EA001640B1

EA001640B1 - Кольцевой хроматограф

Info

Publication number: EA001640B1
Application number: EA199901022A
Authority: EA
Inventors: Адальберт Прайер
Original assignee: Прайер Сепарейшн Текнолоджи Гмбх
Priority date: 1997-12-01
Filing date: 1998-11-30
Publication date: 2001-06-25
Also published as: AT405025B; WO1999028740A1; CA2301570A1; ATA203097A; AU754824B2; AU1474399A; EA199901022A1; EP1183531A1

Abstract

Объектом изобретения является кольцевой хроматограф с загрузкой в виде слоя частиц, отличающийся тем, что слой частиц имеет, по меньшей мере, две расположенные одна над другой зоны, состоящие из различных материалов и отделенные друг от друга преимущественно, по меньшей мере, одним разделительным слоем каждая.

Description

Настоящее изобретение относится к кольцевому хроматографу с загрузкой в виде слоя частиц.

Кольцевая хроматография представляет собой зарекомендовавший себя на протяжении лет и практикуемый во все большей степени вариант препаративного хроматографического разделения. Преимущественно применяют кольцевую хроматографию, если необходимо разделить большие количества смесей веществ, поскольку этот вид хроматографии может эксплуатироваться непрерывно, и это при относительно высокой степени разрешения.

Типичная Р-САС-аппаратура (Р-САС, ргерагайуе соиИииоик аппи1аг сйгота1одгарЬу = препаративная непрерывная кольцевая хроматография) состоит из кольцеобразного слоя частиц, упакованного в промежутке (кольцевой зазор) между двумя концентричными цилиндрами. При вращении слоя частиц вокруг его оси на верхнем конце непрерывно загружают питающий раствор, а также один или несколько элюентов. Подобные действия известны из уровня техники и широко распространены (см. европейскую заявку № 371648).

Помимо преимущества высокой производительности кольцевая хроматография отличается также высокими разрешением и специфичностью. Однако для решения различных специфических задач разделения требуется вводить дополнительные этапы кольцевой хроматографии, например, с применением иных разделительных гелей, нежели на первом этапе, с тем чтобы достичь нужной степени разделения. С одной стороны, по сравнению с обычной колончатой хроматографией, это можно реализовать относительно просто, поскольку при кольцевом хроматографическом разделении известно, в каком месте окружности выйдет или выйдут нужные продукты. С другой стороны, для этого требуются дополнительные кольцевые хроматографы, что, конечно, резко повышает аппаратурные и, тем самым, финансовые затраты.

Целью настоящего изобретения является поэтому создание устройства для кольцевой хроматографии, с помощью которого можно эффективно повысить разрешение и специфичность этого хроматографического способа разделения без чрезмерного увеличения аппаратурных затрат и, тем самым, технологических издержек.

Изобретение достигает этой цели посредством кольцевого хроматографа с загрузкой в виде слоя частиц, который отличается тем, что слой частиц имеет, по меньшей мере, две расположенные одна над другой зоны, содержащие различный материал слоя и отделенные друг от друга преимущественно, по меньшей мере, одним разделительным слоем каждый.

Таким образом, могут быть осуществлены предварительные или главные этапы разделе ния или же несколько разделений на различной основе, например эксклюзионная или аффинная или ионообменная хроматография и т. п., последовательно внутри одного и того разделительного устройства, непрерывно и с высокими разрешением и специфичностью, причем дополнительно минимизированы или полностью исключены затраты времени, средств и аппаратурные затраты на замену колонок, включая, например, сужение и кондиционирование смеси для следующего этапа разделения, регенерация или повторное приведение в равновесие колонок и т.п., а также (например, у восприимчивых к окислению или влажности веществ) опасность ухудшения проб при манипулировании ими.

В предпочтительном варианте выполнения, по меньшей мере, одна из зон может быть за счет предусмотрения электрических выводов, преимущественно в виде скользящих контактов, адаптирована в качестве зоны электрофореза, благодаря чему может быть осуществлено также электрофоретическое разделение описанным выше предпочтительным образом. Эта зона электрофореза может быть преимущественно ограничена, по меньшей мере, одним электронепроводящим разделительным слоем от другой зоны (других зон), с тем чтобы повысить эффективность электрофореза.

Материал слоя, по меньшей мере, для двух зон может быть при этом выбран в целом из анионообменных смол, катионообменных смол, эксклюзионных гелей, гельпроникающих гелей, аффинных гелей, гидрофобнохроматографических (Н1С) гелей, вытеснительных (О18р1асетеи1) смол, обращеннофазных (Кеуегаеб Рйаке) гелей, электрофоретических гелей и других применяемых на практике разделительных сред, что обеспечивает множество возможностей для комбинированного разделения, как это ниже описано более подробно. В случае, если одна из зон в хроматографе согласно изобретению является зоной электрофореза, то в качестве слоя частиц для этой зоны выбирают, конечно, электрофоретический гель.

Разделительный слой или разделительные слои выбирают, согласно изобретению, предпочтительно из мембран, непористого инертного материала частиц, в частности стеклянного бисера, и особенно для возможных зон электрофореза - из электронепроводящего материала.

В предпочтительных вариантах выполнения изобретения самая верхняя зона постели частиц покрыта покрывающим слоем и/или выложена слоем-основой, причем покрывающий слой и слой-основа состоят преимущественно из того же материала, что и разделительный слой (слои).

Особенно предпочтительно хроматограф согласно изобретению включает в себя, по меньшей мере, одну зону электрофореза или, по меньшей мере, одну зону эксклюзионного геля и, по меньшей мере, одну зону адсорбционной смолы, причем, в частности, по меньшей мере, одна зона адсорбционной смолы содержит ионообменную смолу, благодаря чему предельно селективно и с высоким разрешением можно разделять и очищать, например, протеины (последовательно в соответствии с их величиной и зарядом), а также многочисленные биотехнологические продукты, например ферменты, Б-ЕСЕ (Бишаи ер1бетта1 дго\\111 ГасЮг фактор роста эпидермиса человека) и иммуноглобулины.

Согласно одному варианту осуществления изобретения также на внутренней и/или внешней периферии кольцевой разделительной колонки (11) может быть предусмотрена термостатирующая (т.е. нагревающая или охлаждающая) рубашка, с тем чтобы можно было устанавливать каждый раз оптимальную для разделения температуру.

Ниже изобретение описано при помощи примеров и со ссылкой на прилагаемые чертежи, на которых фиг. 1а) и 1Б) схематично изображают используемый, согласно изобретению, кольцевой хроматограф с 2 и 3 разделительными зонами, фиг. 2а) схематично изображает частичный вид разреза через другой кольцевой хроматограф согласно изобретению с зоной электрофореза, а фиг. 2Б) - схематично увеличенный фрагмент обозначенного штриховой линией участка из фиг. 2а).

На фиг. 1а) и 1Б) схематично изображены два варианта кольцевого хроматографа согласно изобретению. На фиг. 1а) изображена форма выполнения с двумя, а на фиг. 1Б) - с тремя разделительными зонами слоя частиц. Эти зоны 1, 2 и 1, 2, 3 состоят преимущественно из разделительных смол, выбранных, например, из анионообменных смол, катионообменных смол, эксклюзионных гелей, аффинных гелей, гидрофобно-хроматографических (Н1С) гелей, вытеснительных (Э|5р1аеетеп1) смол, электрофоретических гелей, а также, при необходимости, из других обычных в этой области неподвижных фаз, например силикагеля, оксида алюминия и т. п. Эта широкая палитра возможностей выбора создает большое разнообразие комбинаций двух или более таких разделительных средств.

Так, изобретение включает в себя следующие комбинации двух неподвижных фаз:

- катионит - анионит;

- катионит - эксклюзионный гель;

- анионит - эксклюзионный гель;

- катионит - аффинный гель;

- анионит - аффинный гель;

- катионит - гидрофобно-хроматографический гель;

- анионит - гидрофобно-хроматографический гель;

- эксклюзионный гель - аффинный гель;

- эксклюзионный гель - гидрофобнохроматографический гель;

- гидрофобно-хроматографический гель аффинный гель, а также подобные комбинации с электрофоретическим гелем вместо одного из обоих вышеперечисленных гелей или дополнительно к нему (трехзонная хроматография). Вышеприведенное перечисление возможностей двойного комбинирования не описывает, как гели расположены в колонке по отношению друг к другу, т. е. какой является верхним гелем, а какой нижним. Это зависит единственно от задачи разделения.

Примерами применяемых в изобретении методов разделения являются, в том числе:

- ионообменная хроматография:

например, моно 8 (Фармация) или тойопирл ЭЕЛЕ 6508 (ТосоХаас);

- обращенно-фазная хроматография: например, амберхром С-161еб (Ром унд Хаас) или сефазил С8 (Фармация);

- гидрофобная хроматография: фенилсефароза (Фармация) или Т8К гельфенил 5РА (ТосоХаас);

- эксклюзионная (8|/е Ехс1и8юп) и гельпроникающая хроматография: например, сефадекс С15 (Фармация) или тойопирл НА 40Е (ТосоХаас);

- аффинная хроматография: например, тойопирл АЕ трезмл-650М (ТосоХаас) или ЕАН сефароза-4В (Фармация);

- адсорбционная хроматография: например, амберлит ХАО (Ром унд Хаас) или пуролит ΜΝ200 (Пуролит).

В объем охраны изобретения включены также комбинации двух или более гелей одного типа, однако, например, разных производителей. Например, друг над другом могут быть также расположены два катионообменных геля или два эксклюзионных геля (например, сефадекс С15 над тойопирл НА 40Е и т.п.).

Согласно изобретению, особенно предпочтительны кольцевые хроматографы со слоем частиц, по меньшей мере, из одной зоны аффинного геля и, по меньшей мере, одной зоны адсорбционной смолы, причем, в частности, по меньшей мере, одна зона адсорбционной смолы содержит анионообменную смолу, а также кольцевые хроматографы, по меньшей мере, с одним электрофоретическим гелем в одной из зон.

Два или три геля последовательно помещают в кольцевой зазор кольцевой колонны 11 из инертного по отношению к компонентам разделительных растворов материала, преимущественно стекла, причем каждую из гелевых зон покрывают разделительным слоем 5, прежде чем на нее будет нанесена следующая, с тем чтобы предотвратить перемешивание различных 9 материалов зон. В обоих случаях слой частиц сверху ограничен покрывающим слоем

8. На фиг. 1а) дополнительно изображен слойоснова 9, который дополнительно к пористой пластине дна (не показана), например, пористый стеклянный фильтр, мембранная шайба и т.п., служит для предотвращения выхода материала частиц на дне колонны. Материал для разделительных 5, покрывающих 8 слоев и слоев- основ 9 выбирают из мембран, а также непористого материала частиц, инертного по отношению ко всем компонентам соответствующих разделительных растворов, и он может быть для всех трех слоев одинаковым или разным, причем особенно для электрофоретического разделения он должен быть электронепроводящим. Согласно изобретению, предпочтителен стеклянный бисер, поскольку он практически во всех случаях применения инертен и легко наносится.

Для кольцевых хроматографов на фиг. 1а) загрузка происходит, таким образом, в последовательности 9-2-5-1-8, а на фиг. 1Ь) - в последовательности 3-5-2-5-1-8.

Остальные конструктивные элементы кольцевого хроматографа могут быть выполнены обычным образом. Так, колонка 11 (приводимая не показанным двигателем) установлена с возможностью вращения на оси 12 и питается через присоединительные трубопроводы 13 для питающего раствора и элюентов, а также через жестко смонтированную на оси распределительную головку 14, причем подающие каналы 15 распределительной головки 14 преимущественно погружены в покрывающий слой 8, с тем чтобы обеспечить равномерную загрузку. Каналы могут иметь обычные формы выполнения, т.е. одиночные, составные или щелевые сопла и т.п., однако, для изобретения предпочтительны приведенные в соответствие с периферией колонок криволинейные щелевые сопла разной ширины, с тем чтобы как можно более точно согласовать между собой потоки питающего раствора и элюентов.

На нижнем конце колонок предусмотрены выпускные каналы или трубки 16 для сбора элюатов. Эти выпуски 16 могут быть либо соединены с колонкой 11 (т.е. они вращаются с ней вокруг оси 12), либо фиксированы на оси 12 и, например, посредством контактного кольца находиться в контакте с вращающейся по отношению к ней колонкой, причем последняя форма выполнения предпочтительна.

На фиг. 2а) изображен частичный вид формы выполнения кольцевого хроматографа согласно изобретению с электрофоретическим этапом разделения, а именно разделительная зона 4 электрофореза, ограниченная от других выше- и нижележащих зон (не показаны) разделительными слоями 5 из электронепроводящего материала. Как на верхнем, так и на нижнем конце зоны 4 электрофореза, преимущественно непосредственно примыкая к соответст вующему разделительному слою (слоям), предусмотрены скользящие контакты, состоящие каждый из смонтированного на наружной стороне оси 12 проводящего кольца 6, питаемого током через сетевой вывод 10, и из предусмотренного на внутренней стороне колонки 11 кольцеобразного токосъемника 7, который плотно прилегает к проводящему кольцу 6 и находится в электрическом контакте с ним. Последний в зоне скользящего контакта проходит либо точечно, либо поверхностно через рубашку колонки для создания внутри колонки электрического напряжения, необходимого для электрофоретического разделения.

Фиг. 2Ь) изображает увеличенный вид обозначенного штриховой линией участка из фиг. 2а) и более подробно скользящий контакт.

Ниже приведены примеры осуществления настоящего изобретения. Изобретение никоим образом не ограничено, однако, этими примерами. Предпочтительными областями применения кольцевых хроматографов, согласно изобретению, являются разделение неблагородных и благородных металлов, а также многочисленные разделения и этапы очистки в биотехнологии.

Пример 1.

Катионит - эксклюзионный гель: ионообменно-эксклюзионная хроматография.

Жидкостно-хроматографическое разделение металлов платиновой группы с одновременным удалением неблагородных металлов.

Металлы платиновой группы: родий, палладий, платина и иридий могут непрерывно отделяться друг от друга посредством препаративной кольцевой хроматографии. Одновременно присутствующие неблагородные металлы, такие как, например, железо, медь, никель или кобальт, также можно непрерывно отделять от благородных металлов.

Хроматографическое разделение металлов платиновой группы с применением обменных гелей (например, сефадекс, тойопирл или биогель) уже было описано в патенте США № 4885143. Концентрированные растворы благородных металлов от процессов выщелачивания в сепарационных установках содержат, как правило, дополнительно неблагородные металлы, такие как железо, медь или никель в разных концентрациях.

После процесса выщелачивания раствор благородных металлов присутствует большей частью в концентрированной соляной кислоте. Из-за высокой концентрации хлоридов все благородные металлы присутствуют в качестве анионных хлорокомплексов. Неблагородные металлы обладают свойством присоединения в определенных условиях к катиониту, тогда как благородные металлы в качестве анионных комплексов проходят через катионит без задержки. Это свойство можно использовать для отделения на первом этапе способа неблаго родных сопутствующих металлов от благородных металлов, а на втором этапе способа - для отделения благородных металлов друг от друга. С помощью Р-САС-системы согласно изобретению это становится возможным с помощью простейшей аппаратуры.

Колонку, изображенную на фиг. 1а), заполняют на определенную высоту (точные опытные условия приведены в табл. 1 и 2) эксклюзионным гелем 2 (например, сефадекс, тойопирл или биогель) и насыпают на него стеклянный бисер 5 (б = 150-240 мкм); на этот слой 5 стеклянного бисера насыпают катионит 1 (например, довекс, амберлит, пуролит), а на него - снова слой 8 стеклянного бисера (фиг. 3).

Питающий раствор закачивают в радиальном положении 0° в кольцевую колонку. При этом питающий канал 15 погружен в верхний слой 8 стеклянного бисера. В качестве главного элюента (топ-элюент) служит НС1 высотой 0,5-1 м. Благородные металлы проходят без взаимодействия через слой 1 катионита и отделяются затем друг от друга в слое 2 эксклюзионного геля. На конце колонки отдельные фракции родия (КБ), палладия (Рб), платины (Р!) и иридия (1г) могут улавливаться отдельно.

Неблагородные металлы адсорбируются на катионите и в радиальном положении, в котором вымывается последний благородный металл (1г), отделяются с помощью степэлюента (НС1 высотой 2 м и более). НС1 высотой 2 м десорбирует неблагородные металлы от катионита и гонит их к слою эксклюзионного геля. Там неблагородные металлы не взаимодействуют с неподвижной фазой. Неблагородные металлы могут быть извлечены теперь в виде совместной фракции.

Непрерывно на отдельные благородные металлы и на фракцию, содержащую неблагородные металлы, разделяют раствор (НС1 высотой 6 м) следующей концентрации.

Таблица 1

Концентрация металлов в питающем растворе

Р!: 30 г/л	Рб: 15 г/л	КБ: 3 г/л	1г: 1 г/л
Бе: 4 г/л	Со: 4 г/л	Νί: 4 г/л	Си: 4 г/л

На слой сефадекса 6-15 высотой 26 см насыпали стеклянный бисер слоем 5 см. На этот слой насыпали слой довекса 50-Ψ Х8 толщиной 54 см, который снова покрывали слоем стеклянного бисера. Вымывали раствор при помощи НС1 высотой 0,5 м. Благородные металлы проходили через слой 1 катионита без взаимодействия и разделялись на слое 2 сефадекса. При этом образовались 4 по-разному окрашенных полосы - полоса КБ (красная), полоса Рб (коричневая), полоса Р! (желтая) и полоса 1г (коричневая).

В радиальном положении 270° относительно точки загрузки питающего раствора степ-элюент (НС1 высотой 2 м) загружали для отделения неблагородных металлов. Степэлюент десорбировал неблагородные металлы от катионита, и образовалась зеленоватожелтая полоса, проходящая через колонку без взаимодействия. Неблагородные металлы удалось извлечь в виде совместной фракции после иридиевой фракции.

Таблица 2

Опытные условия

Скорость течения топэлюента	Скорость течения степэлюента	Скорость течения питающего раствора	Скорость вращения	Площадь сечения кольцевого зазора
18 мл/мин	4 мл/ мин	0,4 мл/мин	125°/ч	24,4 см²

Высота колонки - 41 см, из них 26 см сефадекса 6-15, 5 см стеклянного бисера (б = 150-240 мкм) , 5 см довекса 50 \У-Х8 в виде Н⁺, 5 см стеклянного бисера (б = 150-240 мкм).

Если, кроме того, в разделяемой смеси содержатся еще Ки и Ок, то Ки вымывают между КБ, Рб и Ок после 1г (см. пример 2).

Пример 2.

Адсорбционная смола - эксклюзионный гель: адсорбционно-эксклюзионная хроматография.

Селективное выделение золота из раствора благородных металлов и одновременное разделение металлов платиновой группы

Эксклюзионный гель заполняют в Р-САС (по меньшей мере, до половины высоты), на эксклюзионный гель наносят разделительный слой (стеклянный бисер или мембрана), на этот слой адсорбционную смолу (амберлит ХАЭ7 или пуролит ΜΝ 200).

Раствор благородных металлов, содержащий все металлы платиновой группы (однако, по меньшей мере, два из них) и золото, используют в качестве питающего раствора для РСАС. Золото селективно адсорбируют адсорбционной смолой, тогда как другие металлы платиновой группы проходят без задержки через слой адсорбера и разделяются на эксклюзионном геле. После вымывания последнего компонента золото отделяют при помощи степэлюента от адсорбционной смолы (фиг. 4).

Пример 3.

Катионит - анионит: ионообменная хроматография.

Выделение неблагородных металлов из раствора КЬ/1г и последующее разделение родия и иридия.

Анионит заполняют в Р-САС, по меньшей мере, до половины высоты. На анионит наносят разделительный слой (мембрана или стеклянный бисер соответствующей величины), а на разделительный слой - катионит до максимальной высоты заполнения. Раствор металлов, содержащий родий и иридий, а также неблагородные металлы, такие как железо, никель, кобальт или медь, закачивают в качестве питающего раствора в кольцевую колонку. Неблагородные металлы адсорбируют на катионите, тогда как родий и иридий проходят до анионита. На анионите адсорбирует 1г (IV), а родий проходит. После того, как вымывают весь родий, в этом угловом положении с помощью степ-элюента 1 вымывают неблагородные металлы. После этого вымывания происходит восстановление 1г (IV) в 1г (III) с помощью степ-элюента 2 (фиг. 5).

Пример 4.

Унионит - эксклюзионный гель: ионообменно-эксклюзионная хроматография.

Выделение цианистого золота из раствора благородных металлов с одновременным разделением благородных металлов.

Р-САС заполняют, по меньшей мере, до половины высоты эксклюзионным гелем, затем наносят разделительный слой, а на него - анионит. Раствор благородных металлов, содержащий помимо золота в качестве цианидного комплекса также металлы платиновой группы, помещают в качестве питающего раствора в кольцевой зазор. Цианистое золото связывается в качестве анионного комплекса с анионитом, а остальные металлы платиновой группы проходят через анионит без взаимодействия и разделяются на эксклюзионном геле. После угла, под которым последний металл платиновой группы (иридий) покидает колонку, в кольцевой зазор помещают стрип-раствор для десорбции золота (фиг. 6).

Возможна также комбинация анионитов и эксклюзионных гелей в биотехнологии, например, для получения и очистки моноклональных антител. При этом посредством анионита можно удалить пирогены, нуклеиновые кислоты и протеазы; в эксклюзионном геле могут быть затем удалены соли буферного раствора.

Пример 5.

Аффинный гель - эксклюзионный гель: аффинно-эксклюзионная хроматография.

Выделение неблагородных металлов из раствора благородных металлов с последующим разделением благородных металлов.

Р-САС-колонку заполняют, по меньшей мере, на 50% высоты эксклюзионным гелем, покрывают разделительным слоем и до окончательной высоты заполнения наносят суперлиггель (суперлиг-гели - это гели с крауэфиром в качестве функциональной группы; торговая марка фирмы Ай-Би-Си Эдвансд

Текнолоджи). Раствор благородных металлов с высоким содержанием неблагородных металлов помещают в кольцевой зазор Р-САС. Неблагородные металлы не обладают сродством с суперлиг-гелем и поэтому вымываются через всю колонку и могут улавливаться в виде совместной фракции. Благородные металлы отделяют суперлиг-гелем и разделяют на эксклюзионном геле в последовательности НВ-РН-Р(-[г (фиг. 7).

Подобные приложения возможны с неподвижными фазами, связанные комплексообразователями, такими как дитизоны, дегидродитизоны, гидроксихинолинаты, пиридилазонафтолаты и т. п.) в качестве реактивных групп. С помощью этих неподвижных фаз, однако, лишь в сложных условиях можно качественно отделить друг от друга благородные металлы (на каждый металл необходимо применять один стрип-элюент). Поэтому нецелесообразно накладывать на эти неподвижные фазы еще одну дополнительную фазу, поскольку это дополнительно усложнило бы условия вымывания и сделало бы процесс неэкономичным.

Пример 6.

Двухступенчатая очистка целлюлазы.

Анионит в качестве верхнего слоя (моно О. Фармация) служит для предварительной очистки целлюлазы; вымывают при помощи трис.НС1-буфера. Извлеченную фракцию, в которой находится целлюлаза, фракционируют дальше в катионите в качестве нижнего слоя (моно 8, Фармация) с помощью ацетатного буфера в качестве элюента. С помощью катионита можно достичь очень высокого разрешения, так что целлюлаза может быть извлечена в чистом виде.

Пример 7.

Катионит - анионит: ионообменноэксклюзионная хроматография.

Извлечение моноклонального ЦСд; из ферментационного раствора.

Предварительная очистка и концентрация антитела достигается с помощью катионита в качестве верхней фазы (8-сефароза хай перформанс, Фармация). При этом используют МЕ8 с ЫаС1 в качестве буфера. Пул (фракция, содержащая также антитело) освобождают затем посредством эксклюзионного геля (супердекс 200) в качестве нижней фазы при помощи стерильного натрийхлоридного буфера от димеров и олигомеров, а также от трансферринов.

Пример 8.

Анионит - эксклюзионный гель: ионообменно-эксклюзионная хроматография.

Очистка фактора роста эпидермиса человека (Й-Е6Е, Нитап Ер16етта1 Сго\\111 Еас!от), экспримированного в качестве экстрацеллюлярного продукта посредством 8ассйатотусе5 сетеуЩае.

Анионит (О-сефароза. Фармация) в качестве верхней фазы служит для предварительной очистки (очистка на основе заряда) фактора роста, а нижняя фаза, эксклюзионный гель (супердекс 75, Фармация), служит для окончательной очистки фактора роста.

Пример 9.

Гидрофобно-хроматографический (Н1С) гель-эксклюзионный гель: аффинно-ионообменная хроматография.

Извлечение пролактина гипофиза человека (Нитап рйийагу рго1асйи).

Верхняя неподвижная фаза (Н1С-гель, фенилсефароза С1., Фармация) служит для первичной очистки и концентрации пролактина (концентрация на коэффициент 7). На втором этапе пролактин окончательно очищают на эксклюзионном геле 21 (например, сефадекс 6100, Фармация).

Пример 10.

Катионит - гидрофобно-хроматографический гель: ионообменно-аффинная хроматография.

Извлечение α-2-макроглобулина.

С помощью катионита (верхняя неподвижная фаза, например, моно 8, Фармация) можно извлечь протеиновый пул, содержащий протеины с одинаковым зарядом, в том числе и макроглобулин. Макроглобулин очищают до однородности во втором слое, Н1С-геле (например, фенилсефароза, Фармация).

Пример 11.

Анионит - гидрофобно-хроматографический гель: ионообменно-аффинная хроматография.

Очистка рекомбинантной обратной транскриптазы Ηΐν.

На верхней фазе, в анионите (например, ΌΕΑΕ сефароза, Фармация) ферментационный раствор разделяют по заряду. Пул, в котором находится транскриптаза, проходит через второй слой, Н1С-гель (например, фенилсефароза хай перформанс, Фармация). После этого слоя за счет различной гидрофобности транскриптазу извлекают в чистом виде.

Пример 12.

Катионит - анионит, с одной из неподвижных фаз в вытеснительном (Э|5р1асстси1) режиме: ионообменно-вытеснительная хроматография.

Разделение протеинов.

В кольцевой хроматограф заполняют анионит (например, моно О. Фармация). На этот анионит насыпают инертный слой, например стеклянный бисер или мембрану, а на него помещают катионит (например, моно 8, Фармация). Смесь различных протеинов разделяют на катионите на основе разного заряда, разделенные фракции концентрируют на анионите с применением вытеснителя или дисплейсера (например, налколит). Таким образом, можно комбинировать разделение и одновременную концентрацию.

Пример 13.

Эксклюзионный гель - электрофоретический гель: эксклюзионная хроматография и электрофорез.

Разделение протеинов.

Электрофоретический гель образует нижний слой в Р-САС, покрытый эксклюзионным гелем. При нанесении на эксклюзионный гель протеинов разного заряда и разных значений р1 они разделяются на основе величины. Электрофоретический слой осуществляет затем дополнительное разделение протеинов на основе их заряда.

Пример 14.

Эксклюзионный гель - катионит, с катионитом в вытеснительном (Э|5р1асстси1) режиме: эксклюзионно-ионообменная хроматография.

Разделение аминокислотной смеси с одновременным выделением протеинов.

Верхняя неподвижная фаза, эксклюзионный гель (например, сефадекс 625, Фармация), служит для выделения протеинов (например, альбуминов) из питающего раствора, содержащего аминокислоты, Ь-глютаминовую кислоту, Ь-валин и Ь-лейцин. Разделение в эксклюзионном геле дает фракцию, содержащую протеины, и фракцию, содержащую аминокислоты. Во втором слое аминокислоты разделяют на катионите (например, довекс 50 \У-Х8) с дисплейсером (например, 0,1н ΝαΟΗ) и одновременно концентрируют. Аминокислоты выделяют в последовательности: глютаминовая кислота - валин - лейцин. За дисплейсером должен следовать регенерирующий раствор (например, разбавленная Н₂8О₄) , с тем чтобы привести слой геля в исходное состояние.

Пример вытеснительного вымывания также не ограничен применением в катионите.

Как видно из вышеприведенного описания, настоящее изобретение предлагает новый кольцевой хроматограф с состоящим из нескольких различных зон слоем частиц, с помощью которого несколько видов хроматографического разделения могут быть осуществлены за один этап и, тем самым, быстрее и экономичнее, чем это было до сих пор возможно в соответствии с уровнем техники.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Кольцевой хроматограф с загрузкой в виде слоя частиц, отличающийся тем, что слой частиц имеет, по меньшей мере, две расположенные одна над другой зоны (1, 2, 3, 4), состоящие из различного материала и отделенные друг от друга преимущественно, по меньшей мере, одним разделительным слоем (5) каждая.
2. Хроматограф по п.1, отличающийся тем, что, по меньшей мере, одна из зон (4) за счет предусмотрения электрических выводов, преимущественно в виде скользящих контактов, выполнена в качестве зоны электрофореза для осуществления электрофоретического разделения.
3. Хроматограф по п.2, отличающийся тем, что зона (4) электрофореза ограничена, по меньшей мере, одним электронепроводящим разделительным слоем (5) от другой зоны (других зон) (1, 2, 3).
4. Хроматограф по одному из пп.1-3, от- личающийся тем, что материал слоя, по меньшей мере, для двух зон (1, 2, 3, 4) выбран из анионообменных смол, катионообменных смол, эксклюзионных гелей, гельпроникающих гелей, аффинных гелей, гидрофобнохроматографических (Н1С) гелей, вытеснительных смол, обращенно-фазных гелей и электрофоретических гелей.
5. Хроматограф по п.4, отличающийся тем, что материал слоя для зоны (4) электрофореза выбран из электрофоретических гелей.
6. Хроматограф по одному из пп.1-5, отличающийся тем, что, по меньшей мере, один разделительный слой (5) выбран из мембран непористого инертного материала частиц, преимущественно стеклянного бисера, и из электронепроводящего материала.

Фиг. 2а)
7. Хроматограф по одному из пп. 1-6, отличающийся тем, что слой частиц покрыт покрывающим слоем (8) и/или выложен слоемосновой (9), причем покрывающий слой (8) и слой-основа (9) состоят преимущественно из того же материала, что и разделительный слой (слои) (5).
8. Хроматограф по одному из пп.1-7, отличающийся тем, что слой частиц содержит, по меньшей мере, одну зону электрофореза.
9. Хроматограф по одному из пп.1-8, отличающийся тем, что слой частиц содержит, по меньшей мере, одну зону эксклюзионного геля и, по меньшей мере, одну зону адсорбционной смолы.
10. Хроматограф по п.9, отличающийся тем, что, по меньшей мере, одна зона адсорбционной смолы содержит ионообменную смолу.
11. Хроматограф по одному из пп.1-10, отличающийся тем, что на внутренней и/или внешней периферии кольцевой разделительной колонки (11) предусмотрена термостатирующая рубашка.