DK2756305T3 - Fremgangsmåde til bestemmelse af glycosyleringen af et antistof - Google Patents

Claims (14)

1. in vitro fremgangsmåde til bestemmelse af bindingen af et konkurrerende antistof med en Fc-receptor eksprimeret i cellemembraner eller intakte celler foreliggende i et målemedie, ved konkurrering med et referenceantistof, omfattende følgende trin: (i) direkte mærkning af den nævnte Fc-receptor med det første medlem af et par FRET partnere, ellers introduktion, i mediet, af cellemembraner eller intakte celler, hvis Fc-receptorer blev mærkede på forhånd direkte med det første medlem af et par af FRET partnere; (ii) tilføjelse af det konkurrerende antistof til målemediet; (iii) tilføjelse af et referenceantistof, som er markeret direkte med det andet medlem af parret af FRET partnere, til målemediet; (iv) måling af FRET signalet, idet en reduktion af signalet målt under tilstedeværelse af det konkurrerende antistof i forhold til det, som er målt under dettes fravær, er repræsentativt for bindingen af dette antistof til Fc-receptoren; kendetegnet ved, at Fc-receptoren er mærket direkte via et suicid-enzym, dvs. at det er eksprimeret i form af et fusionsprotein omfattende Fc-receptoren og suicid-enzymet, og at markeringen udføres ved tilføjelse af substratet af enzymet, konjugeret med en af FRET partnerne, til målemediet.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at trin (ii) reproduceres med forskellige mængder af konkurrerende antistof, idet mængden af referenceantistof tilføjet i trin (iii) er fast, og at det omfatter et yderligere trin (v) ved bestemmelse af EC50 for det konkurrerende antistof og med sammenligning med EC50 for referenceantistoffet.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 og 2, kendetegnet ved, at referenceantistoffet og det konkurrerende antistof afvigeer især ved, at sidstnævnte blev fremstillet ved en fremgangsmåde, eller er blevet underkastet en behandling, som sigter mod at ændre niveauet for glycosylering af dettes Fc-fragment.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 og 2, kendetegnet ved, at referenceantistoffet og testantistoffet afviger især ved, at sidstnævnte blev fremstillet ved en fremgangsmåde, eller er blevet underkastet en behandling, som sigter mod at ændre niveauet for fucosylering af dettes Fc-fragment.

5. Fremgangsmåde til bestemmelse af niveauet for glycosylering af et antistof, omfattende følgende trin: - udførelse af fremgangsmåden ifølge krav 2, under anvendelse, i trin (ii), af adskillige konkurrerende antistoffer, som har kendte niveauer for glycosylering eller for deglycosylering, derefter - udøvelse af fremgangsmåden ifølge krav 2, under anvendelse, i trin (ii), af antistoffet, hvis niveau for glycosylering skal bestemmes, og - bestemmelse af niveauet for glycosylering af testantistoffet ved sammenligning af dettes EC50 med dette for de konkurrerende antistoffer, som har kendte niveauer for glycosylering eller for deglycosylering.

6. Fremgangsmåde til bestemmelse af niveauet for fucosylering for et antistof, omfattende følgende trin: - udførelse af fremgangsmåden ifølge krav 2, under anvendelse af, i trin (ii), adskillige konkurrerende antistoffer, som har kendte niveauer for fucosylering ellerfor defucosylering, efterfølgende, - udførelse af fremgangsmåden ifølge krav 4, under anvendelse af, i trin (ii), et antistof, hvis niveau for fucosylering eller for defucosylering skal bestemmes, og - bestemmelse af niveauet for fucosylering for testantistoffet ved sammenligning af dettes EC50 med dette for konkurrerende antistoffer, som har kendte niveauer for fucosylering ellerfor defucosylering.

7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at Fc-receptoren er en gamma Fc-receptor.

8. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at Fc-receptoren er CD16a-receptoren eller en variant deraf.

9. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 8, kendetegnet ved, at suicid-enzymet vælges blandt: mutanterne af O6-alkylguanin-DNA-alkyltransferase, mutanterne af dehalogenase, eller et fragment af acylbærerproteinet.

10. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at fremgangsmåden udøves med intakte celler.

11. Sæt af reagenser til udøvelse af fremgangsmåden ifølge ethvert af kravene 1 til 10, kendetegnet ved, at de omfatter en ekspressionsvektor, som omfatter DNA-sek-vensen, som koder for en Fc-receptor, og DNA-sekvensen, som koder for et suicid enzym, eller celler, som omfatter ekspressionsvektoren og i det mindste ét medlem af et par af FRET partnere.

12. Sæt af reagenser ifølge krav 11, kendetegnet ved, at suicid-enzymet vælges blandt mutanterne af dehalogenase, et fragment af acylbærerproteinet eller mutanterne af 06-alkylguanin-DNA-alkyltransferase.

13. Sæt at reagenser ifølge krav 11 eller 12, kendetegnet ved, at Fc-receptoren er CD16a-receptoren.

14. Sæt af reagenser ifølge ethvert af kravene 11 til 13, kendetegnet ved, at cellerne foreligger i frossen form.