EA005030B1 - Сочетания ингибиторов транспорта желчных кислот в подвздошной кишке и производных никотиновой кислоты, фармкомпозиция и способ профилактики и лечения гиперлипидемических состояний - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение предоставляет терапевтические сочетания соединений, предназначенных для профилактики или лечения сердечно-сосудистого заболевания, включая гиперхолестеринемию, атеросклероз или гиперлипидемию. Раскрытые сочетания включают ингибитор транспорта желчных кислот в подвздошной кишке с производным никотиновой кислоты.

Description

В данной заявке испрашивается приоритет на основании предварительной заявки США сер. № 60/142550, поданной 7 июля 1999 г., и предварительной заявки США сер. № 60/ 113955, поданной 23 декабря 1998 г.

Предпосылки создания изобретения

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способам лечения сердечно-сосудистых заболеваний и, конкретно, оно относится к сочетаниям (комбинациям) соединений, композициям и способам их применения в медицине, особенно, для профилактики и лечения гиперлипидемических состояний, таких как состояния, связанные с атеросклерозом, гиперхолестеринемией и другими заболеваниями коронарной артерии у млекопитающих. Более конкретно, данное изобретение относится к соединениям, ингибирующим соединение, транспортирующее (транспортер) желчные кислоты в подвздошной кишке (ΙΒΑΤ). Данное изобретение также относится к производным никотиновой кислоты.

Описание уровня техники

Установлено, что гиперлипидемические состояния, связанные с повышенными концентрациями общего холестерина и холестерина липопротеинов низкой плотности (БОБ), являются основными факторами риска сердечнососудистой недостаточности и особенно атеросклероза. Так как высокие уровни холестерина БОБ увеличивают риск атеросклероза, способы снижения уровня холестерина БОБ в плазме могли бы быть терапевтически полезными для лечения атеросклероза и других заболеваний, связанных с накоплением липидов в кровеносных сосудах. Данные заболевания включают, не ограничиваясь ими, сердечно-сосудистую недостаточность, заболевание периферических сосудов и удар.

Атеросклероз лежит в основе большей части заболеваний коронарной артерии (ΟΑΌ), основной причины заболеваемости и смертности в современном обществе. Было показано, что высокий уровень холестерина БОБ (выше приблизительно 180 мг/дл) и низкий уровень холестерина НЭБ (ниже 35 мг/дл) вносят важный вклад в развитие атеросклероза. Неблагоприятные соотношения НОБ/БББ отрицательно влияют на другие заболевания или факторы риска, такие как заболевание периферических сосудов, удар и гиперхолестеринемия.

Обнаружено, что нарушение рециркуляции желчных кислот из просвета кишечного тракта является причиной снижения уровня сывороточного холестерина в причинном отношении. Были накоплены эпидемиологические данные, показывающие, что такое снижение приводит к улучшению состояния атеросклероза. 8!едтопкку в 1п!етас!юп оГ Ы1е аадк апд сБо1ек1его1 \\ЙБ попкукйтк адеп!к Басищ Ьуросйо1е81ето1ет1с рторейек, ВюсЫтка е! Вюрйукка Ас1а, 1210, 255-287 (1994) обсуждает биохимию, физиоло гию и известные активные агенты, имеющие отношение к желчным кислотам и холестерину.

Показано, что временные патофизиологические взаимодействия согласуются с нарушениями энтерогепатической (внутрипеченочной) циркуляции желчных кислот у людей с врожденной недостаточностью ΙΒΑΤ активности, как опубликовано НеиЫ, БЕ., е! а1. См. Рптату Вйе Ас1д Ма1аЬкогЬ!юп: ОеГесОсе т Уйто Неа1 Асйуе Вйе Ас1д Тгапкрог!, Оа81тоеп!его1о§у, 83, 804-11 (1982).

В другом подходе к уменьшению рециркуляции желчных кислот система транспорта желчных кислот в подвздошной кишке является предполагаемой фармацевтической мишенью для лечения гиперхолестеринемии, основанной на нарушении энтерогепатической циркуляции, с помощью специфических ингибиторов транспорта (Кгатег, е! а1., 1п1е81ша1 Вйе Аад АЬкотЫюп ТБе 1оитпа1 оГ Вю1одка1 Сйет181ту, 268 (24) 18035-46 (1993)).

В нескольких патентных заявках НоесБк! Акйепдекейксйай раскрывает полимеры, включающие различные встречающиеся в природе составные части энтерогепатической циркуляционной системы и их производные, включая желчную кислоту, которые ингибируют физиологический транспорт желчных кислот с целью снижения уровня холестерина БОБ, достаточного, чтобы являться эффективными лекарственными препаратами и, в частности, для применения в качестве гипохолестеринэмических агентов. Патентные заявки НоесНкБ которые раскрывают такие соединения, ингибирующие транспорт желчных кислот, перечислены ниже.

К1. Патентная заявка Канады № 2025294. К2. Патентная заявка Канады № 2078588. К.3. Патентная заявка Канады № 2085782. К4. Патентная заявка Канады № 2085830. К5. Заявка ЕР № 0379161.

К6. Заявка ЕР № 0549967.

К7. Заявка ЕР № 0559064.

К8. Заявка ЕР № 0563731.

Избранные бензотиепины раскрыты в заявке номер XVО 93/321146 для многочисленных применений, включая метаболизм жирных кислот и сердечно-сосудистые заболевания.

Известно, что отдельные бензотиепины могут применяться в качестве гиполипемических и гипохолестеринемических агентов, особенно, для лечения или профилактики атеросклероза, как раскрыто в заявке № ЕР 508425. Патентная заявка Франции, ЕК 2661676 дополнительно раскрывает бензотиепины для применения в качестве гиполипемических и гипохолестеринемических агентов. Кроме того, патентная заявка № νθ 92/18462 перечисляет другие бензотиепины для применения в качестве гиполипемических и гипохолестеринемических агентов. Патент США № 5994391 (Бее е! а1.). Каждый из бензотиепиновых гиполипемических и гипохолестеринемических агентов, описанных в данных патентных заявках, ограничен амидом, связанным с атомом углерода, соседним по отношению к фенильному циклу сопряженного бициклобензотиепинового цикла.

Дополнительно бензотиепины, которые могут применяться для лечения гиперхолестеринемии и гиперлипидемии, раскрыты в патентной заявке № РСТ/И8 95/10863. Другие бензотиепины, которые могут применяться для профилактики и лечения гиперхолестеринемии и гиперлипидемии, а также фармацевтические композиции таких бензотиепинов, описаны в РСТ/И8 97/04076. Также бензотиепины и их композиции, которые могут применяться для профилактики и лечения гиперхолестеринемии и гиперлипидемии, описаны в заявке США № 08/816065.

В описании \Ус11сошс Еоипбайои Ытйеб патентной заявки № XVО 93/16055 Нуройр1беиис ВепхоОпахерте Сотроипбк раскрыто, что ш ν 11 го ингибирование транспорта желчных кислот коррелирует с гиполипидемической активностью. Данная публикация описывает ряд гиполипидемических бензотиазепиновых соединений. Дополнительно гиполипидемические бензотиазепиновые соединения (особенно 2,3,4,5-тетрагидробензо -1-ти-4-азепиновые соединения) раскрыты в патентной заявке № νθ 96/05188. Особенно применяемым бензотиазепином, раскрытым в νθ 96/05188, является соединение формулы В-2. Дополнительно гиполипидемические бензотиазепиновые соединения описаны в патентной заявке № νθ 96/16051.

(3В,5В)-3-бутил-3-этил-2,3,4,5-тетрагидро7,8-диметокси-5-фенил-1-4-бензотиазепина 1,1диоксид

Другие бензотиазепиновые соединения, которые могут применяться для контролирования уровня холестерина, описаны в патентной заявке РСТ № νθ 99/35135. В данное описание включено соединение формулы В-7.

Дополнительные соединения-ингибиторы 1ВАТ включают класс нафталиновых соединений, описанных Т. 1с1и11ак1и е! а1. в 1. Рйагтасо1. Ехр. Тйег., 284(1), 43-50 (1998). В данном классе особенно полезным является соединение 8-8921 (метил 1 -(3,4-диметоксифенил)-3-(3 -этилвалерил)-4-гидрокси-6,7,8 -триметокси-2-нафтоат). Структура 8-8921 показана в формуле В-20. Дополнительно нафталиновые соединения или производные лигнина, которые могут приме няться для лечения или профилактики гиперлипидемии или атеросклероза, описаны в патентной заявке РСТ № νθ 94/24087.

Уже в 1955 г. было опубликовано, что никотиновая кислота (ниацин), являющаяся витамином В-комплекса, действует как гиполипидемический агент (В. А1!ксй1, е! а1., Агсй. Вюсйет. Вюрйук., 54, 558-9 (1955)). Она иногда используется для повышения низких уровней НЭЬ и снижения уровней УЬЭЬ и ЬЭЬ. Применяющиеся коммерческие композиции, содержащие никотиновую кислоту, включают №асог, №акрап, №соЫб, №со1аг, 81о-№асш. Никотиновая кислота противопоказана пациентам, имеющим дисфункцию печени, активную пептическую язву или артериальное кровотечение. Другим соединением, относящимся к данному классу, которое может применяться при сердечно-сосудистых показаниях, является ницеритрол (Т. Кахшш е! а1. , Сигг. Тйег. Век., 55, 546-51). 1. 8акак| е! а1. (1п!. 1. СНп. Рйагт. Тйег., 33 (7), 42026 (1995)) описывает уменьшение активности, переносящей эфир холестерина, под влиянием монотерапии с использованием ницеритрола. Аципимокс (5-метилпиразин-2-карбоновой кислоты 4-оксид, патент США № 4002750) структурно подобен никотиновой кислоте и обладает антигиперлипидемической активностью.

В литературе были описаны некоторые варианты комбинированной терапии, предназначенные для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Сочетания ингибиторов 1ВАТ с ингибиторами НМС СоА редуктазы, которые могут применяться для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, раскрыты в патентной заявке США № 09/037308.

Сочетанная терапия с использованием флювастатина и ницеритрола описана 1. 8акак1 е! а1. (1б.). Данные исследователи сделали вывод, что сочетание флювастатина и ницеритрола в дозе, составляющей 750 мг/дневную дозу, повидимому, не увеличивает и не ослабляет полезных эффектов флювастатина.

Ь. СакЫп-НетрЫ11 е! а1. (1. Ат. Меб. Аккос, 264 (23), 3013-17 (1990)) описывают благоприятные эффекты сочетанной терапии с использованием колестипола и ниацина на атеросклероз коронарных сосудов. Описанные эффекты включают отсутствие прогрессирования и регресс нативных бляшек в коронарной артерии.

Сочетанная терапия с использованием аципимокса и симвастатина демонстрирует бла гоприятное влияние на уровень НЭИ у пациентов с высокими уровнями триглицеридов (Ν. НоодегЬгидде е! а1., I. 1п!егпа1 Мей., 241, 151-55 (1997)).

Сочетанная терапия с использованием ситостанолового эфира маргарина и правастатина описана Н. СуШпд е! а1. (1. Ыр1й Кек., 37, 177685 (1996)). Как описано, в результате данной терапии одновременно ингибируется абсорбция холестерина и значительно снижается уровень холестерина ИПЬ у людей с инсулиннезависимым диабетом.

Вго\\'п е! а1. (Νονν Епд. 1. Мей. , 323 (19), 1289-1339 (1990)) описывают сочетанную терапию с использованием ловастатина и колестипола, в результате которой уменьшается прогрессирование атеросклеротических бляшек и увеличивается регрессия бляшек по сравнению с использованием одного ловастатина.

Висй е! а1. (патентная заявка РСТ № АО 9911263) описывает сочетанную терапию, включающую амлодипиновое и статиновое соединения, предназначенную для лечения субъектов, страдающих от грудной жабы, атеросклероза, одновременно от гипертонии и гиперлипидемии, и для лечения симптомов остановки сердца. Висй е! а1. описывает в патентной заявке РСТ № АО 9911259 сочетанную терапию, включающую амлодипин и аторвастатин.

8со!! е! а1. (патентная заявка РСТ № АО 9911260) описывает сочетанную терапию, включающую аторвастатин и антигипертонический агент.

Эейтаг апй С1Ькоп (патентная заявка Великобритании № СВ 2329334 А) заявляют терапевтическую композицию, которая может применяться для уменьшения уровней липопротеинов низкой плотности и холестерина в плазме, данная композиция включает ингибитор НМС СоА редуктазы и агент, образующий комплексы с желчью.

Вышеприведенные ссылки демонстрируют, что в настоящее время существует необходимость в поиске безопасных, эффективных агентов, которые могут быть использованы для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний.

Краткое описание изобретения

В данном документе описываются сочетанные терапии с использованием сердечнососудистых препаратов, которые можно применять для профилактики и лечения сердечнососудистых заболеваний, направленные на удовлетворение существующей в настоящее время потребности в поиске безопасных и эффективных средств.

В одном из своих воплощений настоящее изобретение предоставляет сочетанную терапию, включающую применение первого количества ингибитора 1ВАТ и второго количества другого сердечно-сосудистого терапевтического препарата, который может применяться для профилактики или лечения гиперлипидемии, атеросклероза или гиперхолестеринемии, где упомянутое первое и второе количества вместе составляют эффективные антигиперлипидемическое, антиатеросклеротическое или антигиперхолестеринемическое количество данных соединений. Например, одно из многих воплощений настоящего изобретения предоставляет сочетанную (комбинированную) терапию, включающую терапевтические дозировки ингибитора 1ВАТ и производного никотиновой кислоты. Предпочтительное воплощение настоящего изобретения предоставляет сочетанную терапию, включающую терапевтические дозировки бензотиепинового соединения, ингибирующего 1ВАТ, и производного никотиновой кислоты.

Следующее воплощение настоящего изобретения включает применение любой из описанных здесь сердечно-сосудистых сочетанных терапий для профилактики или лечения гиперхолестеринемии, атеросклероза или гиперлипидемии. Следовательно, в одном воплощении настоящее изобретение предоставляет способ профилактики или лечения гиперлипидемического состояния, включающий введение пациенту, нуждающемуся в лечении, сочетания в дозированной лекарственной форме, где сочетание включает первое количество соединения, ингибирующего транспорт желчных кислот в подвздошной кишке, и второе количество производного никотиновой кислоты, где первое количество и второе количество вместе составляют эффективное антигиперлипидемическое количество данных соединений.

В другом воплощении настоящее изобретение предоставляет способ профилактики или лечения атеросклеротического состояния, включающий введение пациенту, нуждающемуся в лечении, сочетания в дозированной лекарственной форме, включающего первое количество соединения, ингибирующего транспорт желчных кислот в подвздошной кишке, и второе количество производного никотиновой кислоты, где первое количество и второе количество вместе составляют эффективное антиатеросклеротическое количество данных соединений.

В следующем воплощении настоящее изобретение предоставляет способ профилактики или лечения гиперхолестеринемии, включающий введение пациенту, нуждающемуся в лечении, сочетания, комбинации в дозированной лекарственной форме, где сочетание включает первое количество соединения, ингибирующего транспорт желчных кислот в подвздошной кишке, и второе количество производного никотиновой кислоты, где первое количество и второе количество вместе составляют антигиперхолестеринемическое эффективное количество данных соединений.

Далее сфера применения настоящего изобретения станет более понятной из подробного описания, приведенного ниже. Однако, следует понимать, что приведенные ниже подробное описание и примеры, хотя и раскрывают предпочтительные воплощения данного изобретения, приведены только в качестве иллюстрации, так как различные изменения и модификации, не отступающие от духа и объема данного изобретения, являются очевидными специалисту в данной области из подробного описания.

Подробное описание предпочтительных воплощений

Нижеследующее подробное описание приводится для того, чтобы помочь специалистам в данной области при практическом осуществлении настоящего изобретения. Тем не менее, данное подробное описание не следует истолковывать как чрезмерно ограничивающее настоящее изобретение, так как рядовые специалисты в данной области могут осуществлять модификации и вариации воплощений, обсуждаемых в данном документе, не отступая от духа и объема раскрытия настоящего изобретения.

Содержание каждой из ссылок, цитирующихся в данном документе, включая содержание ссылок, цитирующихся в пределах данных первичных ссылок, включено здесь в качестве ссылки во всей своей полноте.

а. Определения

Следующие определения приводятся для того, чтобы помочь читателю в понимании подробного описания настоящего изобретения.

Транспортер желчных кислот в подвздошной кишке, или ΙΒΑΤ, является синонимом апикального натрий- созависимого транспортера желчных кислот, или Α8ΒΤ.

Бензотиепиновый ингибитор ΙΒΑΤ относится к ингибитору транспорта желчных кислот в подвздошной кишке, который включает терапевтическое соединение, включающее структуру 1,1-диоксид 2,3,4,5-тетрагидро-1-бензотиепина.

Производное никотиновой кислоты обозначает терапевтическое соединение, включающее пиридин-3-карбоксилатную структуру или пиразин-2-карбоксилатную структуру, включая кислые формы, соли, эфиры, цвиттерионы и таутомеры. Производные никотиновой кислоты включают, например, никотиновую кислоту (ниацин), ницеритрол и аципимокс.

Сочетанная, комбинированная терапия относится к введению двух или более терапевтических агентов для лечения гиперлипидемического состояния, например, атеросклероза и гиперхолестеринемии. Такое введение включает совместное введение данных терапевтических агентов по существу одновременно, например, в одной дозированной форме, имеющей фиксированное соотношение активных ингредиентов, или в нескольких отдельных дозированных формах для каждого ингибирующего агента. Кроме того, такое введение также включает последовательное применение терапевтических агентов каждого типа. В любом случае, режим лечения обеспечивает благоприятные эффекты от приема лекарственных препаратов при лечении гиперлипидемического состояния.

Фраза терапевтически эффективный относится к определенному для сочетанной терапии объединенному количеству ингибиторов. Данное объединенное количество позволяет достичь цель, которая состоит в уменьшении или устранении гиперлипидемического состояния.

Терапевтическое соединение относится к соединению, которое может применяться для профилактики или лечения гиперлипидемического состояния, включая атеросклероз и гиперхолестеринемию.

Ь. Сочетания

Сочетания (комбинации) настоящего изобретения имеют ряд применений. Например, в результате регулирования дозировки и медицинского мониторинга индивидуальные дозы терапевтических соединений, использующихся в сочетаниях настоящего изобретения, будут ниже, чем обычные дозы терапевтических соединений при использовании в монотерапии. Уменьшение дозы обеспечивает преимущества, включающие уменьшение побочных эффектов индивидуальных терапевтических соединений по сравнению с монотерапией. Кроме того, уменьшение побочных эффектов сочетанной терапии по сравнению с монотерапией приводит к увеличению согласия пациентов с режимами лечения.

Соединения, которые могут применяться в настоящем изобретении, охватывают широкий ряд терапевтических соединений. Ингибиторы ΙΒΑΤ, представляющие в настоящем изобретении особый интерес, включают соединения, приведенные в табл. 1, а также их диастереомеры, энантиомеры, рацематы, соли и таутомеры.

Таблица 1

Указанное соединение обнаружило ряд неожиданных преимуществ перед другими соединениями 1ВАТ(ИТЖК), ингибирующими транспорт желчных кислот, придающих заявленным сочетаниям весьма полезные свойства, а именно:

соединение формулы В-5 обладает кристаллической формой, упрощающей процессы получения, очистки и использования включающих его составов;

соединение формулы В-5 негигроскопично, т.е. обладает стабильностью. В частности при хранении в течение 2 недель при темпера туре 40°С и 80% влажности, вес образца увеличивается только на 2,1%;

соединение формулы В-5 не обладает системным действием, в частности демонстрируя нулевую концентрацию как в артериальной, так и в венозной крови при пероральном введении, позволяя т.о. избежать множества побочных эффектов, неизбежно сопровождающих действие средств с системной абсорбцией.

Производные никотиновой кислоты, которые могут применяться в сочетаниях и способах настоящего изобретения, включают широкий ряд структур и функций. Предпочтительные производные никотиновой кислоты описаны в табл. 2. Терапевтические соединения, приведенные в табл. 2, могут применяться в настоящем изобретении в разных формах, включая кислую форму, солевую форму, рацематы, энантиомеры, цвиттерионы и таутомеры. Каждый из индивидуальных патентных документов, приведенных в табл. 2, включен в данный документ в качестве ссылки.

Таблица 2

Номер соединения	Тривиальное название	Регистрационный номер САЗ	Ссылка на патентный документ
С-118	Никотиновая кислота	59-67-6
С-117	Ницеритрол	5868-05-3	СВ 1022880
С-3	Аципимокс	51037-30-0	СВ 1351967

Соединения (например, соединения, ингибирующие транспорт желчных кислот в подвздошной кишке, или производные никотиновой кислоты), которые могут применяться в настоящем изобретении, могут не иметь ассиметричных атомов углерода, или, альтернативно, данные соединения могут иметь один или несколько ассимметричных атомов углерода. Если использующиеся соединения имеют один или несколько асимметричных атомов углерода, следовательно, они включают рацематы и стереоизомеры, такие как диастереомеры и энантиомеры, в чистом виде и в виде смесей. Такие стереоизомеры могут быть получены с помощью традиционных методов, либо путем использования энантиомеров в качестве исходных веществ, либо путем разделения изомеров соединений настоящего изобретения.

Изомеры могут включать геометрические изомеры, например, цис-изомеры или трансизомеры, относительно двойной связи. Подразумевается, что к соединениям, использующимся в настоящем изобретении, относятся все такие изомеры.

Соединения, которые могут применяться в настоящем изобретении, также включают таутомеры.

Соединения, которые могут применяться в настоящем изобретении, как описано ниже, включают их соли, сольваты и пролекарства.

Дозировки, композиции и способы введения

Композиции настоящего изобретения могут быть введены для профилактики или лечения гиперлипидемических заболеваний или состояний любым способом, предпочтительно пероральным, который обеспечивает контакт данных соединений с местом их действия в организме, например, в подвздошной кишке, плазме или печени млекопитающего, например, человека.

Для профилактики или лечения состояний, указанных выше, соединения, применимые в композициях и способах настоящего изобретения, могут использоваться сами по себе. Фармацевтически приемлемые соли являются особенно подходящими для медицинских применений, так как они лучше растворяются в воде, чем исходные соединения. Безусловно, такие соли должны иметь фармацевтически приемлемый анион или катион. Подходящие фармацевтическиприемлемые кислотно-аддитивные соли соединений настоящего изобретения, когда возможно, включают производные неорганических кислот, таких как хлористоводородная, бромисто-водородная, фосфорная, метафосфорная, азотная, сульфоновая и серная килоты, и органических кислот, таких как уксусная, бензолсульфоновая, бензойная, лимонная, этансульфоновая, фумаровая, глюконовая, гликолевая, изотионовая, молочная, лактобионовая, малеиновая, яблочная, метансульфоновая, янтарная, толуолсульфоновая, виннокаменная и трифторуксусная кислоты. Для медицинских целей особенно предпочтительными являются хлориды. Соли подходящих фармацевтически приемлемых оснований включают соли аммония, соли щелочных металлов, такие как соли натрия и калия, и соли щелочно-земельных металлов, такие как соли магния и кальция.

Анионы, применимые в настоящем изобретении, конечно, также должны быть фармацевтически приемлемыми и могут быть также выбраны из вышеприведенного списка.

Соединения, которые могут применяться в настоящем изобретении, могут быть представлены с приемлемым носителем в виде фармацевтической композиции. Носитель, конечно, тоже должен быть приемлемым в смысле совместимости с другими ингредиентами композиции и не должен быть вредным для реципиента. Носитель может быть твердым или жидким, или тем и другим, и предпочтительно входит вместе с соединением в состав дозированной композиции, например, таблетки, которая может содержать от 0,05 до 95% по массе активного соединения. Могут также присутствовать другие фармакологически активные вещества, включая другие соединения настоящего изобретения. Фармацевтические композиции данного изобретения могут быть получены с помощью любого из хорошо известных методов фармации, состоящего по существу в смешивании компонентов.

Необязательно сочетание настоящего изобретения может включать композицию, включающую соединение, ингибирующее транспорт желчных кислот в подвздошной кишке, и про изводное никотиновой кислоты. В такой композиции соединение, ингибирующее транспорт желчных кислот в подвздошной кишке, и производное никотиновой кислоты могут присутствовать в дозированной лекарственной форме, например, в виде пилюли, капсулы или жидкости, которая содержит оба соединения.

Данные соединения могут быть введены с помощью любого традиционного средства, доступного для применения вместе с фармацевтическими препаратами, либо в виде индивидуальных терапевтических соединений, или в виде сочетания терапевтических соединений.

Количество соединения, необходимое для достижения желательного биологического эффекта, конечно, зависит от ряда факторов, таких как конкретное выбранное соединение, предназначенное для применения, способ введения и клиническое состояние реципиента.

В основном, общая дневная доза ингибитора ΙΒΑΤ может находиться в интервале приблизительно от 0,01 до 1000 мг/день, предпочтительно приблизительно от 0,1 до 50 мг/день, более предпочтительно приблизительно от 1 до 10 мг/день.

Общая дневная доза производного никотиновой кислоты, в основном, может находиться в интервале приблизительно от 500 до 10000 мг/день, предпочтительно, приблизительно от 1000 до 8000 мг/день, и, более предпочтительно, приблизительно от 3000 до 6000 мг/день в одной или нескольких отдельных дозах.

Дневные дозы, описанные в предыдущих параграфах для разных терапевтических соединений, могут быть введены пациенту в одной дозе, или в виде пропорционально разделенных доз. Разделенные дозы могут быть введены от 2 до 6 раз в день. Дозы могут быть в виде композиции с замедленным высвобождением, эффективным для получения желательных результатов.

В случае фармацевтически приемлемых солей указанные выше массы относятся к массе кислотного или основного эквивалента терапевтического соединения, получающегося из соли.

Пероральная доставка сочетаний настоящего изобретения может включать композиции, как хорошо известно в данной области, предназначенные для обеспечения пролонгированной или непрерывной доставки лекарственного препарата к желудочно-кишечному тракту с помощью любого из механизмов. Они включают, без ограничения, рН-чувствительное высвобождение из дозированной формы, основанное на изменении рН в тонком кишечнике, медленную эрозию таблетки или капсулы, удерживание в желудке на основе физических свойств состава, биоадгезию дозированной формы к слизистой выстилке кишечного тракта, или ферментативное высвобождение активного препарата из дозированной формы. Для некоторых из терапевтических соединений, которые могут приме няться в настоящем изобретении (например, ингибитор ΙΒΑΤ или производное никотиновой кислоты), желательным эффектом является продление промежутка времени, в течение которого молекула активного препарата доставляется к месту действия (например, к подвздошной кишке), путем манипуляции с дозированной формой. Таким образом, композиции с энтеропокрытием и с энтеропокрытием с контролируемым высвобождением входят в объем настоящего изобретения. Подходящие энтеропокрытия включают фталат ацетатцеллюлозы, фталат поливинилацетата, фталат гидроксипропилметилцелюлозы и анионные полимеры метакриловой кислоты и метилового эфира метакриловой кислоты.

Комбинации настоящего изобретения могут быть доставлены перорально в твердой, полутвердой или жидкой форме. В случае жидкой или полутвердой формы сочетания настоящего изобретения могут существовать, например, в виде жидкости, сиропа или содержаться в гелевой капсуле (например, в гелевом колпачке). В одном воплощении, если ингибитор ΙΒΑΤ применяется в сочетании настоящего изобретения, то ингибитор ΙΒΑΤ может быть предоставлен в виде жидкости, сиропа, или содержаться в гелевой капсуле. В другом воплощении, если производное никотиновой кислоты применяется в сочетании настоящего изобретения, то производное никотиновой кислоты может быть предоставлено в виде жидкости, сиропа, или содержаться в гелевой капсуле.

При внутривенном введении доза производного никотиновой кислоты может, например, находиться в интервале, составляющем приблизительно от 150 мг/кг массы тела до 3000 мг/кг массы тела, предпочтительно, приблизительно от 300 мг/кг массы тела до 2000 мг/кг массы тела, более предпочтительно, приблизительно от 500 мг/кг массы тела до 1000 мг/кг массы тела.

Доза любого из данных терапевтических соединений может быть удобно введена посредством вливания со скоростью, составляющей приблизительно от 10 нг/кг массы тела до 100 нг/кг массы тела в минуту. Жидкости для вливания, подходящие для данной цели, могут содержать, например, приблизительно от 0,1 нг до 10 мг, предпочтительно, приблизительно от 1 нг до 10 мг на миллилитр. Дозированные формы могут содержать, например, приблизительно от 1 мг до 10 г соединения настоящего изобретения. Таким образом, ампулы для инъекций могут содержать, например, приблизительно от 1 мг до 100 мг.

Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением включают композиции, подходящие для перорального, ректального, местного, защечного (например, подъязычного) и парентерального (например, подкожного, внутримышечного, внутрикожного или внутривенного) введения, хотя наиболее подходящий способ в каждом данном случае зависит от природы и тяжести состояния, подлежащего лечению, а также от природы конкретного используемого соединения. В большинстве случаев предпочтительным способом введения является пероральное введение.

Фармацевтические композиции, подходящие для перорального введения, могут присутствовать в виде дискретных единиц, таких как капсулы, облатки, пастилки или таблетки, каждая из которых содержит заранее определенное количество по меньшей мере одного терапевтического соединения, применимого в настоящем изобретении; в виде порошка или гранул; в виде раствора или суспензии в водной или неводной жидкости; или в виде эмульсий масло-в-воде или вода-в-масле. Как указано, такие композиции могут быть получены с помощью любого подходящего фармацевтического метода, который включает стадию объединения активного соединения(й) и носителя (который может состоять из одного или нескольких вспомогательных ингредиентов). В основном, композиции получают путем равномерного и однородного смешивания активного соединения с жидким или мелкоразмельченным твердым носителем, или с обоими, и затем, при необходимости, придают продукту форму. Например, таблетка может быть получена путем прессования или формования порошка или гранул соединения, необязательно с одним или несколькими вспомогательными ингредиентами. Прессованные таблетки могут быть получены путем прессования в подходящем устройстве соединения в свободно-текучем виде, таком как порошок или гранулы, необязательно смешанного со связующим агентом, смазочным агентом, инертным разбавителем и/или поверхностно-активным/ диспергирующим агентом(ами). Формованные таблетки могут быть получены путем формования в подходящем устройстве порошкообразного соединения, смоченного инертным жидким разбавителем.

Фармацевтические композиции, подходящие для защечного (подъязычного) введения, включают таблетки, содержащие соединение настоящего изобретения во вкусовой основе, обычно сахарозе, и гуммиарабик или трагакант, и пастилки, содержащие соединение в инертной основе, такой как желатин и глицерин, или сахароза и гуммиарабик.

Фармацевтические композиции, подходящие для парентерального введения, обычно включают стерильные водные препараты соединения настоящего изобретения. Данные препараты предпочтительно вводят внутривенно, хотя введение может также осуществляться путем подкожной, внутримышечной или внутрикожной инъекции. Такие препараты традиционно могут быть получены путем смешивания соединения с водой и переведения полученного раствора в стерильную и изотоническую по отношению к крови форму. Композиции для инъекции в соответствии с данным изобретением обычно содержат от 0,1 до 5% мас./мас., соединения, раскрытого в данном документе.

Фармацевтические композиции, подходящие для ректального введения, предпочтительно присутствуют в виде дозированных свечей. Они могут быть получены путем смешивания соединения настоящего изобретения с одним или несколькими традиционными твердыми носителями, например, кокосовым маслом, и затем путем придания формы полученной смеси.

Фармацевтические композиции, подходящие для местного применения на коже, предпочтительно находятся в виде мази, крема, лосьона, пасты, геля, спрея, аэрозоля или масла. Носители, которые могут применяться, включают петролатум (например, вазелин), ланолин, полиэтиленгликоли, спирты, а также сочетания двух или более из данных веществ. Активное соединение обычно присутствует в концентрации, составляющей от 0,1 до 50 мас.%, от массы композиции, например, от 0,5 до 2%.

Также возможно чрескожное введение. Фармацевтические композиции, подходящие для чрезкожного введения, могут присутствовать в виде отдельных пластырей, приспособленных для того, чтобы оставаться в тесном контакте с эпидермисом реципиента в течение длительного периода времени. Подходящим является, если такие пластыри содержат соединение настоящего изобретения в необязательно забуференном водном растворе, растворенное и/или диспергированное в липкой основе, или диспергированное в полимере. Подходящая концентрация активного соединения составляет приблизительно от 1 до 35%, предпочтительно от 3 до 15%. Особого внимания заслуживает способ, при котором соединение может быть доставлено из пластыря посредством электротранспорта или ионофореза, например, как описано в Р11агтассиЦса1 Рс5сагс11. 3(6), 318 (1986).

В любом случае, количество активного ингредиента, которое может быть объединено с веществами-носителями с получением дозированной формы, предназначенной для введения, зависит от пациента, подлежащего лечению и конкретного способа введения.

Твердые дозированные формы для перорального введения включают капсулы, таблетки, пилюли, порошки, гелевые колпачки и гранулы, указанные выше, содержащие одно или несколько соединений, применимых в настоящем изобретении, смешанных по меньшей мере с одним инертным разбавителем, таким как сахароза, лактоза или крахмал. Такие дозированные формы могут также содержать, как известно в обычной практике, добавочные вещества, отличные от инертных разбавителей, например, смазывающие агенты, такие как стеарат магния, или солюбилизирующие агенты, такие как циклодекстрины. В случае капсул, таблеток, порошков, гранул, гелевых колпачков и пилюль, дозированные формы могут также включать забуферивающие агенты. Могут быть также получены таблетки и пилюли с энтеропокрытиями.

Жидкие дозированные формы для перорального введения могут включать фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры, содержащие инертные разбавители, обычно применяющиеся в данной области, такие как вода. Такие композиции могут также включать адъюванты, такие как увлажняющие агенты, эмульгирующие и суспендирующие агенты, а также подсластители, ароматизаторы и отдушки.

Препараты для инъекций, например, стерильные водные или маслянистые суспензии для инъекций, могут быть получены в соответствии с известными в данной области способами, с использованием подходящих диспергирующих агентов или отвердителей, а также суспендирующих агентов. Стерильные препараты для инъекций могут также представлять собой стерильный раствор или суспензию в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, в виде раствора в 1,3-бутандиоле. К приемлемым средам и растворителям, которые могут применяться, относится вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды традиционно применяются стерильные нелетучие масла. Для этого могут использоваться любые мягкие нелетучие масла, включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, в получении препаратов для инъекций находят применение жирные кислоты, такие как олеиновая кислота.

Фармацевтически приемлемые носители охватывают все вышеупомянутые носители и т. п.

В сочетанной терапии введение двух или более терапевтических агентов, применимых в настоящем изобретении, может происходить последовательно, в отдельных композициях, или может быть осуществлено путем одновременного введения в одной или в отдельных композициях. Введение может осуществляться пероральным способом, или посредством внутривенных, внутримышечных или подкожных инъекций. Композиции могут находиться в виде болюсов, или в виде водных или неводных изотонических стерильных растворов или суспензий для инъекций. Данные растворы и суспензии могут быть получены из стерильных порошков или гранул, имеющих один или несколько фармацевтически приемлемых носителей или разбавителей, или связующее вещество, такое как желатин или гидроксипропилметилцеллюлоза, вместе с одним или несколькими агентами из смазывающего агента, консерванта, поверхностно-активного или диспергирующего агента.

Фармацевтическая композиция, предназначенная для перорального введения, может находиться в виде, например, таблетки, капсулы, суспензии или жидкости. Капсулы, таблетки и др. могут быть получены с помощью традиционных способов, хорошо известных в данной области. Фармацевтическую композицию предпочтительно получают в виде дозированной формы, содержащей конкретное количество активного ингредиента или ингредиентов. Примерами дозированных форм являются таблетки или капсулы. Они могут преимущественно содержать одно или несколько терапевтических соединений в количестве, описанном выше. Например, в случае ингибитора ΙΒΑΤ доза находится в интервале, который может составлять приблизительно от 0,01 мг/день до 500 мг/день, или представляет собой любую другую дозу, в зависимости от конкретного ингибитора, как известно в данной области. В случае производного никотиновой кислоты, доза находится в интервале, который может составлять приблизительно от 0,01 мг до 500 мг, или представляет собой любую другую дозу, в зависимости от конкретного ингибитора, как известно в данной области.

Активные ингредиенты могут быть также введены путем инъекции в виде композиции, в которой, например, в качестве подходящего носителя может применяться физиологический раствор, декстроза или вода. Подходящей дневной дозой каждого активного терапевтического соединения является такая доза, которая обеспечивает такой уровень в сыворотке крови, какой обеспечивается в результате перорального введения, как описано выше.

Терапевтические соединения могут быть также введены посредством сочетания способов пероральный/пероральный, пероральный/парентеральный или парентеральный/парентеральный.

Фармацевтические композиции, предназначенные для применения в способах лечения настоящего изобретения, могут быть введены в пероральной форме или путем внутривенного введения. При сочетанной терапии предпочтительно пероральное введение. Дозировка для перорального введения может находиться в пределах режима, указанного для однократной дневной дозы, или для однократной дозы каждый следующий день, или для нескольких, разделенных доз в течение дня. Терапевтические соединения, которые составляют сочетанную терапию, могут быть введены одновременно, либо в объединенной дозированной форме, либо в отдельных дозированных формах, предназначенных для по существу одновременного перорального введения. Терапевтические соединения, которые составляют сочетанную терапию, могут быть также введены последовательно, причем каждое терапевтическое соединение вводят по режиму, указанному для двухстадийного приема. Таким образом, режим может требовать последовательного введения терапевтических соединений с раздельным приемом отдельных активных агентов. Период времени между несколькими стадиями приема может варьировать от нескольких минут до нескольких часов, в зависимости от свойств каждого терапевтического соединения, таких как активность, растворимость, биодоступность, период полужизни в плазме и кинетический профиль терапевтического соединения, а также в зависимости от эффекта от приема пищи, возраста и состояния пациента. Суточные изменения концентрации целевой молекулы также может определять интервал оптимальной дозы. Терапевтические соединения сочетанной терапии, введенные или одновременно, по существу одновременно, или последовательно, могут включать режим, требующий введения одного терапевтического соединения перорально, а другого терапевтического соединения внутривенно. Вводят ли терапевтические соединения сочетанной терапии пероральным или внутривенным способом, отдельно или вместе, каждое такое терапевтическое соединение будет содержаться в подходящей фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемые эксципиенты, разбавители или другие компоненты композиций. Примеры подходящих фармацевтически приемлемых композиций, содержащих терапевтические соединения, предназначенных для перорального введения, приведены выше.

Режим лечения

Режим дозирования для профилактики, облегчения или улучшения болезненного состояния, включающего гиперлипемию как элемент заболевания, например, атеросклероза, или лечения повышенных уровней холестерина в плазме или в крови или для защиты от них с помощью соединений и/или композиций настоящего изобретения, выбирают в соответствии с рядом факторов. Данные факторы включают тип, возраст, вес, пол, диету и медицинское состояние пациента, тяжесть заболевания, способ введения, фармакологические характеристики, такие как активность, эффективность, фармакокинетика и токсикологические профили конкретного применяемого соединения, в случае использования системы доставки лекарственного препарата, и в случае, если соединение вводят как часть сочетания лекарственных препаратов. Таким образом, применяемый в действительности режим дозирования может широко варьировать в широких пределах и, следовательно, может отклоняться от предпочтительного режима дозирования, приведенного выше.

Сначала лечение пациента, страдающего от гиперлипидемического состояния, может начинаться с доз, указанных выше. Лечение обычно должно продолжаться, как необходимо, в течение периода от нескольких недель до нескольких месяцев или лет, до тех пор, пока гиперлипидемическое болезненное состояние не будет подавлено или устранено. Для определения эффективности сочетанной терапии состояние пациентов, подвергающихся лечению соединениями или композициями, раскрытыми в данном документе, обычно можно отслеживать, например, измеряя сывороточные уровни общего холестерина и холестерина ТПЬ с помощью любого из методов, хорошо известных в данной области. Непрерывный анализ таких данных позволяет изменять режим лечения в процессе лечения так, чтобы в любой момент времени вводить оптимальные эффективные количества каждого типа терапевтического соединения, и, кроме того, определить продолжительность лечения. Таким образом, режим лечения/порядок дозирования могут быть рационально изменены в течение курса лечения, так, чтобы вводить самое низкое количество терапевтических соединений, которые вместе проявляют удовлетворительную эффективность, и так, чтобы введение продолжалось в течение времени, необходимого для удовлетворительного лечения гиперлипидемического состояния.

Потенциальным преимуществом сочетанной терапии, раскрытой в данном документе, может быть уменьшенное количество любого индивидуального терапевтического соединения, или всех терапевтических соединений, эффективное для лечения гиперлипидемических состояний, таких как атеросклероз и гиперхолестеринемия. Снижение дозы обеспечивает преимущества, включающие уменьшение побочных эффектов индивидуальных терапевтических соединений по сравнению с монотерапией.

Одно из нескольких воплощений настоящего изобретения включает сочетанную терапию, включающую применение первого количества ингибитора ΙΒΑΤ и второе количество другого сердечно-сосудистого терапевтического препарата, применимого для профилактики или лечения гиперлипидемии или атеросклероза, где упомянутые первое и второе количества вместе составляют количество упомянутых соединений, эффективное против гиперлипидемического состояния, или эффективное против атеросклеротического состояния. Например, одно из многих воплощений настоящего изобретения представляет сочетанную терапию, включающую терапевтические дозы ингибитора ΙΒΑΤ и производного никотиновой кислоты. Предпочтительное воплощение настоящего изобретения представляет сочетанную терапию, включающую терапевтические дозы бензотиепинового ингибитора ΙΒΑΤ и производного никотиновой кислоты.

Нижеследующие неограничивающие примеры служат для иллюстрации различных аспектов настоящего изобретения.

с. Примеры

Табл. 3 иллюстрирует примеры некоторых сочетаний настоящего изобретения, где сочетание включает первое количество ингибитора ΙΒΑΤ и второе количество производного никотиновой кислоты, где упомянутые первое и второе количества вместе составляют количество упомянутых соединений, эффективное против гиперлипидемического состояния, или эффективное против атеросклеротического состояния.

Таблица 3

Номер примера	Компонент 1	Компонент 2
1.	В-5	Никотиновая кислота (ниацин)
2 .	В-5	Ницеритрол
3.	В-5	Аципимокс

Биологические анализы

Применение сочетаний настоящего изобретения может быть продемонстрировано с помощью нижеследующих анализов. Данные анализы проводят ίη νίΐτο и на моделях животных, по существу используя методы, которые могут продемонстрировать применение настоящего изобретения.

Ιη νίΐτο анализ соединений, ингибирующих поглощение [¹⁴С]-аланина

Анализ поглощения аланина может быть проведен по способу, идентичному таурохолатному анализу, за исключением того, что меченный таурохолат заменяют на меченный аланин. Измерение концентрации желчных кислот в фекалиях (ΡΒΑ) крысы

Общее количество фекалий от индивидуально размещенных крыс собирали в течение 24 или 48 ч, сушили в токе азота, растирали в порошок, перемешивали и взвешивали. Приблизительно 0,1 г отбирали и экстрагировали органическим растворителем (бутанол/вода). После разделения и высушивания остаток растворяли в метаноле и количество присутствующих желчных кислот измеряли с помощью ферментного анализа, используя взаимодействие 3 агидроксистероид-дегидрогеназы с желчными кислотами с восстановлением ΝΑΌ. (см. Макй1де, Р. е! а1. Οΐίη. Сйет., 27, 1352 (1981), включенный в данный документ в качестве ссылки).

Анализ введения препарата крысе через желудочный зонд

Самцам крыс νίηκ^Γ (275-300 г) вводили ингибиторы ΙΒΑΤ, используя перорально желудочные зонды. Лекарственный препарат или среду для лекарства (0,2% ΤνΕΕΝ 80 в воде) вводят один раз в день (9:00 -10:00 утра) в течение 4 дней в различных дозах в конечном объеме 2 мл на килограмм массы тела. (ΤνΕΕΝ 80 представляет собой поверхностно-активное вещество 20 молярный моноолеат полиэтиленоксид сорбитана, произведенный 1С1 ЗреааЙу Сйетюак, \νί1ιηίη§ΐοη. Ие1атеаге, и.З.А.). Собирали фекалии в течение последних 48 ч периода лечения и анализировали на содержание желчных кислот, используя ферментативный анализ, как описано ниже. Эффективность соединения определяли путем сравнения увеличения концентрации фекальных желчных кислот (РВА) у крыс, получающих лекарственный препарат, со средним значением концентрации РВА у крыс, получающих носитель (среду для лекарства).

Поглощение [³Н]-таурохолата в мембранных везикулах ворсистого эпителия (ВВМУ) Мембраны ворсистого эпителия подвздошной кишки кролика получали из замороженной слизистой оболочки с помощью метода осаждения кальцием, описанного Ма1а!й1 е! а1. (ВюсЫтюа Вюрйукка Ас!а, 554, 259 (1979), включен в данный документ в качестве ссылки). Способ для измерения таурохолата по существу являлся таким, как описан Кгатег е! а1. (Вюсйшйса Вюрйукюа Ас!а, 554, 259 (1979), включен в данный документ в качестве ссылки), за исключением того, что аналитический объем составлял 200 мкл вместо 100 мкл. Коротко говоря, при комнатной температуре 190 мкл раствора, содержащего 2 мкМ [³Н]-таурохолата (0,75 мкКи) , 20 мМ !пк, 100 мМ №С1, 100 мМ маннитол рН 7,4, инкубировали 5 с с 10 мкл мембранных везикул ворсистого эпителия (60120 мкг белка). Инкубацию инициировали путем добавления ВВМУ при энергичном перемешивании и реакцию останавливали путем добавления 5 мл охлажденного во льду буфера (20 мМ Нерек-йгк, 150 мМ КС1), сразу после этого фильтровали через найлоновый фильтр (поры 0,2 мкм) и промывали еще 5 мл останавливающего буфера.

Ацил-СоА; Холестеринацил трансфераза (АСАТ)

Микросомы печени хомяка и кишечника крысы получали из ткани по описанной ранее методике (1. Вю1. Сйет., 255, 9098 (1980), включен в данный документ в качестве ссылки) и использовали в качестве источника фермента АСАТ. Анализ включал 2,0 мл инкубационной среды, содержащей 24 мкМ олеоил-СоА (0,05 мкКи) в 50 мМ фосфате натрия, 2 мМ ΌΤΤ, буфера рН 7,4, содержащего 0,25% ВЗА и 200 мкг микросомального белка. Анализ инициировали добавлением олеоил-СоА. Реакция протекала 5 мин при 37°С, ее завершали путем добавления 8,0 мл смеси хлороформ/метанол (2:1). К экстракционной смеси добавляли 125 мкг олеата холестерина в смеси хлороформ/метанол в качестве носителя, и органическую и водную фазы экстракционной смеси разделяли путем центрифугирования после энергичного перемешивания. Хлороформную фазу высушивали и затем наносили на ТСХ пластинки с силикагелем 60 и проявляли смесью гексан/этиловый эфир (9:1). Количество образовавшегося эфира холестерина определяли путем измерения количества радиоактивности, включенной в пятна на пластинке ТСХ, содержащие олеат холестерина, с помощью Раскагб Iη8ΐа^таде^.

Измерение концентрации печеночного холестерина (НЕРАТ1С СНОЬ)

Ткань печени взвешивали и гомогенизировали в смеси хлороформ/метанол (2:1). После гомогенизации и центрифугирования супернатант отделяли и сушили в атмосфере азота. Остаток растворяли в изопропаноле и содержание холестерина измеряли с помощью ферментного анализа, используя сочетание холестериноксидазы и пероксидазы, как описано А11а1п, С. А. е! а1., Сйп. Сйет., 20, 470 (1974) (включен в данный документ в качестве ссылки).

Измерение активности НОМ СоА-редуктазы печени (НОМ СоА)

Микросомы печени получали путем гомогенизации образцов печени в фосфатносахарозном буфере, затем отделяли путем центрифугирования. Вещество осадка ресуспендировали в буфере и аликвоту анализировали на активность НОМ СоА-редуктазы путем инкубации в течение 60 мин при 37°С в присутствии ¹⁴С-НОМ-СоА (ΌΗροηΐ-ΝΕΝ). Реакцию останавливали путем добавления 6п НС1, после чего центрифугировали. Аликвоту супернатанта разделяли с помощью тонкослойной хроматографии, пятно, соответствующее продукту ферментативной реакции, соскабливали с пластинки, экстрагировали и радиоактивность определяли путем сцинтилляционного счета (ссылка: Акег1ипб, 1. апб Вргкйет, I. (1990) 1. ΠϊρΐΠ. Век. 31, 2159).

Измерение активности холестерин 7-αгидроксилазы в печени (7а-ОНаке) Печеночные микросомы получали путем гомогенизации образцов печени в фосфатносахарозном буфере, затем отделяли путем центрифугирования. Вещество конечного осадка ресуспендировали в буфере и аликвоту анализировали на активность холестерин 7-αгидроксилазы путем инкубации в течение 5 мин при 37°С в присутствии NА^РН. После экстракции петролейным эфиром органический растворитель упаривали и остаток растворяли в смеси ацетонитрил/метанол. Продукт ферментативной реакции разделяли путем введения аликвоты экстракта в колонку ВЭЖХ с обращенной фазой С18 и количественно определяли элюирующееся вещество с помощью УФ-детектора при 240 нм (ссылка: Ног1оп, 1. Ό., е! а1 (1994) 1. Сйп. 1пуек1. 93, 2084).

Определение сывороточного холестерина (8ЕВ.СНОЙ, НОЙ-СНОЙ, ТО1 и У1.111. + ЬПЬ)

Общий сывороточный холестерин (8ЕКСНОЙ) измеряли с помощью ферментного анализа с использованием набора от \Уако Ете Сйеткак (Ктейтопб, УА); холестерин С11, № по каталогу 276-64909. Холестерин НИЙ (НИЙСНОй) анализировали, используя тот же набор, после осаждения УЙЭЙ и ййй. с помощью НЭЙ холестеринового реагента, Еадта Сйет1еа1 Со., № по каталогу 352-3 (декстран сульфатный ме тод). Общие сывороточные триглицериды (контрольные) (ТО1) анализировали с помощью ферментативной реакции с использованием 81дта Сйет1еа1 Со. ОРО-Тппбег, № по каталогу 337-В. Концентрации холестерина Уййй и ййй (УЙЙЙ + ЙЭЙ) рассчитывали как разность между общим холестерином и холестерином НЭЙ.

Измерение концентрации желчных кислот в фекалиях хомяка (ЕВА)

Все фекалии от индивидуально размещенных хомяков собирали в течение 24 или 48 ч, сушили в токе азота, растирали в порошок и взвешивали. Приблизительно 0,1 г отбирали и экстрагировали органическим растворителем (бутанол/вода). После разделения и высушивания остаток растворяли в метаноле и количество присутствующих желчных кислот измеряли с помощью ферментного анализа, используя реакцию 3а-гидроксистероиддегидрогеназы с желчными кислотами с восстановлением ΝΛΟ. (см. МакЫде, Е. е! а1. Сйп. Сйет., 27, 1352 (1981), включенный в данный документ в качестве ссылки).

Модель для оценки лекарственных препаратов, снижающих уровень липидов на собаках

Самцов коротконогих гончих собак, полученных из такого источника, как питомник Маршалла, весом 6-12 кг, кормили один раз в день в течение двух часов и давали воду по потребности. Собак случайным образом определяли в группы дозирования, состоящие из 6-12 собак каждая, такие как: среда для лекарства, в. ж.; 1 мг/кг, в. ж.; 2 мг/кг, в. ж.; 4 мг/кг, в. ж.; 2 мг/кг, р.о. (порошок в капсуле). Внутрижелудочное введение дозы терапевтического вещества, растворенного в водном растворе (например, 0,2% раствор Т\сееп 80 [полиоксиэтилена моноолеат, 81дта Сйет1еа1к Со., 81. йошк, МО]) может быть осуществлено с помощью желудочного зонда. Перед началом получения дозы образцы крови брали из латеральной подкожной вены передней конечности утром перед кормлением для оценки уровней холестерина (общего и НЭЙ) и триглицеридов в сыворотке. В течение нескольких последующих дней животные получали дозу утром, перед кормлением. Животным позволяли есть 2 ч, после чего остатки пищи удаляли. Фекалии собирали в течение двух дней в конце исследования и анализировали на содержание желчных кислот или липидов. В конце периода лечения также отбирали образцы крови для сравнения с уровнями липидов в сыворотке до исследования. Статистически достоверное значение определяли с помощью стандартного Т-теста Стьюдента при р<0,05.

Измерение липидов в сыворотке собак

Кровь собирали из латеральной подкожной вены передней конечности собак, не получающих пищу, в пробирки для отделения сыворотки (Уаси1атег 88Т, Вес1оп Июкткоп апб Со., Егапкйп йакек, N1). Кровь центрифугировали 20 мин при 2000 об/мин и сыворотку декантировали.

Общий холестерин измеряли в 96луночном формате с помощью ферментного диагностического набора Аако (холестерин С11) (Аако СБеткак, Ккйтопб, УА) , с использованием реакции холестериноксидазы с образованием пероксида водорода, который измеряли колориметрически. Стандартную кривую для концентраций холестерина от 0,5 до 10 мкг получали, используя первые две колонки планшета. Образцы сыворотки (20-40 мкл, в зависимости от ожидаемой концентрации липидов) или известные сывороточные контрольные образцы добавляли в отдельные лунки с повторами. Воду добавляли в таком количестве, чтобы довести объем в каждой лунке до 100 мкл. К каждой лунке добавляли аликвоту окрашивающего реагента объемом 100 мкл и планшеты считывали при 500 нм после 15 мин инкубации при 37°С.

Холестерин НББ анализировали с помощью набора 81дта № 352-3 (81дта Сйетка1 Со., 81. Боик, МО), с использованием декстрансульфата и ионов Мд для избирательного осаждения БОБ и УБББ. Каждый сывороточный образец объемом 150 мкл добавляют в отдельные пробирки для микроцентрифугирования с последующим добавлением 15 мкл холестеринового реагента НББ (81дта 352-3). Образцы перемешивали и центрифугировали 5 мин при 5000 об/мин. Затем аликвоту супернатанта объемом 50 мкл смешивали с 200 мкл физиологического раствора и анализировали по методу, использующемуся для измерения общего холестерина.

Триглицериды измеряли с помощью набора 81дта № 337 в формате 96-луночного планшет. По данной методике измеряют глицерин после его высвобождения в результате взаимодействия триглицеридов с липопротеинлипазой. Для получения стандартной кривой используют стандартные растворы глицерина (81дта 339-11) с концентрацией, находящейся в интервале от 1 до 24 мкг. Образцы сыворотки (20-40 мкл, в зависимости от ожидаемой концентрации липидов) или известные сывороточные контрольные образцы добавляли в лунки с повторами. Воду добавляли в таком количестве, чтобы довести объем в каждой лунке до 100 мкл и к каждой лунке также добавляли окрашивающий реагент объемом 100 мкл. После перемешивания и инкубации в течение 15 мин планшеты считывали при 540 нм и значения концентраций триглицеридов рассчитывали по стандартной кривой. В опыте также использовали дубликат планшета с использованием контроля ферментного реагента для корректировки эндогенного глицерина в образцах сыворотки.

Измерение желчных кислот в фекалиях собаки

Для определения концентрации фекальных желчных кислот (ЕВА) собирали образцы фекалий каждого животного. Сбор фекалий проводили в течение последних 48 ч исследования, в течение двух последовательных 24-часовых периодов между 9:00 и 10:00 утра каждый день, перед введением препаратов и кормлением. Отдельные двухдневные сборы фекалий от каждого животного взвешивали, объединяли и гомогенизировали с дистиллированной водой в процессоре (Сиктай) до получения гомогенной взвеси. Приблизительно 1,4 г гомогената экстрагировали в конечной концентрации 50% третичный бутанол/дистиллированная вода (2:0,6) в течение 45 мин в водяной бане при 37°С и центрифугировали 13 мин при 2000хд. Концентрацию желчных кислот (ммоль/день) определяли с помощью 96-луночной ферментативной аналитической системы (1,2). Аликвоту фекального экстракта объемом 20 мкл добавляли к двум сериям каждого из тройных повторов лунок в 96-луночном аналитическом планшете. Для контроля качества анализа также анализировали стандартизированный раствор таурохо-лата натрия и стандартизированный раствор фекального экстракта (предварительно полученный из объединенных образцов и характеризованный по концентрации присутствующих в нем желчных кислот). Подобным образом к двум сериям тройных повторов лунок добавляли двадцатимикролитровые аликвоты таурохолата натрия, серийно разбавленные для получения стандартной кривой. К каждой лунке добавляли реакционную смесь, содержащую 1М гидразингидрата, 0,1М пирофосфата и 0,46 мг/мл ΝΑΌ. Затем к одной из двух серий тройных повторов добавляли аликвоту фермента 3а-гидроксистероиддегидрогеназы (Η8Ό; 0,8 ед./мл) или аналитического буфера (0,1 М пирофосфат натрия) объемом 50 мкл. Все реагенты были получены от 81дта С11списа1 Со., 81. Боик, МО. После 60 мин инкубации при комнатной температуре измеряли оптическую плотность при 340 нм и рассчитывали среднее значение каждой серии тройных повторов образцов. Различие в оптической плотности ± Η8Ό фермент использовали для определения концентрации желчных кислот (мМ) в каждом образце на основе стандартной кривой таурохолата. Для расчета соответствующей концентрации ΕΒΑ в ммоль/ кг/день использовали концентрацию желчных кислот в экстракте, массу гомогената фекалий (граммы) и массу тела животного. Для определения увеличения (значение дельта) концентрации ΕΒΑ в результате лечения среднюю концентрацию ΕΒΑ (ммоль/кг/день), полученную для группы, получающей среду для лекарства (носитель), вычитали из концентрации ΕΒΑ, полученной для группы, получающей лекарственный препарат.

Анализ абсорбции холестерина в кишечнике

Показано, что ряд соединений ингибирует абсорбцию холестерина из кишечного тракта. Данные соединения снижают уровень холестерина в сыворотке путем уменьшения абсорбции в кишечнике как экзогенного (пищевого), так и эндогенного (секретируемого из желчного пузыря в кишечный тракт) холестерина.

У хомяков применение двойного изотопного метода плазменного соотношения для измерения абсорбции холестерина в кишечнике было усовершенствовано и оценено, как описано Тиг1еу е! а1. (1. Ыр1б Кек. 35, 329-339 (1994), включенный в данный документ в качестве ссылки).

Самцы хомяков весом 80-100 г получали пищу и воду по потребности (свободно) в комнате с 12-часовыми чередующимися световым и темным периодами. Четыре часа в световом периоде каждому хомяку вводили вначале внутривенно дозу 2,5 мкКи [1,2-³Н]холестерина, суспендированного в ΙηίΓαΙίρίά (20%) и затем перорально дозу [4-¹⁴С]холестерина в масле из среднецепочечных триглицеридов (МСТ). В.в. дозу давали путем введения смеси ΙηίΓηΙίρίΗ объемом 0,4 мл в дистальную бедренную вену. Пероральную дозу давали путем введения масляной смеси МСТ объемом 0,6 мл в желудок через зонд, представляющий собой полиэтиленовую трубку. Через 72 ч хомяков обескровливали и определяли количество ³Н и ¹⁴С в плазме и в исходном количестве вводимой метки с помощью жидкостной стинцилляционной спектрометрии. Абсорбцию холестерина рассчитывали на основе следующего уравнения:

Процент абсорбированного холестерина = % пероральной дозы на мл 72-часового образца плазмы х100 % в.в. дозы на мл 72-часового образца плазмы

Анализ микросомального белка, переносящего триглицериды (МТР)

МТР выделяли из ткани печени или из культуры клеток (например, клеток НерС2) с помощью стандартных методов, как описано ОЬппдег е1 а1. (Ас!а СгуккИодг. Ό52, 224-225 (1996), включен в данный документ в качестве ссылки).

Последующие анализы активности МТР проводили как описано ΤιιηίΙ е1 а1. (Ргос. Ν;·ιΐ1. Асаб. 8с1. 93, 11991-11995 (1996), включен в данный документ в качестве ссылки).

Основой данного анализа является измерение переноса меченных триглицеридов от популяции донорных везикул к популяции акцепторных везикул в присутствии МТР. Ингибиторы МТР оценивали путем добавления их к смеси перед введением МТР. Донорные везикулы получали путем обработки ультразвуком водной смеси яичных фосфолипидов, кардиолипина, ³Н-меченного фосфолипида и ¹⁴С-меченных триглицеридов. Акцепторные везикулы получали путем обработки ультразвуком водной смеси фосфолипидов яйца. Растворы везикул смешивали вместе, в присутствии или в отсутствии добавленных ингибиторов МТР, и добавляли МТР для инициации реакции переноса. Анализ завершают через 60 мин путем добавления 0,5 мл целлюлозы ΌΕ-52, затем центрифугируют для осаждения донорных молекул. Количество ³Н и ¹⁴С в осадке и исходное количество метки в смеси определяют с помощью жидкостной сцинтилляционной спектрометрии. Скорость переноса липидов оценивают на основе кинетической зависимости первого порядка, используя выражение:

[8] = [8]0 е^-к!, где [8]₀ и [8] обозначают долю метки ¹⁴С в осадке донорной мембраны в моменты времени 0 и 1, соответственно, а коэффициент к обозначает долю метки, переносимую в единицу времени.

Анализ липидов плазмы кроликов

Липиды плазмы анализировали с помощью стандартных методов, как описано 1. К. 8с1ш11 е1 а1., 1. С1ш. ИчуеЧ., 91, 1453-1458 (1993), включен в данный документ в качестве ссылки. Группы самцов ново-зеландских белых кроликов сажали на стандартную диету (100 г/день), дополненную 0,3% холестерина и 2% кукурузного масла (2е1§1ег Во1кег5. 1пс., Оагбпегк, РА). Воду по потребности давали в свободном режиме. Группы контрольных и обработанных животных умерщвляли после 1 и 3 месяцев лечения. Ткани удаляли для характеристики атеросклеротических бляшек. Для определения концентрации липидов в плазме брали образцы крови.

Липиды плазмы

Плазму для анализа липидов получали путем забора крови из ушной вены в ЭДТАсодержащие пробирки (Уаси!атег; ВесЮп Рккепкоп & Со., КШкегГогб, N1), с последующим отделением клеток путем центрифугирования. Общий холестерин определяли с помощью ферментного анализа с использованием реакции холестериноксидазы (С.А. А11аш е1 а1., С1ш. СНет., 20, 470-475 (1974), включен в данный документ в качестве ссылки). Холестерин НРЬ также измеряли с помощью ферментного анализа, после избирательного осаждения ЕРЬ и УЕРЬ под действием декстран-сульфата и магния (О.К. Аагшск е! а1., С1т. СНет., 28, 13791388 (1982), включен в данный документ в качестве ссылки). Уровни триглицеридов в плазме определяли путем измерения количества глицерина, высвобождающегося под действием липопротеин-липазы, посредством анализа с использованием связанного фермента (О. Висо1о е! а1., С1т. СНет., 19, 476-482 (1973), включен в данный документ в качестве ссылки).

Атеросклероз

Животных умерщвляли путем инъекции пентобарбитала. Торакальные аорты быстро удаляли, фиксировали погружением в 10% нейтральный забуференный формалин и окрашивали маслянистым красным О (0,3%). После одного продольного надреза вдоль стенки, противоположной устью, сосуды закрепляли открытыми для оценки площади, занимаемой бляшками. Процент площади, покрытой бляшками, определяют из значений общей исследуемой площади и окрашенной площади путем порогового анализа с использованием анализатора изображе ния подлинного окрашивания (У|бсошс1пс 150; Лшспсап Ιηηονίδίοη, 1пс., Баи Ωίοβο. СА), сопряженного с цветовой камерой (ТокЫЬа ЗССЭ). установленной на аналитическом микроскопе. Тканевой холестерин измеряли с помощью ферментного анализа, как описано, после экстракции смесью хлороформ/метанол (2:1) в соответствии с методом, описанным Ро1с11 с1 а1. (1. ΒίοΙ. Сйет., 226, 497-509 (1957), включен в данный документ в качестве ссылки).

Сосудистый ответ ίη νίίτο

После инъекции пентобарбитала натрия абдоминальные аорты быстро вырезают и помещают в насыщенный кислородом бикарбонатный буфер Кребса. После удаления периваскулярной ткани вырезают круговые сегменты диаметром 3 мм, помещают при 37°С в мускульную (тц§с1е) баню, содержащую бикарбонатный раствор Кребса, и подвешивают между двумя неокрашенными стальными проволоками, одна из которых присоединена к преобразователю усилия (Сга§8 1и81гцтеп1 Отпсу, МА).

Изменение усилия в ответ на добавление к водяной бане ангиотензина ΙΙ записывали на регистрирующем устройстве.

Примеры, описанные в данном документе, могут быть осуществлены путем замены описанных в общем или конкретно терапевтических соединений или инертных ингредиентов на применяемые в предшествующих примерах.

Очевидно, что в пределах описанного изобретения разными способами могут осуществляться вариации. Такие вариации не должны считаться отклонением от духа и объема настоящего изобретения, и подразумевается, что все такие модификации и эквиваленты, являющиеся очевидными специалисту в данной области, включены в объем нижеприведенной формулы изобретения.

Claims (18)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Терапевтическое сочетание, включающее эффективное количество первого соединения, ингибирующего транспорт желчных кислот в подвздошной кишке, и второго соединения, представляющего собой никотиновую кислоту или ее производное, где количества первого и второго вместе составляют эффективное в отношении гиперлипидемического состояния количество данных соединений и где указанное соединение, ингибирующее транспорт желчных кислот в подвздошной кишке, представляет собой соединение формулы В-5 или его энантиомер, рацемат или фармацевтически приемлемая соль.
2. 2. Терапевтическое сочетание по п.1, где никотиновую кислоту или ее производное выбирают из группы, включающей никотиновую кислоту, ницеритрол, аципимокс и их фармацевтически приемлемые соли.
3. 3. Терапевтическое сочетание по п.1, где никотиновой кислотой или ее производным является никотиновая кислота или ее соль.
4. 4. Терапевтическое сочетание по п.1, где никотиновой кислотой или ее производным является ницеритрол или его фармацевтически приемлемая соль.
5. 5. Терапевтическое сочетание по п.1, где никотиновой кислотой или ее производным является аципимокс или его фармацевтически приемлемая соль.
6. 6. Фармацевтическая композиция, включающая эффективное количество первого соединения, ингибирующего транспорт желчных кислот в подвздошной кишке, и второго соединения, представляющего собой никотиновую кислоту или ее производное, где количества первого и второго вместе составляют эффективное в отношении гиперлипидемического состояния количество данных соединений, причем количество первого составляет примерно от 0,01 до 1000 мг, а второго примерно от 0,01 до 10000 мг, и где соединение, ингибирующее транспорт желчных кислот в подвздошной кишке, представляет соединение В-5 или его энантиомер, рацемат или фармацевтически приемлемую соль.
7. 7. Фармацевтическая композиция по п.6, где никотиновую кислоту или ее производное выбирают из группы, включающей никотиновую кислоту, ницеритрол, аципимокс и их фармацевтически приемлемые соли.
8. 8. Фармацевтическая композиция по п.6, где никотиновой кислотой или ее производным является никотиновая кислота или ее соль.
9. 9. Фармацевтическая композиция по п.6, где никотиновой кислотой или ее производным является ницеритрол или его фармацевтически приемлемая соль.
10. 10. Фармацевтическая композиция по п.6, где никотиновой кислотой или ее производным является аципимокс или его фармацевтически приемлемая соль.
11. 11. Способ профилактики или лечения гиперлипидемического состояния, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту в стандартной дозированной форме сочетания, которое включает эффективное количество первого соединения, ингибирующего транспорт желчных кислот в подвздошной кишке, и второ- го соединения, представляющего собой никотиновую кислоту или ее производное, где количества первого и второго вместе составляют эффективное в отношении гиперлипидемического состояния количество данных соединений, а соединение, ингибирующее транспорт желчных кислот в подвздошной кишке, представляет соединение В-5 или его энантиомер, рацемат или фармацевтически приемлемую соль.
12. 12. Способ по п.11, где соединения, ингибирующие транспорт желчных кислот в подвздошной кишке, вводят в суточной дозе в интервале примерно от 0,01 до 1000 мг, а соединение никотиновой кислоты или производного никотиновой кислоты вводят в суточной дозе в интервале примерно от 0,01 до 10000 мг.
13. 13. Способ по п.11, где гиперлипидемическим состоянием является атеросклеротическое состояние.
14. 14. Способ по п.11, где гиперлипидемическим состоянием является гиперхолестеринемия.
15. 15. Способ по п.11, где никотиновую кислоту или ее производное выбирают из группы, включающей никотиновую кислоту, ницеритрол, аципимокс и их фармацевтически приемлемые соли.
16. 16. Способ по п.11, где никотиновой кислотой или ее производным является никотиновая кислота или ее соль.
17. 17. Способ по п.11, где никотиновой кислотой или ее производным является ницеритрол или его фармацевтически приемлемая соль.
18. 18. Способ по п.11, где никотиновой кислотой или ее производным является аципимокс или его фармацевтически приемлемая соль.

    4^^ Евразийская патентная организация, ЕАПВ

    Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6