DK3128325T3 - Fremgangsmåde til bestemmelse af en koncentration af epitheliale celler i en blodprøve eller aspirat prøve - Google Patents

Claims (14)

1. Fremgangsmåde til bestemmelse af en koncentration af epitheliale celler i en blodprøve eller aspirat prøve, der stammer fra et menneske eller pattedyr og er tilsat et koagulationshæmmende middel, med følgende trin: a) lysering af de i blodprøven eller den aspirate prøve indeholdte erythrocyter ved tilsætning af en buffer, der bevirker en lysering af erythrocyterne, isolering af de celler, der herved ikke er lyseret, og suspension af de isolerede celler i en buffer, hvorved blodprøven eller den aspirate prøve lagres i i det mindste 24 timer ved en temperatur mellem 0 og 40 °C, før erythrocyterne lyseres, b) tilsætning af antistoffer, antistoffragmenter eller antistofmimetika, som hver bærer i det mindste en markering, og som hver især er rettet mod det epitheliale celleadhæsionsmolekyle (EpCAM) og/eller i det mindste et andet antigen, der er specifikt for epitheliale celler, til en cellesuspension, der er opnået ved trin a), eller en ved isolering opnået delmængde af denne cellesuspension, blanding af antistofferne, antistoffragmenterne eller antistofmimetika og cellesuspensionen eller delmængden og inkubation af en derved opnået blanding i i det mindste en tid, der er nødvendig til opnåelse af en aftagende bindingsrate af en binding af antistofferne, antistoffragmenterne eller antistofmimetika til cellerne, hvorved inkubationen sker i i det mindste 6 timer, c) bestemmelse af antallet af ved hjælp af en binding af antistofferne, antistoffragmenterne eller antistofmimetika markerede celler i den ved trin b) opnåede blanding og d) beregning af koncentrationen af de markerede celler, hvis antal blev bestemt ved trin c), i blodprøven eller den aspirate prøve.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvorved der mellem trinene a) og b) gennemføres følgende yderligere trin: a1) isolering af i det mindste en delmængde eller en yderligere delmængde af den ved trin a) opnåede cellesuspension, a2) tilsætning af de antistoffer, antistoffragmenter eller antistofmimetika, der hver bærer i det mindste en markering, og som hver især er rettet mod det epitheliale celleadhæsionsmolekyle (EpCAM) og/eller i det mindste et andet antigen, der er specifikt for epitheliale celler, til den yderligere delmængde i en sådan mængde, at deres koncentration i den yderligere delmængde er identisk med koncentrationen af antistofferne, antistoffragmenterne eller antistofmimetika i cellesuspensionen eller delmængden ifølge trin b), blanding af antistofferne, antistoffragmenterne eller antistofmimetika og den yderligere delmængde og inkubation af en derved opnået blanding ved en forudfastsat temperatur og a3) fortløbende eller gentagen bestemmelse af en mængde af antistoffer, antistoffragmenter eller antistofmimetika, som er bundet til celler, der er indeholdt i den yderligere delmængde, i afhængighed af tiden fra blandingen ifølge trin a2) at regne, herudfra konstatering af en bindingsrate og bestemmelse af en tid, som er nødvendig til opnåelse af en aftagende bindingsrate for bindingen af antistofferne, antistoffragmenterne eller antistofmimetika til disse celler, hvorved inkubationen ved trin b) sker ved den forudfastsatte temperatur, hvorved tiden ifølge trin b) er valgt sådan, at den er i det mindste lige så lang som tiden bestemt ved trin a3).

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, hvorved den forudfastsatte temperatur er en temperatur i området fra 0 til 30 °C, især 0 til 20 °C, især 8 til 15 °C.

4. Fremgangsmåde ifølge et af de foregående krav, hvorved inkubationen ifølge trin b) sker i i det mindste 7 timer, i det mindste 8 timer, i det mindste 10 timer, i det mindste 12 timer, i det mindste 14 timer, i det mindste 16 timer, i det mindste 18 timer, i det mindste 20 timer, i det mindste 22 timer, i det mindste 24 timer, i det mindste 25 timer eller i det mindste 30 timer.

5. Fremgangsmåde ifølge et af de foregående krav, hvorved markeringen er en fluorescensmarkering ved hjælp af en fluorochrom, en farvemarkering ved hjælp af en chromophor eller en indirekte detekterbar markering ved hjælp af biotin, avidin, streptavidin eller et andet affinitets-tag, epitop-tag eller protein-tag.

6. Fremgangsmåde ifølge et af de foregående krav, hvorved bestemmelsen af mængden af bundne antistoffer, antistoffragmenter eller antistofmimetika ifølge trin a3) og/eller bestemmelsen af antallet af celler, der er markeret ved en binding af antistofferne, antistoffragmenterne eller antistofmimetika, ifølge trin c) sker ved hjælp laserscanningcytometri, fluorescensmikroskopi eller lysmikroskopi.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, hvorved bestemmelsen af mængden af bundne antistoffer, antistoffragmenter eller antistofmimetika og/eller bestemmelsen af antallet af markerede celler sker ved hjælp af fluorescensmikroskopi eller lysmikroskopi, og der til identifikationen af cellerne anvendes en software til billedgenkendelse.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6 eller 7, hvorved markeringen er en fluorescensmarkering, og der ved laserscanningcytometrien eller fluorescensmikroskopien for hver af cellerne dynamisk bestemmes en samlet fluorescens pr. celle og en baggrundsfluorescens for denne celle, således at der for cellerne fås ækvivalente fluorescensværdier hver gang som differens mellem den for den respektive celle konstaterede samlede fluorescens og den for denne celle konstaterede baggrundsfluorescens.

9. Fremgangsmåde ifølge et af de foregående krav, hvorved isoleringen ifølge trin a) sker ved centrifugering, sedimentation eller filtration.

10. Fremgangsmåde ifølge et af de foregående krav, hvorved der til cellesuspensionen, delmængden eller den yderligere delmængde af cellesuspensionen hver gang før tilsætningen af antistoffer, antistoffragmenter eller antistofmimetika ifølge trinene b) og a2), der hver bærer i det mindste en markering, tilsættes en blokeringsreagens til blokering af ikke-specifikke bindingssteder og/eller af Fc-receptorer og blandes og inkuberes med cellesuspensionen, delmængden eller den yderligere delmængde af cellesuspensionen.

11. Fremgangsmåde ifølge et af de foregående krav, hvorved der ved intet af trinene anvendes en detergent, og/eller ved intet af trinene sker en fiksering af cellerne.

12. Fremgangsmåde ifølge et af de foregående krav, hvorved samtlige trin af fremgangsmåden eller i det mindste trinene b) og c) eller i det mindste trinene b), a2), a3) og c) gennemføres automatiseret af en dertil konstrueret automat.

13. Fremgangsmåde ifølge et af de foregående krav, hvorved der ved trin a1) isoleres flere delmængder, hvorved der ved trin a2) til hver af delmængderne hver gang tilsættes en forskellig mængde af antistofferne, antistoffragmenterne eller antistofmimetika og blandes med den respektive delmængde, hvorved der ved trin a3) for hver af delmængderne bestemmes den tid, der er nødvendig til opnåelse af den aftagende bindingsrate, hvorved der til gennemførelsen af trin b) derefter vælges den mængde af antistofferne, antistoffragmenterne eller antistofmimetika, ved hvilken den aftagende bindingsrate opnås i en ønsket tid.

14. Fremgangsmåde ifølge et af de foregående krav, hvorved det øvrige for epitheliale celler specifikke antigen er udvalgt fra den følgende gruppe: androgenreceptor, epithelial growth factor receptor (EGF receptor), estrogen receptor, progesteron receptor, prostataspecifikt antigen (PSA), prostataspecifikt membranantigen (PSMA), programmed death ligand 1 (PDL-1), Melan A, B7-H3, vascular endothelial growth factor receptor (VEGF receptor), Ki67, insulin-like growth factor receptor (IGF receptor) og her2neu.