. Р. Грин, П. А. Пуль-Уилсон, Н. Дж. Севере, Кровообращение 1993, 88 864875.

(Ν. 8. Ρе1е^κ, С. К. Огееп, Ρ. Α. Ροο1е-\V^1κοη. Ν. 1. 8еуега, С1гси1аЙ0п 1993,88 864-875).

[10.] Дж. Е. Саффиц, Р. Б. Шуесслер, К. А. Йамада, Сердечно-сосудистые исследования 1999,42 309-317.

(1. Ε. 8аГЙх, К. В. 8сЬие881ег, К. Α. Υатаάа, Сагйюуазс ^κ 1999, 42 309-317).

[11.] С. Аонума, Й. Коама, К. Акай, Й. Комияма, С. Накайама, М. Вакабайаши, Т. Макино. Бюллетень по химической фармакологии (Токио) 1980, 28 3332-3339.

(8. Αοπита, Υ. К0Ната, К. ΑΚαί, Υ. К0Ш1уата, 8. №1ка]1та, Μ. \Уака+1уа411, Т. 1^114110, СНет ΡΙιηγιιι Ви11 (Т0ку0) 1980, 28 3332-3339).

[12.] С. Аонума, Й. Коама, К. Акай, С. Ивасаки. Бюллетень по химической фармакологии (Токио) 1980, 28 3340-3346.

(8. Αοπита, Υ. К0Ната, К. Α1η1, 8. ΝικίΑί, СНет Ρ+ιηη Ви11 (Т0ку0) 1980, 28 3340-3346).

[13.] С. Аонума, Й. Коама, Т. Макино, Й. Фуйсава, Журнал фармакобиодинамики 1982, 5 40-48.

(8. Αοπита, Υ. К0Ната, Т. Μак^πο, Υ. ΕρίίκαΓΗ, 1 ΡНаηиасοЬ1οάуπ 1982, 5 40-48).

[14.] Μ. А. Ронсберг, Т. К. Саундерс, П. С. Чан, П. Червони. Медицинская наука 86 А.Д., 14 350351.

(М. Α. К0п8Ьегд, Т. К. 811111+2133 Ρ. 8. СНап, Ρ. Сегу0ш, Μеά 8а 86 Α.Ό., 14 350-351).

[15.] М. Дикшит, Р. Шривастава, Б. Кунду, К. Б. Матур, К. Кар. Индийский журнал экспериментальной биологии 1988, 26 874-876.

(М. ΟιΚκΗιΙ, К. 8πνικ1ινι, В. КипСи, К. В. Μαΐ+ΐΓ, К. Каг, [пИап 1 Εxρ Вю1 1988, 26 874-876).

- 117 007792 [16.] Й. Коама, Н. Оклмото, Т. Минура, С. Фукая, М. Ватанабе, К. Йокояма. Бюллетень по химической фармакологии (Токио) 1987, 35 3928-3930.

(У. КоГата, N. Ок1то!о, Т. М1тига, С. Рикауа, М. ^аΐаηаЬе, К. Уокоуата. СГет РГагт Ви11 (Токуо) 1987, 35 3928-3930).

[17.] Й. Коама, С. Куваара, К. Йамамото, М. Окабе, Т. Минура, С. Фукая, М. Ватанабе, К. Йокояма. Бюллетень по химической фармакологии (Токио) 1988, 36 4597-4599.

(У. КоГата, З. КиуаЕага, К. Уатато!о, М. ОкаЬе, Т. М1тига, С. Рикауа, М. ХУай-цтЬе, К. Уокоуата, СГет РГагт Ви11 (Токуо) 1988, 36 4597-4599).

[18.] С. Деин, Н. Маниконе, А. Мюллер, Р. Гервин, У. Жисковен, А. Иранхаи, С. Минке, У. Клаус. Достижения в фармакологии 1994,350 174-184.

(З. ОГеш, N. Матсом, А. Ми11ег, К. Сегут, и. Ζ^зкονеη, А. I^аηкГаГ^, С. Мшке, ^. К1аиз, Ν;·ιιιηνη ЗсЕт1ебеЬегдз АгсГ РГагтасо1 1994,350 174-184).

[19.] Т. Аргентиери, Е. Кантор, Дж. Р. Уиггинс. Эксперимент 1989, 45 737-738. (Т. Аг^еШей, Е. СаШог, 1 К. ^1ддтз, ЕхрепеПа 1989, 45 737-738).

[20.] А. Мюллер, М. Готвальд, Т. Тудика, У. Линке, У. Клаус, С. Деин. Европейский журнал фармакологии 1997, 327 65-72.

(А. Ми11ег, М. СоЕуа1б, Т. Тибука, ^. Ьшке, ^. К1аиз, З, ОГет, Еиг ί РГагтасо1 1997, 327 65-72).

[21.] Р. Гровер, С. Деин. Пептиды 1998,19 1725-1729. (К. Сготег, З. ПГеш, РерЕбез 1998, 19 17251729).

[22.] С. Деин, Т. Тудика. Лекарства 1995, 49 851-855. (З. ОГет, Т. Тибука, Эгидз 1995, 49 851855).

[23.] С. С. Куо, К. Мунаката, С. П. Редди, Б. Шуравич. Кровообращение 1983, 671356-1367.

(С. З. Кио, К. Μиηакаΐа, С. Р. Кеббу, В. Зип-нуЖ, СЕсиВЕоп 1983, 671356-1367).

[24.] С. Деин, К. Крусеманн, Т. Шафер. Британский журнал фармакологии 1999, 128 1375-1384.

(З. ОГет, К. Кгизетат, Т. ЗсГаеГег, Вг 1 РГагтасо1 1999,128 1375-1384).

[25.] Н. С. Петере, Дж. Коромилас, Н. Дж. Северс, А. Л. Вит. Кровообращение 1997, 95 988-996.

(Ν. З. Ре!егз, 1. Соготбаз, N. 1. Зетегз, А. Ь. ^б, СпсиВЕоп 1997, 95 988-996., [26.] Ό. ^. Ьш, С Аηΐζе1еνбсГ, С1гс Кез 1995, 76 351-365).

[26.] Д. У. Лью, С. Анцелевич. Исследования кровообращения 1995, 76 351-365. (Ό. ^. Ьш, С. Аηΐζе1еνбсГ, С1гс Кез 1995, 76 351-365).

[27.] Канагаратнам П., Севере Н. Дж. и Петере Н. С. Связь между проводимостью, типом возбуждения и качеством иммунореактивного коннексина при хронической фибриляции предсердия у человека. Кровообращение 102[18], П-485. 2000. Тип сноски: Реферат.

(Ка^дага^ат Р., Зетегз N. к, апб Ре!егз N. З. ТГе Ке1аΐ^οηзЬ^р Ьеΐуееη Соп6исЕоп, АсЦтаБог! райет амб РиаШбу оГ Iштиηο^еасΐ^νе ί,’οηΜχίη ίη СЕгошс Нитаη А1па1 ΕίόΓίΙΙηΙίοη. СпсиВЕоп 102[18], П-485. 2000. КеГ Туре: АЬз1гас1).

[28.] Дж. М. Пастор, Д. С. Розенбаум. Исследования кровообращения 2000, 87 1157-1163. (1. М. РазФге, Ό. З. Козе^аит, СпсиВЕоп КезеагсГ 2000, 87 1157-1163).

[29.] Р. Д. Бергер. Исследования кровообращения 2000, 87 1083-1084. (К. Ό. Вегдег, СпсиВЕоп КезеагсГ 2000, 87 1083-1084).

[30.] Дж. Е. Саффиц, К. А. Йамада. Кровообращение 1998, 97 630-632. (1. Е. ЗаГГбх, К. А . Уатаба, СйсиШюп 1998, 97 630-632).

[31.] Гутштайн Д. Е., Морли Г. Е., Тамаддон Хоуман С, Вайдя Д., Шнайдер М. Д., Чен Дж., Чин К, Р., Штульманн X., и Фишман Г.И. Генетическая манипуляция экспрессией коннексина 43 в сердце: установление роли коррекции щелевого соединения при аритмогенезе и вентикулярной дисфункции. Кровообращение 102[18], Н-15. 2001. Тип сноски: Реферат.

(Си1з1еш Ό. Е., Мог1еу С. Е., Татаббοη Нοитаη З., Vа^буа Ό., ЗсНтбег М. Ό., С11ег1 1., С1неп К, К., З^Штат Н., аиб Пз^т-т С. I. СемЕс МатриН-ию!'! оГ Сотехт 43 Ехргезз1ОГ1 ίη 111е НеаЕ: ЕзйЬЕзЕтд а Ко!е Гог Сар 1ипсЕоп Кетобе1шд ίη А^^Гуίйтοдеηез^з апб Vеηί^^си1а^ ОузГипсБоп. СЕсиВЕоп 102[18], Н15. 2001. КеГТуре: АЬз1гас1).

[32.] А. Мюллер, Т. Шафер У., Линке Т. Тудика М. Готвальд У. Клаус, С. Деин. Достижения в фармакологии 1997, 356 76-82.

(А. Ми11ег, Т. ЗсГаеГег, ^. Ьшке Т. Тибука М. Со11\та1б ^. К1аиз, З. ОГеш, №ιιιηνη ЗсЕтэебеЬегдз АгсГ.РЬагтасо1. 1997, 356 76-82).

[33.] С. Деин, Р. Гровер, А. Мюллер, М. Лаувен, П. Поеппель, Т. Шафер. Кровообращение 1999,100 1-426.

(З. ОГеш, К. Сготег А. Ми11ег М. каитет Р. Роерре1, Т. ЗсГаеГег, СЕсиВЕоп 1999, 100 1-426).

[34.] Коениг Дж. И. Связывание радиолигандов в интактных клетках. Кин, М. [106], 89-98. 1999. Тотова, N1, издательство Хъюман пресс. Методы молекулярной биологии. Тип сноски: Серия (Книга, Монография).

(Коешд ί. I. Еабю1|даг1б Ьшбшд ίη Е11ас1 се11з. Кееη М. [106], 89-98. 1999. ТоЮуа, Ж Нитам Ргезз Ечс. Ме!Гобз ίη Мо1еси1аг Вю1оду. КеГТуре: Зепа1 (Воок, Μοηοд^арГ)).

- 118 007792 [35.] К. Вассерманн, К. Молгаард, Е. Штайнес. Химиотерапия и фармакология рака. 1985, 15 244252.

(К. Уа^еттат, К. МО1даагб, Е. 81етекк, Саг1сег Сйето1йег. РНагтасо1. 1985, 15 244-252).

[36.] Е. Майер, К. Фредериксен, М. Нильсен, X. Л. Лембол, X. Педерсен, Дж. Хиттел. Разработка и иссследование лекарств 1997,40 1-16.

(Е. Ме1ег, К. Е^ебе^^ккеη, М. Мейеа Н. Ь. ЬетЬо1, Н. Ребетет 1. Ну11е1, Эгид ^еνе1οртеηΐ Кекеагсй 1997, 40 1-16).

[37.] Дж. Дж. Линч, Р. Г. Раван, Д. Т. Витиак. Журнал сердечно-сосудистой фармакологии 1981, 3 49-60.

(1. 1. Ьупсй, К. С. Κайуал, Ό. Т. Уй1ак, 1 Сагб1оуакс-РНагтасо1. 1981, 3 49-60).

[38.] М. Забель, С. X. Хонлосер, С. Беренс, Р. Л. Вулси, М. Р. Франц. Журнал сердечно-сосудистой электрофизиологии 1997, 8 1239-1245.

(М. Ζ;·ι^1 8. Н. НойЫокег, 8. Ве11гег1к К. Ь. Уоок1еу М. К. Ега^, 1 Сагбюхакс. Е1ес1горйукю1. 1997, 8 1239-1245).

[39.] С. Деин, Н. Маниконе, А. Мюллер, Р. Гервин, У. Жисковен, А. Иранхаи, С. Минке, У. Клаус. Достижения в фармакологии 1994, 350 174-184.

(8. РНет, Ν. Матсов, А. Ми11ег, К. Сегуш, и. Ζ^ккονеη, А. [ΓηηΚΗΗΗί, С Мтке, У. К1аик, №шпуп 8с1ип1ебеЬегдк Агсй РНагтасо1 1994, 350 174-184).

[40.] X. Д. Хуанг, Г. Е. Сандуски, Д. П. Зипес. Журнал сердечно-сосудистой электрофизиологии 1999, 10 79-91.

(X. Ό. Ниалд, С. Е. 8аηбикку, Ό. Р. Ζ^рек, 1 С’агбюуакс. Е1ес1горйукю1. 1999, 10 79-91).

[41.] Д. Ксинг, Дж. Б. Мартине. Американский журнал физиологии. Физиология сердечнососудистой системы 2001, 280 Н684-Н692.

(Ό. XI1^ 1. В. Майшк, Ат 1 РНук101 Неаг1 С1гс. РНук101 2001, 280 Н684-Н692).

[42.] Ф. Шапиро. Обызвествление тканей 1997, 61 285-293. (Е. 8йар1го, Са1с|Г Т1ккие Σηΐ 1997, 61 285-293).

[43.] Р. Сивитейли, Е. С. Бейер, П. М. Уарлоу, А. Дж. Робертсон, С. Т. Гейст, Т. X. Штайнберг. Журнал клинических исследований 1993, 91 1888-1896.

(К. СЕЛеШ, Е. С. Веуег, Р. М. Уаг1оу, А. к КоЬейкой 8. Т. СеШ, Т. Н. 81ешЬегд, ^.С1^η.^ηνекΐ. 1993,97 1888-1896).

[44.] Т. X. Штайнберг, Р. Сивитейли, С. Т. Гейст, А. Дж. Робертсон, Е. Хик, Р. Д. Веенстра, X. З. Ванг, П. М. Уарлоу, Е. М. Вестфале, Дж. Г. Лаинг, а. е1, ЕМВОДж. 1994, 13 744-750.

(Т. Н. 81ешЬегд, К. СгуйеШ, 8. Т. СейР А. к КоЬейкой Е. Н1ск, К. Ό. Vееηкΐ^а, Н. Ζ. Уалд, Р. М. Уаг1оу, Е. М. Уек1рНа1е, к С. Ьашд, а. е1, ЕМВО к 1994, 13 744-750).

[45.] X. Чиба, Н. Савада, М. Ойамада, Т. Койима, С. Номура, С. Ишии, М. Мори, Структура и функционирование клетки 1993, 18 419-426.

(Н. СЫЬа, Ν. 8а\уаба, М. Оуатаба, Т. Корта, 8. №тига, 8. !кНП, М. Мой, Се11 81гис1.Еипс1. 1993, 18 419-426).

[46.] Ф. Лесанда, Д. А. Тоу1ег, К. Зиамбарас, С. Л. Ченг, М. Коваль, Т. X. Штайнберг, Р. Сивитейли. Молекулярная биология клетки 1998, 9 2249-2258.

(Е. кеса^а, Ό. А. Тоу1ег, К. Ζ^ашЬа^ак, 8. Ь. СНе^, М. Коуз1, Т. Н. 81етЬегд, К. САйеШ, Мо1 Вю1 Се11 1998, 9 2249-2258).

[47.] Ф. Лесанда, П. М. Уарлоу, С. Шайх, Ф. Фурлан, Т. X. Штайнберг, Р. Сивитейли. Журнал биологии клетки 2000, 151 931-943.

(Е. ^есаηба. Р. М. Уаг1оу, 8. 8йе1кй, Е. Еи^1ал, Т. Н. 81етЬегд, К. СЕйеШ, к Се11 В1о1 2000, 151 931943).

[48.] Н. Р. Йоргенсен, С. Т. Гейст, Р. Сивитейли, Т. X. Штайнберг. Журнал биологии клетки 1997, 139 497-506.

(Ν. К. Σοι^η^η, 8. Т. Се1к1, К. СМ1еШ, Т. Н. 81ешЬегд, к Се11 Вю1. 1997, 139 497-506).

[49.] Н. Р. Йоргенсен, З. Хенриксен, С. Брот, Е. Ф. Эриксен, О. X. Соренсен, Р. Сивитейли, Т. X. Штайнберг. Журнал исследований минерализации костей, 2000, 15 1024-1032.

(Ν. К. Σοι^η^η, Ζ. Нешт^ей С. Вго1, Е. Е. Ейккей О. Н. 8οΐΐη^η, К. СШет, Т. Н. 81етЬегд, Σ Вогю Мтег.Кек. 2000, 75 1024-1032).

[50.] А. Клермон, Д. Тессман, А. Шток, С. Николаи, У. Штаи, X. Сиес. Карценогенез 1996, 171389-1391.

(А. СЫгтоШ, Ό. Те^тат А. 81оск, 8. №со1ак У. 81аЫ, Н. 81ек, Са^с^ηοдеηек^к 1996, 171389-1391).

[51.] М. А. Ван дер Молен, С. Т; Рубин, К. Дж. МкЛеод, Л. К. МкКаулей, X. Дж. Донахью, Журнал биологической химии, 1996, 27712165-12171.

(М. А. Vал бег Мо1ещ С. Т; КиЬт, К. к МсЬеоб, Ь. К. МсСаи1еу, Н. к ^οηайие, кВю1.СЬет. 1996, 27712165-12171).

[52.] Р. Сивитейли, К. Зиамбарас, П. М. Уарлоу, Ф. Лесанда, Т. Нельсон, Дж. Харлей, Н. Атаи, Е. С. Бейер, Т. X. Штайнберг. Журнал биохимии клетки 1998, 68 8-21.

- 119 007792 (К. С1УЙеШ, К. Ζ^атЬа^ак, Р. М. \Уаг1о\у. Г. Ьесапба, Т. №1коп, 1. Наг1еу, Ν. А1аг Е. С. Веуег, Т. Н. 8!етЬегд, 1. Се11 Вюсйет. 1998, 68 8-21).

[53.] П. Д'Андреа, А. Калабрезе, И. Капоцци, М. Грандольфо, Р. Тонон, Ф. Виттур. Биореология 2000, 37 75-83.

(Р. □'Аибгеа, А. Са1аЬгеке, I. Сароххг М. СгапбоПо, К. Топоп, Г. Уй!иг, Вюгйео1оду 2000, 37 75-83).

[54.] П. Д'Андреа, Ф. Виттур. Клеточный кальций 1996, 20 389-397. (Р. □'АпФеа, Г. У1йиг, Се11 Са1сшт 1996, 20 389-397).

[55.] С. Лоту, С. Фоли, Н. Форест, Дж. Сотьер. Достижения в биологии рта 2000, 45 843-856.

(8. Ьо!у, С. Бой, Ν. ВогекВ 1. 8аийег, Агсй.Ога1 Вю1. 2000, 45 843-856).

[56.] Н. Сиреней, Б. М. Коломбо, М. Меслин, С. Бенедетти, X. Йамасаки, Г. Финочаро. Генная терапия 1998, 5 1221-1226.

(Ν. Сагеней В. М. Со1отЬо, М. Мекш1, 8. ВепебеИй Н. Уатахакг С. БшоссЫаго, Сепе Тйег. 1998, 5 1221-1226).

[57.] О. Мённикес, А. Бушманн, К. Виллеке, О. Трауб, М. Шварц. Гепатология 2000, 32 501-506. (О. Моепткек, А. Висйтапп, К. ^Шеске, О. ТгаиЬ, М. 8сй^агх, Нера!о1оду 2000, 32 501-506).

[58.] О. Мённикес, А. Бушманн, А. Ромуалди, Т. Отт, Дж. Веррингоер, К. Виллеке, М. Шварц. Исследования рака 2000, 50 5087-5091.

(О. Моепткек, А. Висйтапп, А. Котиа1б1, Т. Ой, 1. ХУегппДоег К. ^Шеске, М. 8сй^агх, Сапсег Кек. 2000, 50 5087-5091).

[59.] Л. Жоу, Е. М. Касперек, Б. Дж. Николсон. Журнал биологии клетки 1999, 144 1033-1045.

(Ь. Ζ^υ Е. М. Какрегек, В. 1. Мсйокон, 1 Се11 Вю1. 1999, 144 1033-1045).

[60.] Д. У. Лаирд, П. Фистоурис, Г. Батист, Л. Алперт, X. Т. Хюн, Г. Д. Каристинос, М. А. АлойДжамали. Исследования рака 1999, 59 4104-4110.

(Ό. ^. Байб, Р. Е1к!оипк, С. Вайк!, Ь. А1реП, Н. Т. Ниупй, С. Ό. Сагукйпок, М. А. А1аош-1ата1й Сансет Кек. 1999, 59 4104-4110).

[61.] Т. Шибата, X. Нагаяси, Дж. Хамада, С. Конака, М. Хосокава, Т. Кавано, X. Китайо, М. Арлсу. Биология опухоли 2000, 21 299-308.

(Т. 8ййЬа!а, Н. Кадауакн, 1. Натаба, 8. Копака, М. Нокока^а, Т. Ка^апо, Н. Кйфо, М. Айкие, Титоиг.Вю1. 2000, 21 299-308).

[62.] X. Гуан, Р. Дж. Руч. Карценогенез 1996, 17 1791-1798. (X. Сиап, К. 1. Кисй, Сагсшодепеак 1996, 17 1791-1798).

[63.] Р. Дж. Руч, У. Дж. Бонни, К. Сиглер, X. Гуан, Д. Матесик, Л. Д. Шафер, Е. Дюпон, Дж. Е. Троско. Карценогенез 1994, 15 301-306.

(К. 1. Кисй, ^. 1. Воппеу, К. 81д1ег, X. Сиап, Ό. Ма!ек1с, Ь. Ό. 8сйаГег, Е. Пироп!, 1. Е. Тгокко, Сагсшодепеак 1994, 15 301-306).

[64.] Б. В. Мадукар, X. Л. Файтер-Рупп, Дж. Е. Троско. Письма о раке 1996,106 117-123. (В. У. Мабйикаг, Н. Ь. Ееу!ег-Кирр, 1. Е. Тгокко, Сапсег Ьей. 1996,106 117-123).

[65.] У. К. Хонг, М. Б. Спорн, Наука 1997, 278 1073-1077. (№. К. Нопд, М. В. 8рот, 8аепсе 1997, 278 1073-1077).

[66.] К. М. Абдулла, Г. Лутра, Дж. Дж. Билски, С. А. Абдулла, Л. П. Рейнолдс, Д. А. Редмер, А. Т. Гразул-Билска, Эндокринология. 1999,10 35-41.

(К. М. АЬбииай, С. Ьи!йга, 1. 1. Вбкк1, 8. А. АЬбииай, Ь. Р. Кеупо1бк, Ό. А. Кебтег, А. Т. Сгахн1Вбкка, Епбосппе. 1999, 70 35-41).

[67.] М. Саито, М. Ойамада, Й. Ойамада, Т. Каку, М. Мори. Карценогенез 1997,18 1319-1328.

(М. 8айой, М. Оуатаба, Υ. Оуатаба, Т. Каки, М. Мой, Сагстодепейк 1997, 18 1319-1328).

[68.] Дж. А. Голигер, Д. Л. Паул. Молекулярная биология клетки 1995, 6 1491-1501. (1. А. Сойдег, Ό. Ь. Раи1, Мо1.Вю1.Се11 1995, 6 1491-1501).

[69.] Т. Мине, Р. Кушима, Т. Фуйита. Журнал клинической гастроэнтерологии 1997, 25 Приложение 1 8111-8115.

(Т. Мше, К. Кикййта, Т. Еи)йа, 1 Сйп. Сак1гоеп1его1. 1997, 25 8ирр11 8111-8115).

[70.] Т. Мине, X. Юсида, А. Катаока, А. Тайима, Дж. Нагасава, Т. Такано. Журнал клинической гастроэнтерологии 1995, 21 Приложение 1 8104-8107.

(Т. Мше, Н. Υикиба, А. Ка!аока, А. Тарта, 1. Кадака^а, Т. Така по, 1 С1т. Сак1гоеп1его1. 1995, 21 8ирр1 1 8104-8107).

[71.] Г. Дж. Крист, П. Р. Бринк. Бразильский журнал медикобиологических исследований 2000, 33 423-429.

(1. Сййк!, Р. К. Вйпк, Вгах 1 Меб Вю1. Кек. 2000, 33 423-429).

[72.] Б. Р. Берг, К. Д. Коен, И. X. Сарельюис. Американский журнал физиологии 1997, 272 Н2693Н2700.

(В. К. Вегд, К. Ό. Сойеп, I. Н. 8аге1шк, Ат 1 Рйукт1 1997, 272 Н2693-Н2700).

[73.] С. де Вит, Ф. Рус, С. С. Болц, 8, Кирхоф, О. Крюгер, К. Виллеке, У. Пол. Исследования кровообращения 2000,86 649-655.

- 120 007792 (С. бе Шй, Ε. Коок, 8. 8. Во1/, 8, КйсйкоГГ, О. Кгидег, К. ШШеске, и. Рок1, С1гси1айоп Кекеагск 2000,86 649-655).

-74.- Б. Нафз, Дж. Стегеманн, М. X. Бестле, Н. Рихтер, Е. Селигер, И. Шимке, X. У. Райнхард, П. Б. Перссон. Кровообращение 2000, 101 553-557.

(В. ΝιΓζ, 1. 81едетапп, М. Н. ВекЙе, Ν. КкЫег, Е. 8ее1щег I. 8сЫтке, Н. Ш. Кеткагбк Р. В. Регккоп, С1гси1айоп 2000, 101 553-557).

-75.- X. Ку. Ксие, В. У. Ху. Экспериментальные исследования клетки 1994, 214 172-176. (Н. О. Же, V. Ш. Ни, Еxр. Се11 Кек. 1994, 214 172-176).

-76.- Р. Дермицел. Исследования мозга. Обозрение исследований мозга 1998, 26 176-183. (К. ЭегниеВек Вгат Кек Вгат Кек Кет 1998, 26 176-183).

-77.- Р. Розенталь, М. Шринивас, С. Гохан, М. Урбан, Р. Дермицел, Дж. А. Кесслер, Д. С. Спрей, М. Ф. Мелер. Исследования мозга. Обозрение исследований мозга 2000, 32 57-71.

(К. Коζеηΐа1, М. 8гш1так, 8. Соккап, М. ИгЬап, К. ^е^т^еΐζе1, 1. А. Кекк1ег, Ό. С 8ргау, М. Ε. Мек1ег, Вгаш Кек. Вгат Кек. Кет. 2000, 32 57-71).

-78.- X. Альдског, Е. Н. Козлова. Прогресс в нейробиологии 1998, 55 1-26. (Н. А1бккодтк, Е. Ν. ^ζ^ι, Ргод. №игоЫо1. 1998, 55 1-26).

-79.- Дж. Д. Пал, X. Лью, Д. Макей, А. Шилс, В. М. Бертуд, Е. С. Бейер, Л. Эбиара. Американский журнал физиологии. Физиолгия клетки 2000, 279 С596-С602.

(1. Ό. Ра1, X. Ьт, Ό. Маскау, А. 8Ые1к, V. М. Вейкоиб, Е. С Веуег, Ь. ЕЫкага, Ат 1 Ркукт! Се11 Ркукю1 2000, 279 С596-С602).

-80. - В. Крутовских, X. Йамасаки. Исследования мутаций 2000, 462 197-207. (V. Кги1откк1кк, Н. Уатакак1, Ми1а1. Кек. 2000,462 197-207).

-81.- Д. Маккей, А. Ионидес, З. Кибар, Г. Ролью, В. Берри, А. Мор, А. Шилс, С. Баттачаря. Американский журнал генетики человека 1999, 64 1357-1364.

(Ό. Маскау, А. йшбек, Ζ. К1Ьаг, С. Кои1еаи, V. Веггу, А. Мооге, А. 8Ые1к, 8. Вкайаскагуа, Ат 1 Нит.Сепей 1999, 64 1357-1364).

-82.- К. Накамура, И. Шибата. Клетки тканей и органов 1999,165 16-21. (К. Накатит, Υ. 8ЫЬа1а, Се11к Пккиек. Огдапк 1999,165 16-21).

-83.- Л. Немет, С. Маддур, П. Пури.Журнал педиатрической хирургии 2000, 35 823-828. (Ь. №те!к, 8. Маббиг, Р. Рип, 1 Реб1ай.8игд. 2000, 35 823-828).

-84.- А. М. Симон, Д. А. Гудэнаф, Е. Ли, Д. Л. Паул. Природа 1997, 385 525-529. (А. М. 81топ, Ό. А. Сообепоидк, Е. Ы, Ό. Ь. Раи1, Ка1ше 1997, 385 525-529).

-85.- Б. Соммерсберг, А. Буллинг, У. Салзер, У. Фролих, Р. Е. Гарфельд, А. Амстердам, А. Майерхофер, Биология репродукции 2000,53 1661-1668.

(В. 8оттегкЬегд, А. ВиШпд, и. 8акег, и. ВгоНКск, К. Е. Сагйе1б, А. Атк1егбат, А. МауегкоГег. Вю1. Кергоб. 2000, 53 1661-1668).

-86.- И. Гранот, Н. Декель, Репродукция человека 1998, 13 Приложение I 4 85-97. (I. СгапоВ Ν. Эекек Нит. Кергоб. 1998,13 8иррI 4 85-97).

-87.- У. М. Киларски, Е. Дюпон, С. Коппен, X. И. Йе, С. Воцци, Р. Г. Горди, М. Резапур, У. Улмстен, Г. М. Рооманс, Н. Дж. Северс. Европейский журнал биологии клетки 1998, 75 1-8.

(Ш. М. Кйагкк1, Е. Пироп!, 8. Сорреп, Н. I. Υек, С. ^ζζ/ К. С. Соигб1е, М. Кеζарои^, и. И1тк1еп, С. М. Коотапк, Ν. 1. 8етегк, Еиг. 1 Се11 Вю1. 1998, 75 1-8).

-88.- X. Н. Сирэй, X. Фу, М. Оловссон, Г. Алсен, С. Шуман, Б. Ундблом, У. Улмсте. Американский журнал акушерства и гинекологии. 2000, 182 926-930.

(Н. Ν. Сйау, X. Ευ, М. О1отккоп, С. Ак1кеп, С. 8китап, В. ИпбЫот, и. И1тк1еп, Ат 1 ОЬк1е1. Супесок 2000, 182 926-930).

-89.- С. Батиас, Н. Дефами, А. Лаблак, Д. Тепот, П. Фенишел, Д. Сегретайн, Г. Поинтис. Исследования клеток тканей. 1999,298 113-121.

(С. Вайак, Ν. ПеГание, А. ЬаЫаск, Ό. Щерой Р. кетскек Ό. 8едге1ат, С. Рошйк, Се11 Нккие Кек. 1999, 298 113-121).

-90.- Е. Шлайермахер, Генетика человека 1980, 54 391-404. (Е. 8ск1е1егтаскег, Нит. Сепе1. 1980, 54 391-404).

-91.- С. Воцци, С. Уллрих, А. Чаролаис, Дж. Филипп, Л. Орчи, П. Меда. Журнал биологии клетки 1995, 131 1561-1572.

(С. ^ζζ/ 8. И11пск, А. СЬаго11а18, 1. РЫкрре, Ь. Огс1, Р. Меба, 1 Се11 Вю1. 1995, 131 1561-1572).

-92.- П. Меда, М. Чансон, М. Пеппер, Е. Джордано, Д. Баско, О. Трауб, К. Виллеке, А. эль Аумари, Д. Грос, Е. С. Бейер. Экспериментальные исследования клетки 1991,192 469-480.

(Р. Меба, М. Скапкоп, М. Реррег, Е. Сюгбапо, Ό. Воксо, О. Н^иЬ, К. ШШеске, А. е1 Аоитап, Ό. Сгок, Е. С Веуег, Еxр. Се11 Кек. 1991, 192 469-480).

-93.- К. Зиамбарас, Ф. Лесанда, Т. X. Штайнберг, Р. Сивитейли. Журнал исследований минерализации костей 1998,13 218-228.

(К. Ζ^атЬа^ак, Ε. Ьесапба, Т. Н. 81етЬегд, К. СшйеШ, 1. Вопе Шпег. Кек. 1998, 13 218-228).

- 121 007792 [94.] И. Капоцци, Р. Тонон, П. Д'Андреа. Биохимический журнал 1999, 344 Р! 2 545-553. (I. Саро//г К. Топоп, Р. О'Апбгеа, В1осЬет Л999, 344 Р! 2 545-553).

[95.] С. Г. Спанакис, С. Петридоу, С. К. Мазур. Офтальмологические исследования. Наука о зрении 1998, 39 1320-1328.

(8. С. 8рапак1к, 8. Ре!пбои, 8. К. Макиг, [пуек1 ОрЬ!Ьа1то1. У1к.8с1. 1998, 39 1320-1328).

[96.] X. Йамасаки, В. Крутовских, М. Меслин, Т. Танака, Д. М. Заидан, Й. Омори. Клинические исследования Академии Наук . II. 1999, 322 151-159.

(Н. Υатакак^, У. Кги^ккзкЬ, М. Мекш1, Т. Тапака, Ό. М. Ζа^баη, Υ. Отоп, С.К.Асаб.8с1. III. 1999, 322 151-159).

[97.] Б. Д. Ларсен, А. Холм. Международный журнал по исследованиям пептидов и белка. 1994, 43 1-9.

(В. Ό. Ьагкеп, А. Но1т, Ш! 1 Рер!. Рго!еш Кек. 1994, 43 1-9).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам КУШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства.
2. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам КУШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства для лечения аритмии.
3. Применение по предыдущему пункту, где упомянутая аритмия является аритмией, вызванной циркуляцией возбуждения, либо предсердного, либо желудочкового происхождения, включая аритмию, вызванную альтернансом реполяризации, когда и наджелудочковые и желудочковые тахиаритмии могут проявляться в виде тахикардии, трепетания или фибрилляции.
4. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам КУШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства для профилактики и/или лечения замедленной проводимости в сердце.
5. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам КУШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства для улучшения сокращаемости сердца.
6. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам КУШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства для лечения болезненных состояний, связанных с ухудшенной МКЩС во время метаболического стресса, включая недостаток глюкозы и гипоксию.
7. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам КУШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства для антитромбического лечения.
8. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам КУШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого при профилактике и/или лечении остеопороза.
9. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам КУШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого при профилактике и/или лечении болезней суставов, включая артрит.
10. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам КУШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого при профилактике и/или лечении заболеваний в тканях хряща и суставах с плохой васкуляризацией.
11. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам КУШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого при профилактике и/или лечении потери костной ткани и для усиления заживляемости переломов костей.
12. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам КУШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого при профилактике и/или лечении васкуляризации роговицы при болезненных состояниях с недостаточным питанием роговицы и для улучшения заживляемости роговицы в случае ее повреждения.
13. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам КУШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого при лечении ран и, в частности, ишемических язв.
14. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам КУШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого при лечении язвы желудка и язвы двенадцатиперсной кишки.
15. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам КУШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, которое усиливает купирование клеток с помо

- 122 007792 щью щелевого соединения и/или МКЩС в стенке сосуда в качестве лекарственного средства для профилактики и/или лечения артериальной гипертензии.
16. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственных средств, применяемых при профилактике ишемического поражения мозга и для лечения органических психозов, которые могут проявляться в виде депрессии, беспокойства, нарушений обучаемости и памяти, фобий и галлюцинаций.
17. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого при профилактике и/или лечении катаракты.
18. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого при профилактике и/или лечении глухоты, связанной с ухудшенной МКЩС.
19. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого при профилактике и/или лечении нарушения двигательной активности желудочно-кишечного тракта.
20. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого при лечении женского бесплодия, которое является следствием плохого купирования клеток в яичниках.
21. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого вместе с окситоцином, для стимуляции и облегчения родов.
22. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого при лечении мужского бесплодия, связанного с ухудшенным купированием клеток.
23. Применение химического соединения по общей формуле I, формулам I-VШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8, в качестве лекарственного средства, применяемого для улучшения переносимости глюкозы у субъекта с инсулиннезависимым сахарным диабетом, вызванным ухудшенной МКЩС между β-клетками.
24. Способ лечения аритмии, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам I-VШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
25. Способ лечения согласно предыдущему пункту, отличающийся тем, что упомянутая аритмия является аритмией, вызываемой циркуляцией возбуждения, либо предсердного, либо желудочкового происхождения, включая аритмию, вызванную альтернансом реполяризации, когда и наджелудочковые, и желудочковые тахиаритмии могут проявляться в виде тахикардии, трепетания или фибрилляции, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам I-VШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
26. Способ усиления межклеточной коммуникации по щелевому соединению клеток млекопитающих, испытывающих недостаток глюкозы и/или гипоксию, включающий введение эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам I-VШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
27. Способ антитромбического лечения, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам I-VШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
28. Способ лечения остеопороза, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам I-VШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
29. Способ лечения или профилактики потери костной ткани и усиления заживляемости переломов костей, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам I-VШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
30. Способ лечения болезней суставов, включая артрит, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам I-VШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
31. Способ лечения рака в ткани эндодермального, мезодермального или эктодермального происхождения, включая виды рака и гепатоцеллюлярные и холангоцеллюлярных неоплазмы и рак кости, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам I-VШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.

- 123 007792
32. Способ лечения ран и, в частности, ишемических язв, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам ЬЩП, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
33. Способ лечения ран или кожных поражений, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам ЬЩП, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
34. Способ лечения ран или поражений слизистой оболочки рта, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам ЬЩП, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
35. Способ лечения язвы желудка и язвы двенадцатиперсной кишки, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам ЬЩП, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
36. Способ лечения или профилактики артериальной гипертензии путем усиления купирования клеток с помощью щелевого соединения и/или МКЩС в стенке сосуда, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам ЬЩП, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
37. Способ профилактики ишемического поражения мозга и лечения органических психозов, которые могут проявляться в виде депрессии, беспокойства, нарушений обучаемости и памяти, фобий и галлюцинаций, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам ЬЩП, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
38. Способ лечения глухоты, связанной с ухудшенной МКЩС, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам ЬЩП, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
39. Способ лечения нарушений двигательной активности желудочно-кишечного тракта, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам ЬЩП, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
40. Способ лечения женского бесплодия, которое является следствием ослабления купирования клеток в яичниках, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам ЬЩП, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
41. Способ стимуляции и облегчения родов, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, вместе с окситоцином терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам ЬЩП, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
42. Способ лечения мужского бесплодия, связанного с ухудшенным купированием клеток, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам ЬЩП, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
43. Способ улучшения переносимости глюкозы у субъекта с инсулиннезависимым сахарным диабетом, вызванным ухудшенной МКЩС между β-клетками, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам ЬЩП, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
44. Способ лечения или профилактики заболеваний в тканях хряща и суставах с плохой васкуляризацией, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам ЬЩП, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
45. Способ по предыдущему пункту, отличающийся тем, что упомянутое заболевание является артритом.
46. Способ лечения или профилактики катаракты, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам ЬЩП, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
47. Способ лечения или профилактики васкуляризации роговицы при болезненных состояниях с недостаточным питанием роговицы и для улучшения заживляемости роговицы в случае ее повреждения, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам ЬЩП, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.

- 124 007792
48. Способ лечения или профилактики роста и распространения по поверхности раковых клеток, типа раковых клеток линий эпителиальных клеток, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам КУШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
49. Способ лечения панкреатита у пациента, страдающего от него, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам КУШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
50. Способ лечения недостатка глюкозы и/или гипоксии клеток, ткани, органа пациента, страдающего недостатком глюкозы и/или гипоксией, включающий введение упомянутому пациенту терапевтически эффективного количества химического соединения по общей формуле I, формулам КУШ, формулам 2-12 и химических соединений, представленных в табл. 1 и 8.
51. Способ по предыдущему пункту, отличающийся тем, что упомянутым органом является сердце.
52. Способ профилактики или лечения непролиферативной болезни, включающий введение терапевтически эффективного количества химического соединения, которое способствует межклеточной коммуникации, что было выявлено на модели мыши с аритмией, вызванной СаС1₂.
53. Способ по п.52, отличающийся тем, что упомянутое химическое соединение имеет индекс для упомянутой модели мыши, который равен 2 или 3.
54. Способ по п.52, отличающийся тем, что упомянутое химическое соединение способствует межклеточной коммуникации по щелевому соединению.
55. Способ по пп.52-54, отличающийся тем, что упомянутое химическое соединение является агонистом антиаритмического рецептора пептида.
56. Способ по пп.52-55, отличающийся тем, что упомянутое химическое соединение выбирается из группы, в состав которой входит ресвератрол, включая различные изомеры, димеры, тримеры, тетрамеры и их производные.
57. Способ по п.56, отличающийся тем, что химическим соединением является транс-ресвератрол (транс-3,5,4'-тригидроксистильбен).
58. Способ по пп.52-54, отличающийся тем, что упомянутое химическое соединение выбирается из группы, в состав которой входит ирзогладин или (6-(2,5-дихлорофенил)-2,4-диамино-1,3,5-триазин) и его производные.
59. Способ по пп.52-54, отличающийся тем, что упомянутое химическое соединение выбирается из группы, в состав которой входят апорфиноидные алкалоиды, предпочтительно болдин и таспин, и их производные.
60. Способ профилактики или лечения болезни, характеризующейся ухудшенной МКЩС в патологически измененной ткани, включающий введение терапевтически эффективного количества химического соединения, которое способствует внутриклеточной коммуникации, что было выявлено на модели мыши с аритмией, вызванной хлористым кальцием, отличающийся тем, что упомянутое химическое соединение выбирается из группы химических соединений по формуле I (I) представляющей пептидную последовательность, где аминокислотные остатки могут иметь форму Э и/или форму Ь с Ν-концевым участком Ν* и Суконцевым участком С*, и обладать цикличностью благодаря ковалентной связи между Ν* и С*, как показано пунктирной линией, или между Ка и С*, как показано пунктирной линией и; и где пунктирная линия между Ν* и С*, которая если имеется, то исключает связь υ, представляет дополнительнуй ковалентную связь, и если упомянутой связи нет, то тогда Ν* связан с атомом водорода; когда дополнительная ковалентная связь и между К_б и С* имеется, то тогда К₇ отсутствует, и наличие К₇исключает связь и; и

- 125 007792 где X является Ν-концевым участком типа фотозонда, способного связываться с аминоконцевым участком Ν*, или ацильной группой, полученной из С(2-22)алкилкарбоновой кислоты, типа уксусной кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты, а также из жирных кислот типа бегеновой кислоты, произвольно замещаемой одним или большим числом заместителей, выбираемых из группы, в состав которой входит гидроксигруппа, галогеновая группа, С(1-6)алкильная группа, нитрогруппа и цианогруппа; или X является водородом;

К₇ является ОН, ΝΗ₂, ΝΗΝΗ₂ или ОК₈, если связь между Ν* и С* отсутствует, или К₇ отсутствует, если связь между Ν* и С* существует;

К8 является Н или прямой или разветвленной С(1-6)алкильной группой, арильной или аралкильной группой.

К_а является боковой аминокислотной цепью Нур или Рго;

К_Ь является боковой аминокислотной цепью Нур или Рго;

К_с является боковой аминокислотной цепью С1у, 8аг, ароматической боковой аминокислотной цепью, произвольно замещаемой одной группой или большим числом гидроксигрупп, галогеновых групп, нитрогрупп, цианогрупп, азидогрупп, аминогрупп, бензоильных групп или нижних алкоксигрупп или тиоалкоксигрупп в ароматическом кольце;

К_б является боковой аминокислотной цепью А1а, С1у, С1и, Азр, ОаЬ, Пара, Ьуз, Азл, С1п, Огп, ТНг, 8ег или Суз;

Ке является боковой аминокислотной цепью А1а;

К_Г является боковой аминокислотной цепью А1а, 8аг или С1у;

К_д представляет любую боковую аминокислотную цепь кроме боковой цепи Ь-4Нур или части по формуле Ζ или Ζι;

К_Н является боковой аминокислотной цепью А1а, или К_Н является частью формулы Ζ или Ζι;

Κι является боковой аминокислотной цепью С1у, или К) представляет ароматическую аминокислоту, произвольно замещаемой одной группой или большим числом гидроксигрупп, галогеновых групп, нитрогрупп, цианогрупп, азидогрупп, аминогрупп, бензоильных групп или нижних алкоксигрупп или тиоалкоксигрупп в ароматическом кольце;

К, является боковой аминокислотной цепью Азл, С1п, Азр, С1и, Суз, или Туг;

и каждый из индексов Т к, 1, ш, п, р и с] независимо друг от друга принимает значение 0 или 1;

и их ретроформ, всех форм Ό, или ретроформ всех Ό форм пептидной последовательности по формуле I, и их солей и амидов.
61. Способ по п.60, отличающийся тем, что под болезнью понимается любая из описанных здесь болезней или любое из состояний, предпочтительно воспаление эпителия дыхательных путей, заболевание альвеолярной ткани, раны, эректильная дисфункция, недержание мочи, нарушение слуха, ослабленного вследствии болезни ушной улитки, эндотелиальные поражения, диабетическая ретинопатия и диабетическая невропатия, нервнопатическая боль, ишемия центральной нервной системы, повреждения спинного мозга, заболевания зубных тканей, включая болезнь пародонта, болезни почек, подострое и хроническое воспаление, рак и патологии костного мозга и стволовых клеток при трансплантации.
62. Способ по пп.52-61, отличающийся тем, что химическое соединение представлено любой из следующих формул:

где К1 является Н или ацетилом (Ас),

К2 является боковой цепью одной из аминокислот С, Υ, Ό-Υ, Р и Ό-Р, К3 является О или Н,

К4 является любой аминокислотной боковой цепью,

К5 является О или Н,

К6 является С(1-4)алкильной группой типа СН2, (СН2)2, (СН2)3 и (СН2)4,

К7 является О или Н,

К8 является О или Н,

К9 является боковой цепью одной из аминокислот С, Υ, Ό-Υ, Р и Ό-Р,

К10 является ОН или ΝΗ₂, и 8, Т, и, V и Ζ - целые числа, принимающие следующие значения:

8 - 0, 1 или 2,

Т - 0, 1 или 2, и - 0 или 1,

- 126 007792

V - 0 или 1,

Ζ - 0 или 1, или ^^1^2^3-^2 (VIII), где X1 равно 0 или является А1а, С1у, в-А1а, Туг, Ό-Тут, Азр, НАА,

X2 равно 0 или является А1а-С1у-Т4с-Рго; А1а-8аг-Нур-Рго; А1а-(6-членный цикл)-; А1а-Азп; Ό-АзпО-А1а; Ό-Азп;

уЛЬи; С1у, А1а; О-А1а; β-Α 1а; Рат1; Азп или НАА;

Х3 является Туг; Ό-Тут; С1у, РатЬ или Р1е; и

К1 является Н или Ас, при условии, что X1 и Х2 - не оба равны 0;

и их солями.
63. Способ по пп.52-61, отличающийся тем, что период полураспада химического соединения, полученный при измерениях с применением стандартного анализа стабильности составлял более 50 мин, но желательно, чтобы период полураспада химического соединения превышал 5 ч.
64. Способ по пп.52-61, отличающийся тем, что период полураспада химического соединения, полученный при измерениях с применением стандартного анализа стабильности превышает 5 ч.
65. Способ лечения воспаления эпителия дыхательных путей, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
66. Способ лечения повреждений, которые вызывают мозговые воспалительные реакции, включая черепно-мозговую травму и ишемию, нейродегенеративные болезни, включая болезнь Паркинсона, аутоиммунные болезни, инфекционные болезни, прионные болезни, и опухоли мозга, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
67. Способ лечения реактивного глиоза, вызванного ударом, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
68. Способ лечения или профилактики развития глиальных неоплазм, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
69. Способ лечения нейронных и мышечных симптомов, связанных с аксотомией спинного мозга, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
70. Способ профилактики или лечения диабетической ретинопатии, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
71. Способ лечения сосудистых заболеваний сетчатки, например, артериосклероза, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
72. Способ лечения ишемии, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации, в количестве, эффективном для обеспечения роста капилляров.
73. Способ ускорения процесса заживления сосудов после поражения балонным катетером сонной артерии, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
74. Способ лечения эректильной дисфункции, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
75. Способ лечения недержания мочи, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
76. Способ лечения раны, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.

- 127 007792
77. Способ лечения подострого или хронического воспаления путем обеспечения местного увеличения синтеза иммуноглобулинов, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
78. Способ лечения периферической невропатии и нервнопатической боли, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
79. Способ профилактики или лечения приобретенной или возрастной потери слуха, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
80. Способ лечения пониженного потенциала кроветворных тканей, например, в кроветворных злокачественных образованиях и после химиотерапии, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
81. Способ профилактики или лечения болезни, характеризующейся расстройством почечной коммуникации по щелевому соединению, вызванным отравлением тяжелыми металлами, неинфекционным воспалением или микробной инфекцией, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
82. Способ лечения нарушенной секреции гормона из передней доли гипофиза, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
83. Способ профилактики или лечения нарушенного развития зубов, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
84. Способ уменьшения симптомов при старении кожи, целлюлите и при морщинах, включающий введение пациенту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
85. Способ лечения болезни, вызванной табаком, связанной с разрывом купирования клеток с помощью щелевого соединения, например, плохое заживление раны и старение кожи у пациента, страдающего этим заболеванием, включающий введение упомянутому пациенту эффективного количества хотя бы одного химического соединения из описанных здесь химических соединений, которое способствует межклеточной коммуникации.
86. Способ по пп.52-85, отличающийся тем, что вводимым химическим соединением является химическое соединение по любому из пп.52-62.
87. Способ по пп.52-86, отличающийся тем, что вводимым химическим соединением является хотя бы одно из следующих химических соединений: