DK2494047T3 - Multifunktionelle alleler - Google Patents

Claims (14)

1. Nukleinsyrekonstruktion, der omfatter: (a) målsøgende arme til at styre nukleinsyrekonstruktionen mod et målgen i en nukleinsyre i en celle; (b) en aktueringssekvens i sense-orientering i forhold til transkription af målgenet og en lægemiddelselektionskassette (DSC) i sense- eller antisense-orientering; (c) i antisense-orientering en nukleotidsekvens af interesse (NSI) og et COIN (konditionelt ved inversion-element); og (d) rekombinerbare enheder, hvor de rekombinerbare enheder omfatter to første par af sammenhørende rekombinasegenkendelsessteder, der genkendes af en første rekombinase, idet en første rekombinerbar enhed omfatter aktueringssekvensen, DSC og NSI, hvor den første rekombinerbare enhed flankeres af et par af de to første par af sammenhørende rekombinasegenkendelsessteder, der genkendes af den første rekombinase, en anden rekombinerbar enhed omfatter NSI, hvor den anden rekombinerbare enhed flankeres af et par af de to første par af sammenhørende rekombinasegenkendelsessteder, der genkendes af den første rekombinase, to “andet” par af sammenhørende rekombinasegenkendelsessteder, der genkendes af en anden rekombinase, og ét tredje par af sammenhørende rekombinasegenkendelsessteder, der genkendes af en tredje rekombinase; hvor de første par, de “andet” par og det tredje par af rekombinasegenkendelsessteder genkendes af forskellige rekombinaser; hvor de rekombinerbare enheder rekombinerer ved eksponering for en første rekombinase til frembringelse af en konditionel allel, der mangler aktueringssekvensen og DSC og indeholder NSI i sense-orientering og COIN i antisense-orientering; og hvor den konditionelle allel rekombinerer, når den yderligere eksponeres forden anden rekombinase, til frembringelse af en allel, der mangler NSI og har COIN i sense-orientering.

2. Fremgangsmåde til modificering afen ikke-human celle, der omfatter: målsøgning mod en nukleotidsekvens af interesse i en celle med en nukleinsyrekonstruktion ifølge krav 1 til frembringelse af en målcelle, eksponering af målcellen for den første rekombinase til frembringelse af den konditionelle allel og eksponering af den konditionelle allel for en anden rekombinase, der udskærer NSI og anbringer COIN i sense-orientering.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, hvor NSI i cellen er et exon eller en nukleotidsekvens, der er forbundet med en fænotype.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, hvor nukleotidsekvensen af interesse i cellen erstattes af nukleinsyrekonstruktionen ifølge krav 1.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, hvor fænotypen bestemmes en første gang efter frembringelse af målcellen, men før eksponering for den første rekombinase.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, hvor fænotypen bestemmes en anden gang efter eksponering for den første rekombinase.

7. Nukleinsyrekonstruktion, der omfatter: en lægemiddelselektionskassette (DSC), en reporter, et COIN, en nukleotidsekvens af interesse (NSI) og fem par af rekombinasesteder, der er anbragt blandt reporteren, DSC, COIN og NSI; hvor intet par af rekombinasesteder er identisk med noget andet par, og hvor et første to par af rekombinasesteder genkendes af den samme første rekombinase, et “andet” to par af rekombinasesteder genkendes af den samme anden rekombinase, og et femte par af rekombinasesteder genkendes af en tredje rekombinase; hvor den første, anden og tredje rekombinase ikke er den samme, og hvor i forhold til transkriptionsretningen reporteren er i sense-orientering, NSI er i antisense-orientering, COIN er i antisense-orientering, og DSC er i sense- eller antisense-orientering; hvor rekombinasestederne er anbragt i rekombinerbare enheder, der omfatter (i) en første rekombinerbar enhed, der omfatter aktueringssekvensen, DSC og NSI, hvor den første rekombinerbare enhed flankeres af et par af de to første par af sammenhørende rekombinasegenkendelsessteder, der genkendes af den første rekombinase; og (ii) en anden rekombinerbar enhed, der omfatter NSI, hvor den anden rekombinerbare enhed flankeres af et par af de to første par af sammenhørende rekombinasegenkendelsessteder, der genkendes af den første rekombinase; og hvor de første to par og de “andet” to par af rekombinasesteder er anbragt, således at der ved eksponering for den første rekombinase dannes en modificeret allel, hvor de første to par af rekombinasesteder styrer udskæring af reporteren, udskæring af DSC og inversion af NSI til sense-orientering, og COIN opretholdes i antisense-orientering, og enten (a) de “andet” to par af rekombinasesteder er anbragt, således at der ved eksponering for den anden rekombinase sker det, at NSI udskæres, og COIN anbringes i sense-orientering; eller (b) de “andet” to par af rekombinasesteder er anbragt, således at der ved eksponering for den anden rekombinase sker det, at NSI anbringes i antisense-orientering, og COIN anbringes i sense-orientering.

8. Nukleinsyrekonstruktion ifølge krav 7, hvor det femte par af rekombinasesteder er anbragt, således at der ved eksponering for den tredje rekombinase og i fravær af eksponering for den første eller den anden rekombinase sker det, at den femte rekombinase udskærer COIN, NSI og DSC, og opretholder reporteren i sense-orientering.

9. Nukleinsyrekonstruktion ifølge krav 7, hvor nukleinsyrekonstruktionen er indsat i et gen, og konstruktionen i forhold til transkriptionsretningen af genet fra 5’ mod 3’ omfatter en reporter i sense-orientering, en DSC i sense- eller antisense-orientering, en NSI i antisense-orientering og et COIN i antisense-orientering.

10. Nukleinsyrekonstruktion ifølge krav 9, hvor DSC er i sense-orientering.

11. Nukleinsyrekonstruktion ifølge krav 7, hvor nukleinsyrekonstruktionen er indsat i et gen, og konstruktionen i forhold til transkriptionsretningen af genet fra 5’ mod 3’ omfatter et COIN i antisense-orientering, en NSI i antisense-orientering, en DSC i sense- eller antisense-orientering og en reporter i sense-orientering.

12. Nukleinsyrekonstruktion ifølge krav 11, hvor DSC er i sense-orientering.

13. Nukleinsyrekonstruktion ifølge krav 7, hvor nukleinsyrekonstruktionen er indsat i et gen, og konstruktionen i forhold til transkriptionsretningen af genet fra 5’ mod 3’ omfatter en NSI i antisense-orientering, en DSC i sense- eller antisense-orientering, en reporter i sense-orientering og et COIN i antisense-orientering.

14. Nukleinsyrekonstruktion ifølge krav 13, hvor DSC er i sense-orientering.