EA002366B1 - Способ и устройство для выращивания (концентрирования) и исследования микробиологических проб - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способу выращивания и исследования микробиологических проб, в котором микроорганизмы помещаются в шприц (1) или аналогичное устройство. В предложенном способе выращивание культуры микроорганизмов осуществляют внутри шприца (1) или аналогичного устройства. Предложенное устройство содержит шприц (1) или аналогичное устройство с каналом, выполненным в шприце или его поршне (3), для подвода или отвода газа или газовой смеси в шприц или из него.

Description

Изобретение относится к способу обогащения и исследования микробиологических проб, при котором микроорганизмы помещаются в шприц или аналогичное устройство. Изобретение также относится к устройству для осуществления способа, состоящему из шприца или аналогичного устройства.

Сбор микробиологических проб методом мазка является важной частью санитарного контроля на промышленных предприятиях, в медицинских учреждениях, лабораториях и других местах, где требуется обязательное соблюдение гигиены помещения и оборудования. Мазковые пробы можно также брать с кожи или слизистой оболочки человека для клинической диагностики.

Обычно взятую мазком микробиологическую пробу или собранную пробу переносят со средства сбора пробы в буферный раствор или другой подходящий раствор, в котором ее можно подвергнуть дальнейшему анализу и обработке, и суспендируют в нем. В этом случае обычный способ получения дополнительной информации о микроорганизмах, которые возможно присоединились к средству сбора проб, называют субкультивированием. Это обычно осуществляют посредством переноса подлежащей исследованию взвеси микроорганизмов в жидкий культуральный субстрат или в твердый культуральный субстрат (например, в чашку Петри). После этого микроорганизмы инкубируют в культуральном субстрате, по меньшей мере, в течение нескольких часов, но обычно в течение суток, или нескольких суток, или даже недель. Во время инкубации количество исследуемого микроорганизма увеличивается до такой степени, что его можно обнаружить с помощью используемого способа обнаружения. Однако рост аэробных организмов во время инкубации может тормозиться, например, кислородом. С другой стороны, можно использовать соответствующие газы для создания и сохранения подходящей анаэробной среды при инкубации аэробных микроорганизмов. Так называемые микроаэрофильные бактерии (например, Сашру1оЬас1ег 8р.) требуют небольшого количества кислорода. Кроме того, при необходимости можно изменять содержание газов, подводимых в пространство, где производится обогащение микроорганизмов.

В некоторых ситуациях большую важность представляет быстрое проведение микробиологического анализа, например, для успешного лечения пациента, для выбора очистных мероприятий при санитарном контроле, контроле качества на производстве и т. д. Опасность, создаваемая микроорганизмами, может возрастать под действием многих факторов - инфекции в медицинских учреждениях, появление новых болезнетворных организмов человека и животных, ранее неизвестные промышленные микробиологические загрязнители, микробиологиче ское загрязнение окружающей среды и т.п. Чтобы эффективно реагировать на перечисленные выше проблемы, требуются способы экспрессдиагностики для обнаружения и идентификации микроорганизмов.

В международной заявке РСТ/ΕΊ 95/00398 предложен упрощенный способ сбора микробиологических проб для последующего исследования, обеспечивающий безопасность в случае работы с болезнетворными микроорганизмами. Это способ реализуется с помощью шприца, имеющего объем 10-40 мл, который характеризуется тем, что поверхность, противоположная поршневому штоку, содержит адгезивный субстрат для микроорганизмов. Адгезивный субстрат на поверхности поршня может быть выполнен, например, из хлопка, ворсистой ткани или подобного пористого материала, который стерилизуется вместе с шприцем или отдельно, например, в автоклаве или облучением. На адгезивную поверхность субстрата можно также при необходимости поместить асептически иммобилизованные биомолекулы (например, антитела), которые улучшают адгезию определенных микроорганизмов. При использовании этого шприца с поршнем с адгезивной поверхностью субстрата исключается необходимость дополнительного манипулирования с содержащими микроорганизмы жидкостями с помощью пипетки, чтобы повысить безопасность работы с инфекционными микроорганизмами. Проба переносится из шприца на отдельный культуральный субстрат, где она выращивается обычным путем. Пробу также можно собирать в шприц обычным способом, путем всасывания жидкости в шприц. Например, так обычно берут пробы крови. Жидкую пробу можно также брать прямо в шприц без инъекционной иглы или с помощью специального длинного наконечника или трубки, или т. п.

В основу настоящего изобретения поставлена задача создания способа и устройства, позволяющих ускорить работу по дальнейшему анализу микробиологических проб и обеспечивающих быстрое и надежное обнаружение, идентификацию, обогащение и т. д.

Задачи изобретения решаются с помощью способа и устройства, которые охарактеризованы в формуле изобретения.

Предложенный способ характеризуется тем, что обогащение или другой рост микроорганизмов осуществляют внутри шприца или аналогичного устройства. Обогащение происходит в условиях, которые можно легко изменять в процессе. Это позволяет, например, обеспечить дополнительную безопасную инокуляцию на заданной фазе роста, так как рост в шприце можно легко контролировать, например, визуально или с помощью цветного индикатора. Использование такого шприца и его измерительной шкалы позволяет удобно осуществлять ряд последовательных микробиологических разбав3 лений. Например, для так называемого разбавления до -1 берут в шприц на один объем пробы девятикратный объем раствора разбавителя. Затем шприц встряхивают и удаляют из него 9 объемов, которые можно использовать в качестве пробы для другого анализа, затем добавляют другие 9 объемов разбавителя, что дает так называемое разбавление до -2.

Существующие условия в шприце можно изменять, например, изменяя температуру, рН и газы, подводимые к субстрату. Целесообразно подводить к субстрату аэрированный поток газа, в котором можно корректировать состав газов и который также можно использовать для регулирования температуры и рН. При этом культура перемешивается, что повышает равномерность распределения питательных веществ в субстрате. В такой шприц можно легко добавлять при необходимости дополнительный субстрат, питательные вещества, селективные факторы и другие вещества в жидкой форме.

Во время инкубации аэробных микроорганизмов за счет подвода в шприц газового потока повышается диффузия кислорода, что важно для обеспечения оптимальной скорости роста, так как наличие кислорода является так называемым ограничительным фактором при аэробной инкубации микроорганизмов. Кроме кислорода, в субстрат можно подводить другие газы, например азот и углекислый газ. С их помощью можно обеспечить, например, анаэробные или микроаэрофильные условия в зависимости от типа микроорганизмов, которые требуют инкубации и обогащения. В качестве селективных факторов можно использовать парциальное давление разных газов. Газы, подводимые к субстрату, можно также использовать в качестве носителей, что позволяет доставлять в субстрат вещества в виде аэрозолей, в парообразной форме или другими соответствующими способами, которые управляют условиями роста культуры или культивированием или даже инокулируют среду или культуру. Для этого перед подачей в шприц газ можно пропустить через жидкость или суспензию, содержащую тот компонент, который необходимо добавить.

Для быстрого и надежного обнаружения микроорганизмов важно как можно быстрее обеспечить необходимую концентрацию микроорганизмов. Этого можно достичь с помощью предложенного способа, например, при проведении иммунологических анализов. Предложенный способ можно использовать для анализа на содержание микроорганизмов, например, для санитарного контроля внутренних поверхностей, инструментов и любых других поверхностей, плесени на любых поверхностях, санитарного контроля мясных туш, например, для обнаружения 8а1шопе11а, а также для анализа многих других микробиологических мазковых и жидких проб, необходимого на промышленных предприятиях, в здравоохранении и при анализе окружающей среды.

При применении предложенного способа с помощью шприца в качестве средства для отбора проб для обогащения микроорганизмов можно использовать соответствующую селективную питательную среду в качестве питательной среды для обогащения сразу же после взятия пробы. Таким образом, обогащение может начинаться сразу же после взятия пробы без задержки на инокуляцию или перенос пробы. Это имеет положительный эффект, так как микроорганизмы с клетками в состоянии покоя имеют лагфазу перед бактериальным ростом. Например, продолжительность лаг-фазы у бактерий 81арйу1ососи5 аигеиз составляет около 1,5 ч.

В больницах и других аналогичных организациях можно определять наличие штаммов микроорганизмов, устойчивых к антибиотикам, на внутренних поверхностях и устройствах, а также на коже и слизистых человека. Аналогичным образом можно анализировать пробы крови и любые другие жидкие пробы. Это могут быть пробы, взятые у пациента, или пробы других жидкостей, используемых в медицинских учреждениях, которые требуют изучения их микробиологических свойств. В процессе обогащения в среду можно добавлять необходимые антибиотики. Предложенный способ также обеспечивает и другие преимущества, кроме простоты процедуры и материальной выгоды, а также безопасности, поскольку перенос опасных бактерий в лабораториях сведен к минимуму.

При практическом использовании изобретения температуру, рН и/или другие условия культурального субстрата регулируют с помощью газа или газовой смеси, подводимой к субстрату внутрь шприца. Газ подается в шприц обычным способом. Так как потоком газа можно регулировать температуру во время культивирования, нет необходимости в инкубационных камерах или аналогичных устройствах. Для нагрева или охлаждения шприца можно использовать специальные нагреватели или охладители, например элементы Пельтье.

При необходимости можно отводить отработавшие газы из пространства для обогащения в шприце через трубку со стерилизацией, например фильтр.

В одном варианте воплощения изобретения шприц на время обогащения помещают в держатель наконечником вверх. Альтернативно, шприц можно поместить в держатель наконечником вниз, если через наконечник в пространство для обогащения подводится газ.

При использовании изобретения на практике питательный раствор и пробу транспортируют для дальнейшего исследования с помощью того же шприца, в котором производится культивирование. Пробы можно при необходимости транспортировать в шприце, для этого наконечник может быть выполнен с возможностью за5 крывания крышкой, клапаном или другим закрывающим устройством. Так как при обогащении и дополнительной обработке проб не требуются сложные устройства и рабочие режимы, их можно осуществлять, например, на промышленном предприятии рядом с технологической линией, которую проверяют. Это позволяет быстрее получить результаты, так как нет необходимости в транспортировке или хранении пробы. При этом также уменьшается опасность, связанная с транспортировкой и хранением.

Предлагаемое устройство согласно изобретению характеризуется тем, что предусмотрен канал или трубка, проходящая в шприц или поршень шприца, для подвода газа или газовой смеси в шприц. Если шток поршня выполнен с проходящей через него трубкой или несколькими трубками для подвода газа, то культуральный субстрат можно аэрировать или можно подавать в него необходимые газы для усиления во время инкубации обогащения аэробных микроорганизмов с одной стороны и анаэробных с другой стороны. Источником такого газа может быть сосуд со сжатым газом.

Газ можно подводить в шприц также непосредственно через поршень, например, проткнув его инъекционной иглой, которая через трубку присоединена к сосуду с газом. Альтернативно, можно подводить газ в шприц через канал или трубку в каком-то другом месте шприца. В процессе культивирования можно изменять состав газа, например, в зависимости от фазы роста микроорганизмов. Чтобы обеспечить асептические условия, газ можно подводить в шприц через стерилизующий фильтр. Соответственно, газ, выходящий через наконечник, можно также фильтровать с помощью стерилизующего фильтра. Наконечник шприца можно также закрывать колпачком, крышкой или клапаном для транспортировки или других целей.

Альтернативно, газ можно подавать в шприц через наконечник, но при этом следует использовать другой путь для отработавшего газа, например, через канал с клапаном или аналогичное устройство, или через поршень, или через воздушные отверстия в нем за счет избыточного давления. Канал в этом случае может быть реализован с помощью инъекционной иглы через поршень или стенку шприца.

Предложенное устройство согласно изобретению содержит шприц, имеющий прозрачные стенки или окошко. Можно определять рост микроорганизмов оптически или визуально, например, через стенку шприца. Можно также добавить в питательную среду индикаторный пигментный раствор, например, для индикации изменения рН, которое свидетельствует об изменении метаболизма микроорганизмов в питательной среде.

В дальнейшем изобретение поясняется описанием примеров его воплощения со ссылками на прилагаемые чертежи, на которых:

фиг. 1 изображает устройство для использования предложенного способа (вид сбоку), согласно изобретению;

фиг. 2 изображает другой вариант устройства подвода газа в шприц через канал (вид сбоку), согласно изобретению.

Устройство содержит один или несколько шприцев 1 (фиг. 1) с микробиологической культуральной средой, которые помещены в держатель 2 наконечником вверх, один или несколько сосудов 4 под давлением для хранения газов или газовых смесей, нагревательную/охладительную рубашку 5 для поступающих газов, в которой температура газа регулируется известными способами. В поршне 3 шприца предусмотрен канал, к которому присоединена трубка 7, через которую из сосуда под давлением в шприц подводится газ или газовая смесь. Трубка 7 содержит один или несколько клапанов 11 для регулировки поступления газа. Кроме того, устройство содержит стерилизующий фильтр 8, размещенный в подводящей трубе, для стерилизации поступающего газа. Отработавший газ стерилизуется с помощью другого стерилизующего фильтра 9, который подсоединен к наконечнику шприца.

В варианте изобретения, показанном на фиг. 2, газ подводится через поршень 3 с помощью отдельной инъекционной иглы 6 или аналогичного устройства. Инъекционная игла соединена с трубкой 7, которая присоединена к сосуду 4 под давлением, как было описано выше.

В дальнейшем предложенный способ описывается на основе рабочих фаз в процессе отбора пробы.

При мазке поверхностью поршня по исследуемой поверхности в разных направлениях микроорганизмы наносятся на увлажненный водой или буферным раствором или сухой адгезивный субстрат, размещенный на поверхности поршня 3. После этого поршень 3 втягивается в пустую камеру шприца 1 и через отверстие в наконечнике камеры выталкивается воздух. Альтернативно, пробу можно брать в шприц путем всасывания жидкости в шприц обычным способом. Сбор проб следует производить так, чтобы они были репрезентативными для исследуемого объекта и чтобы область сбора пробы была достаточно большой.

После этого камеру посредством всасывания заполняют необходимым объемом жидкости, например буферного раствора, воды или культурального раствора, а затем некоторого количества воздуха, чтобы осуществить перемешивание. После этого устройство встряхивают как пробирку, чтобы микроорганизмы отделились и перешли в жидкий раствор.

Если культуральный раствор используется в качестве раствора, то шприц можно перевернуть вниз и поместить в держатель 2 при температуре роста, подходящей для роста тех микро7 организмов, которые требуется обнаружить. Если газ подводится альтернативным путем через наконечник шприца, то шприц не переворачивают. Культуральный раствор можно также добавлять в шприц после того, как была получена суспензия микроорганизмов в другом растворе. Температуру или рН, или аналогичный параметр можно регулировать с помощью газа, подводимого через канал в поршне шприца. Для получения суспензии можно использовать буферный солевой раствор, раствор экстракта, например разбавленную кислоту или щелочь, раствор моющего средства, или любой аналогичный раствор.

Суспензию можно использовать для инокуляции или подавать в культуральную среду сразу, или после культивирования, или любого другого анализа. В этом случае, например, можно идентифицировать микроорганизмы с помощью обычных биохимических, иммунологических или генетических методов. Для обогащения подлежащего обнаружению микроорганизма и его антигена можно использовать способ, описанный в патенте Финляндии № 93742.

Claims (16)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ выращивания (концентрирования) и исследования микробиологических проб, заключающийся в том, что микроорганизмы помещают в шприц (1) или аналогичное устройство, отличающийся тем, что культивирование или выращивание микроорганизмов осуществляют внутри шприца (1) или аналогичного устройства, причем в шприц подводят газ или газовую смесь для перемешивания культуры, или для взбалтывания или аэрации, или для регулирования других параметров, важных для роста микроорганизмов внутри шприца.
2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что температуру, рН, парциальные давления газов и/или диффузию культурального субстрата, или концентрацию и/или диффузию питательной среды, или другие условия регулируют с помощью газа или газовой смеси, подводимой в субстрат в шприце.
3. 3. Способ по любому из п.2 или 3, отличающийся тем, что культуральный субстрат, помещаемый внутрь шприца или аналогичного устройства, выбирают с учетом его селективности к требуемым микроорганизмам.
4. 4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что пробу, содержащую микроорга низмы, собирают в шприц до добавления питательной среды.
5. 5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что шприц помещают наконечником вверх в держатель (2) на период роста.
6. 6. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что шприц помещают наконечником вниз в держатель на период роста и подводят газ в шприц через наконечник.
7. 7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что культуральный раствор транспортируют для дальнейшего исследования с помощью того же шприца, в котором производилось культивирование.
8. 8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что перед последующими инокуляциями осуществляют в шприце ряд последовательных микробиологических разбавлений.
9. 9. Устройство для выращивания и исследования микробиологических проб, содержащее шприц (1) или аналогичное устройство, отличающееся тем, что в шприце или поршне (3) шприца выполнен канал для подвода или отвода газа или газовой смеси в шприц или из него.
10. 10. Устройство по п.9, отличающееся тем, что содержит один или более сосудов (4) под давлением для подвода газа или газовой смеси из сосудов в шприц.
11. 11. Устройство по любому из пп.9, 10, отличающееся тем, что содержит нагревательную/охладительную рубашку (5), в которой по необходимости регулируется температура газа перед его подачей в шприц.
12. 12. Устройство по п.9, отличающееся тем, что в качестве канала, ведущего в шприц или его поршень (3), используется инъекционная игла (6) или аналогичное устройство.
13. 13. Устройство по п.12, отличающееся тем, что к инъекционной игле присоединена трубка (7) для подвода или отвода газа в шприц или из него.
14. 14. Устройство по любому из пп.9-13, отличающееся тем, что содержит крышку, колпачок или клапан для закрывания наконечника шприца.
15. 15. Устройство по любому из пп.9-13, отличающееся тем, что содержит прозрачную стенку или окошко для наблюдения за ростом микробиологической культуры.
16. 16. Устройство по любому из пп.9-13, отличающееся тем, что содержит один или более стерилизующих фильтров (8, 9) для пропускания поступающего и/или выходящего газа или газовой смеси через стерилизующий фильтр.