EA004256B1 - beta-AMINOLOID PEPTIDE BINDING PROTEIN, POLYNUCLEOTIDE ENCODING THEREOF AND METHODS FOR USING THE SAME - Google Patents
beta-AMINOLOID PEPTIDE BINDING PROTEIN, POLYNUCLEOTIDE ENCODING THEREOF AND METHODS FOR USING THE SAME Download PDFInfo
- Publication number
- EA004256B1 EA004256B1 EA199900941A EA199900941A EA004256B1 EA 004256 B1 EA004256 B1 EA 004256B1 EA 199900941 A EA199900941 A EA 199900941A EA 199900941 A EA199900941 A EA 199900941A EA 004256 B1 EA004256 B1 EA 004256B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- protein
- fragment
- cdna molecule
- sequence
- polynucleotide
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
Данная заявка раскрывает преимущества предварительной заявки США № 60/064583, поданной 16 апреля 1997 г, содержание которой включено здесь в качестве ссылки.This application discloses the benefits of provisional application US No. 60/064583, filed April 16, 1997, the contents of which are incorporated herein by reference.
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Настоящее изобретение касается новых полинуклеотидов и белков, кодируемых такими полинуклеотидами, наряду с терапевтическим, диагностическим и исследовательским применением этих полинуклеотидов и белков. В частности, настоящее изобретение касается полинуклеотидов и белков, кодируемых такими полинуклеотидами, которые связываются с βамилоидным пептидом, являющимся одним из первичных компонентов амилоидных отложений, связанных с патогенезом болезни Альцгеймера.The present invention relates to new polynucleotides and proteins encoded by such polynucleotides, along with therapeutic, diagnostic and research applications of these polynucleotides and proteins. In particular, the present invention relates to polynucleotides and proteins encoded by such polynucleotides that bind to a β-amyloid peptide, which is one of the primary components of amyloid deposits associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease.
Предпосылки для изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION
Болезнь Альцгеймера (АО) - нарушение, связанное с прогрессирующей деменцией у пожилых людей, характеризующееся рядом структурных аномалий головного мозга. В множественных участках центральной нервной системы (ЦНС) нейроны становятся дисфункциональными и погибают, в результате чего происходит изменение синаптических путей. Тела и проксимальные дендриты этих уязвимых нейронов содержат нейрофибриллярные клубки, состоящие из парных спиральных нитей, основным компонентом которых является фосфорилированный, связывающийся с микротрубочками белок, обозначенный как τ-белок (белок тау). Одним из существенных признаков данного заболевания является накопление амилоидных отложений в пределах головного мозга, называемых старческими (или нейритными) бляшками. Принципиальным компонентом амилоидных бляшек является β-амилоидный пептид (здесь и далее обозначается как ВАР, а в литературе также известный как Ав, вАР и др.), который образует плотные скопления в процессе развития АО.Alzheimer's disease (AO) is a disorder associated with progressive dementia in the elderly, characterized by a number of structural abnormalities of the brain. In multiple areas of the central nervous system (CNS), neurons become dysfunctional and die, resulting in a change in synaptic pathways. The bodies and proximal dendrites of these vulnerable neurons contain neurofibrillary tangles consisting of paired helical filaments, the main component of which is a phosphorylated, microtubule-binding protein, designated as a τ-protein (tau protein). One of the essential signs of this disease is the accumulation of amyloid deposits within the brain, called senile (or neuritic) plaques. The principal component of amyloid plaques is the β-amyloid peptide (hereinafter referred to as BAP, and in the literature also known as Av, BAP, etc.), which forms dense clusters during the development of AO.
ВАР - состоящий из 39-43 аминокислот белок, образующийся в результате протеолитического расщепления из амилоидного полипептида-предшественника (здесь и далее обозначаемого как АРР) и состоящий из части трансмембранного домена и домена просвета эндоплазматического ретикулюма АРР. Считается, что пептид ВАР, состоящий из 42 аминокислот (ВАР42), у человека является потенциально более токсичной агрегированной формой. АРР встречается в виде нескольких ВАРвключающих изоформ. Основные изоформы состоят из 695, 751 и 770 аминокислот, при том, что последние две АРР включают домен, обладающий структурной и функциональной гомологией с ингибиторами сериновой протеазы Кюнитца. У здоровых индивидуумов ВАР не накапливается и быстро удаляется из циркули рующих жидкостей организма. Однако пептид способен образовывать бляшки на поверхности аномальных дендритов и аксонов, микроглии и реактивных астроцитов. Агрегирование и отложение ВАР в виде нейритных бляшек рассматривается как один из запускных механизмов развития болезни Альцгеймера. Изучение процессов, приводящих к экспрессии и функций ВАР и их собственной роли в патогенезе АО, занимает существенное внимание в нейрологических исследованиях. В частности, открытие белков, которые могут связываться с белком ВАР, является принципиальным в связи с пониманием патогенетических путей данного заболевания и приводит к появлению новых потенциальных терапевтических мишеней.BAP is a protein consisting of 39-43 amino acids that is formed as a result of proteolytic cleavage from the amyloid precursor polypeptide (hereinafter referred to as APP) and consisting of a portion of the transmembrane domain and the lumen domain of the endoplasmic reticulum APP. The 42-amino acid BAP peptide is believed to be a potentially more toxic aggregated form in humans. APP is found in the form of several BAP including isoforms. The main isoforms consist of 695, 751 and 770 amino acids, despite the fact that the last two APPs include a domain that has structural and functional homology with Kunitz serine protease inhibitors. In healthy individuals, BAP does not accumulate and is quickly removed from the circulating body fluids. However, the peptide is capable of forming plaques on the surface of abnormal dendrites and axons, microglia and reactive astrocytes. Aggregation and deposition of BAP in the form of neuritic plaques is considered as one of the triggering mechanisms for the development of Alzheimer's disease. The study of the processes leading to the expression and functions of BAP and their own role in the pathogenesis of AO takes significant attention in neurological studies. In particular, the discovery of proteins that can bind to the BAP protein is crucial in connection with an understanding of the pathogenetic pathways of this disease and leads to the emergence of new potential therapeutic targets.
До настоящего изобретения белки и их фрагменты, которые бы связывались с белком ВАР человека и которые бы могли быть вовлечены в биологические эффекты ВАР в ходе развития АО, идентифицированы не были.Prior to the present invention, proteins and fragments thereof that would bind to the human BAP protein and which could be involved in the biological effects of BAP during the development of AO were not identified.
Резюме изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
Настоящее изобретение представляет новые выделенные полинуклеотиды, которые кодируют генные продукты, избирательно связывающиеся с аминокислотными последовательностями β-амилоидного пептида человека (ВАР).The present invention provides novel isolated polynucleotides that encode gene products that selectively bind to the amino acid sequences of human β-amyloid peptide (BAP).
В одном из вариантов настоящее изобретение представляет композицию, включающую выделенный полинуклеотид, выбираемый из группы, включающей:In one embodiment, the present invention provides a composition comprising an isolated polynucleotide selected from the group including:
(a) полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность по 8ЕС ГО N0 1;(a) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of 8EC GO N0 1;
(b) полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность связывающегося с β-амилоидным пептидом белка (ВВР) клона ВВР1-11, внесенного под депозитарным номером АТСС 98617;(b) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of a β-amyloid peptide binding protein (BBP) of clone BBB1-11 introduced under ATCC 98617;
(c) полинуклеотид, кодирующий связывающийся с β-амилоидным пептидом белок (ВВР), кодируемый вставкой кДНК клона ВВР1-11, внесенного под депозитарным номером АТСС 98617;(c) a polynucleotide encoding a β-amyloid peptide binding protein (BBP) encoded by the cDNA insert of clone BBB1-11, inserted under ATCC 98617;
(б) полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность по 8ЕС ГО N0 1 от 202-го нуклеотида до 807-го нуклеотида;(b) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of 8ES GO N0 1 from the 202nd nucleotide to the 807th nucleotide;
(е) полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность связывающегося с β-амилоидным пептидом белка (ВВР) клона рЕК196, внесенного под депозитарным номером АТСС 98399;(e) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of a β-amyloid peptide binding protein (BBP) of clone pEK196 introduced under ATCC 98399;
(1) полинуклеотид, кодирующий связывающийся с β-амилоидным пептидом белок (ВВР), кодируемый вставкой кДНК клона рЕК196, внесенного под депозитарным номером АТСС 98399;(1) a polynucleotide encoding a β-amyloid peptide binding protein (BBP) encoded by the cDNA insert of clone pEK196, inserted under ATCC 98399;
(д) полинуклеотид, кодирующий белок, включающий аминокислотную последовательность по 8ЕС ГО N0 2;(e) a polynucleotide encoding a protein comprising the amino acid sequence of 8ES GO N0 2;
(11) полинуклеотид, кодирующий белок, включающий фрагмент аминокислотной последовательности по 8ЕО ΙΌ N0 2, обладающий активностью по связыванию с β-амилоидным пептидом, т.е. фрагмент, включающий аминокислотную последовательность от 68-й аминокислоты до 269-й аминокислоты в соответствии с 8ЕО ΙΌ N0 2;(11) a polynucleotide encoding a protein including an 8EO по N0 2 amino acid sequence fragment having binding activity to a β-amyloid peptide, i.e. a fragment comprising the amino acid sequence from the 68th amino acid to the 269th amino acid in accordance with 8EO ΙΌ N0 2;
(ί) полинуклеотид, являющийся аллельным вариантом полинуклеотида по пп.(а)-(£), описанным выше;(ί) a polynucleotide that is an allelic variant of a polynucleotide according to claims (a) to (£) described above;
(k) полинуклеотид, который кодирует вариант, гомологичный белку по пп.(§)-(1), описанный выше; и (l) полинуклеотид, способный гибридизоваться в жестких условиях с любым полинуклеотидом по пп.(а)-(1).(k) a polynucleotide that encodes a variant homologous to the protein according to (§) to (1) described above; and (l) a polynucleotide capable of hybridizing under stringent conditions with any polynucleotide according to (a) to (1).
Предпочтительно такой полинуклеотид включает нуклеотидную последовательность по 8Е0 ΙΌ N0 1, нуклеотидную последовательность связывающегося с β-амилоидным пептидом белка (ВВР) клона ВВР1-Д, внесенного под депозитарным номером АТСС 98617, или полинуклеотид, кодирующий связывающийся с βамилоидным пептидом белок (ВВР), кодируемый вставкой кДНК клона ВВР1-Д, внесенного под депозитарным номером АТСС 98617. Другой вариант представляет ген, соответствующий последовательности кДНК по 8Е0 ΙΌ N0 1.Preferably, such a polynucleotide comprises a nucleotide sequence of 8E0 ΙΌ N0 1, a nucleotide sequence of a β-amyloid peptide binding protein (BBP) of clone BBB1-D introduced under ATCC deposit number 98617, or a polynucleotide encoding a protein (BBP) encoded by a β amyloid peptide encoded by insertion of cDNA of clone BBB1-D introduced under ATCC 98617. Another option is a gene corresponding to a cDNA sequence of 8E0 ΙΌ N0 1.
В других вариантах настоящее изобретение представляет композицию, включающую белок, при том, что упомянутый белок включает аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, которая включает:In other embodiments, the present invention provides a composition comprising a protein, wherein said protein comprises an amino acid sequence selected from the group which includes:
(a) аминокислотную последовательность по 8ЕО ΙΌ N0 2;(a) the amino acid sequence of 8EO ΙΌ N0 2;
(b) аминокислотную последовательность по 8Е0 ΙΌ N0 2 от 68-й аминокислоты до 269-й аминокислоты;(b) the amino acid sequence of 8E0 ΙΌ N0 2 from the 68th amino acid to the 269th amino acid;
(c) аминокислотную последовательность, кодируемую вставкой кДНК клона ВВР1-П. внесенного по депозитарным номером АТСС 96817; и (б) фрагменты аминокислотной последовательности по 8Е0 ΙΌ N0 2, включающие аминокислотную последовательность от 185-й аминокислоты до 217-й аминокислоты по 8Е0 ΙΌ N0 2.(c) the amino acid sequence encoded by the cDNA insert of clone BBB1-P. contributed by ATCC 96817; and (b) fragments of the amino acid sequence of 8E0 ΙΌ N0 2, including the amino acid sequence from the 185th amino acid to the 217th amino acid of 8E0 ΙΌ N0 2.
Предпочтительно такой белок включает аминокислотную последовательность по 8Е0 ΙΌ N0 2 или аминокислотную последовательность по 8Е0 ΙΌ N0 2 от 68-й аминокислоты до 269-й аминокислоты. Слитые белки также формулируются настоящим изобретением.Preferably, such a protein comprises an amino acid sequence of 8E0 ΙΌ N0 2 or an amino acid sequence of 8E0 ΙΌ N0 2 from the 68th amino acid to the 269th amino acid. Fusion proteins are also formulated by the present invention.
В ряде предпочтительных вариантов полинуклеотид функционально присоединен к последовательности, регулирующей экспрессию. Также настоящее изобретение представляет клетку-хозяин, включая бактериальные, дрожжевые клетки, клетки насекомых и млекопитающих, трансформированные такими полинуклеотидными композициями.In a number of preferred embodiments, the polynucleotide is operably linked to an expression control sequence. The present invention also provides a host cell, including bacterial, yeast, insect and mammalian cells, transformed with such polynucleotide compositions.
Также представляются способы выработки ВВР, которые включают (а) выращивание культуры клеток-хозяев по п.3 формулы изобретения в подходящей культуральной среде; и (Ь) очистку белка из культуральной среды.Also provided are methods for generating VVR, which include (a) growing a host cell culture according to claim 3 in a suitable culture medium; and (b) purification of the protein from the culture medium.
Также настоящим изобретением представляются композиции, включающие антитело, специфичное в отношении таких ВВР.The present invention also provides compositions comprising an antibody specific for such VVR.
Способы и диагностические приемы также представляются в связи с выявлением заболевания, характеризующегося аномальной экспрессией человеческого белка ВАР, равно как и способы идентификации соединений, участвующих в регуляции активности ВВР.Methods and diagnostic techniques are also presented in connection with the identification of a disease characterized by abnormal expression of the human BAP protein, as well as methods for identifying compounds involved in the regulation of BBB activity.
Другой вариант настоящего изобретения включает трансгенных животных, несущих полинуклеотид, кодирующий ВВР, функционально соединенный с последовательностью, регулирующей экспрессию.Another embodiment of the present invention includes transgenic animals carrying a polynucleotide encoding BBB operably linked to an expression control sequence.
Краткое описание чертежейBrief Description of the Drawings
Следующие чертежи характеризуют некоторые варианты настоящего изобретения. Они являются исключительно иллюстративными и ни в чем не ограничивают настоящее изобретение.The following drawings characterize some variants of the present invention. They are illustrative only and in no way limit the present invention.
Фиг. 1. Тест на дигибридный дрожжевой скрининг. Хозяинный штамм Υ2Η, экспрессирующий ДНК-связывающий домен Оа14, слитый с ВАЕ42 (ВАРВС; плазмида, несущая маркер ТВР1) и неслитый ВАР42 (ВАР; плазмида, несущая маркер ИКА3) был трансформирован Υ2Н-библиотекой кДНК клеток плодного головного мозг человека (плазмида, несущая маркер ЬЕи2), экспрессирующей слитые белки (иикиотеиАС), включающие активаторный домен Оа14, в соответствии с описанным в данном тексте. Соответственно, штаммы, несущие три внехромосомные плазмиды, обозначенные окружностями, экспрессировали обозначенный белок. Положительные межбелковые взаимодействия восстанавливают активность Оа14 по расположенной выше активаторной последовательности (0АЬиА8), в результате чего индуцируется транскрипция репортерного гена ΗΙ83.FIG. 1. Test for yeast dihybrid screening. The host strain Υ2Η expressing the DNA-binding domain of Oa14 fused to BAE42 (BAP BC ; plasmid carrying the TBP1 marker) and the non-fused BAP42 (BAP; plasmid carrying the ICA marker) was transformed with the Υ2H library of human fetal brain cells cDNA (plasmid, carrying the marker LFe2) expressing fusion proteins (iikothei AC ), including the activator domain of Oa14, as described in this text. Accordingly, strains carrying three extrachromosomal plasmids indicated by circles expressed the indicated protein. Positive protein-protein interactions restore Oa14 activity by the upstream activator sequence (0AbAi8), as a result of which transcription of the ΗΙ83 reporter gene is induced.
Фиг. 2. Выявление связывания ВВР1/ВАР. Штаммы Υ2Η были тестированы на прототрофию по гистидину путем получения 10-кратных серийных разведении и раскапыванием по 5 мкл на синтетическую агаровую среду, лишенную триптофана, лейцина, гистидина и содержащую 25 мМ 3-аминотриазола, в соответствии с описанным в данном тексте. Все штаммы несут плазмиду рЕК162, экспрессирующую слитый белок ВАР, что отмечено меткой ВАР. Первые столбцы (вектор) соответствуют независимо сформированным штаммам, несущим плазмиду рЕК162 и вектор рАСТ2, экспрессирующий посторонний слитый белок. Этот вариант служит в качестве фона для сравнения со штаммами, которые экспрессируют интересующие белки. Ко лонки, обозначенные ΒΒΡΙΔΙιη. соответствуют экспрессии укороченного ВВР1 с плазмиды рЕК198 так, как это описано в настоящем тексте. Взаимодействие между слитыми белками ВАР и ΒΒΡΙΔΙιη восстанавливает активность Са14, в результате чего происходит индуцирование репортерного гена ΗΙ83 (см. фиг. 1), что выявляется по усилению прототрофного роста в сравнении с контрольными штаммами.FIG. 2. Detection of binding of BBP1 / BAP. The Υ2Η strains were tested for histidine prototrophy by obtaining 10-fold serial dilutions and digging in 5 μl onto synthetic agar medium lacking tryptophan, leucine, histidine and containing 25 mM 3-aminotriazole, as described in this text. All strains carry the plasmid pEK162 expressing the BAP fusion protein, which is indicated by the BAP tag. The first columns (vector) correspond to independently formed strains carrying plasmid pEK162 and vector pAST2 expressing an extraneous fusion protein. This option serves as a background for comparison with strains that express proteins of interest. Columns denoted by ΒΒΡΙΔΙιη. correspond to the expression of shortened BBB1 from plasmid pEK198 as described herein. The interaction between the BAP and ΒΒΡΙΔΒΒΡΙιη fusion proteins restores Ca14 activity, as a result of which the происходит83 reporter gene is induced (see Fig. 1), which is detected by increased prototrophic growth in comparison with control strains.
Фиг. 3. Биотесты, показывающие взаимодействие ВВР1 с Са-белками. Предполагаемый внутриклеточный домен белка ВВР1 экспрессировали в качестве ДНК-связывающего домена Са14, соединенного с частями факторов Сак, Сао или Οαί2 крысы, экспрессированными в качестве слитых белков, включающих активаторный домен Са14. Ответы Υ2Η, представляющих два независимо образованных клона каждого штамма, сравнивали с ответами клеток, лишенных С-белкового компонента (колонки вектор). Методика описана в легенде к фиг. 2.FIG. 3. Biotests showing the interaction of BBP1 with Ca proteins. The putative intracellular domain of the BBP1 protein was expressed as the Ca14 DNA-binding domain, coupled to parts of rat CaC, Cao or ΟαΟ2 rats expressed as fusion proteins including the Ca14 activator domain. The Υ2Η responses, representing two independently formed clones of each strain, were compared with the responses of cells lacking the C-protein component (vector column). The technique is described in the legend of FIG. 2.
Фиг. 4. Картирование взаимодействий между ВВР1 и ВАР. ΒΒΡ1 ΔΙιη был разделен на два перекрывающихся сегмента в соответствии с описанным в данном тексте. Эти белки, обозначенные ВВРШС и ΒΒΡ1ΔΝ, были протестированы по их взаимодействию с ВАР. Протокол тестирования и штаммы, обозначенные как вектор и ВВРШ1т, описаны в легенде к фиг.FIG. 4. Mapping interactions between BBB1 and BAP. ΒΒΡ1 ΔΙιη was divided into two overlapping segments as described in this text. These proteins, designated VVRHS and ΒΒΡ1ΔΝ, were tested for their interaction with BAP. The test protocol and strains designated as vector and VVRSh1t are described in the legend of FIG.
2. Штаммы, помеченные как ВВРШС и ΒΒΡ1ΔΝ, экспрессируют обозначенный сегмент ВВР1 в виде слитого белка.2. The strains labeled as BBRS and ΒΒΡ1ΔΝ express the designated segment of BBB1 as a fusion protein.
Фиг. 5. Экспрессия мРНК ВВР1 в тканях человека (А) и участках головного мозга (В). Нейлоновые мембраны, на которые было нанесено по 2 мкг фракционированной по размеру полиаденилированной РНК, выделенной из обозначенных тканей, были получены от С1оШсе11. Их гибридизовали с радиоактивно помеченным зондом кДНК-ВВР1 так, как это описано в данном тексте. Основной бэнд, соответствующий 1250 пар нуклеотидов (определено по маркерам молекулярной массы: данные здесь не включены) был выявлен во всех линиях. Более высокие значение молекулярной массы, по-видимому, соответствуют гетероядерным РНК; ген ВВР1 включает несколько интронов. Блоты были освобождены и повторно зондированы β-актином с целью контроля загрузки и интегрированности РНК: все линии проявили одинаковый сигнал (данные здесь не включены).FIG. 5. Expression of mRNA of BBP1 in human tissues (A) and brain regions (B). Nylon membranes, onto which 2 μg of size-fractionated polyadenylated RNA isolated from the designated tissues were applied, were obtained from C1oSce11. They were hybridized with a radioactively labeled cDNA-BBB1 probe as described herein. The main band corresponding to 1250 nucleotide pairs (determined by molecular weight markers: data not included here) was detected in all lines. Higher molecular weights appear to correspond to heteronuclear RNA; the BBP1 gene includes several introns. Blots were released and re-probed with β-actin in order to control the loading and RNA integration: all lines showed the same signal (data not included here).
Фиг. 6. Экспрессия ВВР1 и АРР в клетках гиппокампа. Представлены изображения авторентгенограмм, полученных в ходе гибридизации ίη κίΐιι и показывающих параметры экспрессии ВВР1 (А) и АРР (В) в гиппокампе и в энторинальной области коры головного мозга человека. Срезы тканей, использовавшиеся для получения данных изображений, были взяты при проведении вскрытия двух различных пациентов. Сокращения: ИС - зубчатая извилина коры головного мозга; СА1 - нижняя область гиппокампа; ЕС - эн-торинальная область коры головного мозга.FIG. 6. Expression of BBP1 and APP in hippocampal cells. The images of X-ray diffraction patterns obtained during hybridization of ίη κίΐιι and showing the expression parameters of BBP1 (A) and APP (B) in the hippocampus and in the entorhinal region of the human cerebral cortex are presented. Tissue sections used to obtain image data were taken during autopsy of two different patients. Abbreviations: IS - dentate gyrus of the cerebral cortex; CA1 - the lower region of the hippocampus; The EU is the entorhinal region of the cerebral cortex.
Фиг. 7. Сравнение взаимодействия ВВР1 с ВАР человека и грызуна. ВАР грызуна был сконструирован и экспрессирован в виде слитого белка в соответствии с описанием в данном тексте. Штаммы, помеченные ВАР человека, идентичны тем, которые были показаны на фиг. 2. Штаммы, помеченные ВАР грызуна, экспрессируют ВАР грызуна в виде слитого белка, включающего ДНК-связывающийся домен Са14. Вектор определяет контрольные штаммы, несущие только вектор в противоположность слитым белкам ВАР; ВВР1 определяет штаммы, экспрессирующие слитый белок ВВРМ!ш.FIG. 7. Comparison of the interaction of VVR1 with human VAR and rodent. The rodent BAP was constructed and expressed as a fusion protein as described in this text. The strains labeled with human BAP are identical to those shown in FIG. 2. Strains labeled with rodent BAP express the rodent BAP as a fusion protein comprising the Ca14 DNA-binding domain. The vector defines control strains carrying only the vector as opposed to the BAP fusion proteins; BBB1 identifies strains expressing the BBPM! Fusion protein.
Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Настоящее изобретение касается выделения и клонирования белка (ВВР1), связывающегося с β-амилоидным пептидом человека. ВВР1 был охарактеризован как слитый белок в дигибридном дрожжевом тесте по связыванию с 42аминокислотным фрагментом ВАР (ВАР42). Экспрессия ВВР1 была продемонстрирована в тканях человека и в конкретных отделах головного мозга (фиг. 5). Важно, что для ВВР1 показана избирательность в связывании с ВАР человека в системе дигибридного дрожжевого теста в сравнении с ВАР грызуна. Эти данные подтверждают предположение о том, что ВВР1 по настоящему изобретению могут быть использованы в диагностике и лечении болезни Альцгеймера, равно как и для оценки и скрининга лекарственных средств, предназначенных для регуляции накопления амилоидных бляшек в головном мозге.The present invention relates to the isolation and cloning of a protein (BBP1) that binds to a human β-amyloid peptide. BBP1 was characterized as a fusion protein in the yeast digibrid assay for binding to the 42 amino acid fragment of BAP (BAP42). The expression of BBP1 was demonstrated in human tissues and in specific parts of the brain (Fig. 5). It is important that for BBP1, selectivity in binding to human BAP in the system of yeast digibrid test is shown in comparison with rodent BAP. These data confirm the suggestion that the BBB1 of the present invention can be used in the diagnosis and treatment of Alzheimer's disease, as well as for the evaluation and screening of drugs designed to regulate the accumulation of amyloid plaques in the brain.
Кодирующая последовательность ВВР1BBR1 coding sequence
Исходный клон ВВР1 человека (обозначенный как клон 14) был получен с использованием дигибридного дрожжевого генетического теста (Υ2Η), разработанного для целей идентификации белков, которые взаимодействуют с ВАР42 человека, являющимся потенциально более токсичной формой ВАР. ВАР42 был экспрессирован при слиянии с ДНК-связывающимся доменом Са14 дрожжей и также был экспрессирован в виде свободного пептида (фиг. 1). Этот штамм был трансформирован Υ24библиотекой кДНК плодного головного мозга человека. Единственный клон, обозначенный как № 14, из примерно миллиона независимых трансформантов, обусловливал отчетливую активацию репортерного гена и включают открытую кодирующую рамку, переходящую в домен САБ4. кДНК-вставка включала 984 пары оснований и заканчивалась полиадениловым трактом. Эта последовательность кодировала 201 аминокислоту (от 68-й аминокислоты до 269-й аминокислоты в соответствии с 8ЕО ΙΌ N0 2) и имела два участка, характеризующиеся длинойThe original human BBB1 clone (designated clone 14) was obtained using a yeast genetic hybrid test (Υ2Η) designed to identify proteins that interact with human BAP42, which is a potentially more toxic form of BAP. BAP42 was expressed by fusion with the DNA-binding domain of yeast Ca14 and was also expressed as a free peptide (Fig. 1). This strain was transformed with the Υ24 library of the human fetal brain cDNA. The only clone designated as No. 14, out of about a million independent transformants, caused distinct activation of the reporter gene and included an open coding frame that goes into the SAB4 domain. The cDNA insert included 984 base pairs and ended with the polyadenyl tract. This sequence encoded 201 amino acids (from the 68th amino acid to the 269th amino acid in accordance with 8EO ΙΌ N0 2) and had two sections characterized by a length
Ί и уровнем гидрофобности, достаточными для проникновения через клеточную мембрану. Также в ее составе имеются потенциальные сайты гликозилирования по остаткам аспарагина (Ν-гликозилирования). Клон 14 был обозначен как клон рЕК196 и внесен в Американскую коллекцию типовых культур под депозитарным номером АТСС 98399.Ί and the level of hydrophobicity, sufficient for penetration through the cell membrane. It also contains potential glycosylation sites for asparagine residues (Ν-glycosylation). Clone 14 was designated as clone pEK196 and entered into the American Type Culture Collection under Depository Number ATCC 98399.
Производная от библиотеки плазмида была выделена из клона 14 и использована для реконструкции штаммов, включенных в тест Υ2Η. Тестирование этих штаммов показало, что слитый белок ВАР специфическим образом взаимодействует с белком, кодируемым клоном 14, хотя ответ оказался достаточно слабым. С учетом того, что обладающие высоким уровнем гидрофобности белковые домены, такие как трансмембранные участки, подавляют ответы в тесте Υ2Η (ОхспЬсгдсг. неопубликованные данные), то клон 14 был укорочен (с получением варианта ВВР1Д1ш: см. ниже табл. 2 в связи с дальнейшим описанием) с целью удаления участка жесткой гидрофобности с последующим повторным тестированием по взаимодействию с ВАР. Существенно более мощный ответ в тесте Υ2Η был отмечен с вариантом ВВР1Д1ш: это подтверждает замечание о том, что делегированные последовательности кодировали вероятный трансмембранный якорь (1ш). Клон 14 идентифицирует новый ВАР-связывающийся белок в форме слитого белка.The plasmid derivative of the library was isolated from clone 14 and used to reconstruct the strains included in the Υ2Η test. Testing of these strains showed that the BAP fusion protein specifically interacts with the protein encoded by clone 14, although the response was rather weak. Considering the fact that protein domains possessing a high level of hydrophobicity, such as transmembrane regions, suppress the responses in the Υ2Η test (Oxspcrdsg unpublished data), clone 14 was shortened (to obtain the BBB1D1sh variant: see Table 2 below for further description) in order to remove the site of hard hydrophobicity with subsequent repeated testing for interaction with BAP. A significantly more powerful answer in the Υ2Η test was noted with the VVR1D1sh variant: this confirms the remark that the delegated sequences encoded a probable transmembrane anchor (1ш). Clone 14 identifies a new BAP-binding protein in the form of a fusion protein.
Последовательности кДНК ВВР1, находящиеся в клоне 14, были идентифицированы как утратившие 5'-кодирующий участок, на что указывает отсутствие потенциального инициирующего кодона метионина. Многочисленные попытки применения стандартного метода 5'КАСЕ (быстрая амплификация концов кДНК) с применением обычной обратной транскриптазы позволили добавить всего 27 нуклеотидов. Таким образом, методика геномного клонирования, описанная ниже в примере 2, была применена для выделения 5'-концевого участка.The BBP1 cDNA sequences located in clone 14 were identified as having lost the 5 ′ coding region, as indicated by the absence of a potential initiating codon of methionine. Numerous attempts to use the standard 5'CACE method (rapid amplification of cDNA ends) using conventional reverse transcriptase allowed a total of 27 nucleotides to be added. Thus, the genomic cloning technique described in Example 2 below was applied to isolate the 5'-terminal region.
Поскольку последовательность, кодирующая 5'-концевой участок, является производной от геномной библиотеки, существует опасность присутствия в этой последовательности интрона. Такая вероятность была оценена с применением двух методов, описанных ниже в примере 2. Полученные в результате данные подтверждают, что точность выделения лежащих выше последовательностей (как из геномных, так и из кДНК-источников) и отсутствие интронов в этом участке. Плазмида ВВР1-П, включающая вставку кДНК, кодирующую полноразмерный белок ВВР1, была заключена в Американскую коллекцию типовых культур под депозитарным номером АТСС 98617. Полный кодирующий участок и расшифрованная последовательность полипептида показаны в 8ЕО ΙΌ N0 1 и 8Е0 ГО N0 2, соответственно. В состав исходного клона (рЕК196) включаются З'-нетранслируемые нуклеотидные последовательности.Since the sequence encoding the 5'-terminal region is derived from the genomic library, there is a danger of the presence of an intron in this sequence. This probability was estimated using the two methods described below in Example 2. The data obtained as a result confirm that the accuracy of the isolation of the sequences lying above (from both genomic and cDNA sources) and the absence of introns in this region. Plasmid BBB1-P, including a cDNA insert encoding the full-sized protein BBB1, was enclosed in the American Type Culture Collection under Depository Number ATCC 98617. The complete coding region and the decoded polypeptide sequence are shown in 8EO ΙΌ N0 1 and 8E0 GO N0 2, respectively. The original clone (pEK196) includes 3'-untranslated nucleotide sequences.
В соответствии с настоящим изобретением нуклеотидные последовательности, которые кодируют ВВР1, его фрагменты, слитые белки или функциональные эквиваленты, могут быть использованы для формирования рекомбинантных молекул ДНК, которые бы направляли экспрессию ВВР1, или функционально активного пептида в подходящей клетке-хозяине. С другой стороны, нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются с фрагментами последовательности ВВР1, могут быть использованы в тестах по гибридизации нуклеиновых кислот, в Саузерн-блоттинге, в Нозерн-блоттинге и т. п.In accordance with the present invention, nucleotide sequences that encode BBB1, fragments thereof, fusion proteins or functional equivalents can be used to form recombinant DNA molecules that direct expression of BBB1, or a functionally active peptide, in a suitable host cell. On the other hand, nucleotide sequences that hybridize with fragments of the BBP1 sequence can be used in nucleic acid hybridization tests, in Southern blotting, in Northern blotting, etc.
Настоящее изобретение также представляет полинуклеотиды, последовательности которых комплементарны описанным в данном тексте полинуклеотидам.The present invention also provides polynucleotides whose sequences are complementary to the polynucleotides described herein.
Также настоящее изобретение представляет полинуклеотиды, способные гибридизовать в условиях сниженной жесткости, более предпочтительно при условиях обычной жесткости и наиболее предпочтительно в условиях высокой жесткости с описанными в данном тексте полинуклеотидами. Примеры условий жесткости гибридизации показаны ниже в таблице: условиями высокой жесткости являются такие условия, которые сопоставимы с теми, которые приведены, например, в графах А-Р; условия обычной жесткости являются по крайней мере настолько жесткими, насколько это показано, например, в графах С-Ь; и условия сниженной жесткости по крайней мере таковы, как это показано, например, в графах М-К.The present invention also provides polynucleotides capable of hybridizing under conditions of reduced stiffness, more preferably under conditions of normal stiffness and most preferably under conditions of high stiffness with the polynucleotides described herein. Examples of hybridization stringency conditions are shown in the table below: conditions of high stringency are those conditions that are comparable to those given, for example, in columns AR; conditions of ordinary stringency are at least as stringent as shown, for example, in columns Cb; and conditions of reduced stiffness are at least as shown, for example, in columns MK.
Условия жесткостиHardness conditions
Примечания:Notes:
1.- под длиной гибрида понимается длина гибридизуемого участка (участков) гибридизующегося полинуклеотида. В случае, когда происходит гибридизация полинуклеотида с полинуклеотидом с неизвестной последовательностью, то длина гибрида подразумевает длину всего исходного гибридизующегося полинуклеотида. Когда гибридизуют полинуклеотиды с известными последовательностями, то длина гибрида может быть определена путем сопоставления последовательностей полинуклеотидов и идентификации участка или участков, с оптимальной комплементарностью последовательности. 1 .- the length of the hybrid refers to the length of the hybridizable portion (s) of the hybridizing polynucleotide. In the case when a polynucleotide is hybridized with a polynucleotide with an unknown sequence, the length of the hybrid implies the length of the entire initial hybridizing polynucleotide. When polynucleotides are hybridized with known sequences, the length of the hybrid can be determined by comparing the polynucleotide sequences and identifying the site or sites with optimal complementarity of the sequence.
н - при составлении гибридизационного и промывочного буферов раствор 88С (1х88С содержит 0,15 М ЫаС1, 15 мМ цитрата натрия) может быть заменен на раствор 88РЕ (1х88РЕ содержат 0,15 М ЫаС1, 10 мМ Ν;·ιΗ;ΡΟ.·| и 1,25 мМ ЕЭТЛ - рН=7,4); промывку осуществляют на протяжении 15 мин после завершения гибридизации; m - in the preparation of hybridization and washing buffers, 88C solution (1x88C contains 0.15 M NaCl, 15 mM sodium citrate) can be replaced by 88PE solution (1x88PE contains 0.15 M NaCl, 10 mM Ν; · ιΗ ; ΡΟ. · | and 1.25 mM EETL - pH = 7.4); washing is carried out for 15 minutes after completion of hybridization;
*Тв-Тв - температура гибридизации для гибридов, длина которых менее 50 пар нуклеотидов, должна быть на 5-10°С ниже, чем температура плавления (Тт) данного гибрида, при том, что Тт определяют в соответствии со следующими уравнениями: для гибридов длиной менее 18 пар нуклеотидов: Тт(°С) = 2х (число оснований А+Т) + 4х(число оснований С+С). Для гибридов длиной от 18 до 49 пар нуклеотидов: Тт(°С) = 81,5 + 16,6 (1оу-|№1'|) + 0,41 (% |С+С.’|)-(60(Ж). где N - число оснований в гибриде, а |Ν;·ι' | - концентрация ионов натрия в гибридизационном буфере (для раствора 1х88С | Ν;ι'| =0,165 М).* T in -T in - the hybridization temperature for hybrids whose length is less than 50 nucleotide pairs should be 5-10 ° C lower than the melting temperature (T t ) of this hybrid, despite the fact that T t is determined in accordance with the following equations: for hybrids with a length of less than 18 pairs of nucleotides: T t (° C) = 2x (number of bases A + T) + 4x (number of bases C + C). For hybrids with a length of 18 to 49 pairs of nucleotides: Tm (° C) = 81.5 + 16.6 (1 ° C | No. 1 '|) + 0.41 (% | C + C.' |) - (60 ( G). Where N is the number of bases in the hybrid, and | Ν; · ι '| is the concentration of sodium ions in the hybridization buffer (for a solution of 1x88C | Ν; ι' | = 0.165 M).
Дополнительные примеры условий жесткости для гибридизации полинуклеотидов представлены у 8атЬтоок 1., Бтйксй Е.Р. & МашайкAdditional examples of stringency conditions for the polynucleotide hybridization are presented in Sambo 1., Btyksy E.R. & Mashaik
Т., 1989, Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬотаФгу Мапиа1, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬ. Ргекк, Со1б 8ртшдT., 1989, Mo1eci1ag Closid: A LabotaFgu Mapia1, Co1b 8rgd Nagbog Lab. Rgekk, So1b 8rtshd
НагЬог, ΝΥ (главы 9 и 11) и в Сштеп! Рго!осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 1995, АикиЬе1 е! а1. (ебк.), к\Уйеу & 8опк 1пс. (разделы 2.10 и 6.3-6.4), включенные в данный текст в виде библиографических ссылок.Nagog, ΝΥ (chapters 9 and 11) and to the Shtep! Рог! Оос1к ίη Mo1esi1ag Vyuodu, 1995, Aikbе1 e! a1. (ebk.), to \ Uyeu & 8opk 1ps. (sections 2.10 and 6.3-6.4) included in this text in the form of bibliographic references.
Предпочтительно, чтобы каждый из таких гибридизующих полинуклеотидов имел длину, составляющую по крайней мере 25% (более предпочтительно - по крайней мере 50%, а наиболее предпочтительно - по крайней мере 75%) длины полинуклеотида по настоящему изобретению, с которым он должен гибридизоваться, а также характеризовался по крайней мере 60%ным уровнем идентичности последовательности (более предпочтительно - по крайней мере 75%ным уровнем идентичности, а наиболее предпочтительно по крайней мере 90%-ным или 95%-ным уровнем идентичности) с полинуклеотидом по настоящему изобретению, с которым он должен гибридизоваться, при том, что уровень идентичности определяют путем сравнения аминокислотных последовательностей при таком их сопоставлении, которое максимально обеспечивает перекрывание и идентичность и минимизует разрывы последовательностей.Preferably, each of such hybridizing polynucleotides has a length of at least 25% (more preferably at least 50%, and most preferably at least 75%) of the length of the polynucleotide of the present invention with which it should be hybridized, and also characterized by at least 60% level of sequence identity (more preferably at least 75% level of identity, and most preferably at least 90% or 95% level of identity) with polynucleotide ohm of the present invention, with which it should be hybridized, despite the fact that the level of identity is determined by comparing the amino acid sequences in such a comparison that maximizes overlap and identity and minimizes sequence breaks.
Экспрессия ВВР1Expression of WWR1
Выделенный полинуклеотид по настоящему изобретению может быть функционально присоединен к контрольной последовательности, регулирующей экспрессию, такой как экспрессионные векторы рМТ2 или рЕЭ, описанные Кауфманом с соавт. (КаиЕтап е! а1., 1991, №с1. Ас1бк Век., 19, 4485-4490), с целью получения белка рекомбинантным путем. Многие контролирующие экспрессию последовательности известны в данной области техники. Также хорошо известны основные методы экспрессии рекомбинантных белков: их примеры можно найти у Кауфмана (КаиЕтап, 1990, МеЙюбк Еп/уто1., 185, 537-566). По использованию в данном тексте термин функционально присоединенный обозначает то, что выделенный полинуклеотид по настоящему изобретению и регулирующая экспрессию последовательность взаиморасположены в составе вектора или в клетке таким образом, чтобы данный белок экспрессировался той клеткой-хозяином, которая была трансформирована (трансфицирована) лигированных друг на друга полинуклеотида и регулирующей экспрессию контрольной последовательности.An isolated polynucleotide of the present invention may be operably linked to an expression control sequence, such as pMT2 or pEE expression vectors described by Kaufman et al. (KaiEtap e! A1., 1991, No. c1. As1bk Vek., 19, 4485-4490), in order to obtain the protein by recombinant means. Many expression control sequences are known in the art. The main methods for the expression of recombinant proteins are also well known: their examples can be found at Kaufman (KaiEtap, 1990, MeYubk En / ut1., 185, 53, 537-566). As used herein, the term “functionally linked” means that the isolated polynucleotide of the present invention and the expression control sequence are mutually arranged in a vector or in a cell so that the protein is expressed by the host cell that has been transformed (transfected) ligated to each other polynucleotide and expression control regulatory sequence.
Экспрессионная система для ВВР1Expression system for WWR1
Большое число типов клеток может быть клетками-хозяевами, пригодными для экспрессии конкретного белка. Клетки-хозяева млекопитающих включают, например, клетки СО 8 зеленой мартышки, клетки СНО яичников китайского хомячка, клетки 293 почек человека, эпидермальные клетки А431 человека, клетки Со1о205 человека, клетки 3Т3 мыши, клетки СУ-1, другие линии трансформированных клеток приматов, нормальные диплоидные клетки, клетки линий, выделенных от культивируемых ίη νίΐΓΟ первичных тканей, первичных эксплантатов, клетки НеЬа, клетки Ь мыши, клетки линий ВНК, НЬ-60, И937 НаК или 1игка1.A large number of cell types may be host cells suitable for expression of a particular protein. Mammalian host cells include, for example, green monkey CO 8 cells, Chinese hamster ovary CHO cells, human 293 kidney cells, human A431 epidermal cells, human Co1o205 cells, mouse 3T3 cells, SU-1 cells, other transformed primate cell lines, normal diploid cells, cells of lines isolated from cultured ίη νίΐΓΟ primary tissues, primary explants, HeLa cells, mouse cells L, BHK, Hb-60, I937 NaK or 1 IgK1 cells.
С другой стороны, возможным является синтезировать белок в клетках низших эукариот, таких как дрожжи, или в прокариотах, таких как бактерии. Потенциально подходящими дрожжевыми штаммами являются штаммы видов 8ассйаготусек се^еν^к^ае, 8сЫхокассйаготусек рошЬе, штаммы КШутеготусек, Сапб1ба или любые другие дрожжевые штаммы, способные вырабатывать чужеродные белки. Потенциально пригодными бактериальными штаммами являются штаммы ЕксйепсЫа сой, ВасШик киЫШк, 8а1шопе11а 1ур1итипит или любой другой бактериальный штамм, способный экспрессировать гетерологичные белки. Если белок был синтезирован в клетках дрожжей или бактерий, то его необходимо модифицировать, например, по подходящим сайтам фосфорилирования или гликозилирования с целью получения функционально активного белка. Такое ковалентное присоединение может быть осуществлено с использованием известных химических или ферментных методов.On the other hand, it is possible to synthesize protein in cells of lower eukaryotes, such as yeast, or in prokaryotes, such as bacteria. Potentially suitable yeast strains are strains of the species 8assyagotus cecidae, 8cChococagus nocicephidae, strains of Chroteus nigra, Sapb1ba or any other yeast strains capable of producing foreign proteins. Potentially suitable bacterial strains are the strains Exxepylaxis, Bacillus tuberosus, 8a1cope11a1ur1itipit, or any other bacterial strain capable of expressing heterologous proteins. If the protein has been synthesized in yeast or bacterial cells, it must be modified, for example, at suitable phosphorylation or glycosylation sites in order to obtain a functionally active protein. Such covalent attachment can be carried out using known chemical or enzymatic methods.
Белок также может быть получен путем функционального соединения выделенного полинуклеотида по настоящему изобретению с подходящими контрольными последовательностями в составе одного или большего числа экспрессионных векторов для клеток насекомых с использованием экспрессионной системы клеток насекомых. Материалы и методы для осуществления экспрессионной системы бакуловирус/клетки насекомого доступны на коммерческой основе в виде стандартных наборов, производимых, например, фирмой 1п-\'йгодеп (8ап О|едо. СА, США) - набор МахВас7: такие методы хорошо известны в данной области техники и описаны, в частности, Саммерсом и Смитом (8итшегк & 8тйй, 1987, Техак Адг1си11. Ехрег. 81а1. Ви11., N 1555: включено в данный текст в виде библиографической ссылки). По использованию в данном тексте клетка насекомого, способная экспрессировать полинуклеотид по настоящему изобретению, называется трансформированной.A protein can also be obtained by functional coupling the isolated polynucleotide of the present invention with suitable control sequences of one or more expression vectors for insect cells using an insect cell expression system. Materials and methods for implementing the baculovirus / insect cell expression system are available on a commercial basis in the form of standard kits manufactured, for example, by the company 1p - \ 'yogodep (8ap O | edo. CA, USA) - the MaxBac7 kit: such methods are well known in this areas of technology and are described, in particular, by Summers and Smith (8mshekk & 8ty, 1987, Techak Adgsi11. Ext. 81a1. Vi11., N 1555: included in this text as a bibliographic reference). As used herein, an insect cell capable of expressing a polynucleotide of the present invention is called transformed.
Белок по настоящему изобретению может быть получен путем культивирования трансформированных клеток-хозяев в таких условиях, которые являются подходящими для экспрессии рекомбинантного белка. Полученный в результате экспрессированный белок затем может быть очищен из такой культуры (например, из культуральной среды или из клеточного экстракта) с использованием известных процедур очистки, таких как гель-фильтрация и ионобменная хроматография. Очистка белка также может включать хроматографию на аффинных колонках, содержащих агенты, которые бы связывались с данным белком: один или большее число этапов очистки на колонках с такими аффинными смолами, как конканавалин-А-агароза, гепарин-1оуореаг1-7 или сефароза-7 с цибахромом голубым 3ОА; один или большее число этапов хроматографии с гидрофобным взаимодействием с использованием таких смол, как фениловый эфир, бутиловый эфир или пропиловый эфир, или иммуноаффинная хроматография.The protein of the present invention can be obtained by culturing the transformed host cells under conditions that are suitable for expression of the recombinant protein. The resulting expressed protein can then be purified from such a culture (for example, from a culture medium or from a cell extract) using known purification procedures such as gel filtration and ion exchange chromatography. Protein purification can also include chromatography on affinity columns containing agents that would bind to this protein: one or more purification steps on columns with affinity resins such as concanavalin A agarose, heparin-1ouoreag1-7, or sepharose-7 cyanachrome blue 3OA; one or more hydrophobic interaction chromatography steps using resins such as phenyl ether, butyl ether or propyl ether, or immunoaffinity chromatography.
С другой стороны, белок по настоящему изобретению также может быть экспрессирован в такой форме, которая бы облегчила его очистку. Например, он может быть экспрессирован в виде слитого белка, такого как мальтозосвязывающегося белка (МВР), глутатион-8трансферазы (68Т) или тиреодоксина (ТЕХ). Стандартные наборы для экспрессии и очистки таких слитых белков доступны в продаже, как продукция фирм, соответственно, №\ν Епд1апб ВюЬаЬ (Веνе^1у, МА), РНагтааа (Р1кса!а^ау, N1) и 1т'йгодеп. Также белок может быть помечен эпитопом и последовательно очищен с использованием специфичного антитела, направленного на этот эпитоп. Один из таких эпитопов (Е1ад) доступен на коммерческой основе на фирме Кобак (Νον Наνеη, СТ).On the other hand, the protein of the present invention can also be expressed in a form that would facilitate its purification. For example, it can be expressed as a fusion protein, such as a maltose-binding protein (MBP), glutathione-8 transferase (68T), or thyroidoxin (TECH). Standard kits for the expression and purification of such fusion proteins are commercially available, such as products of the companies, respectively, No. \ ν Epd1apb VbLaB (Beve ^ 1y, MA), Rnagtaaa (P1xa! A ^ ay, N1) and 1t'ygodep. Also, the protein can be labeled with an epitope and sequentially purified using a specific antibody directed at that epitope. One of these epitopes (E1ad) is available commercially at Kobak (Νον Наνеη, СТ).
Наконец, для дальнейшей очистки белка могут быть использованы один или большее число этапов высокоразрешающей жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в обратной фазе с использованием гидрофобной среды для ОФВЭЖХ - такой как силикагель, включающий метильную или другую алифатическую боковую цепь. Все или некоторые из названных выше этапов очистки в различных сочетаниях также могут быть применены для получения в существенной степени гомогенного выделенного рекомбинантного белка. Очищенный таким образом белок, по сути свободен от других белков млекопитающих и в соответствии с настоящим изобретением определяется как выделенный белок.Finally, for further protein purification, one or more high-performance liquid chromatography (HPLC) steps in the reverse phase can be used using a hydrophobic HPLC medium such as silica gel including a methyl or other aliphatic side chain. All or some of the above purification steps in various combinations can also be used to obtain a substantially homogeneous isolated recombinant protein. The protein thus purified is essentially free of other mammalian proteins and is defined as an isolated protein in accordance with the present invention.
Белок по настоящему изобретению также может быть экспрессирован в виде продукта, вырабатываемого трансгенным животным: например, в виде компонента молока у трансгенных коров, коз, свиней или овец, которые бы характеризовались соматическими или половыми клетками, несущими нуклеотидную последовательность, кодирующую белок.The protein of the present invention can also be expressed as a product produced by a transgenic animal: for example, as a component of milk in transgenic cows, goats, pigs or sheep, which would be characterized by somatic or germ cells carrying a nucleotide sequence encoding a protein.
Также белок может быть получен с помощью стандартного химического синтеза. Методы конструирования белков по настоящему изобретению синтетическим путем хорошо известны специалистам в данной области техники. Созданные синтетическим путем последовательности белков за счет гомологии первичной, вторичной или четвертичной структурных и (или) конформационных параметров может обеспечить общие биологические свойства, включая активность белка. Таким образом, они могут быть использованы в качестве биологически активных или иммунологических замести телей естественных очищенных белков при проведении скрининга лекарственных соединений и иммунологических процессов, связанных с формированием антител.Protein can also be obtained using standard chemical synthesis. Synthetic methods for constructing the proteins of the present invention are well known to those skilled in the art. Synthetically created protein sequences due to the homology of the primary, secondary or quaternary structural and (or) conformational parameters can provide general biological properties, including protein activity. Thus, they can be used as biologically active or immunological substitutes for naturally purified proteins during screening of drug compounds and immunological processes associated with antibody formation.
Представляемые здесь белки также включают белки, характеризующиеся аминокислотными последовательностями, сходными с таковыми у очищенных белков, но при этом имеющими естественно возникшие или искусственно созданные модификации. Например, модификации в пептидных последовательностях или последовательностях ДНК могут быть выполнены с применением методов, хорошо известных специалистам в данной области техники. Представляющие интерес модификации белковых последовательностей могут включать замещения, замены, вставки или делеции выбранного аминокислотного остатка в составе кодирующей его последовательности. Например, один или большее число остатков цистеина могут быть делегированы или замещены другой аминокислотой с целью изменения конформации данной молекулы. Методики таких замещений, замен, вставок или делеции хорошо известны специалистам в данной области техники (см., например, патент США № 4518584). Предпочтительно, чтобы такие замены, замещения, вставки и делеции сохраняли желательную активность данного белка.The proteins provided herein also include proteins characterized by amino acid sequences similar to those of purified proteins, but with naturally occurring or artificially created modifications. For example, modifications in peptide sequences or DNA sequences can be performed using methods well known to those skilled in the art. Modifications of protein sequences of interest may include substitutions, substitutions, insertions, or deletions of a selected amino acid residue as part of its coding sequence. For example, one or more cysteine residues can be delegated or substituted with another amino acid to change the conformation of a given molecule. Techniques for such substitutions, substitutions, insertions, or deletions are well known to those skilled in the art (see, for example, US Pat. No. 4,518,584). Preferably, such substitutions, substitutions, insertions and deletions retain the desired activity of the protein.
Другие фрагменты и производные последовательностей белков, которые предположительно будут сохранять активность белка полностью или отчасти и таким образом могут быть использованы для скрининга или иных иммунологических методик, также могут быть легко сформированы специалистами в данной области техники на основе описанного в данном тексте. Такие модификации также охватываются масштабом настоящего изобретения.Other fragments and derivatives of protein sequences that are expected to retain the activity of the protein, in whole or in part, and thus can be used for screening or other immunological methods, can also be easily formed by specialists in the art based on what is described in this text. Such modifications are also encompassed by the scope of the present invention.
Дигибридные дрожжевые тестыHybrid Hybrid Yeast Test
Тесты Υ2Η показали, что связывание ВАР со слитым белком ВВР1 является специфичным. Связывание ВВР1 с ВАР подтверждает, что активность ВВР1 может играть определенную роль в патогенезе болезни Альцгеймера.Υ2Η tests showed that the binding of BAP to the BBP1 fusion protein is specific. The binding of BBB1 to BAP confirms that the activity of BBB1 may play a role in the pathogenesis of Alzheimer's disease.
Последовательности ВВР1 сравнивали с данными СеиВаик, используя программу для локального сопоставления-поиска (ВБА8Т: А115с1ш1 е! а1., 1990). Были сопоставлены белок ВВР1 и трансляты включенных в базу данных экспрессируемых маркеров с последующим поиском консервативных участков и оценкой их с помощью программы для поиска специфических полипептидых мотивов (ΜοδΤ: Та!и§оу е! а1., 1994). Такой анализ позволил установить возможность эволюционного родства с семейством С-связанных белковых рецепторов (СРСЯ). Конкретно этот анализ показал, что ВВР1 включает два потенциальных трансмембранных домена, эквивалентных трансмембранным доменам 3 и 4, имеющимся в составе С-связанных белковых рецепторов. Расположенная между ними гидрофильная петля включает хорошо известный мотив, состоящий из трех аминокислот - остаток аспарагиновой (Ό) или глутаминовой кислоты, далее аргинин (Я) и затем ароматический остаток (Υ или Р) (обычно обозначаемый как последовательность ΌΡΥ), который консервативен у почти всех членов данного рецепторного семейства, и для него ранее было показано участие в молекулярном механизме опосредования активации С-белка (Асйатуа & Катшк, 1996).The sequences of BBB1 were compared with SeiVaik data using a local search-matching program (VBA8T: A115s1sh1 e! A1., 1990). The BBP1 protein and translates of the expressed markers included in the database were compared, followed by searching for conservative sites and evaluating them using the program for searching for specific polypeptide motifs (ΜοδΤ: Ta! Igou e! A1., 1994). Such an analysis made it possible to establish the possibility of evolutionary kinship with the family of C-linked protein receptors (SRNS). Specifically, this analysis showed that BBP1 includes two potential transmembrane domains equivalent to the transmembrane domains 3 and 4 present in C-linked protein receptors. The hydrophilic loop located between them includes a well-known motif consisting of three amino acids - the remainder of aspartic (Ό) or glutamic acid, then arginine (I) and then the aromatic residue (Υ or P) (usually denoted as the sequence ΌΡΥ), which is almost conservative all members of this receptor family, and for it, participation in the molecular mechanism of mediating C-protein activation was previously shown (Asyatua & Katshk, 1996).
Данные тестов Υ2Η (см. фиг. 2-4) показывают, что белок ВВР1 представляет новый белок, потенциально включающий функциональный модуль, общий с представителями суперсемейства С-связанных белковых рецепторов. Конкретно предполагается, что белок ВВР1 сохраняет важную последовательность ИЯР (от 199-й аминокислоты до 201-й аминокислоты в составе 8Εβ ГО N0 2) между двумя предсказываемыми трансмембранными доменами и может обладать потенциалом по связыванию с Сбелком, участвующим в регуляции соответствующего сигнального механизма.Test data Υ2Η (see Fig. 2-4) show that the BBB1 protein is a new protein, potentially including a functional module, common with representatives of the superfamily of C-linked protein receptors. Specifically, it is assumed that the BBP1 protein retains an important sequence of INR (from the 199th amino acid to the 201st amino acid in the composition of 8Εβ GO N0 2) between two predictable transmembrane domains and may have the potential to bind to the Protein involved in the regulation of the corresponding signaling mechanism.
Для АРР было показано функциональное связывание с Сао (Νίδΐιίιηοίο е! а1., 1993; Υаша18ир е! а1., 1996), а ВВР1 включает структурный мотив, для которого известно то, что он является активаторной последовательностью для Са-белка, находясь в составе родственных С-связанных белковых рецепторов. Кроме того, гипотеза, основанная на предполагаемом расположении и ориентации трансмембранных доменов в составе ВВР1, предполагает, что участок белка, который взаимодействует с ВАР, должен быть топологически соответствующим тому же положению, что и ВАР в АРР.Functional binding to Cao has been shown for APP (Νίδΐιίιηοίο e! A1., 1993; 18asha18ir e! A1., 1996), and BBP1 includes a structural motif, for which it is known that it is an activator sequence for Ca protein, being in the composition related C-linked protein receptors. In addition, the hypothesis based on the assumed location and orientation of transmembrane domains in BBP1 suggests that the portion of the protein that interacts with BAP should be topologically corresponding to the same position as BAP in APP.
Штаммы для теста Υ2Η были сконструированы с целью оценки связывания внутриклеточного сегмента ВВР1 с Са-белками. Предполагаемые внутриклеточные последовательности в составе ВВР1 были экспрессированы в виде слитого белка и оценены по их взаимодействию с С-концевыми участками трех Са-белков. Сегменты белка, которые были использованы в этих экспериментах, перечислены ниже в табл. 2. Внутриклеточная петля в составе ВВР1 взаимодействовала со всеми тремя Са-белками (фиг. 3), подтверждая тем самым предположение о том, что ВВР1 может функционировать в качестве модулятора активности С-белков. Эти различные Υ2Н-тесты предполагают представляющую интерес модель множественного белкового комплекса, по минимуму состоящего из взаимодействующих мембранных белков ВВР1 и АРР, связанных с гетеротримерным С-белком.Υ2 теста test strains were designed to evaluate the binding of the intracellular segment of BBB1 to Ca proteins. The putative intracellular sequences in BBP1 were expressed as a fusion protein and evaluated by their interaction with the C-terminal regions of the three Ca proteins. The protein segments that were used in these experiments are listed below in table. 2. The intracellular loop in the composition of BBB1 interacted with all three Ca proteins (Fig. 3), thereby confirming the assumption that BBB1 can function as a modulator of the activity of C proteins. These various Υ2H tests suggest an interesting model of the multiple protein complex, at least consisting of the interacting membrane proteins BBP1 and APP linked to a heterotrimeric C protein.
Таблица 2. Плазмиды, использовавшиеся в дигибридных дрожжевых тестахTable 2. Plasmids Used in Digibrid Yeast Assays
Дальнейший анализ ВВР1 был осуществлен с помощью тестов Υ2Η. Две перекрывающиеся части последовательностей ВВР1, содержащиеся в составе клона ΒΒΡΙΔΙιη. были амплифицированы и клонированы в состав Υ24вектора рАСТ2 (экспрессирующие плазмиды рЕК216 и рЕК219 [табл. 2] и соответствующие им белки ΒΒΡ1ΔΝ и ВВРЫС [фиг. 4]). Конструкция ΔС характеризуется отсутствием обоих трансмембранных доменов, а конструкция ΔΝ кодирует первый трансмембранный домен плюс предшествующие ему 52 аминокислоты. Эти слитые белки были оценены с использованием ВАР-слитых белков, а полученные ответы сравнивали с ответами штаммов, экспрессирующих более длинный вариант белка ΒΒΡ1Δ1111. Белок ΒΒΡ1Δ11Π индуцирует слабый ответ в тесте Υ2Η (сравнивая ВВРЫС с вектором: фиг. 4), однако, белок ΒΒΡ1ΔΝ, включающий первый трансмембранный домен и прилежащие Ν-концевые последовательности, обусловливает ответ, который лишь немного слабее, чем тот, который получен для белка ΒΒΡ1Δ1111 (фиг. 4). Эти данные подтверждают, что основной детерминант связывания с ВАР находится в пределах того участка ВВР1, который предположительно топологически сходен с ВАР в составе белка АРР дикого типа.Further analysis of WWR1 was performed using Υ2Η tests. Two overlapping portions of the BBP1 sequences contained in the clone ΒΒΡΙΔΙιη. were amplified and cloned into the Υ24 vector of pAST2 (expressing plasmids pEK216 and pEK219 [Table 2] and their corresponding proteins ΒΒΡ1ΔΝ and BBRS [Fig. 4]). The ΔC construct is characterized by the absence of both transmembrane domains, and the ΔΝ construct encodes the first transmembrane domain plus 52 amino acids preceding it. These fusion proteins were evaluated using BAP fusion proteins, and the responses obtained were compared with the responses of strains expressing the longer version of the ΒΒΡ1Δ1111 protein. Protein ΒΒΡ1Δ11Π induces a weak response in the Υ2Η test (comparing the BBRI with the vector: Fig. 4), however, the ΒΒΡ1ΔΝ protein, including the first transmembrane domain and adjacent Ν -terminal sequences, results in a response that is only slightly weaker than that obtained for the protein ΒΒΡ1Δ1111 (Fig. 4). These data confirm that the main determinant of binding to BAP lies within the region of BBP1, which is supposedly topologically similar to BAP in the wild-type APP protein.
Система Υ2Η была использована для того, чтобы показать избирательность и специфичность связывания ВВР1 с ВАР человека в сравнении с ВАР грызуна. В составе аминокислотной последовательности ВАР грызуна имеется три аминокислотные замены (С5К, Ε10Υ и Κ13Η) по сравнению с последовательностью ВАР человека. В тесте Υ2Η, описанном в примере 6, белок грызуна проявляет сниженную нейротоксичность и отсутствие связывания с гомогенатами ткани головного мозга человека (Маддю с1 а1., 1992). Интересно, следовательно, было бы оценить связываемость ВАР грызуна с ВВР1 в системе Υ2Η. Последовательность ВАР человека в составе рЕК162 была изменена таким образом, чтобы кодировать пептид грызуна, с применением опосредованного олигонуклеоти дами мутагенеза с помощью ПЦР. Полученная в результате плазмида рЕК240 была идентична плазмиде, экспрессирующей слитый белок ВАР человека, использованной в данном эксперименте, за исключением трех кодонов, продуцирующих три аминокислотные замены, соответствующие пептидной последовательности грызуна. Взаимодействия между слитым белком ВВР1 и слитыми белками ВАР человека и грызуна сопоставляли с помощью биотеста Υ2Η. Штаммы, экспрессирующие ВВР1 и ВАР грызуна, не проявляли способности к ростовому ответу (фиг. 7). Эти данные подтверждают предположение о том, что ВВР1 может являться специфическим медиатором нейротоксического действия ВАР, а также указывает на механизм, объясняющий сниженную нейротоксичность ВАР грызуна. Важно также, что полученные данные демонстрируют высокую степень специфичности взаимодействия ВВР1/ВАР в тестах Υ2Η при том, что замены трех аминокислот были достаточны для полного нарушения такой связи (фиг. 7).The Υ2Η system was used to show the selectivity and specificity of binding of BBB1 to human BAP compared to rodent BAP. The amino acid sequence of rodent BAP has three amino acid substitutions (C5K, Ε10Υ and Κ13 В) compared to the human BAP sequence. In the Υ2Υ test described in Example 6, the rodent protein exhibits reduced neurotoxicity and lack of binding to human brain tissue homogenates (Maddu c1 a1., 1992). It would be interesting, therefore, to assess the binding of the rodent BAP to BBB1 in the Υ2Η system. The sequence of human BAP in pEK162 was changed to encode a rodent peptide using oligonucleotide-mediated mutagenesis using PCR. The resulting plasmid pEK240 was identical to the plasmid expressing the human BAP fusion protein used in this experiment, with the exception of three codons producing three amino acid substitutions corresponding to the rodent peptide sequence. The interactions between the BBP1 fusion protein and the human and rodent BAP fusion proteins were compared using the Υ2Η biotest. Strains expressing rodent BBB1 and BAP did not show growth response (Fig. 7). These data confirm the assumption that VVR1 may be a specific mediator of the neurotoxic effect of VAR, and also indicates a mechanism explaining the reduced neurotoxicity of VAR rodent. It is also important that the obtained data demonstrate a high degree of specificity of the BBB1 / BAP interaction in the Υ2Η tests, while the substitutions of three amino acids were sufficient to completely disrupt such a relationship (Fig. 7).
Выделенные полипептиды ВВР1Isolated BBB1 polypeptides
Белки и фрагменты белков по настоящему изобретению включают белки, аминокислотные последовательности которых по длине по крайней мере на 25% (более предпочтительно по крайней мере на 50%, а наиболее предпочтительно по крайней мере на 75%) соответствуют длине представляемого белка, и которые характеризуются по крайней мере 60%-ным уровнем идентичности последовательностей (более предпочтительно по крайней мере 75%-ным уровнем идентичности, а наиболее предпочтительно по крайней мере 90%-ным или 95%-ным уровнем идентичности) с последовательностью представляемого белка, при том, что уровень идентичности определяют путем сравнения аминокислотных последовательностей при таком их сопоставлении, которое максимально обеспечивает перекрывание и идентичность и минимизует разрывы последовательностей. Также в настоящее изобретение включены белки и фрагменты белков, которые включают сегмент, предпочтительно включающий 8 или больше (более предпочтительно 20 или больше, а наиболее предпочтительно - 30 или больше) расположенных подряд аминокислот, который проявляют по крайней мере 75%-ный уровень идентичности последовательностей (более предпочтительно по крайней мере 85%-ный уровень идентичности, а наиболее предпочтительно по крайней мере 95%-ный уровень идентичности) с любым таким сегментом любого представляемого белка.Proteins and protein fragments of the present invention include proteins whose amino acid sequences are at least 25% in length (more preferably at least 50%, and most preferably at least 75%) correspond to the length of the protein being presented, and which are characterized by at least 60% level of sequence identity (more preferably at least 75% level of identity, and most preferably at least 90% or 95% level of identity) with the sequence of the delivered protein, despite the fact that the level of identity is determined by comparing amino acid sequences with such a comparison that maximizes overlap and identity and minimizes sequence breaks. Also included in the present invention are proteins and protein fragments that comprise a segment, preferably comprising 8 or more (more preferably 20 or more, and most preferably 30 or more) amino acids arranged in a row that exhibit at least 75% sequence identity (more preferably at least 85% level of identity, and most preferably at least 95% level of identity) with any such segment of any protein presentable.
Также настоящим изобретением представляются видовые варианты, гомологичные заявляемым полинуклеотидам и белкам. По использованию в данном тексте видовой гомологичный вариант - это белок или полинуклеотид, происходящий от другого вида в сравнении с данным белком или полинуклеотидом, но характеризующийся существенным уровнем сходства последовательности по сравнению с данным белком или полинуклеотидом. Предпочтительно, чтобы видовой гомологичный вариант полинуклеотида характеризовался по крайней мере 60%-ным уровнем идентичности последовательностей (более предпочтительно по крайней мере 75%-ным уровнем идентичности, а наиболее предпочтительно по крайней мере 90%-ным уровнем идентичности) по сравнению с данным полинуклеотидом, а видовой гомологичный вариант белка характеризовался по крайней мере 30%-ным уровнем идентичности (более предпочтительно по крайней мере 45%ным уровнем идентичности, а наиболее предпочтительно по крайней мере 60%-ным уровнем идентичности) по сравнению с данным белком, при том, что уровень идентичности последовательностей определяют путем сравнения нуклеотидных последовательностей полинуклеотидов или аминокислотных последовательностей белков при таком их сопоставлении, которое максимально обеспечивает перекрывание и идентичность и минимизирует разрывы последовательностей. Видовые гомологичные варианты могут быть выделены и идентифицированы путем формирования подходящих зондов или затравок на основе представленных здесь последовательностей и скрининга подходящего источника нуклеиновых кислот, соответствующих желательному виду. Предпочтительно, чтобы видовые гомологичные варианты были выделены у видов млекопитающих. Более предпочтительно, чтобы видовые гомологичные варианты были выделены у таких видов млекопитающих, как, например, шимпанзе Рап 1год1обу1ск. горилла СогШа догШа, орангутанг Ропдо рудтаеик, гиббон Ну1оЬа!ек сопсо1ог, макака Масаса ти1а!!а, павиан Рарю рарю, гамадрил Рарю йатабгуак, зеленая мартышка Сегсорййесик ае1Шорк, капуцин СеЬик сарисшик, дурукули Ао!ек !г1у1гда!ик, 8апдшпик оеб1рик, мышиный лемур МюгосеЬик тип пик, домовая мышь Мик тикси1ик, крыса РаНик погуедкик, китайский хомячок Спсейбик дпкеик, домашняя кошка ЕеНк са!ик, американская норка Мик!е1а У1коп, домашняя собака Сашк ГатШапк, кролик Огус!о1адик сишси1ик, крупный рогатый скот Вок 1аигик, домашняя овца Оу1к апек, домашняя свинья 8ик ксгоГа и лошадь Есцшк саЬа11ик, для которых уже были созданы генетические карты, позволяющие оценивать отношения синтении между геномной организацией одного вида и геномной организацией соответствующих генов у других видов (О'Впеп & 8еиапе/, 1988, Апп. Неу. Сепе!., 22, 323-351; О'Впеп е! а1., 1993, Ыа!иге Сепе!., 3, 103-112; 1ойапккоп е! а1., 1995, Сепоткк, 25, 682-690; Ьуопк е! а1., 1997, Ыа!иге Сепе!., 15, 47-56; О'Впеп е! а1., 1997, Тгепбк ш Сепе!., 13 [10], 393-399; Сагуег & 8!иЬЬк, 1997,Also, the present invention provides species variants homologous to the claimed polynucleotides and proteins. As used in this text, a species homologous variant is a protein or polynucleotide that originates from a different species in comparison with a given protein or polynucleotide, but is characterized by a significant level of sequence similarity compared to this protein or polynucleotide. Preferably, the species homologous variant of the polynucleotide has at least 60% level of sequence identity (more preferably at least 75% level of identity, and most preferably at least 90% level of identity) compared to this polynucleotide, and the species homologous variant of the protein was characterized by at least 30% identity (more preferably at least 45% identity, and most preferably at least 60% m level of identity) compared with this protein, despite the fact that the level of sequence identity is determined by comparing the nucleotide sequences of the polynucleotides or amino acid sequences of the proteins with such a comparison that maximizes overlap and identity and minimizes sequence breaks. Species homologous variants can be isolated and identified by forming suitable probes or seeds based on the sequences presented here and screening a suitable source of nucleic acids corresponding to the desired species. Preferably, species homologous variants are isolated from mammalian species. More preferably, species homologous variants are isolated in mammalian species, such as, for example, chimpanzee Rap 1 year 1 obu 1sk. gorilla SogSha doga, orangutan Ropdo rudtayeyk, gibbon Nuooba! ek sopso1og, macaque Masasa tiaaaa, baboon Raryu raryu, hamadryl Rarya yatabguak, green monkey Segsyoriyesik ae1Shork, cactus biloba! mouse lemur Mugosebik type rush, house mouse Mik tiksi1ik, rat Ranik poguedudik, Chinese hamster Spseybik dpkeik, domestic cat EiNk sa! ik, American mink Mik! e1a U1kop, domestic dog Sashka GatShapk, rabbit Ogus! o1adik sorigsy 1 , domestic sheep Ou1k apek, domestic St. Nya 8iksGGGa and the horse Yeskssk saBa11ik, for which genetic maps have already been created, allowing one to evaluate the relations of synteny between the genomic organization of one species and the genomic organization of the corresponding genes in other species (O'Vpep & 8eyape /, 1988, App. Neu. Sepe !. , 22, 323-351; O'Vpep e! A1., 1993, Ya! Ige Sepe!., 3, 103-112; 1st appcop e! A1., 1995, Sepotkk, 25, 682-690; ., 1997, Ya! Ig Sepe!., 15, 47-56; O'Vpep e! A1., 1997, Tgepbk and Sepe!., 13 [10], 393-399; Sagueg & 8! Bk, 1997,
Сепоте Нек., 7, 1123-1137: все статьи включены здесь в виде библиографических ссылок).Sepot Nek., 7, 1123-1137: all articles are included here in the form of bibliographic references).
Также настоящее изобретение представляет аллельные варианты заявляемых полинуклеотидов или белков: они являются естественно встречающимися альтернативными формами выделенных полинуклеотидов, которые также кодируют белки, идентичные или обладающие существенно сходными последовательностями по сравнению с теми, которые кодируются заявляемыми полинуклеотидами. Предпочтительно, чтобы аллельные варианты характеризовались по крайней мере 60%-ным уровнем идентичности последовательностей (более предпочтительно по крайней мере 75%-ным уровнем идентичности, а наиболее предпочтительно по крайней мере 90%-ным уровнем идентичности) по сравнению с данным полинуклеотидом, при том, что уровень идентичности определяют путем сравнения нуклеотидных последовательностей полинуклеотидов при таком их сопоставлении, которое максимально обеспечивает перекрывание и идентичность и минимизирует разрывы последовательностей. Аллельные варианты могут быть выделены и идентифицированы путем использования подходящих зондов или затравок на основе представленных здесь последовательностей и скрининга подходящего источника нуклеиновых кислот от особей соответствующего вида.Also, the present invention provides allelic variants of the claimed polynucleotides or proteins: they are naturally occurring alternative forms of isolated polynucleotides that also encode proteins that are identical or have substantially similar sequences compared to those encoded by the claimed polynucleotides. Preferably, allelic variants are characterized by at least 60% level of sequence identity (more preferably at least 75% level of identity, and most preferably at least 90% level of identity) compared to this polynucleotide, while that the level of identity is determined by comparing the nucleotide sequences of the polynucleotides with such a comparison that maximizes overlap and identity and minimizes gaps lnostey. Allelic variants can be isolated and identified by using suitable probes or seeds based on the sequences presented here and screening a suitable source of nucleic acids from individuals of the corresponding species.
Также настоящее изобретение представляет полинуклеотиды, последовательности которых комплементарны последовательностям заявляемых здесь полинуклеотидов.The present invention also provides polynucleotides, the sequences of which are complementary to the sequences of the polynucleotides claimed herein.
ПримененияApplications
Белки ВВР1 по настоящему изобретению могут быть применены способами, являющимися стандартными для специалистов в данной области техники исходя из изложенного в настоящем тексте. Конкретно белки ВВР могут быть использованы в качестве иммуногенов для повышения количества вырабатываемых антител, которые специфичны в отношении клонированных полипептидов. Различные процедуры, известные в данной области техники, могут быть использованы для получения антител к белкам ВВР1. Такие антитела включают, тем самым не ограничиваясь, поликлональные, моноклональные, слитые, одноцепочечные антитела, фрагменты ЕаЬ и ЕаЬ-экспрессионную библиотеку. Для получения антител животныхреципиентов различных видов, включая, но не ограничиваясь этим, кроликов, мышей и крыс, инъецируют белком ВВР. В одном из вариантов полипептид или фрагмент полипептида, обладающий специфической иммунной активностью, соединяют с иммуногенным носителем. Также в сочетании с полипептидом могут быть введены адъюванты с целью усиления иммунного ответа животного-реципиента. Примерами адъювантов, которые могут быть использованы, являются, не ограничиваясь ими, полный и не19 полный адъюванты Фройнда, минеральные гели, такие как гидроокись алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюроновые высокомолекулярные спирты, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин слизня и динитрофенол.Proteins BBB1 of the present invention can be applied by methods that are standard for specialists in this field of technology based on what is set forth in this text. Specifically, BBB proteins can be used as immunogens to increase the amount of antibody produced that is specific for cloned polypeptides. Various procedures known in the art can be used to produce antibodies to BBB1 proteins. Such antibodies include, but are not limited to, polyclonal, monoclonal, fused, single chain antibodies, fragments of an EaB and an EaB expression library. In order to obtain antibodies of animal recipients of various species, including, but not limited to, rabbits, mice and rats, are injected with the BBP protein. In one embodiment, a polypeptide or fragment of a polypeptide having specific immune activity is coupled to an immunogenic carrier. Adjuvants may also be administered in combination with the polypeptide in order to enhance the immune response of the animal recipient. Examples of adjuvants that can be used include, but are not limited to, Freund's complete and incomplete19 complete adjuvants, mineral gels such as aluminum hydroxide, surfactants such as lysolecithin, high molecular weight pluronic alcohols, polyanions, peptides, oil emulsions, hemocyanin slug and dinitrophenol.
Моноклональные антитела к белкам ВВР1 по настоящему изобретению могут быть получены с использованием любой методики, которая бы обеспечивала выработку антител непрерывно культивируемой клеточной линией. Такие методики хорошо известны специалистам в данной области техники и включают, тем самым не ограничиваясь, гибридомную технологию, первоначально описанную Кёлером и Мильштейном (КоЫет & МПМейт 1975, Ыа!иге, 256, 4202-4207), гибридомную методику с использованием В-клеток человека, описанную Косбором с соавт. (КокЬот е! а1., 1983, 1ттипо1. Тобау, 4, 72), и основанную на трансформации вирусом Эпштейна-Барр гибридомную методику, описанную Коулом с соавт. (Со1е е! а1., Мопос1опа1 АпбЬоб1ек апб Сапсег Тйетару, Л.Р.Ыкк 1пс., рр. 77-96).Monoclonal antibodies to the BBB1 proteins of the present invention can be obtained using any technique that would ensure the production of antibodies by a continuously cultured cell line. Such techniques are well known to those of skill in the art and include, but are not limited to, the hybridoma technology originally described by Köhler and Milstein (Köyet & MPMate 1975, Ya! Ig, 256, 4202-4207), a hybridoma technique using human B cells described by Cosbor et al. (Kokot e! A1., 1983, 1ttypo1. Tobau, 4, 72), and based on the transformation of the Epstein-Barr virus hybrid method described by Cole et al. (Сеее! А1., Мопос1оп1 Apbobobek apb Sapseg Tyetaru, L.R. Ykk 1ps., Pp. 77-96).
Антитела, реагирующие с полипептидами по настоящему изобретению, могут быть затем использованы для скрининга на присутствие и субклеточное распределение сходных полипептидов в биологическом образце. Кроме того, моноклональные антитела, специфичные в отношении белков ВВР1 по настоящему изобретению, могут быть использованы и как лекарственные средства.Antibodies that react with the polypeptides of the present invention can then be used to screen for the presence and subcellular distribution of similar polypeptides in a biological sample. In addition, monoclonal antibodies specific for the BBB1 proteins of the present invention can also be used as drugs.
Белки ВВР1 также могут быть использованы в качестве антигенов, применимых в твердофазных тестах, нацеленных на измерение присутствия антител, которые являются иммунореактивными в отношении заявленных пептидов. Тесты на конкуренцию в твердой фазе могут быть использованы для имуннологического количественного анализа родственных клону 14 антигенов в биологических образцах. Такой анализ применим не только для облегчения получения полной характеристики клеточной функции или функций полипептидов по настоящему изобретению, но и также могут быть использованы для выявления пациентов, характеризующихся аномальным количеством этих белков.The BBB1 proteins can also be used as antigens useful in solid-state tests aimed at measuring the presence of antibodies that are immunoreactive in relation to the claimed peptides. Solid phase competition tests can be used for immunological quantitative analysis of clone-related 14 antigens in biological samples. Such an analysis is applicable not only to facilitate the complete characterization of the cellular function or functions of the polypeptides of the present invention, but can also be used to identify patients characterized by an abnormal amount of these proteins.
Белки ВВР1 по настоящему изобретению также могут быть использованы в качестве реагентов-уловителей в аффинной хроматографии для выявления собственно ВАР и агрегаций ВАР, являющихся симптомами болезни Альцгеймера.The BBP1 proteins of the present invention can also be used as trapping reagents in affinity chromatography to detect BAP itself and BAP aggregations, which are symptoms of Alzheimer's disease.
Кроме того, эти белки ВВР1 применимы в качестве реагентов в тесте, предназначенном для идентификации молекул кандидатов, которые влияют на взаимодействие ВАР и клонированного белка. Соединения, которые специфически блокируют такое взаимодействие, могут быть использованы для лечения или профилактики болезни Альцгеймера.In addition, these BBB1 proteins are useful as reagents in a test designed to identify candidate molecules that affect the interaction of BAP and a cloned protein. Compounds that specifically block this interaction can be used to treat or prevent Alzheimer's disease.
Также эти белки ВВР1 применимы в тестах на бесклеточное связывание ίη уйго, в котором определяется изменение под влиянием соединения связывания данных белков, ассоциированных с β-амилоидными пептидами, с ВАР или агрегациями ВАР. Бесклеточные тесты особенно применимы для скрининга большого числа соединений, поскольку такие тесты относительно экономичны и просты в осуществлении в сравнении тестами, основанными на использовании живых клеток. С учетом использования полипептидов по настоящему изобретению разработка таких тестов была бы рутинной процедурой для специалиста в данной области техники. В таких тестах либо ВВР1, либо ВАР снабжают меткой. Такие метки включают, тем самым не ограничиваясь, радиоактивные метки, антитела или флуоресцентные или ультрафиолетовые метки. Связывание ВВР1 с ВАР или агрегациями ВАР сначала выявляют в отсутствие любого из тестируемых соединений. Затем в тестовую среду добавляют предназначенные к тестированию соединения с целью определения того, влияют ли эти соединения на данное взаимодействие.Also, these BBB1 proteins are applicable in cell-free binding tests for ίη yugo, which determines the change in the influence of the binding compound of these proteins associated with β-amyloid peptides with BAP or BAP aggregations. Cell-free tests are especially applicable for screening a large number of compounds, since such tests are relatively economical and easy to perform in comparison with tests based on the use of living cells. Given the use of the polypeptides of the present invention, the development of such tests would be a routine for a person skilled in the art. In such tests, either BBB1 or BAP is labeled. Such labels include, but are not limited to, radioactive labels, antibodies, or fluorescent or ultraviolet labels. Binding of BBB1 to BAP or BAP aggregations is first detected in the absence of any of the test compounds. Then, compounds intended for testing are added to the test medium to determine whether these compounds influence this interaction.
ПримерыExamples
Далее настоящее изобретение описывается в форме примеров. Примеры представлены исключительно для того, чтобы проиллюстрировать изобретение путем отсылки к конкретным вариантам. Эти примеры, иллюстрирующие некоторые конкретные варианты настоящего изобретения, не вносят тем самым каких-либо ограничений или пределов масштаба настоящего изобретения.Further, the present invention is described in the form of examples. The examples are presented solely in order to illustrate the invention by reference to specific options. These examples, illustrating some specific variations of the present invention, do not thereby introduce any limitations or scope to the scope of the present invention.
Дигибридная дрожжевая система (здесь и далее обозначаемая как Υ2Η). Экспрессионные плазмиды для Υ2Η были сконструированы на векторах рЛ82 и рАСТ2 (описаны \УабеНагрег е! а1., 1993) и рСИР (описаны ОхепЬегдег & Υоиηд, 1995). Штамм дрожжей СУ770(ОхепЬегдег & Υоиηд, 1995) использовался в качестве штамма-хозяина во всех тестах Υ2Η.Hybrid yeast system (hereinafter referred to as Υ2Η). The expression plasmids for Υ2Η were constructed on the vectors pL82 and pACT2 (described by UabeNagreg e! A1., 1993) and pCIR (described by Oxepegdeg & Koynd, 1995). The yeast strain SU770 (Ocherbegdeg & Koynd, 1995) was used as the host strain in all of the 2G tests.
Генетический скрининг. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) был применен для амплификации и модифицирования последовательностей, кодирующих белок ВАР. Олигонуклеотиды № 1 (5'-СС АТС ОЛТ ОСА ОЛА ТТС СОА С) и №3 (5'-ААОСТТОТСОАС ТТА СОС ТАТОАС ААС АСС ОС) были использованы для амплификации ВАР с использованием в качестве матрицы рСЬЬ621, являющимся модифицированным АРР-клоном человека (1асоЬкеп е! а1., 1994). Амплифицированная ДНК включает кодоны 389-430 (которые кодируют ВАР42) белка-предшественника АРР с учетом следующих модификаций. Смысловая затравка добавила рестрикционный 5'-сайт Ысо1 в состав той же транслируемой открытой рамки, в кото21 рой имеется Ысо1-сайт в составе рА82. Антисмысловая затравка добавила стоп-кодон и сайты ΗίηάΙΙΙ и 8аИ, необходимые для проведения клонирования. Продукты данной амплификации были лигированы в состав клонирующей системы ТА (ГпуЦгодсп Согр., СагНЬаф СА) с последующим удалением с использованием рестриктаз Ысо1 и 8аИ. Полученный фрагмент клонировали в состав плазмиды рА82, расщепленной рестриктазами Ысо1+8а11. Полученную в результате плазмиду -рЕК162 - подтверждали путем секвенирования ДНК по участку соединения САЬ4/ВАР. Белок (ВАР80: фиг. 1), экспрессируемый с плазмиды рЕК162, включает слитый белок, содержащий ДНК-связывающийся домен дрожжевого белка-активатора транскрипции Са14 (лишенного последовательностей функциональной активации) с добавлением с С-конца 42 аминокислот ВАР. Экспрессирующую плазмиду формируют таким образом, чтобы она опосредовала экспрессию немодифицированного ВАР42. Затравку № 2 (5'ААССТТААС АТС САТ ССА САА ТТС ССА С) объединяли с затравкой № 3 в описанном выше методе ПЦР. Продукт, полученный в результате данной амплификации, включает 5'расположенный ΗίηάΙΙΙ-сайт и сигналы инициации трансляции, оптимизованные для экспрессии в клетках Зассйагошуссз ссгссыас. Опятьтаки фрагмент ДНК был клонирован в состав системы ТА. Затем он был выделен в виде ΗίηάΙΙΙ-фрагмента, который клонировали в состав плазмиды рСИР по ΗίηάΙΙΙ-сайту. Ориентация гена ВАР в составе полученной в результате плазмиды рЕК149 (ВАР: фиг. 1) была подтверждена с помощью ДНК-секвенирования. Экспрессирующие ВАР плазмиды рК149 (использующая ген НКА3 в качестве селективного маркера) и рЕК162 (использующая ген ТВР1 в качестве селективного маркера) были использованы для трансформации ими дрожжевых клетокхозяев СУ770 (ОхспЬсгзсг & Уошщ. 1995). Штамм, несущий обе эти плазмиды, был обозначен СУ2091. Плазмидную библиотеку, включающую фрагменты кДНК, выделенные из клеток плодного головного мозга человека, клонированную в вектор рАСТ2 (использующий ген ЬЕи2 в качестве селективного маркера) для дигибридной дрожжевой экспрессии, была приобретена в С1ойссй ЬаЬ. Шс. (Ра1о Айо, СА). Полученный из библиотеки белок на фиг. 1 обозначен как 411-11(^41-191°1. Эта библиотека была использована для трансформации СУ2091. Образцы были распределены в полной синтетической среде (8С) для культивирования дрожжей, лишенной урацила, триптофана и лейцина с целью отбора клеток, несущих все три плазмиды. В среде также отсутствовал гистидин и присутствовал в концентрации 25 мМ 3-аминотриазол, являющийся ингибитором продукта гена ΗΙ83 дрожжей. 3-Аминотризол был использован для снижения низкого уровня конститутивной ак тивности репортерного гена ΗΙ83. Планшеты инкубировали при 30°С в течение 12 дней. Были выделены 24 колонии, проявляющие усиленную прототрофию по гистидину. Трансформационные контроли показали, что в проведенном скрининге были тестированы 106 отдельных клонов. Для оперативного определения состава позитивных клонов был применен метод ПЦР. Общую ДНК выделяли из каждого позитивного штамма с помощью стандартных приемов. Полученный материал был использован в качестве матрицы для ПЦР с затравками № 4 (5' ТТТААТАССА СТАСААТ ССА Т) + № 5 (5'ТТТТСАСТАТ СТАССАТТСА Т), которые фланкируют клонирующий сегмент библиотечного вектора рАСТ2. Фрагменты ДНК были лигированы в состав системы ТА и протестированы путем секвенирования ДНК. Содержащуюся в клоне № 14 библиотечную плазмиду (так, как это было описано выше) выделяли по бифункциональному пути в Е.сой. Была определена нуклеотидная последовательность кДНК человека, что подтвердило состав последовательности исходного ПЦР-продукта.Genetic screening. The polymerase chain reaction (PCR) method was used to amplify and modify sequences encoding the BAP protein. Oligonucleotides No. 1 (5'-SS ATS OLT OSA OLA TTS SOA S) and No. 3 (5'-AAOOSTTOTSOAS TTA SOS TATOAS AAS ACC OS) were used to amplify BAP using pCb621 as a template, which is a modified human APP clone ( 1ACOBEK E! A1., 1994). The amplified DNA includes codons 389-430 (which encode BAP42) of the APP precursor protein, subject to the following modifications. The semantic seed added the restriction 5'-site of Yco1 to the composition of the same broadcast open frame, in which there is a Yso1 site of pA82. Antisense seed added a stop codon and the sites ΗίηάΙΙΙ and 8aI, necessary for cloning. The products of this amplification were ligated into the TA cloning system (GpuGodspods Comp., CnHlAf CA), followed by removal using restriction enzymes LiCl and 8aI. The resulting fragment was cloned into the plasmid pA82 digested with restriction enzymes Lyso1 + 8a11. The resulting plasmid, pEK162, was confirmed by DNA sequencing at the site of the CA4 / BAP compound. The protein (BAP 80 : FIG. 1) expressed from plasmid pEK162 includes a fusion protein containing the DNA-binding domain of the yeast Ca14 transcription activator protein (lacking functional activation sequences) with 42 BAP amino acids added from the C-terminus. The expression plasmid is formed in such a way that it mediates the expression of unmodified BAP42. Seed No. 2 (5'AASSTTAAS ATS CAT CAT SSA CAA TTS CCA S) was combined with seed No. 3 in the PCR method described above. The product obtained as a result of this amplification includes a 5 'located άΙΙΙηάΙΙΙ site and translation initiation signals optimized for expression in Sassyagossus sssssyas cells. Again, the DNA fragment was cloned into the TA system. Then it was isolated as a ΗίηάΙΙΙ fragment, which was cloned into the pCIR plasmid at the ΗίηάΙΙΙ site. The orientation of the BAP gene in the resulting plasmid pEK149 (BAP: Fig. 1) was confirmed by DNA sequencing. The BAP-expressing plasmids pK149 (using the HKA3 gene as a selective marker) and pEK162 (using the TBP1 gene as a selectable marker) were used to transform the yeast cells of the SU770 host (Oxfcrms & Wash. 1995). The strain carrying both of these plasmids was designated SU2091. A plasmid library, including cDNA fragments isolated from human fetal brain cells, cloned into the pAST2 vector (using the LFe2 gene as a selectable marker) for yeast yeast expression, was purchased from CIoxys baB. Ws (Ra1o Ayo, CA). The protein obtained from the library of FIG. 1 is designated as 411-11 (^ 41-1 91 ° 1. This library was used to transform SU2091. Samples were distributed in complete synthetic medium (8C) for culturing yeast lacking uracil, tryptophan and leucine to select cells carrying all three plasmids. Histidine was also absent in the medium and was present at a concentration of 25 mM 3-aminotriazole, an inhibitor of the product of the ΗΙ83 gene. 3-Aminotrizole was used to reduce the low constitutive activity of the ΗΙ83 reporter gene. The plates were incubated at 30 ° C for of 12 days. it was identified 24 colonies exhibiting enhanced prototrophy by histidine. Transformation controls indicated that the screening were tested June 10 individual clones. For efficient determination of the composition of positive clones was used the PCR method. Total DNA was isolated from each positive strain by means standard methods The resulting material was used as a template for PCR with seeds No. 4 (5 'TTTAATASS STASAAT CCA T) + No. 5 (5'TTTTTSASTAT STASSATTS T), which flank the cloning library segment pAST2 vector. DNA fragments were ligated into the TA system and tested by DNA sequencing. The library plasmid contained in clone No. 14 (as described above) was isolated by the bifunctional pathway to E. soi. The nucleotide sequence of the human cDNA was determined, which confirmed the sequence composition of the initial PCR product.
Биотесты. Штаммы выращивали на протяжении ночи в 2 мл среды 8С, лишенной лейцина и триптофана до достижения плотности приблизительно 7х107 клеток на 1 мл. Клетки подсчитывали, а затем готовили 10-кратные серийные разведения из расчета от 104 до 108 клеток на 1 мл стерильной воды. Эти образцы раскапывали в виде аликвот по 5 мкл на среду 8С, лишенную лейцина, триптофана и гистидина и содержащую 25 мМ 3-аминотриазола. Планшеты инкубировали при 30°С в течение 2-3 дней. Позитивные межбелковые взаимодействия были выявлены по увеличению прототрофного роста в сравнении с контрольными штаммами, экспрессирующими слитный белок с ДНК-связывающимся доменом Са14 плюс посторонний слитный белок с доменом активации транскрипции (или просто включающий вектор рАСТ, в котором отсутствовали какие-либо встроенные последовательности). Эти контрольные штаммы были определены в описанных выше фигурах как пометка вектор. Данный тест характеризуется высоким уровнем воспроизводимости результатов и пригоден для выявления даже слабой индукции роста, опосредованной специфическим взаимодействием между белкамимишенями. Исходный клон ВВР1, обозначенный рЕК196 и внесенный под депозитарным номером АТСС 98399 (обозначенный здесь как клон 14), был использован в качестве ПЦРматрицы для укорочения белкового продукта, экспрессируемого ВВР1А1Ш. Смысловую затравку № 6 (5'-ТТТААТАССА СТАСААТССА Т) отжигали на последовательности САЕ4 в составе рАСТ2. Антисмысловая затравка № 7 (5'-СТССАС ТТА ААА ТСС АТС ТСС ТСС САА СС) вносила 3'-стоп-кодон и ХйоЕсайт сразу с 3'-стороны последовательности, коди23 рующей ЭВЕ-мотив в составе ВВР1. ПЦРпродукт был лигирован в состав клонирующей векторной системы ТА с последующим вырезанием рестриктазами ЕсоВ1+Х1ю1 и клонировали в плазмиду рАТС2. Экспрессируемый этой плазмидой (рЕК198) гибридный продукт был обозначен ВВР1Д1т. Сходным образом затравка № 7 была объединена с затравкой № 8 (5'СААТТ ССА ААА АТА АТ САС ССТ АСС) с целью конструирования плазмиды рЕК216, экспрессирующей ВВР1АК Опять же ПЦРпродукт был лигирован в состав системы ТА, а полученную в результате плазмиду, обработанную рестриктазами ЕсоВ1+Х1юЕ несущую фрагмент ВВР1 (кодоны 123-202), в конечном счете лигировали в состав рАТС2, расщепленную теми же рестриктазами. Вариант ВВР1ДС был сформирован с использованием специфичной для рАТС затравки № 6 и антисмысловой затравки № 9 (5'-СТССАС ТСА АСА ТАТ ССС СТТ САА ААА АС). После ТА-клонирования, выделения ЕсоВ1-Х1о1-фрагмента и клонирования в состав рАСТ2 полученная в результате плазмида рЕК219 экспрессировала ВВР1 от 68го по 175-й аминокислотный остаток. Последовательности, кодирующие внутриклеточную петлю ВВР1, амплифицировали с использованием олигонуклеотидных зондов № 10 (5'ССТТСС АТС САА СТС ССА СТС ССА ТТС ТСТ) + № 11 (5'-ААСАСТС САС ТСА ААА ССС ТАС АСТ ССА ААА С). Этот продукт, включающий кодоны ВВР1 от 185-го по 217-й, расщепляли рестриктазами Хсо1+Х1ю1 и клонировали в состав рА82, расщепляемую №о1+8а11 с получением плазмиды ρ0Ζ339. Конструкции плазмид, экспрессирующих все варианты Сабелков, использовали ВатН1-сайт, расположенный вблизи центра каждой последовательности кДНК крысы (Капд е1 аЬ, 1980), в качестве сайта для соединения с рАСТ2. Смысловые затравки отжигали на последовательности, расположенные с 5'-стороны от ВатН1-сайта, а антисмысловые затравки отжигали на последовательности 3'-стоп-кодона, включающие рестрикционный сайт 8а11. Использованы такие затравки: Сао, смысловая (№ 17) -5'-СТССАТССАС ТССТТСС-АСС АТ, антисмысловая (№ 18) - 5'СТССАСССТТ ССТАТАСАСС АСААС-АСС; Сак, смысловая (№ 19) - 5'-СТССАТССАС ТССТТСААТС АТ, антисмысловая (№20) - 5'СТССАСТААА ТТТСССССТТ СССТТСТТ; Са12, смысловая (№ 21) - 5'-СТССАТССАС ТССТТТСАСС СТ, антисмысловая (№ 22) - 5'СТССАСССТС ТТСТТССССС САТСТТСС. ПЦР-продукты были клонированы в состав ТАвектора. Последовательности генов Са были выделены в виде ВатН1-8а11-фрагментов, которые клонировали в состав рАСТ2, расщепляемой рестриктазами ВатН1+8а11 (см. табл. 2 с обозначением плазмид). Наконец, олигонуклеотид № 23 был синтезирован для конверсии ВАР человека в последовательность грызуна. Эта затравка имела такую последовательность: 5'АТАТССССАТС САТ ССА САА ТТС ССА САТ САС ТСА ССА ТТТ САА СТТ ССТ. Триплеты представляют первые 13 кодонов ВАР: подчеркнуты три нуклеотида, которые были изменены так, чтобы кодировать последовательность грызуна. Олигонуклеотидную затравку № 23 объединяли с затравкой № 24 (5'ТСАССТАСАС САААСАСТТА), которая отжигается на участок векторов Υ2Η, расположенный с 3'-стороны от сайта клонирования, в ПЦР с использованием рЕК.162 в качестве матрицы. Полученный продукт расщепляли рестриктазами №о1+8а11 и лигировали в состав рА82 с получением плазмиды рЕК240. Была подтверждена точность нуклеотидной последовательности в сегменте, кодирующем ВАР грызуна.Biotests. Strains were grown overnight in 2 ml of 8C medium devoid of leucine and tryptophan until a density of approximately 7x10 7 cells per 1 ml was reached. Cells were counted, and then 10-fold serial dilutions were prepared from 10 4 to 10 8 cells per 1 ml of sterile water. These samples were instilled in aliquots of 5 μl onto 8C medium lacking leucine, tryptophan and histidine and containing 25 mM 3-aminotriazole. The plates were incubated at 30 ° C for 2-3 days. Positive interprotein interactions were detected by an increase in prototrophic growth compared with control strains expressing a fusion protein with a Ca14 DNA binding domain plus an extraneous fusion protein with a transcription activation domain (or simply including a pAST vector that lacked any built-in sequences). These control strains were defined in the above figures as labeling vector. This test is characterized by a high level of reproducibility of the results and is suitable for detecting even weak growth induction mediated by a specific interaction between target proteins. The original BBP1 clone designated pEK196 and introduced under ATCC 98399 (designated clone 14 here) was used as a PCR template to shorten the protein product expressed by BBP1A1Sh. Semantic seed No. 6 (5'-TTTAATASS STASAATSS T) was annealed on the CAE4 sequence as part of pAST2. Antisense seed No. 7 (5'-STCCAS TTA AAA TCC ATS TCC TCC CAA SS) introduced a 3'-stop codon and HyoESite immediately from the 3'-side of the sequence encoding the EVE motif in BBP1. The PCR product was ligated into the cloning vector system TA followed by cutting with restriction enzymes EcoB1 + X1y1 and cloned into the plasmid pATC2. The hybrid product expressed by this plasmid (pEK198) was designated BBB1D1t. Similarly, seed No. 7 was combined with seed No. 8 (5'CAATT CCA AAA ATA AT CAC SST ACC) to construct plasmid pEK216 expressing BBP1AK. Again, the PCR product was ligated into the TA system, and the resulting plasmid processed with EcoB1 restriction enzymes + X1yE-bearing BBB1 fragment (codons 123-202) was ultimately ligated into pATC2 cleaved with the same restriction enzymes. The VVR1DS variant was formed using the RATS-specific primer No. 6 and the antisense primer No. 9 (5'-STCCAS TSA ACA TAT CCC CTT CAA AAA AC). After TA-cloning, isolation of the EcoB1-X1o1 fragment and cloning into pAST2, the resulting plasmid pEK219 expressed BBP1 from the 68th to 175th amino acid residue. The sequences encoding the intracellular loop of BBB1 were amplified using oligonucleotide probes No. 10 (5'CSTTCC ATC CAA STS CCA STC CCA TTC TST) + No. 11 (5'-AACASTC CAC TCA AAA CCC TAC AST CCA AAA C). This product, including the BBP1 codons from 185th to 217th, was digested with restriction enzymes Xco1 + X1u1 and cloned into pA82, cleaved with #o1 + 8a11 to obtain plasmid ρ0Ζ339. Plasmid constructs expressing all Sabelkov variants used the WatH1 site located near the center of each rat cDNA sequence (Kapd e1 ab, 1980) as a site for connection with pAST2. The sense seeds were annealed at sequences located on the 5'-side of the WatH1 site, and the antisense seeds were annealed at sequences of the 3'-stop codon, including the restriction site 8a11. The following seeds were used: Cao, semantic (No. 17) -5'-STSSATSSAS TSSTTSS-ACC AT, antisense (No. 18) - 5'STSSASSSST STATASASS ASAAS-ACC; Sak, semantic (No. 19) - 5'-STSSATSSAS TSSTTSAATS AT, antisense (No. 20) - 5'STSSASTAAA TTTSSSSSTT SSSTTSTT; Ca12, semantic (No. 21) - 5'-STSSATSSAS TSSTTTSASS ST, antisense (No. 22) - 5'STSSASSSSST TSTSTSSSSS SATSTTS. PCR products were cloned into TAvector. Ca gene sequences were isolated as BatH1-8a11 fragments, which were cloned into pAST2, cleaved by the restriction enzymes BatH1 + 8a11 (see Table 2 with the plasmid designation). Finally, oligonucleotide No. 23 was synthesized to convert a human BAP into a rodent sequence. This seed had the following sequence: 5'ATATSSSSATS CAT CCA CAA TTS CCA CAT CAC TCA CCA TTT CAA CTT CCT. Triplets represent the first 13 BAP codons: underlined are three nucleotides that have been modified to encode a rodent sequence. Oligonucleotide seed No. 23 was combined with seed No. 24 (5'TSACSTASAS SAAASASTTA), which was annealed to the участок2Η vector site located on the 3'-side of the cloning site, in PCR using pЕК.162 as a template. The resulting product was digested with restriction enzymes No. 1 + 8a11 and ligated into pA82 to obtain plasmid pEK240. The accuracy of the nucleotide sequence in the rodent coding segment was confirmed.
Геномное клонирование: метод ВАСЕ (быстрая амплификация концов кДНК). Геномная клонотека на λ-фагах (8!га!адепе), соответствующая а2,0х.106 рГик, была подвергнута скринингу с зондом из случайного праймированного ЕсоВ1/-С1а1-фрагмента, соответствующим нуклеотидам 187-600 (фиг. 2). Этот зонд был помечен 32Р-ЦТФ с использованием набора реактивов '' СшскРптег ΒίΙ в соответствии с рекомендацией производителя (Рйагтас1а). Фильтры гибридизовались в условиях высокой жесткости: 40°С в 50%-ном формамиде, 0,12 М NаΗР04, 0,25 М №С1, 7% 8Ό8 и 25 мг/мл облученной ультразвуком ДНК спермы лосося и промывали при 65°С в буфере 0,1х88С, содержащем 0,1% додецилсульфата натрия и сканировали с использованием пленки Собак ВюМах М8. Клоны λ-фагов, гибридизовавшие с зондом, очищали путем успешного высевания и повторного скрининга. Десять позитивных клонов были очищены и подвергнуты дальнейшему анализу путем гибридизации с 45-нуклеотидным олигонуклеотидным зондом, соответствующим 5'-последовательности, известной в составе исходного клона кДНК. Этот олигонуклеотид характеризовался обратным составом нуклеотидов 157-201 (фиг. 2) и характеризовался последовательностью δ'-ССАССССССС СССАТСТТССGenomic cloning: BACE method (rapid amplification of cDNA ends). The genomic clonothek on λ-phages (8! Ha! Adepe), corresponding to a 2.0 × 10 6 rGik, was screened with a probe from a randomly primed EcoB1 / -C1a1 fragment corresponding to nucleotides 187-600 (Fig. 2). This probe was labeled 32 P-CTF using a reagent kit `` Ssskrpteg ΒίΙ in accordance with the manufacturer's recommendation (Ryagtas1a). The filters were hybridized under conditions of high stringency: 40 ° C in 50% formamide, 0.12 M NaΗP0 4 , 0.25 M No. C1, 7% 8–8 and 25 mg / ml of salmon sperm DNA irradiated with ultrasound and washed at 65 ° C in a 0.1x88C buffer containing 0.1% sodium dodecyl sulfate and scanned using a Dog VuMax M8 film. Clones of λ-phages hybridizing with the probe were purified by successful plating and re-screening. Ten positive clones were purified and subjected to further analysis by hybridization with a 45-nucleotide oligonucleotide probe corresponding to the 5'-sequence known in the original cDNA clone. This oligonucleotide was characterized by the reverse composition of nucleotides 157-201 (Fig. 2) and was characterized by the sequence δ'-ССССССССССС СССАТСТТСС
АСАСССАСАС ТТТСТССССА СТТСС. ДНК λ-фага была выделена с помощью стандартных молекулярно-биологических методик и подвергнута прямому секвенированию по методу Сэйнджера с использованием автоматического секвенсора АВ1-373.ASASSSSASAS TTTSTSSSSA STTSS. Λ-phage DNA was isolated using standard molecular biological techniques and subjected to direct sequencing using the Sanger method using an AB1-373 automatic sequencer.
Метод ВАСЕ. Синтез первой цепи ДНК был осуществлен с использованием системы термостойкой полимеразы гТ(Н (Регкт Е1тег).BACE method. The synthesis of the first DNA strand was carried out using the heat-resistant polymerase system gT (H (Reg E1tag).
Следующие реагенты были соединены в 1,5-мл пробирке с достижением объема 10 мкл: 1х обратнотранскриптазный буфер, 1 мМ МпС12, 1,6 мМ дНТФ (смесь), 2,5 ед. гТШ-полимеразы, 100 нг поли-А РНК гиппокампа человека (С1оп1се11). 10 мМ олигонуклеотида (нуклеотиды 429-452 фиг. 2: 5'-СТТАТСТТСС СТССТС СААА АСАС). Реакционную смесь инкубировали при 70°С в течение 15 мин и немедленно помещали на лед. Набор для синтеза кДНК Матаййоп (СопИесН) был использован для формирования второй цепи кДНК. Полный объем (10 мкл) реакционной смеси первой цепи был дополнен следующими реагентами: 1х буфера второй цепи, 0,8 мМ смеси дНТФ, 4х коктейля второй цепи (ДНК-полимераза I Е.соН. ДНК-лигаза Е.сой, РНКаза-Н Е.соН) и дистиллированная вода до объема 80 мкл. Пробирку инкубировали при 16°С в течение полутора часов, после чего была добавлена ДНК-полимераза фага Т4 (10 ед.), и инкубировали в течение еще 45 мин при 16°С. Для остановки реакции 4 мкл 20 х смеси ЕЭТА/гликогена (0,2 М ЕЭТА + 2 мг/мл гликогена) добавляли к реакционным смесям с последующей экстракцией смесью фенола/хлороформа/изо-амилового спирта для удаления ферментов и других примесей. ДНК преципитировали добавлением 0,1х 3 М ацетата натрия (рН=5,2) и 2,5х химически чистого этанола с помещением в температуру -70°С. ДНК промывали один раз 70%-ным этанолом, высушивали и ресуспендировали в 10 мкл дистиллированной воды. Половину ДНК использовали для лигирования с адаптером Мата1йоп с последующим использованием в реакциях КАСЕПЦР в соответствии с протоколом фирмы С1оп1сс11 следующим образом: 5 мкл кДНК добавляли к 2 мкл (10 мМ) Матаййоп (5'-СТААТАССАС ТСАСТАСАСС ССТССАСССС СССССССССС АССТ), 1х буфера ДНК-лигирования и 1 мкл (1 ед.) ДНК-лигазы Т4. Реакционную смесь инкубировали на протяжении ночи при 16°С. Смесь разводили 1:50 для исходной реакции КАСЕ объединяли в 0,2-мл пробирке для ПЦР со следующими реактивами: 40 мкл дистиллированной воды, 1 мкл 10х ДНК-полимеразы К1еп1ас.| (С1оп1есй), 1 мкл (10 мМ) АР1 затравки (5'ССАТССТААТ АССАСТСАСТ АТАСССС), 1 мкл (10 мМ) ВВР1-специфичной затравки (соответствующей нуклеотидам 187-209- фиг. 2: 5'ССЕСАСССССА СССССССССС АТ), 5 мкл 10х буфера полимеразы К1еп1ад, 1 мкл 10 мМ смеси дНТФ, 1 мкл разведенной кДНК, полученной в предыдущей реакции. Следующие циклические условия были осуществлены с использованием термоциклера СепеАтр 2400 (Реткш Е1тег): цикл денатурации при 94°С в течение 1 мин с последующими 5 циклами при 94°С в течение 30 с, при 72°С в течение 3 мин, 5 циклами при 94°С 30 с, при 70°С 3 мин, с последующими 25 циклами при 94°С 30 с, при 68°С 3 мин, с конечной достройкой цепи при 72°С в течение 7 мин. После этого этапа осуществляли КАСЕ-ПЦР со вложенными затравками по такой схеме: 40 мкл дистиллированной воды, 1 мкл (1 ед.) 10х ДНК-полимеразы Ат р1йас.|Со1б (Реткш Е1тег), 1 мкл (10 мМ) затравки АР2 (5'-АСТСАСТАТА ССССТССАСС ССС), 1 мкл (10 мМ) ВВР1-специфичной затравки (соответствующей нуклеотидам 172-194 - фиг. 2: 5'-ССССССАТСТ ТССАСАСССА САС), 5 мкл 10х буфера полимеразы Атр1йад, 1 мкл 10 мМ смеси дНТФ, 1 мкл первичного КАСЕ-продукта циклические условия проведения ПЦР были такими: исходный цикл денатурации - 9 мин при 94°С, 25 циклов по 30 с при 94°С, 30 с при 68°С, 2 мин при 72°С, с последующей достройкой цепи при 72°С в течение 7 мин. ПЦР-продукт был перенесен в 1%-ный агарозный гель в буфере 1хТВЕ. Полученный в результате продукт, состоящий из 350 пар нуклеотидов, был очищен в геле и напрямую клонирован с использованием набора для клонирования ТА С1ошпд кй (1пуйгодеп). Лигационными смесями трансформировали клетки Опе81ю1 (1пуйтодеп), которые высевали на агар с ЬВампициллином (100 мкг/мл) на планшеты, содержащие Х-да1. Минипрепараты ДНК были получены и подвергнуты секвенированию по методу Сэйнджера на автоматическом секвенсоре АВ1-373.The following reagents were combined in a 1.5 ml tube to achieve a volume of 10 μl: 1x reverse transcriptase buffer, 1 mm MPS12, 1.6 mm dNTP (mixture), 2.5 units hTSH polymerase, 100 ng poly-A human hippocampal RNA (S1op1se11). 10 mM oligonucleotide (nucleotides 429-452 of FIG. 2: 5'-STTATSTTSS STSTS CAAA ACAC). The reaction mixture was incubated at 70 ° C for 15 minutes and immediately placed on ice. The Matayop cDNA synthesis kit (SopIesN) was used to form the second cDNA strand. The full volume (10 μl) of the reaction mixture of the first chain was supplemented with the following reagents: 1x buffer of the second chain, 0.8 mM dNTP mixture, 4x cocktail of the second chain (DNA polymerase I E.coN. DNA ligase E. soi, RNase-N E.coN) and distilled water to a volume of 80 μl. The tube was incubated at 16 ° C for one and a half hours, after which T4 phage DNA polymerase was added (10 units), and incubated for another 45 min at 16 ° C. To stop the reaction, 4 μl of a 20 x EETA / glycogen mixture (0.2 M EETA + 2 mg / ml glycogen) was added to the reaction mixtures, followed by extraction with a phenol / chloroform / iso-amyl alcohol mixture to remove enzymes and other impurities. DNA was precipitated by the addition of 0.1 × 3 M sodium acetate (pH = 5.2) and 2.5 × chemically pure ethanol with a temperature of -70 ° C. The DNA was washed once with 70% ethanol, dried and resuspended in 10 μl of distilled water. Half of the DNA was used for ligation with the Mata1yop adapter, followed by use in CASEPCR reactions in accordance with the S1op1ss11 protocol as follows: 5 μl of cDNA was added to 2 μl (10 mM) Matayyop (5'-STAATASSAS TSASTASASSS SSTSSASSSSSSSSSSSSSSSSeSSST DNA) ligation and 1 μl (1 unit) of T4 DNA ligase. The reaction mixture was incubated overnight at 16 ° C. The mixture was diluted 1:50 for the initial reaction. CASE was combined in a 0.2-ml PCR tube with the following reagents: 40 μl of distilled water, 1 μl of 10x K1ep1ac DNA polymerase. | (C1op1esy), 1 μl (10 mM) seed AR1 (5'CCATSSTAAT ASSASTSAST ATASSSS), 1 μl (10 mm) BBP1-specific seed (corresponding to nucleotides 187-209 - Fig. 2: 5'CESSASSSSSS SSSSSSSSSSS AT), 5 μl 10x K1ep1ad polymerase buffer, 1 μl of 10 mM dNTP mixture, 1 μl of diluted cDNA obtained in the previous reaction. The following cyclic conditions were carried out using a SepeAtr 2400 thermal cycler (Retksh E1teg): denaturation cycle at 94 ° C for 1 min followed by 5 cycles at 94 ° C for 30 s, at 72 ° C for 3 min, 5 cycles at 94 ° C 30 s, at 70 ° C 3 min, followed by 25 cycles at 94 ° C 30 s, at 68 ° C 3 min, with final chain completion at 72 ° C for 7 min. After this step, CACE-PCR was carried out with the seeds seeded according to the following scheme: 40 μl of distilled water, 1 μl (1 unit) 10x DNA polymerase At p1ac. | Co1b (Retksh E1teg), 1 μl (10 mM) of AP2 seed (5 'A-ASTASTA SSSSTSSASS SSS), 1 μl (10 mM) of BBP1-specific seed (corresponding to nucleotides 172-194 - Fig. 2: 5'-SSSSSSSATST TSSASASSSS SAS), 5 μl 10x Atr1yad polymerase buffer, 1 μl 10 mM dNTF mixture, 1 μl of the primary CACE product, the cyclic PCR conditions were as follows: the initial denaturation cycle was 9 min at 94 ° C, 25 cycles of 30 s at 94 ° C, 30 s at 68 ° C, 2 min at 72 ° C, followed by chain completion at 72 ° C for 7 min. The PCR product was transferred to a 1% agarose gel in 1 × TBE buffer. The resulting product, consisting of 350 pairs of nucleotides, was gel-purified and directly cloned using a TA Clone kit cloning kit (1 Puygodep). Ligation mixtures transformed Ope81U1 cells (1 Puitodep), which were plated on L -ampicillin agar (100 μg / ml) onto X-da1 plates. DNA mini-preparations were obtained and sequenced by the Sanger method on an AB1-373 automatic sequencer.
Анализ методом Нозерн-блоттинга. Нозерн-блоты мРНК из различных тканей человека и из тканей различных участков головного мозга были получены от С1оп1ес11 (Ра1о А11о, СА). Последовательности ВВР1, продолжающиеся от исходного слитого соединения до полиаденилового сигнала, были выделены в ЕсоК1-фрагмент из ТА-клона, производного от плазмиды рЕК196. ДНК β-актина была предоставлена производителем. Радиоактивно помеченные зонды были получены на материале таких ДНК с использованием метода случайного прайминга с целью введения 32Р-дЦТФ (Рйагтааа Вюйесй, Рйсайатау, N1). Гибридизация была осуществлена согласно инструкциям производителя (С1оп1есй) в растворе Ехртекк Нуй при 68°С. Блоты промывали в буфере 2х88С (1х88С - 0,15 М хлорида натрия, 0,015 М цитрата натрия), 0,05% 8Ό8 при комнатной температуре с последующим промыванием в 0,1х88С, 0,1% 8Ό8 при 50°С. Гибридизационные сигналы были визуализованы с использованием фотопленки Кобак ВюМах.Northern blot analysis. Northern blots of mRNA from various human tissues and from tissues of various parts of the brain were obtained from C1op1es11 (Pa1o A11o, CA). The BBB1 sequences, extending from the initial fusion to the polyadenyl signal, were isolated into the EcoK1 fragment from the TA clone derived from the plasmid pEK196. Β-actin DNA was provided by the manufacturer. Radioactively labeled probes were obtained on the material of such DNA using random priming with the aim of introducing 32 R-dTCP (Ryagtaa Vuyesy, Rysayatau, N1). Hybridization was carried out according to the manufacturer's instructions (C1O1esy) in an Exteck Nui solution at 68 ° C. Blots were washed in 2x88C buffer (1x88C - 0.15 M sodium chloride, 0.015 M sodium citrate), 0.05% 8–8 at room temperature, followed by washing in 0.1x88C, 0.1% 8–8 at 50 ° C. Hybridization signals were visualized using a Kobak VuMax film.
Гибридизация ш 8Йи. Матрицы ДНК для синтеза рибонуклеиновых зондов были получены с помощью ПЦР с использованием плазмидного клона, включающего полноразмерную кДНК ВВР человека. Был использован единственный рибозонд, метящий 3'-ИТК (3'нетранслируемый сегмент) данной кДНК. Последовательности зондов были проверены сопоставлением с базой данных СепВапк для того, чтобы быть уверенным в том, что они только распознают подходящие метки среди всех депонированных последовательностей. Для формирования рибозондов для ВВР1 была сконструирована пара олигонуклеотидных затравок, кото27 рые позволяют амплифицировать участок, состоящий из 275 нуклеотидов от 3'-ИТК кДНКВВР1, и добавлять промоторные последовательности к Т7 (смысловой) и Т3 (антисмысловой) полимеразе. Эти затравки имели следующие последовательности: 5'-ТААТАС6АСТ САСТАТА 666 ТТА6АА6ААА СА6АТТТ6А6 (прямая) и 5'-АТТААСССТС АСТААА6 66А САА6Т66САА СТТ6ССТТТ6 (обратная). ПЦР-продукты были очищены в 1,5%-ном легкоплавком агарозном геле, содержащие продукт бэнды вырезали, экстрагировали фенолом и смесью фенола/хлороформа и преципитировали этиловых спиртом. Осадок высушивали и ресуспендировали в 1х буфере ТЕ (10 мМ ТрисНС! 1 мМ ЕЭТА - рН=7,4). АРР-рибозондовая матрица включала ЭбеЕХЕоЕфрагмент из состава кодирующей последовательности в соответствии с описанным у Якобсена с соавт. (1асоЬкеп с1 аБ, 1991). Пятьдесят нг ДНК-матрицы использовали для реакции транскрипции с использованием меченного 358-ЦТФ (Ыете Епд1апб №.1с1еаг. Вок!оп, МА) и рибозонда ШЬортоЬе 6еш1ш™ (Рготеда, Майкоп, XVI).Hybridization w 8Yi. DNA matrices for the synthesis of ribonuclein probes were obtained by PCR using a plasmid clone, including a full-sized human VVR cDNA. A single ribosonde was used that labeled the 3'-ITC (3 'untranslated segment) of this cDNA. The probe sequences were checked by comparing with the SepWap database to ensure that they only recognize suitable labels from all deposited sequences. To form ribosondes for BBP1, a pair of oligonucleotide seeds was constructed, which allow amplifying a region of 275 nucleotides from 3'-TEC cDNABPB1 and adding promoter sequences to T7 (sense) and T3 (antisense) polymerase. These primers had the following sequences: 5'-TAATAS6AST SASTAT 666 TTA6AA6AAA CA6ATTT6A6 (direct) and 5'-ATTAASSSTS ASTAAA6 66A CAA6T66CAA STT6STST6 (reverse). PCR products were purified on a 1.5% low-melting agarose gel, the product containing bands were excised, extracted with phenol and a phenol / chloroform mixture, and precipitated with ethyl alcohol. The precipitate was dried and resuspended in 1x TE buffer (10 mM TrisNS! 1 mM EETA - pH = 7.4). The APP ribosonde matrix included an EbeEEXEoE fragment from the coding sequence as described by Jacobsen et al. (1ACOBKEP1 AB, 1991). Fifty ng of the DNA template was used for the transcription reaction using the labeled 35 8-CTF (Ete Epnapb No. 1c1eag. Wok! Op, MA) and the Ribotonus Schortoe 6esch ™ (Rgoteda, Maikop, XVI).
Гистохимическую гибридизацию ίη кйи с использованием срезов ткани гиппокампа человека, полученных рок! тойет, осуществляли в соответствии с ранее описанным (Кйобек, 1996). Срезы получали толщиной в 10 мкм с использованием криостат-ультратома Наскег-ВгфЫк и по растаиванию были распластаны на охлажденные до -20°С предметные стёкла, покрытые реагентом Уес1аЬопб (УесЮг БаЬк, Виг1тдате, СА). Все растворы были получены в дистиллированной воде, обработаны 0,1%-ным (объемные проценты) диэтил-пирокарбонатом и автоклавированы. Срезы были зафиксированы погружением в 4%-ный параформальдегид в фосфатном буфере (рН=7,4), затем их последовательно погружали в 2х88С, дистиллированную воду и 0,1 М триэтиламин (рН=8,0). Затем срезы подвергали ацетилированию погружением в 0,1 М триэтаноламин, содержащий 0,25% (объемные проценты) уксусного ангидрида, промывали в 0,2х88С, обезвоживали в 50%-ном, 70%-ном и 90%-ном этаноле и быстро высушивали. Один мл прегибридизационного раствора, содержащего 0,9 М ЫаС1, 1 мМ ЕЭТА, 5х раствора Данхардта, 0,25 мг/мл одноцепочечной ДНК спермы сельди (61Ьсо/ВКЕ, 6аййегкЬегд, МЭ), 50% деионизированного формамида (ЕМ 8с1епсек, 61ЬЬк1о^п, N1) в 10 мМ Трис (рН=7,6) были пипеткой раскапаны на каждое предметное стекло, которые затем инкубировали в течение 3 ч при 50°С во влажном инкубаторе. Затем срезы были обезвожены погружением в 50%-ный, 70%-ный и 90%-ный этанол и высушены на воздухе. Помеченные рибозонды добавляли в конечной концентрации 50000 имп/мин на 1 мкл к гибридизационному раствору, содержащему 0,9 М №С1, 1 мМ ЕЭТА, 1х раствора Данхардта, 0,1 мг/мл дрожжевых тРНК, 0,1 мг/мл одноцепо чечной ДНК спермы лосося, декстрансульфат (10%), 0,08% бычьего сывороточного альбумина (В8А), 10 мМ дитиотреитола (Воейппдет МаппЬе1т, 1пб1апаро11к, ΙΝ) и 50% деионизированного формамида в 10 мМ Трис (рН=7,6). Затем зонды были денатурированы при 95°С (1 мин), помещены на лед (5 мин) и раскапаны на срезы: они были оставлены для гибридизации на протяжении ночи при 55°С во влажном инкубаторе. Срезы последовательно промывали один раз в течение 45 мин при 37°С в 2х88С, включающем 10 мМ дитиотреитола, затем один раз в течение 30 мин при 37°С в 1х88С, содержащем 50% формамида, и один раз в течение 30 мин при 37°С в 2х88С. Одноцепочечные и неспецифически гибридизованные рибозонды расщепляли путем погружения в 10 мМ Трис (рН=8,0), содержащий РНКазу-А поджелудочной железы быка (Воейппдет МаппЕепп; 40 мг/мл), 0,5 М №1С1 и 1 мМ ЕЭТА. Срезы промывали в 2х88С в течение 1 ч при 60°С, затем - в 0,1х88С, содержащий 0,5% (весовые проценты) тиосульфата натрия, в течение 2 ч при 60°С. Затем срезы обезвоживали 50-70-90%-ным этанолом, содержащим 0,3М ацетата аммония, и высушивали. Предметные стекла были заложены в рентгенографические кассеты и подвергнуты контакту с НуретШт Ь-Мах (Атеткйат) в течение 14-30 дней. Когда был получен удовлетворительный результат, предметные стекла были покрыты эмульсией для выявления ядерных треков (ΝΊΒ2; Кобак) и тестированы в течение 7-21 дней при 4°С. Эмульсионные авторадиограммы были получены и зафиксированы в соответствии с инструкциями производителя, а расположенные под эмульсией срезы тканей окрашивали гематоксилином. Для оценки неспецифического мечения контрольный зонд был сформирован на основе матрицы, взятой из набора КтЬортоЬе 6ет1ш™ 8ук1ет кй (Рготеда). Этот вектор был линеаризован с использованием рестриктазы 8са1 и транскрибирован с использованием полимеразы Т3. В полученных транскрипционных реакциях получены два продукта - рибозонды, состоящие из 250 и 1525 нуклеотидов, содержащие только векторную последовательность. Смесь с этим контрольным зондом была помечена так, как это описано выше, добавлена к гибридизационному раствору при конечной концентрации 50000 имп/мин в 1 мкл. На контрольных срезах специфическая гибридизация не была выявлена, т. е. эти срезы дают очень слабый однообразный гибридизационный сигнал, который не соответствует каким-либо нейро-анатомическим маркерам (данные не включены).Histochemical hybridization of ίη Kyi using sections of human hippocampal tissue obtained by rock! Toyota was carried out in accordance with the previously described (Kyobek, 1996). Slices were obtained with a thickness of 10 μm using the Naskeg-BrfK cryostat ultratome and, upon melting, were spread onto glass slides cooled to -20 ° C, coated with the Reagent-Reagent reagent (Uesug-Baib, Vigtdate, CA). All solutions were obtained in distilled water, treated with 0.1% (volume percent) diethyl pyrocarbonate and autoclaved. Sections were fixed by immersion in 4% paraformaldehyde in phosphate buffer (pH = 7.4), then they were successively immersed in 2x88C, distilled water and 0.1 M triethylamine (pH = 8.0). Then the sections were acetylated by immersion in 0.1 M triethanolamine containing 0.25% (volume percent) of acetic anhydride, washed in 0.2x88 ° C, dehydrated in 50%, 70% and 90% ethanol and quickly dried . One ml of a prehybridization solution containing 0.9 M NaCl, 1 mM EETA, 5x Dunhardt's solution, 0.25 mg / ml single-stranded herring sperm DNA (61LCO / BKE, 6yegkkegd, ME), 50% deionized formamide (EM 8c1epsek, 61bk1k p, N1) in 10 mM Tris (pH = 7.6) were pipetted onto each glass slide, which was then incubated for 3 hours at 50 ° C in a wet incubator. Then the sections were dehydrated by immersion in 50%, 70% and 90% ethanol and dried in air. Labeled ribosondes were added at a final concentration of 50,000 imp / min per 1 μl to a hybridization solution containing 0.9 M No. C1, 1 mM EETA, 1x Dunhardt solution, 0.1 mg / ml yeast tRNA, 0.1 mg / ml single chain Salmon sperm DNA, dextransulfate (10%), 0.08% bovine serum albumin (B8A), 10 mM dithiothreitol (Voyeppdet Mapple1t, 1pb1aparo11k, ΙΝ) and 50% deionized formamide in 10 mM Tris (pH = 7.6). Then the probes were denatured at 95 ° C (1 min), placed on ice (5 min) and dug into sections: they were left to hybridize overnight at 55 ° C in a wet incubator. Sections were washed sequentially once for 45 minutes at 37 ° C in 2x88C, including 10 mM dithiothreitol, then once for 30 minutes at 37 ° C in 1x88C containing 50% formamide, and once for 30 minutes at 37 ° C in 2x88C. Single-stranded and non-specifically hybridized ribosondes were digested by immersion in 10 mM Tris (pH = 8.0) containing bovine pancreatic RNase-A (Voyeppdet MappEepp; 40 mg / ml), 0.5 M No. 1C1 and 1 mM EETA. Sections were washed in 2x88C for 1 h at 60 ° C, then in 0.1x88C containing 0.5% (weight percent) of sodium thiosulfate for 2 hours at 60 ° C. Then the sections were dehydrated with 50-70-90% ethanol containing 0.3 M ammonium acetate, and dried. Slides were placed in radiographic cassettes and subjected to contact with Nuret Sht-Max (Atetkyat) for 14-30 days. When a satisfactory result was obtained, the slides were coated with an emulsion to detect nuclear tracks (ΝΊΒ2; Kobak) and tested for 7-21 days at 4 ° C. Emulsion autoradiograms were obtained and recorded in accordance with the manufacturer's instructions, and tissue sections located under the emulsion were stained with hematoxylin. To evaluate nonspecific labeling, a control probe was formed on the basis of a matrix taken from a set of Brtorte 6t1sh ™ 8uk1et ky (Rgoteda). This vector was linearized using restriction enzyme 8ca1 and transcribed using polymerase T3. In the obtained transcriptional reactions, two products were obtained - ribosondes, consisting of 250 and 1525 nucleotides, containing only the vector sequence. The mixture with this control probe was labeled as described above, added to the hybridization solution at a final concentration of 50,000 cpm in 1 μl. No specific hybridization was detected in the control sections, i.e., these sections produce a very weak uniform hybridization signal that does not correspond to any neuroanatomical markers (data not included).
Пример 1. Клонирование и выделениеExample 1. Cloning and selection
ВАР-связывающего белка (ВВР1).BAP-binding protein (BBP1).
Метод дигибридного дрожжевого скрининга (Υ2Η) был разработан для целей идентификации белков, которые взаимодействуют сThe Hybrid Yeast Screening Method (Υ2Η) was developed to identify proteins that interact with
ВАР42 человека - состоящим из 42 аминокислот протеолитический фрагментом АРР, который потенциально существенно более токсичен в агрегационной форме ВАР. ВАР42 был экспрессирован в виде химеры в соединении с ДНКсвязывающимся доменом Са1 4, а также был экспрессирован в виде свободного пептида (фиг. 1). Данный штамм был трансформирован У2Нбиблиотекой кДНК плодного головного мозга человека. Единственный клон, обозначенный, в соответствии с отмеченным выше, как клон 14, из приблизительно миллиона независимых трансформантов, проявлял существенную активацию репортерного гена и по сути включал открытую кодирующую рамку, непрерывно переходящую в последовательность, кодирующую домен САЬ4. Вставка кДНК включала 984 пары нуклеотидов и заканчивалась полиадениловым трактом. Последовательность кодировала 201 аминокислоту (аминокислотные остатки 68-269 в 8ЕО ИЗ N0 2) с наличием двух участков, характеризующихся длиной и уровнем гидрофобности, достаточными для проникновения через клеточную мембрану.Human BAP42, a 42-amino acid proteolytic APP fragment that is potentially substantially more toxic in the aggregated form of BAP. BAP42 was expressed as a chimera in combination with the Ca1 4 DNA binding domain, and was also expressed as a free peptide (Fig. 1). This strain was transformed with the U2N library of the human fetal brain cDNA. The only clone designated, in accordance with the aforementioned, as clone 14, out of approximately one million independent transformants, showed significant activation of the reporter gene and essentially included an open coding frame that continuously transitions to the sequence encoding the CAB4 domain. The cDNA insert included 984 nucleotide pairs and terminated in the polyadenyl tract. The sequence encoded 201 amino acids (amino acid residues 68-269 in 8EO FROM N0 2) with the presence of two sites, characterized by a length and level of hydrophobicity, sufficient for penetration through the cell membrane.
Производная от библиотеки плазмида была выделена из клона 14 и использована для реконструкции штаммов, включенных в тест Υ2Η. Тестирование этих штаммов показало, что слитый белок ВАР специфическим образом взаимодействует с белком, кодируемым клоном 14, хотя ответ оказался достаточно слабым. С учетом того, что обладающие высоким уровнем гидрофобности белковые домены, такие как трансмембранные участки, подавляют ответы в тесте Υ2Η (ОхспЬсгдсг. неопубликованные данные), то клон 14 был укорочен (обозначен как ΒΒΡ1Δ1111) с целью удаления участка жесткой гидрофобности с последующим повторным тестированием по взаимодействию с ВАР. Существенно более мощный ответ в тесте Υ2Η был отмечен с вариантом ΒΒΡΙΔΙιη (фиг. 2): это подтверждает предположение о том, что делегированные последовательности кодировали вероятный трансмембранный якорь (1т) . Нуклеотидная последовательность клона 14 была скринирована по данным СспВапк: в результате ВАР-связывающий белок (ВВР1) был определен как новый.The plasmid derivative of the library was isolated from clone 14 and used to reconstruct the strains included in the Υ2Η test. Testing of these strains showed that the BAP fusion protein specifically interacts with the protein encoded by clone 14, although the response was rather weak. Given that high-level hydrophobicity protein domains, such as transmembrane regions, suppress the responses in the Υ2Η test (Oxspcrdsg unpublished data), clone 14 was shortened (denoted as ΒΒΡ1Δ1111) in order to remove the region of hard hydrophobicity, followed by retesting interaction with BAP. A significantly more powerful answer in the Υ2Η test was noted with the ΒΒΡΙΔΙιη variant (Fig. 2): this confirms the assumption that the delegated sequences encoded a probable transmembrane anchor (1t). The nucleotide sequence of clone 14 was screened according to CspBap: as a result, a BAP-binding protein (BBP1) was identified as new.
Пример 2. Выделение и подтверждение 5'конца ВР1.Example 2. Isolation and confirmation of the 5'end of BP1.
Последовательности кДНК ВВР1, включавшие клон 14, описанные в примере 1, были лишены 5'-кодирующего участка, на что указывает отсутствие потенциального инициирующего кодона метионина. Многочисленные попытки применения стандартного метода 5'-КАСЕ (быстрая амплификация концов кДНК) с применением обычной обратной транскриптазы позволили добавить всего 27 нуклеотидов. Эти последовательности включали триплет АТС, но не включали расположенный выше стоп-кодон в той же транслируемой кодирующей рамке, что подтверждает точность определения этого триплета как инициирующего кодона. Методика геномного клонирования была применена для выделения 5'-концевой части гена ВР1.The BBP1 cDNA sequences including clone 14 described in Example 1 were devoid of the 5'-coding region, as indicated by the absence of a potential initiating codon of methionine. Numerous attempts to use the standard 5'-CACE method (rapid amplification of cDNA ends) using conventional reverse transcriptase allowed a total of 27 nucleotides to be added. These sequences included the ATS triplet, but did not include the stop codon located above in the same broadcast coding frame, which confirms the accuracy of determining this triplet as the initiating codon. The genomic cloning technique was used to isolate the 5'-terminal portion of the BP1 gene.
Гибридизация геномной λ-библиотеки человека с зондом, полученным методом случайного прайминга, соответствующим 400 парам нуклеотидов (п.н.) 5'-последовательности клона 14 привела к выявлению 10 позитивных клонов. Дальнейшее охарактеризование этих клонов с использованием 45-мерного олигонуклеотидного зонда, направленного на самую верхнюю ΒΡΙ-последовательность клона 14 (и соответствующей 5'-верхней последовательности 400п. н.), этот зонд показал, что 6 клонов из 10 выделенных включают концевые 5'-последовательности, находящиеся в пределах тех, которые были идентифицированы ранее. Было установлено, что другие четыре λ-клона представляют другие экзоны, которые входят в состав исходного производного из кДНК зонда, полученного с помощью случайного прайминга 400п. н. (данные здесь не показаны).Hybridization of the human genomic λ-library with a random priming probe corresponding to 400 pairs of nucleotides (bp) of the 5'-sequence of clone 14 led to the identification of 10 positive clones. Further characterization of these clones using a 45-dimensional oligonucleotide probe directed to the uppermost ΒΡΙ-sequence of clone 14 (and the corresponding 5′-top sequence 400 bp), this probe showed that 6 out of 10 isolated clones include terminal 5′- sequences within those that have been previously identified. It was found that the other four λ-clones represent other exons that are part of the original derivative of the cDNA probe obtained by random priming 400p. n (data not shown here).
Прямое секвенирование ДНК λ-фага из клонов, соответствующих 5'-концу ВВР1, представляет примерно 500 нуклеотидов, находящихся сверху и перекрывающихся с известным клоном 14. Эта дополнительная последовательность предположительно кодирует 62 аминокислоты, расположенные в Ν-сторону по отношению к ранее охарактеризованному метионину, выявленному до обнаружения МЕТ, предваряющего внутрирамочный стоп-кодон. Хотя по отношению в верхнему МЕТ имеются два других нижних остатка метионина, с помощью стандартных подходов заявители экспериментально определили последовательности Νконцевой части гена ВВР1 человека, как включающую первый из 5'-метиониновых кодонов, следующий за внутрирамочным стоп-кодоном. Полный кодирующий сегмент и расшифрованная аминокислотная последовательность показаны в 8ЕО ΙΌ N0 1 и 2. Плазмида (обозначенная как ΒΒΡ1-Π), включающая данную аминокислотную последовательность, была внесена в Американскую коллекцию типовых культур под депозитарным номером АТСС 98617.Direct sequencing of λ-phage DNA from clones corresponding to the 5′-end of BBB1 represents about 500 nucleotides located on top and overlapping with known clone 14. This additional sequence allegedly encodes 62 amino acids located in the Ν side with respect to the previously characterized methionine, identified before the detection of MET, preceding the intra-frame stop codon. Although there are two other lower methionine residues in relation to the upper MET, using standard approaches, the applicants experimentally determined the sequences of the “terminal part of the human BBB1 gene as including the first of the 5'-methionine codons following the intra-frame stop codon. The complete coding segment and the decoded amino acid sequence are shown in 8EO ΙΌ N0 1 and 2. A plasmid (designated ΒΒΡ1-Π) including this amino acid sequence was added to the American Type Culture Collection under Depository Number ATCC 98617.
Поскольку 5'-кодирующие последовательности происходили от геномной клонотеки, то существует вероятность того, что этот сегмент включает интроны. Эта вероятность была оценена с применением двух методов. Во-первых, прямая затравка, соответствующая сегменту 5'МЕТ, и обратная затравка, соответствующая участку, находящемуся в пределах клона 14, были использованы для амплификации последовательностей из состава кДНК головного мозга, равно как и геномной ДНК. Из обоих образцов были получены продукты идентичного размера: это указывает на отсутствие интронов в пределах данного участка и подтверждает связь верхней последовательности с исходной последовательностью. Во-вторых, последовательности кДНК были выделены в экспериментах на основе модифицированного метода 5'-ВАСЕ (см. раздел Материалы и методы), которые оказались идентичными тем, которые были выделены из геномного клона. Эти данные подтвердили точность установления верхних последовательностей (из источников как библио теки кДНК, так и геномной клонотеки) и отсутствие интронов в этом сегменте.Since the 5'-coding sequences originated from the genomic clonotheque, it is likely that this segment includes introns. This probability was estimated using two methods. First, the direct seed corresponding to the 5'MET segment and the reverse seed corresponding to the region within clone 14 were used to amplify the sequences of the brain cDNA, as well as genomic DNA. Products of identical size were obtained from both samples: this indicates the absence of introns within this region and confirms the relationship of the upper sequence with the original sequence. Secondly, cDNA sequences were isolated in experiments based on the modified 5'-BACE method (see Materials and Methods section), which turned out to be identical to those that were isolated from the genomic clone. These data confirmed the accuracy of the establishment of the upper sequences (from the sources of both the cDNA library and the genomic clon library) and the absence of introns in this segment.
Пример 3. Характеристика ВВР1.Example 3. Characteristics of WWR1.
Последовательности ВВР1 сравнивали с данными СеиВаик с применением программы локального сопоставления (ВБА8Т: Л115сйи1 е! а1., 1990). Были идентифицированы две геномные последовательности свободноживущей нематоды СаеиогйаЬбШк е1едаи8 и одна геномная последовательность дрозофилы Иго8орЫ1а те1аиодайег, а также большое количество экспрессирующихся маркеров геномов человека, мыши и других видов млекопитающих. Однако не было найдено полных последовательностей кДНК, равно как и каких-либо функциональных данных, связанных с геном. Белок ВВР1 и продукты трансляции представленных экспрессирующихся маркеров были сопоставлены, тестированы на наличие консервативных сегментов и оценены с применением программы Мо8Т (Та!и§оу е! а1., 1994), нацеленной на поиск специфичных белковых мотивов. Эти анализы показали наличие вероятного эволюционной связи с семейством С-связанных белковых рецепторов. Конкретно эти анализы показали, что ВВР1 включает два потенциальных трансмембранных домена, эквивалентных трансмембранным доменам 3 и 4, имеющимся в составе С-связанных белковых рецепторов. Расположенная между ними гидрофильная петля включает хорошо известный мотив, включающий три аминокислоты - аспарагиновая (Ό) или глутаминовая кислоты, далее аргинин (В) и затем ароматический остаток (Υ или Е) (обычно обозначаемый как последовательность ΌΒΥ), который консервативен у почти всех членов данного рецепторного семейства, и для него ранее было показано участие в молекулярном механизме опосредования активации С-белков (Асйагуа & Кагшк, 1996).The sequences of VVR1 were compared with SeiVaik data using a local matching program (VBA8T: L115syi1 e! A1., 1990). We identified two genomic sequences of the free-living nematode Saeogia bibcidae8 and one genomic sequence of the Drosophila Igoopor1a te1aodaieg, as well as a large number of expressed markers of the genomes of humans, mice, and other mammalian species. However, no complete cDNA sequences were found, nor were any functional data associated with the gene. The BBP1 protein and translation products of the expressed expressing markers were compared, tested for the presence of conserved segments and evaluated using the Mo8T program (Ta! And e! A1., 1994), aimed at searching for specific protein motifs. These analyzes showed a likely evolutionary link to the C-linked protein receptor family. Specifically, these analyzes showed that BBP1 includes two potential transmembrane domains equivalent to the transmembrane domains 3 and 4 present in C-linked protein receptors. The hydrophilic loop located between them includes a well-known motif that includes three amino acids - aspartic (Ό) or glutamic acid, then arginine (B) and then an aromatic residue (Υ or E) (usually denoted as sequence ΌΒΥ), which is conservative in almost all members this receptor family, and for it, participation in the molecular mechanism of mediating C-protein activation was previously shown (Asyagua & Kagshk, 1996).
Эти данные указывают на то, что белок ВВР1 представляет новый белок, потенциально включающий функциональный модуль, общий с членами суперсемейства С-связанных белковых рецепторов. Конкретно, считается, что белок ВВР1 сохраняет критическую последовательность ΌΒΡ между двумя его предполагаемыми доменами так, что он может быть потенциальным лигандом С-связанных белковых, участвующих в регуляции сигнального пути.These data indicate that the BBP1 protein is a new protein that potentially includes a functional module that is common with members of the superfamily of C-linked protein receptors. Specifically, it is believed that the BBB1 protein retains a critical sequence ΌΒΡ between its two putative domains so that it can be a potential ligand of C-linked proteins involved in the regulation of the signaling pathway.
Структурный анализ белка ВВР1 показал, что он включает структурный мотив, известный как активаторная последовательность Са-белка в составе родственных С-связанных белковых рецепторов. Дигибридные дрожжевые тесты, показывающие наличие взаимодействия ВВР1 с различными членами семейства С-связанных белковых рецепторов, проиллюстрированы на фиг. 3. Основываясь на структурных предсказаниях, белок ВВР1 определен как белок, дважды проникающий сквозь мембрану обоими своими концами в ком-партмент просвета. Но и другие ориентации этого белка полностью не могут быть отвергнуты. Описанные выше потенциальные межбелковые взаимодействия были исследованы в тестах Υ2Η. Два перекрывающихся сегмента последовательностей ВВР1, входящие в состав клона ВВР1Д1т, были амплифицированы и клонированы в состав Υ2Η-вектора рАСТ2 (экспрессирующие плазмиды рЕК216 и рЕК219 -табл. 2; и соответствующие белки ВВР1ΔN и ВВР1ДС - фиг. 4). Конструкция ДС утрачивает оба трансмембранных домена, а конструкция ДИ кодирует первый трансмембранный домен плюс предшествующие 52 аминокислоты. Эти слитые белки были тестированы на взаимодействие со слитыми белками ВАР, а полученные ответы сравнивали с такими ответами штаммов, экспрессирующих больший белок ВВР1Д1т. Полученные результаты подтверждают, что основной детерминант связывания с белком ВАР находится в пределах того сегмента белка ВВР1, который предположительно топологически сходен с сегментом ВАР в пределах предшественника АРР дикого типа.Structural analysis of the BBP1 protein showed that it includes a structural motif known as the activator sequence of the Ca protein in the composition of related C-linked protein receptors. Hybrid yeast tests showing the interaction of BBB1 with various members of the C-linked protein receptor family are illustrated in FIG. 3. Based on structural predictions, the BBP1 protein is defined as a protein that penetrates twice through the membrane at both ends of the membrane into the lumen component. But other orientations of this protein cannot be completely rejected. The potential protein interactions described above were investigated in the Υ2Η tests. Two overlapping segments of the BBB1 sequences included in the BBB1D1t clone were amplified and cloned into the А2Η vector pAST2 (expressing plasmids pK216 and pKK219-table 2; and the corresponding proteins BBB1ΔN and BBB1DS - Fig. 4). The DS construct loses both transmembrane domains, and the DI construct encodes the first transmembrane domain plus the previous 52 amino acids. These fusion proteins were tested for interaction with BAP fusion proteins, and the responses obtained were compared with those of strains expressing the larger BBB1D1t protein. The results confirm that the main determinant of binding to the BAP protein lies within the segment of the BBP1 protein, which is supposedly topologically similar to the segment of the BAP within the wild-type APP precursor.
Пример 4. Тканевое распределение экспрессии ВВР1 человека.Example 4. Tissue distribution of expression of human BBB1.
Экспрессия мРНК ВВР1 была исследована в качестве исходного этапа выявления активности данного гена и кодируемого им продукта. Основной транскрипт длиной 1250 нуклеотидов был найден во всех тканях (фиг. 5А). Отмечен высокий уровень экспрессии в сердце. Цельный головной мозг характеризовался средним уровнем экспрессии. Все образцы отдельных отделов головного мозга проявляли экспрессию ВВР1 (фиг. 5В). Интересно, что все лимбические участки характеризовались относительно большим количеством мРНК ВВР1. Имелись участки головного мозга, в которых исходно имеются агрегации ВАР и связанное с ними проявление нейротоксичности. Анализ авторентгенограмм гибридизации ίη б1и, полученные с использованием специфичного рибозонда ВВР1, показал, что в гиппокампе человека энторинальном отделе полушарий головного мозга мРНК ВВР1 экспрессирована в клетках от среднего до крупного размера по типу, согласующемуся с экспрессией в нейронах в противоположность глиальным клеткам (фиг. 6). Более того, мРНК ВВР1 виртуально экспрессирована во всех гиппокампных и энторинальных нейронах, поскольку не удалось выявить каких-либо реальных или ламинарных различий в интенсив33 ности гибридизационного сигнала. Интересно, что параметры экспрессии ВВР1 оказались в значительной степени сходными с параметрами, выявленными с использованием рибозонда, направленного на мРНК, кодирующую предшественник амилоидного белка - АРР (фиг. 6). В целом, мРНК ВВР1 была выявлена во всех тканях и всех тестированных сегментах головного мозга. Анализ ίη зки экспрессии мРНК ВВР1 также показал наличие высокого уровня экспрессии в сегменте гиппокампа.The expression of BBR1 mRNA was investigated as the initial step in detecting the activity of this gene and its encoded product. A basic transcript of 1250 nucleotides in length was found in all tissues (Fig. 5A). A high level of expression in the heart was noted. The whole brain was characterized by an average level of expression. All samples of individual parts of the brain showed expression of BBB1 (Fig. 5B). Interestingly, all limbic regions were characterized by a relatively large number of BBP1 mRNA. There were areas of the brain in which initially there were aggregations of BAP and the associated manifestation of neurotoxicity. An analysis of autologous X-ray diffraction patterns of ίη b1i obtained using a specific BBB1 ribosonde showed that, in the human hippocampus, the entorhinal part of the cerebral hemispheres, BBB1 mRNA was expressed in medium to large sized cells, consistent with expression in neurons as opposed to glial cells (Fig. 6 ) Moreover, BBB1 mRNA is virtually expressed in all hippocampal and entorhinal neurons, since it was not possible to identify any real or laminar differences in the intensity of the hybridization signal. Interestingly, the parameters of BBB1 expression turned out to be substantially similar to the parameters detected using a ribosonde directed to an mRNA encoding an amyloid protein precursor, APP (Fig. 6). In general, BBR1 mRNA was detected in all tissues and all tested segments of the brain. Analysis of the expression of BBP1 mRNA expression also showed the presence of a high level of expression in the hippocampus segment.
Пример 5. Распределение экспрессии ВВР1 в линиях клеток.Example 5. Distribution of expression of BBP1 in cell lines.
Экспрессия ВВР1 также была исследована в ряде клеточных линий, а также были взяты данные из бЬЕ8Т - коллекции экспрессирующихся маркеров, имеющейся в Национальном Центре биотехнологической информации. Методы полимеразной цепной реакции с ревертированием (ОТ-ПЦР) были применены для количественного анализа экспрессии мРНК ВВР1 в клеточных линиях, обычно используемых для экспрессии рекомбинантных белков, а также в ряде линий опухолевых клеток. Белок ВВР1 был обнаружен в клетках яичника китайского хомяка и клетках НЕК293 человека. Сигналы были обнаружена в линии эмбриональных стволовых клеток №ега-2 и нейробластомных линиях 1МК82 и 8Κ-Ν-8Η. Экспрессия ВВР1 была выявлена в линиях опухолевых клеток, происходящих из следующих тканей: толстая кишка (Сх-1, Со1о205, М1Р101, 8№948, СаСо, 8№620, Б8174Т), яичники (А27808, А2780ИИР), молочная железа (МСР-7, 8КВг-3, Т47-И, В7474), легкие (Ьх-1, А5439), меланома (Ьох, 8кте130), лейкоз (ΗΕ60, СЕМ), простата (БЖАР, Ии 145, РС-3). Во всех образцах была обнаружена экспрессия ВВР1 при использовании Нозернблоттинга с мРНК, выделенными из следующих линий опухолевых клеток: промиелоцитозный лейкоз (ΗΕ-60), карцинома (ИеБа 83), хронический миелогенный лейкоз (К-562), лимфобластоидный лейкоз (МОБТ-4), лимфома Беркитта (Кац), колоректальная аденокарцинома (8\У480), карцинома легких (А549) и меланома (С361).The expression of BBP1 was also investigated in a number of cell lines, and data were also taken from bBE8T, a collection of expressed markers available at the National Center for Biotechnological Information. Reverse polymerase chain reaction (RT-PCR) methods were used to quantify the expression of BBP1 mRNA in cell lines commonly used for expression of recombinant proteins, as well as in a number of tumor cell lines. The BBP1 protein was found in Chinese hamster ovary cells and human HEK293 cells. Signals were detected in the No. 2-embryonic stem cell line and the 1MK82 and 8Κ-Ν-8Η neuroblastoma lines. The expression of BBP1 was detected in the lines of tumor cells originating from the following tissues: colon (Cx-1, Co1o205, M1P101, 8 No. 948, CaCO, 8 No. 620, B8174T), ovaries (A27808, A2780IIIR), mammary gland (MCP- 7, 8KVg-3, T47-I, B7474), lungs (Lx-1, A5439), melanoma (Lox, 8kte130), leukemia (L60, CEM), prostate (BJAR, Ii 145, RS-3). All samples showed expression of BBP1 using Northern blotting with mRNA isolated from the following tumor cell lines: promyelocytic leukemia (ΗΕ-60), carcinoma (IeBa 83), chronic myelogenous leukemia (K-562), lymphoblastoid leukemia (MOBT-4) , Burkitt's lymphoma (Katz), colorectal adenocarcinoma (8 \ U480), lung carcinoma (A549) and melanoma (C361).
Пример 6. Избирательное взаимодействие ВВР1 с ВАР человека в противопоставлении ВАР грызуна.Example 6. Selective interaction of VVR1 with human VAR as opposed to rodent VAR.
В составе ВАР грызуна имеются три аминокислотные замены (С5К, Ρ10Υ и Κ13Η) по сравнению с последовательностью человека. Пептид грызуна проявляет сниженную нейротоксичность и отсутствие связывания с гомогенатами головного мозга человека (Маддю е1 а1, 1992). Таким образом представлялось интересным оценить связывание ВАР грызуна с белком ВВР1 в тест-системе Υ2Η. Последовательность ВАР человека в составе рЕК162 была изменена таким образом, чтобы кодировать пептид грызуна, с применением олигонуклеотиднаправленного мутагенеза с помощью ПЦР, описанном выше. Полученная в результате плазмида рЕК240 была идентична плазмиде, экспрессирующей слитый белок ВАР человека, использованной в настоящем изобретении, за исключением трех кодонов, продуцирующих три аминокислотные замены, соответствующие аминокислотной последовательности грызуна. Взаимодействия между слитым белком ВВР1 и слитыми белками ВАР человека и грызуна сопоставляли с помощью биотеста Υ2Η. Штаммы, экспрессирующие ВВР1 и ВАР грызуна, не проявляли способности ответу по интенсивности роста (фиг. 7). Эти данные подтверждают предположение о том, что ВВР1 может являться специфическим медиатором нейротоксического действия ВАР, а также указывает на механизм, объясняющий сниженную нейротоксичность ВАР грызуна. Важно также, что полученные данные демонстрируют высокую степень специфичности взаимодействия ВВР1/ВАР в тестах Υ2Η при том, что замены трех аминокислот были достаточны для полного нарушения такой связи (фиг. 7).In the rodent BAP, there are three amino acid substitutions (C5K, Υ10Υ and Κ13Η) compared to the human sequence. The rodent peptide exhibits reduced neurotoxicity and lack of binding to human brain homogenates (Maddu e1 a1, 1992). Thus, it was interesting to evaluate the binding of the rodent BAP to the BBP1 protein in the Υ2Η test system. The sequence of human BAP in pEK162 was changed to encode a rodent peptide using oligonucleotide directed mutagenesis using PCR described above. The resulting plasmid pEK240 was identical to the plasmid expressing the human BAP fusion protein used in the present invention, with the exception of three codons producing three amino acid substitutions corresponding to the rodent amino acid sequence. The interactions between the BBP1 fusion protein and the human and rodent BAP fusion proteins were compared using the Υ2Η biotest. Strains expressing rodent BBB1 and BAP did not show the ability to respond in terms of growth rate (Fig. 7). These data confirm the assumption that VVR1 may be a specific mediator of the neurotoxic effect of VAR, and also indicates a mechanism explaining the reduced neurotoxicity of VAR rodent. It is also important that the obtained data demonstrate a high degree of specificity of the BBB1 / BAP interaction in the Υ2Η tests, while the substitutions of three amino acids were sufficient to completely disrupt such a relationship (Fig. 7).
Ясно, что настоящее изобретение может быть применено на практике другими путями в сравнении с тем конкретными вариантами, которые имеются в представленных выше описаниях и примерах. Различные модификации и изменения настоящего изобретения являются возможными в свете представленных описаний и, соответственно, они попадают в масштаб прилагаемой формулы изобретения.It is clear that the present invention can be practiced in other ways in comparison with those specific options that are available in the above descriptions and examples. Various modifications and variations of the present invention are possible in light of the descriptions and, accordingly, they fall within the scope of the attached claims.
БиблиографияBibliography
Аскагуа, 8., апб Кагшк, 8. (1996). Моби1абоп оТ СИР ге1еазе Тгот Ргапзбисш Ьу Рке сопзегуеб С1и134-Агд 135 зедиепсе т гкоборзш. ί Бю1 Скет 271, 25406-25411.Askagua, 8., apb Kagshk, 8. (1996). Mobilabop OT SIRGease Tgot Rgapzbisch Lw Rke sopzegueb C1i134-Agd 135 zedepse t gkoborzsh. ί BU1 Sketch 271, 25406-25411.
А1Рзски1, 8., С1зк, М111ег, Муегз, Е., апб Ыртап, И. (1990). Вазк 1оса1 акдптепР зеагск Роо1. 1 Мо1 Вю1 215, 403-410.A1Rzski1, 8., C1zk, M111eg, Muegs, E., apb Irtap, I. (1990). Vazk 1osa1 Akdptepr Zeagsk Roo1. 1 Mo1 Vu1 215, 403-410.
Ска^Р^е^-Ηа^1^η, М., Сга\\Тогб, Р., ^^беп, Η., ХУаггеп, А., Ш^кез, И., Р1бат, Б., СоаРе, А., Коззог, М., Кодиез, Р., Ηа^бу, 1., апб Ми11ап, М. (1991). Еаг1у-опзеР Аккетег'з б1зеазе саизеб Ьу тиРаРюпз а! собоп 717 оТ 1ке 3-ату1о1б ргесигзог ргоРеш депе. №11иге 353, 844-846.Ska ^ P ^ e ^ -Ηa ^ 1 ^ η, M., Sga \\ Togb, R., ^^ bep, Η., XUaggep, A., Sh ^ kez, I., P1bat, B., CoaRe, A., Kozzog, M., Kodiez, R., Ηa ^ bu, 1., apb Mi11ap, M. (1991). EG1U-OPZER AKKETEG'S B1ZEAZE SAIZEB LU TIRARUPZ a! Sobop 717 oT 1ke 3-atu1o1b rgesigzog rgoResh depe. No. 11ige 353, 844-846.
ИиУап, 8., СЬеп, X., Ри, ί., СЬеп, М., Ζΐιιι, Η., Кокег, А., 81аРРегу, Т., Ζкао, Б., №даз1ита, М., Могзег, ί., М1дке11, А., №1\\то1к, Р., 81егп, И., апб 8скт1б1, А. (1996). КАСЕ апб атуЫб-в реркбе пеигоРохгаРу т Аккетег'з б1зеазе. №Риге 382, 685-691.IIUap, 8., Ciep, X., Ri, ί., Ciep, M., Ζΐιιι, Η., Kokeg, A., 81aRegu, T., Ζkao, B., No. daz1ita, M., Mogzeg, ί. , M1dke11, A., No. 1 \\ to1k, R., 81egp, I., apb 8skt1b1, A. (1996). KASE apb atyb-v rekba peigorogharu t Akketeg'z b1zease. No. Riga 382, 685-691.
Е1 Ккоигу, ί., Шсктап, 8., Ткотаз, С., Сао, Б., 811уегзРет, 8., апб Бо1ке, 1. (1996). 8сауепдег гесер1ог-теб!а1еб абкезюп оТ ткгодка Ро βату1о1б ПЬгбз. Мииге 382, 716-719.E1 Kkoigu, ί., Shsktap, 8., Tkotaz, S., Sao, B., 811, Open, 8., apb Bo1ke, 1. (1996). 8 Sauepdeg geser1og-teb! Miige 382, 716-719.
СоаРе, А., Ска^Р^е^-Ηа^1^η, М., Ми11ап, М.,CoaRe, A., Ska ^ P ^ e ^ -Ηa ^ 1 ^ η, M., Mi11ap, M.,
Вго^п, 1., Сга\\Тогб, Р., Р1баш, Б., СшТТга, Б.,Vgo ^ n, 1., Sg \\ Togb, R., P1bash, B., SshTTga, B.,
Шупез, А., 1гу1пд, Ν., 1атез, Б., МапР, К., №\\Роп, Р., Кооке, К., Кодиез, Р., Та1ЬоР, С., Репсак35Chupez, A., 1g1pd, Ν., 1athes, B., MapR, K., No. \\ Rop, R., Koke, K., Kodiez, R., Ta1ooR, S., Repsak35
Уапсе, М., Яокек, А., ^1Шаткоп, Я., Яокког, М., 0^еп, М., апб Нагбу, I. (1991).Wapse, M., Yaokek, A., ^ 1 Shatkop, Y., Yokokkog, M., 0 ^ ep, M., apb Nagbu, I. (1991).
8едгедабоп оГ а пиккепке ти!абоп ίη !йе ату1о1б ргесигког рго!ет депе ινίΟι ГатШа1 Α1ζйетег'к бйеаке. №11иге 349, 704-706.8Gedabop OG and pikkepke ti! Abop ίη! É ат 1 1 р р г иг иг иг! Ет ет ет ет деп деп е Г Г Г ат 1 1 б б б б б. No. 11ige 349, 704-706.
Непбпкк, Ь., уап Эицп, С., Сгак, Р., Сги!к, М., уап Нш, V., уап Нагккатр, Р., Магбп, к-к, НоГтап, А., апб уап Вгоескйоуеп, С. (1992). Ргекепбе бетепРа апб сегеЬга1 йаетоггйаде Нпкеб 1о а ти!абоп а! собоп 692 оГ 1Не 3-ату1о1б ргесигког рго!ет депе. №11 Сепе! 1, 218-221.Nepbpkk, b., Uap Eitzp, S., Sgak, R., Sg! K, M., uap Nsh, V., uap Nagkkatr, R., Magbp, kk, Nogtap, A., apb uap Vgoeskyouep, S. (1992). Rhekepbe Betepa apb seGeBa1 yayetoggyade Npkeb 1o a ti! Abop a! Sobop 692 oG 1He 3-atu1o1b prgesiggogo rgo! depe. No. 11 Sepe! 1, 218-221.
.ТасоЬкеп, к, 8ргиу!, М., Вго^п, А., 8айакгаЬибйе, 8., В1ите, А., Уйек, М., Миепке1, Н., апб 8оппепЬегд-Яетек, к (1994). Тйе ге1еаке оГ Акйетег'к бкеаке β ату1о1б рерПбе 1к гебисеб Ьу рйогЬо1 йеа!теп!. I Вю1 Сйет 269, 8376-8382..TasoKep, k, 8rgyu !, M., Vgo ^ n, A., 8aiakbaibie, 8., Bite, A., Uyek, M., Miepke1, N., apb 8oppebegd-Yaetek, k (1994). Thye ge1eake oG Akyeteg'k bkeake β atu1o1b rePb 1k hebiseb uy ryogo1 jea! Tep !. I Vu1 Set 269, 8376-8382.
.ТасоЬкеп, к Миепке1, Н, В1ите, А, апб Уйек, М (1991). А поуе1 креаек-кресбгс ЯNΑ ге1а!еб !о а11егпа(1уе1у крйсеб ату1о1б ргесигког рго!ет тЯNΑк. №игоЬю1 оГ Адтд 12, 575-583..TasoKep, to Miepke1, H, B1ite, A, apb Uyek, M (1991). And the poey1 kreak-kresbgs YANΑ ge1a! Eb! O a11egpa (1ue1u kreseb atu1o1b prgesiggogo rgo! Is tanank. №yugu1 oG Addd 12, 575-583.
Капд, Υ.-8., Капе, I., Кицап, I., 8!абе1, I., апб Т1ррег, Ό. (1990). ЕГГсс!к оГ ехргеккюп оГ таттайап Са апб йуЬпб таттайап-уеак! Са рго!етк оп !йе уеак! рйеготопе гекропке к1дпа1 йапкбисбоп ра!йгау. Мо1 Се11 Вю1 10, 25822590.Kapd, Υ.-8., Kape, I., Kitsap, I., 8! Abe1, I., apb T1reg, Ό. (1990). EGGss! To OG exrgekkup OG tattayap Sa apb yybpb tattayap-ueak! SARGO! ETC! ryegotope gekropke k1dpa1 yapkbisbop ra! ygau. Mo1 Ce11 Vue1 10, 25822590.
ЬаРег1а, Р., Т1пк1е, В., В1еЬепсй, С., Наибепксббб, С., апб 1ау, С. (1995). Тйе Акйетег'к А18 рерббе шбисек пеигобедепегабоп апб арорЮРс се11 беа!й ш !гапкдешс тйе. ΝιΡιιό Сепебск 9, 21-30.LaRegl, R., Tlpk1e, V., B1eLepsi, S., Naibepksbbb, S., apb 1au, S. (1995). Thye Akyeteg'k A18 rerbbe shbisek peigobedepegabop apb arorYURs se11 beaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa. ΝιΡιιό Sepebsk 9, 21-30.
Ьакктапп, Н., Вапсйег, С., ВгейксйорГ, Н., ^ед1е1, I., ВоЬткк1, М., .ТеШпдег, К., апб XV № те\укк! Н. (1995). Се11 беа!й ш Акйетег'к б1кеаке еуа1иа!еб Ьу ^NΑ ГгадтеШабоп т кйи. Ас!а №игора!йо1 89, 35-41. Ьеуу, Е., Сагтап, М., Регηаηбеζ-Маб^^б, I., Ро\уег М., ЫеЬегЬигд, I., уапОшпеп, 8., Во!к, С., Ьиуепбцк, V., апб Ргапдюпе,Lucktapp, N., Wapsjieg, S., VeyksjörG, N., ^ ed1e1, I., Wtkk1, M.,. TeShpdeg, K., app. XV No. te \ ukk! N. (1995). Se11 beaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa. Ace! And #igora! Yo1 89, 35-41. Leuu, E., Sagtap, M., Regηaηbeζ-Mab ^^ b, I., Po \ ye M., Lebeuigd, I., uapOspep, 8., Wo! K, S., Liuepbck, V., apb Rgapdupe ,
B. (1990). Ми!абоп оГ !йе Акйетег'к бйеаке ату1о1б депе ш йегебйагу сегеЬга1 йетоггйаде, Ои!сй !уре. 8с1епсе 248, 1124-1126.B. (1990). Mi! Abop oG! Ye Akyeteg'k bieake atu1o1b depe sh yegebyagu segebaetoggyade, Oi! Sy! Ur. 8c1epse 248, 1124-1126.
Ьоо, Ό., Сораш, А., Р1ке, С., ’№Ыбетоге, Е., XVа1еηсе\ν^сζ. А., апб Со!тап, С. (1993). Арор!обк 1к тбисеб Ьу (ЬатуЫб т сийигеб сеп!га1 пегуоик кук!ет пеигопк. Ргос ΝηΙΙ Асаб 8а И8А 90, 7951-7955.Loo, Ό., Sorash, A., P1ke, S., ’No. Ybetoge, E., XVa1еηсе \ ν ^ сζ. A., apb So! Tap, S. (1993). Aror! Obk 1k tbiseb bj (batuyb t siyigeb sep! Ha1 pegooik kuk! Yet peigopk. Prgos ΝηΙΙ Asab 8a I8A 90, 7951-7955.
Маддю, к, 8бткоп, Е., СЫ1агб1, к, Абеп,Maddu, k, 8btkop, E., SY1agb1, k, Abep,
C. , ОаЫ, С., ХУ^ПсотЬ, Ό., У1дпа, 8., Ут!егк, Н., ЬаЬепкк1, М., апб Мап!уй, Р. (1992). Яеуегк1Ь1е ш уйго дгоМй оГ Акйетег бйеаке Ь-ату1о1б р1ас.|иек Ьу беробРоп оГ 1аЬе1еб ату1о1б рер11бе. Ргос №б Асаб 8с И8А 89, 5462-5466. Ми11ап, М., СгаМогб, Р., Ахе1тап, К., Нои1беп, Н., Ьбтк, Ь., УтЬ1аб, V., апб ЬаппГеЙ, Ь. (1992). А ра!йодешс ти!абоп Гог ргоЬаЬ1е Акйетег'к б1кеаке т !йе №1егтбшк оГ К-ату1о1б. №11 Сепе! 1, 345-347.C., OaY, S., XU ^ Psot, Ό., U1dpa, 8., Ut! Ekk, N., Lebepkk1, M., apb Map! Uy, R. (1992). Yauegk1b1e uygo dGoMy oG Akyeteg bieake b-atu1o1b p1ac. | Iek berobrop oG 1ae1eb atu1o1b re11be. Proposal No. 6 Asab 8s I8A 89, 5462-5466. Mi11ap, M., SgMogb, R., Akhe1tap, K., No1bep, N., bbtk, b., Utlab, V., apb Lappge, b. (1992). And ra! Yodesht ty! Abop Gog rgoBa1e Akyeteg'k b1keake t! Ee №1egtbshk oG K-atu1o1b. No. 11 Sepe! 1, 345-347.
Мигге11, Ь, Работе, М., Сйе!б, В., апб Вепкоп, М. (1991). А ти!абоп ш !йе ату1о1б ргесигког рго!ет аккоаа!еб тейй йегебйагу Акйетег б1кеаке. 8аепсе 254, 97-99.Migge11, b, Work, M., Cie! B, V., apb Wepkop, M. (1991). But ty! Abop sh! Ye atu1o1b prgesigkogo rgo! Eh aktoa! Ebey yeebebyagu Akyeteg b1keake. 8aepse 254, 97-99.
№1кЫто!о, I., 0като!о, Т., Ма!киига, Υ., ТакайакЫ, 8., 0като!о, Т., Мигауата, Υ., апб 0да!а, Е. (1993). Акйетег ату1о1б ргсйет ргесигког сотр1ехек тейй Ьгат СТР-Ьтбтд рго!ет Со. №Ииге 362, 75-79. 0ζеηЬе^де^, В., апб Υоиηд, К. (1995). Рипсбопа1 йИегасбоп оГ бдапбк апб гесерЮгк оГ !йе йета!оро1ебс кирегГатйу т уеак! Мо1 Епбосппо1 9, 1321-1329.No. 1to! O, I., 0kato! O, T., Ma! Kiiga, Υ., Takayaki, 8., 0kato! O, T., Migauata, Υ., Apb 0da! A, E. (1993). Akyeteg atu1o1b rgsyet przigigogot sotrekheek tey Lgat STR-ttbtgo rgo! Co. No. Iige 362, 75-79. 0ζеηЬе ^ de ^, V., apb Υоіηд, К. (1995). RIPSBOPA 1 JIEGASBOP OG BDBPK APB GESERYUGK OG! YE YETA! ORO1EBS KIREGGATYU T UEAK! Mo1 Eppospo1 9, 1321-1329.
Яйобек К., Мопадйап М., Βа^^еζие!а Ν., №!\уокс1ик 8., Веке1е-Агсил Ζ., Ма!ок М., №акаййа К., 8сйесй!ег Ь, апб Тбттег I. (1996). Уо1!аде-да!еб К + сйаппе1 β киЬипйк: ехргеккюп апб бМпйиРоп оГ Ку β 1 апб Ку β 2 ш абий га! Ьгат I №еигока 16, 4846-4860.Yayobek K., Mopadyap M., Βа ^^ еζие! А Ν., No.! \ Уоксік 8., Веке1е-Агсил Ζ., Ма! Ok M., №akayya K., 8syesy! Heb, apb Tbtteg I. (1996). Wo1! Adea da! Eb K + syappe1 β kiBiipyk: exrgekkup apb bMpiyiopop og Ku β 1 apb Ku β 2 sh aby ga! Lgat I No. eigoka 16, 4846-4860.
8сйеипег, Ό., Есктап, С., .Тепкеп, М., 8опд, X., Сйгоп, М., 81.щикй Ν., Вйб, Т., Нагбу, I., Ни!!оп, М., Кики11, V., Ьагкоп, Е., Ьеуу-Еайаб, Е., Уй!апеп, М., Рекктб, Е., Роогкаф Р., 8сйе11епЬегд, С., Татр Я., Уаксо, V., ЬаппГеЙ, Ь, 8е1кое, Ό., апб Υоиηк^η. 8. (1996). Αβ42 (43) 1к тсгеакеб т у1уо Ьу !йе Р81/2 апб АРР ти!а!юпк йпкеб !о Гатб1а1 Акйетег'к бйеаке. №а! Меб 2, 864-870.8seyepeg, Ό., Esktap, S., .Tepkep, M., 8opd, X., Sygop, M., 81.shchik Ν., Vyb, T., Nagbu, I., Ni !! op, M., Kiki11, V., Lagkop, E., Leuu-Ejab, E., Uy! Apep, M., Rekktb, E., Roogkaf R., 8sey11epbegd, S., Tatr Y., Waxo, V., Lappge, L , 8e1koe, Ό., Apb Υoiηk ^ η. 8. (1996). Αβ42 (43) 1k tsgeakeb t u1uo bу! Е Р81 / 2 apb APP ti! A! Yupk ypkeb! O Gatb1a1 Akyeteg'k bieake. No! Meb 2, 864-870.
8е1кое, Ό. (1997). Акйетег'к Эйеаке: Сепо!урек, рйепо!уре, апб !геа!теп!к. 8аепсе 275, 630-631.8e1koe, Ό. (1997). Akyeteg'k Eeyake: Sepo! Urek, riyepo! Ure, apb! Gea! Tep! K. 8aepse 275, 630-631.
8та1е, С., №1сйо1к, Ν., Вгабу, Ό., Ртсй, С., апб Я, V. Н. (1995). Еу1бепсе Гог арор!обс се11 беа!й ш Акйетег'к бйеаке. Ехр №ιιιό1 133, 225230.8a1e, S., No. 1syo1k, Ν., Vgabu, Ό., Rtsy, S., apb Ya, V. N. (1995). Eu1bepse Gog aror! Obs se11 bea! Y sh Akyeteg'k bieake. Exp No.ιιιιό1 133, 225230.
Татй Я., Сике11а, I., Vа!к^ηκ, Р., Вгипк, С., Сеогде-Нук1ор, Р. 8., уапКеигеп, М., Ра!!егкоп, Ό., Радап, 8., Кигпй, Ό., апб №уе, Я. (1987). Ату1о1б β рго!ет депе: с^NΑ, тЯNΑ б1к!лЬи!юп апб депебс бпкаде пеаг !йе Акйетег 1осик. 8аепсе 235, 880-884.Taty Ya., Sike11a, I., Va! K ^ ηκ, R., Vgipk, S., Seogde-Nuk1or, R. 8., uapKeigep, M., Ra !! ekkop, Ό., Radap, 8., Kigpy, Ό., Apb No.ue, Ya. (1987). Atu1o1b β го ет! С е т т:: с с с ^ ^ Α Α т т!!!!!!! П ап ап ап ка ка ка аг аг аг ик ик ик ик ик. 8aepse 235, 880-884.
Та!икоу, Я., А1!ксйи1, 8., апб Коошп, Е. (1994). ЭеЮсРоп оГ сопкегуеб кедтеп!к ш рго!етк: ИегаРуе ксапптд оГ кериепсе ба!аЬакек тейй абдптеп! Ь1оскк. Ргос ΝηΙΙ Асаб 8а И8А 91, 12091-12095.Ta! Tikou, Y., A1! Ksyy1, 8., apb Kooshp, E. (1994). EeyusRop og sopkegueb kedtep! To shgo! Etk: Jeharue ksapptd og kerepse ba! Aakek tey abdptep! B1skk. Rgos ΝηΙΙ Asab 8a I8A 91, 12091-12095.
Vабе Нагрег, I., Абатц С. Я., Vе^, Ν., Кеуотагкр К., апб Е11ебде, 8. I. (1993). Тйе р21 Сбк-т!егасбпд рго!ет С1р1 1к а ро!еп! шЫЬйог оГ С1 сусбп-берепбеп! ктакек. Се11 75, 805-816.Vabe Nagreg, I., Abatz S. Ya., Vе ^, Ν., Keuotagkr K., apb E11ebde, 8. I. (1993). Tie p21 Sbk-t! Egasbpd rgo! E C1p1 1k and ro! Ep! SHYYOG OG C1 SUSBP-BEREPBEP! ktakek. Ce11 75, 805-816.
Vа!!, к, Р1ке, С., Vа1еηсеΉсζ-Vаκκе^таη,Va !!, k, P1ke, S., Va1еηсеΉсζ-Vаκκе ^ таη,
А., апб Со!тап, С. (1994). и1!гак!гис!ига1 апа1убк оГ β-ату1о^б-^ηбисеб арорЮбк ш си1!игеб Ырросатра1 пеигопк. Вгат Яек 661, 147-156.A., apb So! Tap, S. (1994). u1! hak! gis! yig1 apa1ubk oG β-atu1o ^ b- ^ η biseb arorubisk w si1! igeb Irrosatra1 peigopk. Vgat Yayek 661, 147-156.
Υата!ки^^, Т., Ма!кш, Т., 0като!о, Т., Кота!ктак1, К., Такеба, 8., Рикито!о, Н., 1^а!киЬо, Т., 8υζυΚί, Ν.. Акат1-0бака, А., 1ге1апб, 8., Ктапе, Т., С1атЬаге11а, и., апб МкЫтоШ, I. (1996). С рго!ет-теб1а!еб пеигопа1 ^NΑ Ггадтеп!абоп тбисеб Ьу Гатй1а1 Акйетег'к ЭйеакеЬтбтд ти!ап!к оГ АРР. 8аепсе 272, 1349-1352.Kata! Ki ^^, T., Ma! Ksh, T., 0kato! O, T., Kota! Ktak1, K., Takeba, 8., Rikito! O, N., 1 ^ a! Kyo, T. , 8υζυΚί, Ν .. Akat1-0 tank, A., 1ge1apb, 8., Ktape, T., C1atbage11a, i., Apb MkYtosh, I. (1996). With rgo! Et-teb1a! Eb peigopa1 ^ NΑ Ggadtep! Abop tbiseb Lu Gaty1a1 Akyeteg'k Eyeeaketbtd ti! Ap! To OG ARR. 8aepse 272, 1349-1352.
Уап, 8., Ей, I., 8о!о, С., Сйеп, X., ΖΕιγ Н.,Wap, 8., Her, I., 8 °! O, S., Syep, X., ΖΕιγ N.,
АЬМойаппа, Р., Со1бкоп, К., ΖΕιγ А., 8!егп, Е.,ABMoyappa, R., Sölbkop, K., ΖΕιγ A., 8! Epp, E.,
8а1бо, Т., Тойуата, М., 0да^а, 8., Яойег, А., апб8a1bo, T., Toyuata, M., 0da ^ a, 8., Yaoyeg, A., apb
8!егп, Ό. (1997). Ап т!гасе11и1аг рго!ет !йа! Ьтбк ату^б^ рерббе апб теб1а!ек пеиго!охюйу т8! Ehp, Ό. (1997). Ap t! Gase11i1ag rgo! Et! Ya! Т ат ату атуууууууу ре рррррр ап ап ап ап ап ап ап ап ап ап ап ап !екекекек
Акйетег'к бйеаке. ΝρΙιιιό 389, 689-695.Akyeteg'k bjake. ΝρΙιιιό 389, 689-695.
Список последовательностей (1) ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ (ί) ЗАЯВИТЕЛЬ: ОгепЬегдег Вгас1 А.List of Sequences (1) GENERAL INFORMATION (ί) APPLICANT: Ogepegdeg Vgas1 A.
басоЬзеп Д.5.Bassop D.5.
КадкоызкЬ ЕНееп.Kadkozyk ENEEP.
(ϋ) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: Белки, связывающиеся с βамилоидным пептидом, и кодирующие их полинуклеотиды (ϋί) КОЛИЧЕСТВО ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ: 2 (ίν} АДРЕС ДЛЯ КОРРЕСПОНДЕНЦИИ:(ϋ) TITLE OF THE INVENTION: Proteins binding to a β-amyloid peptide and polynucleotides encoding them (ϋί) NUMBER OF SEQUENCE: 2 (ίν} CORRESPONDENCE ADDRESS:
(A) АДРЕСАТ: Атегхсап Ноте РгойисЬз (B) УЛИЦА: Опе Сатриз Οτίνθ (C) ГОРОД: Рагзграппу (ϋ) ШТАТ: N6 (Е) СТРАНА: Соединенные Штаты Америки (Г) ПОЧТОВЫЙ ИНДЕКС: 07054 (V) ФОРМА, ПРИГОДНАЯ ДЛЯ КОМПЬЮТЕРА (A) ТИП НОСИТЕЛЯ: дискета (B) КОМПЬЮТЕР: 1ВМ-Совместимый (C) ОПЕРАЦИОННАЯ СИСТЕМА: РС-005/М5-005 (О) ПРОГРАММА: РасепЫп Ве1еазе 1.0, νετδ. 1.30 (νί) ТЕКУЩИЕ ПАРАМЕТРЫ ЗАЯВКИ (A) НОМЕР ЗАЯВКИ: 03 (B) ДАТА ПОДАЧИ:(A) ADDRESS: Ateghsap Note Rhois (B) STREET: Opera Satriz Οτίνθ (C) CITY: Ragzgrappu (ϋ) STATE: N6 (E) COUNTRY: United States of America (D) Zip Code: 07054 (V) FORM, PRIGE COMPUTER (A) MEDIA TYPE: floppy disk (B) COMPUTER: 1VM-Compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-005 / M5-005 (O) PROGRAM: Razepyp Be1ease 1.0, νετδ. 1.30 (νί) CURRENT APPLICATION PARAMETERS (A) APPLICATION NUMBER: 03 (B) DELIVERY DATE:
(C) КЛАССИФИКАЦИЯ:(C) CLASSIFICATION:
(νϋί) ИНФОРМАЦИЯ О ПАТЕНТНОМ ПОВЕРЕННОМ:(νϋί) PATENT ATTORNEY INFORMATION:
(A) ИМЯ: Иа1зЬ АпЗгеа С.(A) NAME: SALES APZGEA S.
(B) НОМЕР РЕГИСТРАЦИИ: 34988 (C) РЕЕСТРОВЫЙ НОМЕР: Э8126 (ίχ) ТЕЛЕКОММУНИКАЦИОННАЯ ИНФОРМАЦИЯ:(B) REGISTRATION NUMBER: 34988 (C) REGISTRATION NUMBER: E8126 (ίχ) TELECOMMUNICATION INFORMATION:
(A) ТЕЛЕФОН: (1-973) 683-2169 (B) ФАКС: (1-973) 683-4117 (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ ЗЕО Ю ΝΟ 1 (ί) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА: .810 нуклеотидов (B) ТИП: нуклеиновая кислота (C) ЧИСЛО НИТЕЙ: одноцепочечная (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная (ϋ) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: мРНК (ίχ) СВОЙСТВА:(A) PHONE: (1-973) 683-2169 (B) FAX: (1-973) 683-4117 (2) INFORMATION FOR Zeo Yu О 1 (ί) CHARACTERISTIC OF THE SEQUENCE (A) LENGTH: .810 nucleotides (B ) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF THREADS: single-stranded (ϋ) TOPOLOGY: linear (ϋ) MOLECULAR TYPE: mRNA (ίχ) PROPERTIES:
(А) ИМЯ/КЛЮЧ: сегмент ' (В) ЛОКАЛИЗАЦИЯ: 1...807 (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО Ιϋ ΝΟ I(A) NAME / KEY: segment '(B) LOCALIZATION: 1 ... 807 (χί) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: ZEO Ιϋ ΝΟ I
АТС САТ АТТ ТТА ААА ССС ТСТ ССС ААТ СТС АТТ ССА ССС ССТ САС ССС48ATS SAT ATT TTA AAA SSS TST SSS AAT STS ATT SSS SSS SST SAS SSS48
МеЬ Нхз Не Ьеи Ьуз С1у Зег Рго Азп Уа1 11е Рго Агд АХа Нхз С1у 15 1015Me Nhz Not Ly Yuz S1y Zeg Rgo Azp Wa1 11e Rgo Agd Akha Nkhz C1u 15 1015
САС ААС ААС АСС ССА АСА САС ССА АСТ ССС СТС ТАТ ССТ АТС ССА ССТ96SAS AAS AAS ACC SSA ASA SAS SSA AST SSS STS TAT SST ATS SSS SST96
С1п Ьуз Азп ТЬг Агд Ахд Азр С1у ТЬг С1у Ьеи Туг Рго Мес АгдС1уС1п Luz Azp Thg Agd Ahd Azr C1y Thg C1u Ley Tug Rgo Mes AgdS1u
25302530
ССС ТТТ ААС ААС СТС ССС СТС ТТС ССС ТТС ТСС СТС ССС СТС СТС ССС144SSS TTT AAS AAS STS SSS STS TTS SSS TTS TSS STS SSS STS STS SSS144
Рго РЬе Ьуз Азп Ьеи А1а Ьеи Ьеи Рго РЬе Зег Ьеи Рго Ьеи ЬеиСХуRgo Rye Luz Azp Ley A1a Lye Ley Rgo Rye Zeg Ley Rgo Lye Leyshu
40454045
ССА ССС ОСА АСС ОСА АСТ ССС САС ААА СТС ТСС СТС ТСС ААС АТС ССС192CCA CCC OSA ACC OSA AST CCC CAC AAA STS CCC CCC CCC AAC CCC192
С1у С1у С1у Зег СХу Зег С1у О1и Ьуз УаХ Зег УаХ Зег Ьуз МеЬА1аС1у С1у С1у Зег СХу Зег С1у О1и Luz Wah Zeg Wah Xeg Zuz MebA1a
55 .6055 .60
ССС ССС ТСС ССС ТСТ ССТ ССС ТСТ ССТ ССС САС ССС СТС АСС ССС АСА240SSS SSS TSS SSS TST SST SSS TST SST SSS SAS SSS STS SSS SSS ASA240
А1а А1а Тгр Рго Зег СХу Рго Зег АХа Рго СХи А1а УаХ ТЬг АХаАгдA1a A1a Tgr Rgo Zeg SXu Rgo Zeg AXa Rgo SXi A1a UaX Thg AXaAgd
- 70 7580- 70 7580
СТС СТТ ССТ СТС СТС ТСС ТТС СТС ТСА СТС АСТ АСА ОСА ССС ТСС ССС268STS STT SST STS STS TSS TTS STS TSA STS AST ASA OSA SSS TSS SSS268
Ьеи Уа1 СХу Уа1 Ьеи Тгр РЬе Уа1 Зег Уа1 ТЬг ТЬг СХу Рго ТгрС1у ' 85 9095Ley Va1 Cxv Va1 Ley Tgr Rb Va1 Zeg Va1 Thr Thr Cxu Rgo TgrS1u '85 9095
ССТ СТТ ССС АСС ТСС ССС ССС ССС САС САС ТСС СТТ ААС ТСС САС САС336SST STT SSS SSS SSS SSS SSS SSS SSS SAS SAS SSS SST SAS SSS SAS SAS SAS336
А1а Уа1 А1а ТЬг Зег А1а С1у С1у С1и С1и Зег Ьеи Ьуз Суз С1иАзрA1a Va1 A1a Tg Zeg A1a C1u C1u C1u C1i Zeg Ley Zuz Suz C1iAzr
100 105110100 105 110
СТС ААА СТС ССА САА ТАТ АТТ ТОТ ААА САТ ССА ААА АТА ААТ САС ССТ384STS AAA STS SSA SAA TAT ATT TOT AAA SAT SSA AAA ATA AAT SAS SST384
Ьеи Ьуз Уа1 С1у С1п Туг Не Суз Ьуз Азр Рго Ьуз Не Азп АзрА1аLey Luz Va1 S1y S1n Tug Not Suz Luz Azr Rgo Luz Ne Azp AzrA1a
115 120125115 120 125
АСС САА САА ССА СТТ ААС ТСТ АСА ААС ТАС АСА ССТ САТ СТТ ТСС ТСТ432ACC SAA CAA SSA STT AAS TST ASA AAS TAS ASA SST SAT STT TSS TST432
ТЬг С1п С1и Рго Уа1 Азп Суз ТЬг Азп Туг ТЬг А1а Нхз Уа1 зегСузTyr C1l C1i Rgo Va1 Azp Suz Tyr Azp Tug Tig A1a Nhz Wa1 zegSuz
130 135140130 135140
ТТТ ССА ОСА ССС ААС АТА АСТ ТОТ ААС САТ ТСС АСТ ССС ААТ САА АСА480TTT SSA OSA SSS AAS ATA AST TOT AAS SAT TSS AST SSS AAT SAA ASA480
РЬе Рго А1а Рго Азп Не ТЬг Суз Ьуз Азр Зег Зег С1у Азп С1иТЬгРее Рgo А1а Рго Азп Not Тг Суз ьз Азр Зег Зег С1у Азп С1иТг
145 150 155160145 150 155160
САТ ТТТ АСТ ОСО ААС САА ОТТ СОТ ТТТ ТТС ААО ССС АТА ТСТ ТСС ССА528SAT TTT AST OCO AAS CAA OTT SOT TTT TTS AAO SSS ATA TST TSS SSA528
Нхз РЬе ТЬг О1у Азп С1и Уа1 С1у РЬе РЬе Ьуз Рго Не Зег СузАгд . 165 170175Nhz Pb Thb O1y Azp C1i Ya1 C1u Pbb Pbb Rg Ne Zeg SuzAgd. 165 170175
ААТ СТА ААТ СОС ТАТ ТСС ТАС ААА-СТС ОСА СТС ССА ТТС ТСТ СТТ ТТТ576AAT STA AAT SOS TAT TSS TAS AAA-STS OSA STS SSA TTS TST STT TTT576
Азп ν»1 Азп С1у Туг Бег Туг Ьуз Уа1 А1а Уа1 А1а Ьеи Зег ЬеиРЬеAzp ν »1 Azp C1u Tug Run Tug bz Va1 A1a Va1 A1a Lye Zeg Leyer
180 ' 185190180 '185190
СТТ ССА ТСС ТТС йОА ССА САТ ССА ТТТ ТАС СТТ ССА ТАС ССТ ОСТ ТТС624STT SSA TSS TTS yOA SSA SAT SSA TTT TAS STT SSA TAS SST OST TTS624
Ьеи С1у Тгр Ьеи О1у А1а Азр Агд РЬе Туг Ьеи С1у Туг Рго А1аЬеиLei C1u Tgr Lei O1u A1a Azr Agd Rye Tug Lei C1u Tug Rgo A1aie
195 200205195 200205
ОСТ ТТС ТТА ААС ТТТ ТСС АСТ СТА ССС ТТТ ТСТ ССА АТТ ОСС АСС СТА672OST TTS TTA AAS TTT TSS AST STA SSS TTT TST SSA ATT OSS ASS STA672
С1у Ьеи Ьеи Ьуз РЬе Суз ТЬг Уа1 С1у РЬе Суз С1у 11е С1у ЗегЬеиС1у Ьеи ёи ЛУ РЬе Суз Тьг Уа1 С1у Рее Суз С1у 11е С1у ЗегЬей
210 215220210 215220
АТТ САТ ТТС АТТ СТТ АТТ ТСА АТС САС АТТ СТТ ССА ССТ ТСА САТ СОА720ATT SAT TTS ATT STT ATT TSA ATS SAS ATT STT SSA SST TSA SAT SOA720
Не Азр РЬе Не Ьеи Не Зег МеЬ СХп 11е Уа1 СХу Рго Зег АзрО1уNot Azr Pye Not Nei Not Zeg MeB SHn 11e Wa1 SHu Rgo Zeg AzrO1u
225 230 235240225 230 235240
АОТ АОТ ТАС АТТ АТА САТ ТАС ТАТ ОСА АСС АСА СТТ АСА АСА СТО АСТ768AOT AOT TAS ATT ATA SAT TAS TAT OSA ACC ASA STT ASA ASA STO AST768
Зег Зег Туг 1Хе 11е Азр Туг Тут СХу ТЬг Агд Ьеи ТЬг Агд ЬеиЗегZeg Zeg Tug 1He 11e Azr Tug Tut SHU Thg Agd Ley Thg Agd Ley Zeg
245 250255245 250255
АТТ АСТ ААТ ОАА АСА ТТТ АСА ААА АСС САА ТТА ТАТ ССА ТАА810ATT AST AAT OAA ASA TTT ASA AAAA ACC SAA TTA TAT CCA TAA810
Не ТЬг Азп С1и ТЬг РЬе Агд Ьуз ТЬг С1п Ьеи Туг РгоNot Thr Azp Cl and Thr Rye Agd Luz Thl Cln Ley Thug Pr
260 '265 (2) ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 8Е<2 Ιϋ ΝΟ 2 (ί) ХАРАКТЕРИСТИКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ (A) ДЛИНА: 269 аминокислот (B) ТИП: аминокислота (ϋ) ТОПОЛОГИЯ: линейная .260 '265 (2) INFORMATION FOR 8E <2 Ιϋ ΝΟ 2 (ί) SEQUENCE CHARACTERISTIC (A) LENGTH: 269 amino acids (B) TYPE: amino acid (ϋ) TOPOLOGY: linear.
(ίί) МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ТИП: белок (χί) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 8Е<2 ГО ΝΟ 2(ίί) MOLECULAR TYPE: protein (χί) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: 8E <2 GO ΝΟ 2
Ьеи <31у Тгр Ьеи О1у А1а Азр Агд РЬе Туг Ьеи С1у Туг Рго А1а Ьеи 195 200205Lei <31u Tgr Lei O1u A1a Azr Agd Rye Tug Lei C1u Tug Rgo A1a Lei 195 200205
С1у Ьеи Ьеи Ьув РЬе Суз ТЬг Уа1 С1у РЬе Суз С1у Не 61у Зег Ьеи 210 215220С1у Ьеи ёи ЛУВ Ре Суз Тьг Уа1 С1у Рее Суз С1у Не 61у Зег бей 210 215220
11е Азр РЬе 11е Ьеи 11е Зег МеС С1п Не Уа1 (31у Рго Зег АзрС1у11th Azr Rye 11e Lei 11th Zeg MeC C1n Ne Wa1 (31u Rgo Zeg AzrS1u
225 230 235240225 230 235240
Зег Зег Туг Не Не Азр Туг Тух* С1у ТЬг Агд Ьеи ТЬг Агд ЬеиЗегZeg Zeg Tug Not Not Azr Tug Tukh * C1u Tgr Agd Ley Thg Agd Leyzeg
245 250255245 250255
11е ТЬг Азп О1и ТНг РЬе Агд Ьуз ТЬг С1п Ьеи Туг Рго11th Trg Azp O1 and Thn Pye Agd bz Thb C1n bie Tug Rgo
260265260265
Claims (21)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US6458397P | 1997-04-16 | 1997-04-16 | |
PCT/US1998/007462 WO1998046636A2 (en) | 1997-04-16 | 1998-04-14 | β-AMYLOID PEPTIDE-BINDING PROTEINS AND POLYNUCLEOTIDES ENCODING THE SAME |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA199900941A1 EA199900941A1 (en) | 2000-06-26 |
EA004256B1 true EA004256B1 (en) | 2004-02-26 |
Family
ID=22056941
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
EA199900941A EA004256B1 (en) | 1997-04-16 | 1998-04-14 | beta-AMINOLOID PEPTIDE BINDING PROTEIN, POLYNUCLEOTIDE ENCODING THEREOF AND METHODS FOR USING THE SAME |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0975753A2 (en) |
JP (3) | JP2001523093A (en) |
KR (1) | KR20010006393A (en) |
CN (2) | CN1690203A (en) |
AU (1) | AU740445B2 (en) |
BR (1) | BR9808562A (en) |
CA (1) | CA2286484A1 (en) |
EA (1) | EA004256B1 (en) |
EE (1) | EE9900482A (en) |
GE (1) | GEP20043386B (en) |
HU (1) | HUP0003116A3 (en) |
ID (1) | ID24914A (en) |
IL (3) | IL132236A0 (en) |
NO (1) | NO995062L (en) |
NZ (1) | NZ500216A (en) |
SK (1) | SK143299A3 (en) |
UA (1) | UA72875C2 (en) |
WO (1) | WO1998046636A2 (en) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7005295B1 (en) | 1997-04-16 | 2006-02-28 | Wyeth | β-amyloid peptide-binding proteins and polynucleotides encoding the same |
US6787319B2 (en) * | 1997-04-16 | 2004-09-07 | American Home Products Corp. | β-amyloid peptide-binding proteins and polynucleotides encoding the same |
NZ510997A (en) * | 1998-10-13 | 2004-01-30 | Wyeth Corp | G-protein-coupled receptor-like proteins, polynucleotides encoded by them, and methods of using same |
US6455082B1 (en) * | 1999-04-26 | 2002-09-24 | Nestec S.A. | Shelf-stable calcium fortified milk and dairy products |
WO2001029225A1 (en) * | 1999-10-21 | 2001-04-26 | Panorama Research, Inc. | A general method for optimizing the expression of heterologous proteins |
US8663650B2 (en) | 2003-02-21 | 2014-03-04 | Ac Immune Sa | Methods and compositions comprising supramolecular constructs |
US7807171B2 (en) | 2003-07-25 | 2010-10-05 | Ac Immune Sa | Therapeutic vaccine targeted against P-glycoprotein 170 for inhibiting multidrug resistance in the treatment of cancers |
WO2012020124A1 (en) | 2010-08-12 | 2012-02-16 | Ac Immune S.A. | Vaccine engineering |
KR101854943B1 (en) | 2010-10-26 | 2018-05-04 | 에이씨 이뮨 에스.에이. | Liposome-based construct comprising a peptide modified through hydrophobic moieties |
CN102060912B (en) * | 2010-11-22 | 2012-11-14 | 清华大学 | Amyloid protein oligomer conformation type epitope polypeptide and application thereof |
CN111320678B (en) * | 2020-03-09 | 2023-06-09 | 安亭生物有限责任公司 | Antibacterial peptide mutant and application thereof |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0274826B1 (en) * | 1986-11-17 | 1998-08-12 | Scios Inc. | Recombinant Alzheimer's amyloid protein |
IL115743A0 (en) * | 1994-10-28 | 1996-01-19 | American Nat Red Cross | A mammal with cells containing a transgene and its production |
US5786180A (en) * | 1995-02-14 | 1998-07-28 | Bayer Corporation | Monoclonal antibody 369.2B specific for β A4 peptide |
-
1998
- 1998-04-14 AU AU71156/98A patent/AU740445B2/en not_active Ceased
- 1998-04-14 GE GE3744A patent/GEP20043386B/en unknown
- 1998-04-14 CN CNA200510052975XA patent/CN1690203A/en active Pending
- 1998-04-14 NZ NZ500216A patent/NZ500216A/en unknown
- 1998-04-14 BR BR9808562-0A patent/BR9808562A/en not_active Application Discontinuation
- 1998-04-14 EA EA199900941A patent/EA004256B1/en not_active IP Right Cessation
- 1998-04-14 HU HU0003116A patent/HUP0003116A3/en unknown
- 1998-04-14 ID IDW991187D patent/ID24914A/en unknown
- 1998-04-14 CN CNB988043173A patent/CN1196785C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-04-14 KR KR1019997009480A patent/KR20010006393A/en not_active Application Discontinuation
- 1998-04-14 CA CA002286484A patent/CA2286484A1/en not_active Abandoned
- 1998-04-14 UA UA99116193A patent/UA72875C2/en unknown
- 1998-04-14 SK SK1432-99A patent/SK143299A3/en unknown
- 1998-04-14 WO PCT/US1998/007462 patent/WO1998046636A2/en active Application Filing
- 1998-04-14 IL IL13223698A patent/IL132236A0/en active IP Right Grant
- 1998-04-14 EE EEP199900482A patent/EE9900482A/xx unknown
- 1998-04-14 EP EP98918186A patent/EP0975753A2/en not_active Withdrawn
- 1998-04-14 JP JP54419698A patent/JP2001523093A/en active Pending
-
1999
- 1999-10-06 IL IL132236A patent/IL132236A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-10-15 NO NO995062A patent/NO995062L/en not_active Application Discontinuation
-
2006
- 2006-11-05 IL IL179047A patent/IL179047A0/en unknown
-
2007
- 2007-12-28 JP JP2007339660A patent/JP2008104465A/en active Pending
-
2008
- 2008-06-18 JP JP2008159606A patent/JP2008253275A/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1196785C (en) | 2005-04-13 |
JP2001523093A (en) | 2001-11-20 |
AU7115698A (en) | 1998-11-11 |
BR9808562A (en) | 2000-05-23 |
JP2008104465A (en) | 2008-05-08 |
SK143299A3 (en) | 2000-09-12 |
JP2008253275A (en) | 2008-10-23 |
KR20010006393A (en) | 2001-01-26 |
EE9900482A (en) | 2000-06-15 |
ID24914A (en) | 2000-08-31 |
HUP0003116A2 (en) | 2001-01-29 |
IL132236A (en) | 2007-03-08 |
CA2286484A1 (en) | 1998-10-22 |
CN1690203A (en) | 2005-11-02 |
EP0975753A2 (en) | 2000-02-02 |
HUP0003116A3 (en) | 2003-03-28 |
UA72875C2 (en) | 2005-05-16 |
AU740445B2 (en) | 2001-11-01 |
NO995062L (en) | 1999-12-14 |
EA199900941A1 (en) | 2000-06-26 |
NZ500216A (en) | 2001-06-29 |
IL179047A0 (en) | 2007-03-08 |
WO1998046636A3 (en) | 1999-01-28 |
CN1268973A (en) | 2000-10-04 |
GEP20043386B (en) | 2004-02-10 |
WO1998046636A2 (en) | 1998-10-22 |
NO995062D0 (en) | 1999-10-15 |
IL132236A0 (en) | 2001-03-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5562640B2 (en) | Gene deletion and mutation ALK kinase in human solid tumors | |
KR100499600B1 (en) | Methods and Compositions for Inhibiting Neoplastic Cell Growth | |
JP4260778B2 (en) | Compositions and methods for the treatment of tumors | |
AU2003200722B2 (en) | Compositions and methods for the treatment of tumor | |
JP6144247B2 (en) | Translocation and mutant ROS kinase in human non-small cell lung cancer | |
EP1220905A2 (en) | Composition and methods for the treatment of immune related diseases | |
JP2002518010A (en) | 94 human secreted proteins | |
WO2004110345A2 (en) | Differentially expressed genes involved in cancer, the polypeptides encoded thereby, and methods of using the same | |
JP2002533058A (en) | 97 human secreted proteins | |
CA2378182C (en) | Compositions and methods for the treatment of tumors | |
JP2002506627A (en) | 95 human secreted proteins | |
EA004256B1 (en) | beta-AMINOLOID PEPTIDE BINDING PROTEIN, POLYNUCLEOTIDE ENCODING THEREOF AND METHODS FOR USING THE SAME | |
KR20020008123A (en) | Compositions and Methods for The Treatment of Tumor | |
KR20010103576A (en) | Compositions and Methods for The Treatment of Tumor | |
JP2000511765A (en) | Purified SR-p70 protein | |
KR20010102960A (en) | Compositions and Methods for The Treatment of Tumor | |
WO2006082826A1 (en) | METHOD OF IDENTIFYING PURKINJE CELL TARGETING Corl2 GENE | |
JP6740172B2 (en) | Gene deletion and mutant ALK kinase in human solid tumors | |
JP2002504361A (en) | 36 human secreted proteins | |
WO2003102028A1 (en) | Rb1 gene induced protein (rb1cc1) and gene | |
AU776063C (en) | Compositions and methods for the treatment of tumor | |
WO2001005836A1 (en) | Polypeptidic compositions and methods for the treatment of tumors | |
JP6141224B2 (en) | Gene deletion and mutation ALK kinase in human solid tumors | |
KR20010102996A (en) | Meg-4 protein | |
JP2020156481A (en) | Gene defects and mutant alk kinase in human solid tumors |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |