JP2021526815A - 進行性骨化性線維異形成症のげっ歯類モデル - Google Patents

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Abstract

部位特異的リコンビナーゼ認識部位に隣接した、アンチセンス配向でＲ２５８Ｇをコードする条件付き改変エクソン７を含む改変Ａｃｖｒ１遺伝子を含む遺伝子修飾げっ歯類が提供され、改変エクソンは、リコンビナーゼの作用時にセンス方向に反転され、異所性骨形成をもたらす。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年６月１３日に出願された米国仮出願第６２／６８４，５８２号、および２０１９年４月３日に出願された米国仮出願第６２／８２８，５３２号からの優先権の利益を主張し、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、遺伝子修飾げっ歯類動物およびヒト疾患のげっ歯類モデルに関する。より詳細には、本開示は、そのゲノムが修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含む遺伝子修飾げっ歯類、異所性骨形成などの進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）の表現型の特徴を示すげっ歯類、そのゲノムが修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含む単離されたげっ歯類組織および細胞、修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含む単離された核酸、遺伝子修飾げっ歯類を作製する成分および方法、育種する方法、ならびに遺伝子修飾げっ歯類を使用する方法に関する。
配列表の参照による組み込み
２０１９年６月６日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して米国特許商標庁に提出された３６１９０＿１０４６１ＵＳ０１＿＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称の４ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルの形態をとる配列表が、参照により本明細書に組み込まれる。
特許、特許出願、公開特許出願、受入番号、技術論文、および学術論文を含む様々な公表文献が、本明細書に引用される。これらの引用された公表文献のそれぞれは、参照により、その全体およびすべての目的のために、この文書に組み込まれる。
Ａｃｒｖ１は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のＩ型受容体である。アミノ酸修飾Ｒ２０６ＨまたはＲ２５８Ｇを生じさせる変異を含むヒトＡＣＶＲ１遺伝子の特定の変異は、進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）と強く関連している（例えば、米国特許出願出版第２００９／０２５３１３２号、Ｐｉｇｎｏｌｏ，Ｒ．Ｊ．（２０１１）Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，６：８０，１−６、およびＫａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ Ａ．２０１５；１６７（１０）：２２６５−２２７１を参照されたい）。Ａｃｖｒ１中にＲ２０６Ｈ変異を保有するキメラマウスは、ＦＯＰ様表現型を発現する（例えば、Ｃｈａｋｋａｌａｋａｌ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓ．２７：１７４６−１７５６を参照されたい）。例えば、Ｒ２０６Ｈ Ａｃｖｒ１タンパク質バリアントをもたらすＡｃｖｒ１遺伝子における特定の変異は、マウスにおいて周産期致死性であり、げっ歯類の生殖細胞系を介して変異を含むノックイン遺伝子を継ぐための課題を呈する。
米国特許出願公開第２００９／０２５３１３２号明細書
Ｐｉｇｎｏｌｏ，Ｒ．Ｊ．（２０１１）Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒａｒｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，６：８０，１−６ Ｋａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ Ａ．２０１５；１６７（１０）：２２６５−２２７１ Ｃｈａｋｋａｌａｋａｌ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓ．２７：１７４６−１７５６を
本開示は、修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含む核酸配列をその生殖系列に含む遺伝子修飾げっ歯類動物を対象とする。
修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含む核酸配列をその生殖系列に含む遺伝子修飾げっ歯類動物が提供され、修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子は、げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子の条件付き改変を含み、改変により、げっ歯類動物は異所性骨形成に対して感受性となる。
条件付き改変Ａｃｖｒ１エクソンを含む修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含む核酸配列をその生殖系列に含む遺伝子修飾げっ歯類動物が提供され、条件付き改変Ａｃｖｒ１エクソンの発現の誘導は、げっ歯類動物に異所性骨形成に対する感受性を付与する。一実施形態では、改変Ａｃｖｒ１エクソンは、エクソン７である。特定の実施形態では、改変Ａｃｖｒ１エクソン７は、Ａｃｖｒ１タンパク質におけるＲ２５８Ｇアミノ酸変化をもたらす改変を含む。
改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子を条件付きで発現するげっ歯類動物が提供される。様々な態様では、改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子は、対立遺伝子を発現するげっ歯類動物に病理学的表現型を付与する対立遺伝子である。様々な態様では、げっ歯類動物は、部位特異的リコンビナーゼ認識部位（ＳＲＲＳ’）と共に上流および下流に隣接したＡｃｖｒ１対立遺伝子の改変エクソンを含み、げっ歯類動物は、ＳＲＲＳ’を認識するリコンビナーゼを含み、リコンビナーゼの活性は誘導性である。
げっ歯類動物が、異所性骨形成を生じ（一実施形態では、ヘテロ接合体において；一実施形態では、ホモ接合体において）、促進するか、またはげっ歯類の動物をそれに対して感受性にする、げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子の修飾を含むげっ歯類動物が提供される。
げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子の条件付き改変を含むげっ歯類動物が提供され、改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子は、子宮内では発現せず、周産期に発現せず、げっ歯類の動物は、改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子を条件付き様式で発現し、条件付き発現は、げっ歯類動物に目的の化合物を投与することによって誘導される。
一態様では、そのゲノムが、アンチセンス方向の改変Ａｃｖｒ１エクソンを含む修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１座を含むげっ歯類動物が提供され、改変Ａｃｖｒ１エクソンは、ＳＲＲＳ’を認識するリコンビナーゼの作用を受けたときに反転を指示するように方向付けられたＳＲＲＳ’によって上流および下流に隣接している。
いくつかの実施形態では、そのゲノムが内因性げっ歯類Ａｃｖｒ１座内の修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含むげっ歯類動物が提供され、修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子は、センス方向で、ＳＲＲＳ’の第１の対が上流および下流に隣接した機能性Ａｃｖｒ１エクソン７と、アンチセンス方向で、ＳＲＲＳ’の第２の対が上流および下流に隣接した改変Ａｃｖｒ１エクソン７と、を含み、ＳＲＲＳ’の第１および第２の対は、リコンビナーゼが、改変Ａｃｖｒ１エクソン７をセンス方向に反転させ、機能性Ａｃｖｒ１エクソン７を削除し、改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子（すなわち、改変を含むＡｃｖｒ１対立遺伝子）をもたらすことができるように配向される。様々な実施形態では、エクソン７を除いて、修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子の残りのエクソンは、内因性げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子の機能性エクソン、例えば、内因性げっ歯類Ａｃｖｒ１座に存在する野生型げっ歯類エクソンである。様々な実施形態では、改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子は、対立遺伝子を発現するげっ歯類動物に病理学的表現型を付与する対立遺伝子である。
いくつかの実施形態では、そのゲノムが内因性げっ歯類Ａｃｖｒ１座内の修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含む遺伝子修飾げっ歯類が本明細書で提供され、修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子は、（ａ）ＳＲＲＳ’の第１の対が上流および下流に隣接した、センス方向でＲ２５８をコードする機能性Ａｃｖｒ１エクソン７と、（ｂ）ＳＲＲＳ’の第１の対とは異なるＳＲＲＳ’の第２の対に隣接した、アンチセンス方向でＲ２５８Ｇ変化をコードする改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７と、を含み、ＳＲＲＳ’の第１および第２の対は、リコンビナーゼが、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７をセンス方向に反転させ、機能性ＡＣＶＲ１エクソン７を削除し、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７を含む改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子が発現できるように配向される。いくつかの実施形態では、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７を含む改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子の発現は、異所性骨形成をもたらす。様々な実施形態では、エクソン７を除いて、修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子の残りのエクソンは、内因性げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子の機能性エクソン、例えば、内因性げっ歯類Ａｃｖｒ１座に存在する野生型げっ歯類エクソンである。
いくつかの実施形態では、Ｒ２５８をコードする機能性Ａｃｖｒ１エクソン７は、天然に発生する機能性げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７、すなわち野生型げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７である。いくつかの実施形態では、Ｒ２５８をコードする機能性Ａｃｖｒ１エクソン７は、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７である。いくつかの実施形態では、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７は、天然に発生しする、機能性ヒトＡＣＶＲ１エクソン７、すなわち野生型ヒトＡＣＶＲ１エクソン７である。他の実施形態では、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７は、野生型ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と少なくとも１つのヌクレオチド（すなわち、１つ以上のヌクレオチド）異なり、野生型ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７との間の配列同一性と比較して、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７との配列同一性が低減されている。いくつかの実施形態では、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７は、野生型ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と同じアミノ酸をコードする。
いくつかの実施形態では、ＳＲＲＳ’の第１の対は、第１のＳＲＲＳおよび第二のＳＲＲＳを含み、第１および第２のＳＲＲＳ’は、互いに互換性があり、反転を指示するように配向される。いくつかの実施形態では、ＳＲＲＳ’の第２の対は、第３のＳＲＲＳおよび第４のＳＲＲＳを含み、第３および第４のＳＲＲＳ’は、互いに互換性があり、反転を指示するように配向されているが、第１または第２のＳＲＲＳとは互換性がない。
いくつかの実施形態では、げっ歯類の生殖系列のＡｃｖｒ１座に修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含む遺伝子修飾げっ歯類が提供され、修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子は、Ａｃｖｒ１遺伝子の転写の方向に関して、（ｉ）センス方向の機能性エクソン７（例えば、実質的なヒトエクソン７）と、（ｉｉ）アンチセンス方向の改変エクソン７と、を含み、かつ第１のＳＲＲＳ（ＳＲＲＳ１）および第２のＳＲＲＳ（ＳＲＲＳ２）からなるＳＲＲＳ’の第１の対と、第３ののＳＲＲＳ（ＳＲＲＳ３）および第４のＳＲＲＳ（ＳＲＲＳ４）からなるＳＲＲＳ’の第２の対を含み、ＳＲＲＳ１はＳＲＲＳ２と互換性があり、ＳＲＲＳ３はＳＲＲＳ４と互換性がるが、ＳＲＲＳ１もＳＲＲＳ２も、ＳＲＲＳ３またはＳＲＲＳ４と互換性がなく、ＳＲＲＳ１は、機能性エクソン７の上流に位置し、ＳＲＲＳ２は、アンチセンス改変エクソン７のすぐ下流（Ａｃｖｒ１遺伝子の転写方向に関して）に位置し、ＳＲＲＳ１およびＳＲＲＳ２は、反転を指示するように配向されており、ＳＲＲＳ３は、機能性エクソン７と改変アンチセンスエクソン７との間に配置されており、ＳＲＲＳ４は、ＳＲＲＳ２の下流（Ａｃｖｒ１遺伝子の配向の方向に関して）に位置しており、ＳＲＲＳ３およびＳＲＲＳ４は、反転を指示するように配向される。いくつかの実施形態では、ＳＲＲＳ’１〜４の各々は、Ｃｒｅなどの同じリコンビナーゼによって認識される。
いくつかの実施形態では、ＳＲＲＳ’の第１の対は、Ｌｏｘ２３７２部位の対であり、ＳＲＲＳ’の第２の対は、ＬｏｘＰ部位の対である。いくつかの実施形態では、ＳＲＲＳ’の第１の対は、ＬｏｘＰ部位の対であり、ＳＲＲＳ’の第２の対は、Ｌｏｘ２３７２部位の対である。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾げっ歯類動物は、ＳＲＲＳ’を認識し、アンチセンス改変Ａｃｖｒ１エクソンをセンス方向に反転させることができる誘導性リコンビナーゼをさらに含む。一実施形態では、誘導性リコンビナーゼをコードする遺伝子は、げっ歯類の生殖細胞系にあり、例えば、内因性のげっ歯類ＲＯＳＡ２６座に組み込まれている。
リコンビナーゼの誘導性は、転写（遺伝子発現）レベル、またはタンパク質活性レベルで達成され得る。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子の発現は、誘導性であり、および／または発生的に制御され、および／または特定の組織または細胞型に特異的である。他の実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子の発現は構成的であり、リコンビナーゼの活性は誘導性である。
いくつかの実施形態では、リコンビナーゼは、Ｃｒｅである。いくつかの実施形態では、ＳＲＲＳ’は、Ｃｒｅによって認識されるｌｏｘ部位またはそのバリアントである。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ）は、リガンドによる結合に応答するリガンド結合ドメインと融合される。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ）は、ステロイド受容体、グルココルチコイド受容体、レチノイド受容体、甲状腺受容体、またはエストロゲン受容体（ＥＲ）などの受容体のリガンド結合ドメインであるリガンド結合ドメインと融合されるか、または受容体のリガンド結合ドメインに由来する。いくつかの実施形態では、Ｃｒｅは、Ｔ２変異（本明細書ではＣｒｅ−ＥＲＴ２と称される）を含むＥＲリガンド結合ドメインと融合される。Ｃｒｅ−ＥＲＴ２融合タンパク質は、リガンド、例えば、タモキシフェンまたはその機能的類似体／誘導体による結合に応答する（すなわち、それにより活性化される）。一実施形態では、ＣｒｅＥＲＴ２をコードする遺伝子は、遺伝子修飾げっ歯類のＲＯＳＡ２６座に存在する。
いくつかの実施形態では、上述の遺伝子修飾げっ歯類に由来する（すなわち、アンチセンス方向の条件付きＡｃｖｒ１改変を含む修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含む遺伝子修飾げっ歯類に由来する）変異げっ歯類が提供され、変異げっ歯類は、センス方向のＡｃｖｒ１改変を含むゲノムを有し、改変を含むＡｃｖｒ１遺伝子は、いくつかの実施形態では、異所性骨形成をもたらす変異げっ歯類で発現される。
一実施形態では、遺伝子修飾げっ歯類は、遺伝子型Ａｃｖｒ１［Ｒ２５８Ｇ］ＦｌＥｘ／＋；Ｇｔ（ＲＯＳＡ２６）ＳｏｒＣｒｅＥＲｔ２／＋を有するマウスである。
いくつかの実施形態では、機能性Ａｃｖｒ１エクソン７（例えば、子宮内および周産期）を含むＡｃｖｒ１対立遺伝子を発現する遺伝子修飾げっ歯類が提供され、リコンビナーゼによる遺伝子修飾げっ歯類の作用により、げっ歯類は、Ｒ２５８Ｇアミノ酸変化を含むバリアントＡｃｖｒ１タンパク質を発現する。
いくつかの実施形態では、Ｒ２５８Ｇ変化により特徴付けされるＡｃｖｒ１遺伝子産物を発現する成体げっ歯類が提供され、げっ歯類の細胞の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、Ｒ２５８Ｇ変化をコードする改変Ａｃｖｒ１遺伝子を含む。他の実施形態では、特定の組織または細胞型においてＲ２５８Ｇ変化により特徴付けされるＡｃｖｒ１遺伝子産物を発現する成体げっ歯類が提供される。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾げっ歯類が提供され、げっ歯類は、その生殖細胞系列に修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１座を含み、リコンビナーゼによる作用により、Ｒ２５８Ｇ変化を含むＡｃｖｒ１タンパク質を発現する。
いくつかの実施形態では、Ｒ２５８Ｇ変化を含むタンパク質バリアントを発現するげっ歯類が提供され、げっ歯類は非キメラである（すなわち、げっ歯類中の全ての細胞は、バリアントタンパク質を発現する）。いくつかの実施形態では、Ｒ２５８Ｇ変化を含むタンパク質バリアントを発現するげっ歯類が提供され、げっ歯類の細胞の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％がタンパク質バリアントを発現する。
いくつかの実施形態では、げっ歯類の生殖系列中の改変げっ歯類Ａｃｖｒ１座からタンパク質バリアントを発現するげっ歯類が提供され、げっ歯類の全てのＡｃｖｒ１発現細胞は、Ｒ２５８Ｇ変化を含むＡｃｖｒ１タンパク質をコードする修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含む。一実施形態では、げっ歯類の全ての生殖細胞は、Ｒ２５８Ｇ変化を有するＡｃｖｒ１タンパク質をコードする条件付き遺伝子修飾を含む修飾げっ歯類Ａｃｒｖ１座を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子修飾げっ歯類は、遺伝子修飾、すなわち、条件付き改変を含む修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子に対してヘテロ接合性である。いくつかの実施形態では、げっ歯類は、遺伝子修飾に対してホモ接合性である。
様々な実施形態では、遺伝子修飾げっ歯類は、マウス、ラット、およびハムスターからなる群から選択される。いくつかの特定の実施形態では、げっ歯類は、マウスである。いくつかの特定の実施形態では、げっ歯類は、ラットである。
別の態様では、本明細書に記載される修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含む核酸が本明細書に開示される。
いくつかの実施形態では、核酸中の修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子は、センス方向で、ＳＲＲＳ’の第１の対が上流および下流に隣接した機能性Ａｃｖｒ１エクソン７と、アンチセンス方向で、ＳＲＲＳ’の第２の対が上流および下流に隣接した改変Ａｃｖｒ１エクソン７と、を含み、ＳＲＲＳ’の第１および第２の対は、リコンビナーゼが、改変Ａｃｖｒ１エクソン７をセンス方向に反転させ、機能性Ａｃｖｒ１エクソン７を削除すことができるように配向される。様々な実施形態では、エクソン７を除いて、修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子の残りのエクソンは、げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子の機能性エクソン、例えば、内因性げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子の野生型エクソンである。
いくつかの実施形態では、核酸中の修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子は、（ａ）ＳＲＲＳ’の第１の対が上流および下流に隣接した、センス方向でＲ２５８をコードする機能性Ａｃｖｒ１エクソン７と、（ｂ）ＳＲＲＳ’の第１の対とは異なるＳＲＲＳ’の第２の対に隣接した、アンチセンス方向でＲ２５８Ｇ変化をコードする改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７と、を含み、ＳＲＲＳ’の第１および第２の対は、リコンビナーゼが、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７をセンス方向に反転させ、機能性ＡＣＶＲ１エクソン７を削除し、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７を含む改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子が発現できるように配向される。いくつかの実施形態では、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７を含む改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子の発現は、異所性骨形成をもたらす。様々な実施形態では、エクソン７を除いて、修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子の残りのエクソンは、げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子の機能性エクソン、例えば、げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子の野生型エクソンである。
いくつかの実施形態では、Ｒ２５８をコードする機能性Ａｃｖｒ１エクソン７は、野生型げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７である。いくつかの実施形態では、Ｒ２５８をコードする機能性Ａｃｖｒ１エクソン７は、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７である。いくつかの実施形態では、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７は、野生型ヒトＡＣＶＲ１エクソン７である。他の実施形態では、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７は、野生型ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と少なくとも１つのヌクレオチド異なり、野生型ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７との間の配列同一性と比較して、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７との配列同一性が低減されている。いくつかの実施形態では、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７は、野生型ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と同じアミノ酸をコードする。
いくつかの実施形態では、ＳＲＲＳ’の第１の対は、第１のＳＲＲＳおよび第二のＳＲＲＳを含み、第１および第２のＳＲＲＳ’は、互いに互換性があり、反転を指示するように配向される。いくつかの実施形態では、ＳＲＲＳ’の第２の対は、第３のＳＲＲＳおよび第４のＳＲＲＳを含み、第３および第４のＳＲＲＳ’は、互いに互換性があり、反転を指示するように配向されているが、第１または第２のＳＲＲＳとは互換性がない。
いくつかの実施形態では、核酸中の修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子は、Ａｃｖｒ１遺伝子の転写の方向に関して、（ｉ）センス方向の機能性エクソン７（例えば、実質的なヒトエクソン７）と、（ｉｉ）アンチセンス方向の改変エクソン７と、を含み、かつ第１のＳＲＲＳ（ＳＲＲＳ１）および第２のＳＲＲＳ（ＳＲＲＳ２）からなるＳＲＲＳ’の第１の対と、第３ののＳＲＲＳ（ＳＲＲＳ３）および第４のＳＲＲＳ（ＳＲＲＳ４）からなるＳＲＲＳ’の第２の対を含み、ＳＲＲＳ１はＳＲＲＳ２と互換性があり、ＳＲＲＳ３はＳＲＲＳ４と互換性がるが、ＳＲＲＳ１もＳＲＲＳ２も、ＳＲＲＳ３またはＳＲＲＳ４と互換性がなく、ＳＲＲＳ１は、機能性エクソン７の上流に位置し、ＳＲＲＳ２は、アンチセンス改変エクソン７のすぐ下流（Ａｃｖｒ１遺伝子の転写方向に関して）に位置し、ＳＲＲＳ１およびＳＲＲＳ２は、反転を指示するように配向されており、ＳＲＲＳ３は、機能性エクソン７と改変アンチセンスエクソン７との間に配置されており、ＳＲＲＳ４は、ＳＲＲＳ２の下流（Ａｃｖｒ１遺伝子の配向の方向に関して）に位置しており、ＳＲＲＳ３およびＳＲＲＳ４は、反転を指示するように配向される。いくつかの実施形態では、ＳＲＲＳ’１〜４の各々は、Ｃｒｅなどの同じリコンビナーゼによって認識される。
別の態様では、上述の修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含む核酸を含むげっ歯類ゲノムが本明細書に開示される。
いくつかの実施形態では、げっ歯類ゲノムは、ＳＲＲＳ’を認識する誘導性リコンビナーゼをコードする遺伝子をさらに含み、改変エクソン７を反転させ、機能性エクソン７を削除することができる。
いくつかの実施形態では、リコンビナーゼは、Ｃｒｅである。いくつかの実施形態では、ＳＲＲＳ’は、Ｃｒｅによって認識されるｌｏｘ部位またはそのバリアントである。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ）は、リガンド、例えば、Ｃｒｅ−ＥＲＴ２による結合に応答するリガンド結合ドメインと融合され、これは、タモキシフェンまたはその機能的類似体／誘導体による結合に応答する（すなわち、それによって活性化される）。一実施形態では、ＣｒｅＥＲＴ２をコードする遺伝子は、げっ歯類ゲノムのＲＯＳＡ２６座に組み込まれる。
さらなる態様では、そのゲノムが上述の核酸を含み、すなわち、組織または細胞のゲノムが修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含む、単離されたげっ歯類組織または細胞が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、単離されたげっ歯類組織または細胞は、内因性げっ歯類Ａｃｖｒ１座内に修飾Ａｃｖｒ１遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、単離されたげっ歯類細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。いくつかの実施形態では、単離されたげっ歯類組織または細胞は、げっ歯類卵子またはげっ歯類胚である。単離されたげっ歯類組織または細胞は、例えば、マウスまたはラットの組織または細胞を含む。
いくつかの実施形態では、そのゲノム中に修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含む単離されたげっ歯類組織または細胞は、センス方向で、ＳＲＲＳ’の第１の対が上流および下流に隣接した機能性Ａｃｖｒ１エクソン７と、アンチセンス方向で、ＳＲＲＳ’の第２の対が上流および下流に隣接した改変Ａｃｖｒ１エクソン７と、を含み、ＳＲＲＳ’の第１および第２の対は、リコンビナーゼが、改変Ａｃｖｒ１エクソン７をセンス方向に反転させ、機能性Ａｃｖｒ１エクソン７を削除すことができるように配向される。様々な実施形態では、エクソン７を除いて、修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子の残りのエクソンは、内因性げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子の機能性エクソン、例えば、内因性げっ歯類Ａｃｖｒ１座に存在する野生型エクソンである。
いくつかの実施形態では、そのゲノム中に修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含む単離されたげっ歯類組織または細胞は、（ａ）ＳＲＲＳ’の第１の対が上流および下流に隣接した、センス方向でＲ２５８をコードする機能性Ａｃｖｒ１エクソン７と、（ｂ）ＳＲＲＳ’の第１の対とは異なるＳＲＲＳ’の第２の対に隣接した、アンチセンス方向でＲ２５８Ｇ変化をコードする改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７と、を含み、ＳＲＲＳ’の第１および第２の対は、リコンビナーゼが、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７をセンス方向に反転させ、機能性ＡＣＶＲ１エクソン７を削除し、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７を含む改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子が発現できるように配向される。いくつかの実施形態では、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７を含む改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子の発現は、異所性骨形成をもたらす。様々な実施形態では、エクソン７を除いて、修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子の残りのエクソンは、内因性げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子の機能性エクソン、例えば、内因性げっ歯類Ａｃｖｒ１座に存在する野生型エクソンである。
いくつかの実施形態では、Ｒ２５８をコードする機能性Ａｃｖｒ１エクソン７は、野生型げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７である。いくつかの実施形態では、Ｒ２５８をコードする機能性Ａｃｖｒ１エクソン７は、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７である。いくつかの実施形態では、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７は、野生型ヒトＡＣＶＲ１エクソン７である。他の実施形態では、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７は、野生型ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と少なくとも１つのヌクレオチド異なり、野生型ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７との間の配列同一性と比較して、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７との配列同一性が低減されている。いくつかの実施形態では、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７は、野生型ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と同じアミノ酸をコードする。
いくつかの実施形態では、ＳＲＲＳ’の第１の対は、第１のＳＲＲＳおよび第二のＳＲＲＳを含み、第１および第２のＳＲＲＳ’は、互いに互換性があり、反転を指示するように配向される。いくつかの実施形態では、ＳＲＲＳ’の第２の対は、第３のＳＲＲＳおよび第４のＳＲＲＳを含み、第３および第４のＳＲＲＳ’は、互いに互換性があり、反転を指示するように配向されているが、第１または第２のＳＲＲＳとは互換性がない。
いくつかの実施形態では、そのゲノム中に修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含む単離されたげっ歯類組織または細胞は、Ａｃｖｒ１遺伝子の転写の方向に関して、（ｉ）センス方向の機能性エクソン７（例えば、実質的なヒトエクソン７）と、（ｉｉ）アンチセンス方向の改変エクソン７と、を含み、かつ第１のＳＲＲＳ（ＳＲＲＳ１）および第２のＳＲＲＳ（ＳＲＲＳ２）からなるＳＲＲＳ’の第１の対と、第３ののＳＲＲＳ（ＳＲＲＳ３）および第４のＳＲＲＳ（ＳＲＲＳ４）からなるＳＲＲＳ’の第２の対を含み、ＳＲＲＳ１はＳＲＲＳ２と互換性があり、ＳＲＲＳ３はＳＲＲＳ４と互換性がるが、ＳＲＲＳ１もＳＲＲＳ２も、ＳＲＲＳ３またはＳＲＲＳ４と互換性がなく、ＳＲＲＳ１は、機能性エクソン７の上流に位置し、ＳＲＲＳ２は、アンチセンス改変エクソン７のすぐ下流（Ａｃｖｒ１遺伝子の転写方向に関して）に位置し、ＳＲＲＳ１およびＳＲＲＳ２は、反転を指示するように配向されており、ＳＲＲＳ３は、機能性エクソン７と改変アンチセンスエクソン７との間に配置されており、ＳＲＲＳ４は、ＳＲＲＳ２の下流（Ａｃｖｒ１遺伝子の配向の方向に関して）に位置しており、ＳＲＲＳ３およびＳＲＲＳ４は、反転を指示するように配向されている。いくつかの実施形態では、ＳＲＲＳ’１〜４の各々は、Ｃｒｅなどの同じリコンビナーゼによって認識される。
さらなる態様では、げっ歯類ゲノム中のＡｃｖｒ１遺伝子の標的化修飾のための核酸構築物が本明細書に開示されており、「標的化核酸」とも称される。
いくつかの実施形態では、標的化核酸は、（ａ）ＳＲＲＳ’の第１の対が上流および下流に隣接した、センス方向でＲ２５８をコードする機能性Ａｃｖｒ１エクソン７と、（ｂ）ＳＲＲＳ’の第１の対とは異なるＳＲＲＳ’の第２の対に隣接した、アンチセンス方向でＲ２５８Ｇ変化をコードする改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７と、を含み、ＳＲＲＳ’の第１および第２の対は、リコンビナーゼが、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７をセンス方向に反転させ、機能性ＡＣＶＲ１エクソン７を削除できるように配向される。いくつかの実施形態では、機能性エクソン７および改変エクソン７は、それぞれイントロン配列に隣接している。典型的には、標的化核酸構築物は、相同アーム間の相同組み換えおよび核酸配列の組み込みを媒介する５’および３’相同性アーム（標的化される座のヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列）を含む。いくつかの実施形態では、標的化核酸構築物はまた、適切に標的化されたクローンの特定および選択を促進する選択マーカー遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、Ｒ２５８をコードする機能性Ａｃｖｒ１エクソン７は、野生型げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７である。いくつかの実施形態では、Ｒ２５８をコードする機能性Ａｃｖｒ１エクソン７は、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７である。いくつかの実施形態では、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７は、野生型ヒトＡＣＶＲ１エクソン７である。他の実施形態では、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７は、野生型ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と少なくとも１つのヌクレオチド異なり、野生型ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７との間の配列同一性と比較して、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７との配列同一性が低減されている。いくつかの実施形態では、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７は、野生型ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と同じアミノ酸をコードする。
いくつかの実施形態では、ＳＲＲＳ’の第１の対は、第１のＳＲＲＳおよび第二のＳＲＲＳを含み、第１および第２のＳＲＲＳ’は、互いに互換性があり、反転を指示するように配向される。いくつかの実施形態では、ＳＲＲＳ’の第２の対は、第３のＳＲＲＳおよび第４のＳＲＲＳを含み、第３および第４のＳＲＲＳ’は、互いに互換性があり、反転を指示するように配向されているが、第１または第２のＳＲＲＳとは互換性がない。
いくつかの実施形態では、標的化核酸は、Ａｃｖｒ１遺伝子の転写の方向に関して、（ｉ）センス方向の機能性エクソン７（例えば、実質的なヒトエクソン７）と、（ｉｉ）アンチセンス方向の改変エクソン７と、を含み、かつ第１のＳＲＲＳ（ＳＲＲＳ１）および第２のＳＲＲＳ（ＳＲＲＳ２）からなるＳＲＲＳ’の第１の対と、第３ののＳＲＲＳ（ＳＲＲＳ３）および第４のＳＲＲＳ（ＳＲＲＳ４）からなるＳＲＲＳ’の第２の対を含み、ＳＲＲＳ１はＳＲＲＳ２と互換性があり、ＳＲＲＳ３はＳＲＲＳ４と互換性がるが、ＳＲＲＳ１もＳＲＲＳ２も、ＳＲＲＳ３またはＳＲＲＳ４と互換性がなく、ＳＲＲＳ１は、機能性エクソン７の上流に位置し、ＳＲＲＳ２は、アンチセンス改変エクソン７のすぐ下流（Ａｃｖｒ１遺伝子の転写方向に関して）に位置し、ＳＲＲＳ１およびＳＲＲＳ２は、反転を指示するように配向されており、ＳＲＲＳ３は、機能性エクソン７と改変アンチセンスエクソン７との間に配置されており、ＳＲＲＳ４は、ＳＲＲＳ２の下流（Ａｃｖｒ１遺伝子の配向の方向に関して）に位置しており、ＳＲＲＳ３およびＳＲＲＳ４は、反転を指示するように配向される。いくつかの実施形態では、ＳＲＲＳ’１〜４の各々は、Ｃｒｅなどの同じリコンビナーゼによって認識される。
別の態様では、本明細書に記載される内因性げっ歯類Ａｃｖｒ１座内に修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含むようにげっ歯類ゲノムを修飾することを含む、遺伝子修飾げっ歯類を作製する方法が本明細書に開示される。
いくつかの実施形態では、げっ歯類ゲノムは、本明細書に記載される標的化核酸構築物をげっ歯類胚性幹（ＥＳ）細胞に導入することと、そのゲノムが修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含むげっ歯類ＥＳ細胞を取得することと、修飾ゲノムを含むげっ歯類ＥＳ細胞を使用して遺伝子修飾げっ歯類を作製することと、を含むプロセスにより修飾される。例えば、標的化核酸がげっ歯類ＥＳ細胞に導入され、標的化核酸は、（ａ）ＳＲＲＳ’の第１の対が上流および下流に隣接した、センス方向でＲ２５８をコードする機能性Ａｃｖｒ１エクソン７と、（ｂ）ＳＲＲＳ’の第１の対とは異なるＳＲＲＳ’の第２の対に隣接した、アンチセンス方向でＲ２５８Ｇ変化をコードする改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７と、を含み、ＳＲＲＳ’の第１および第２の対は、リコンビナーゼが、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７をセンス方向に反転させ、機能性ＡＣＶＲ１エクソン７を削除できるように配向される。そのゲノムが修飾されており、ＳＲＲＳ’の第１の対が上流および下流に隣接した、センス方向でＲ２５８をコードする機能性Ａｃｖｒ１エクソン７と、ＳＲＲＳ’の第１の対とは異なるＳＲＲＳ’の第２の対に隣接した、アンチセンス方向でＲ２５８Ｇ変化をコードする改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７と、を含む、げっ歯類ＥＳ細胞を選択することができる。かかるげっ歯類ＥＳ細胞を使用して、げっ歯類を作製することができる。
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって作製され、修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含む遺伝子修飾げっ歯類は、誘導性リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、誘導性リコンビナーゼをコードする核酸は、標的化核酸構築物が導入されたげっ歯類ＥＳ細胞のゲノム中に存在する。いくつかの実施形態では、そのゲノム中に修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含むげっ歯類は、最初に作製され、次いでそのゲノム中に誘導性リコンビナーゼをコードする核酸を含む別のげっ歯類と交配される。
いくつかの実施形態では、誘導性リコンビナーゼは、げっ歯類において活性化され、改変エクソン７を反転させ、機能性エクソンを削除し、改変（例えば、Ｒ２５８Ｇ）を含むＡｃｖｒ１タンパク質が発現できるように作用する。
さらなる態様では、取得されたげっ歯類およびげっ歯類子孫を育種する方法が本明細書に開示される。
いくつかの実施形態では、そのゲノムが修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含む第１のげっ歯類を第２のげっ歯類と育種させ、そのゲノムが修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含む子孫げっ歯類をもたらす方法が本明細書に開示される。修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子が本明細書に記載されており、例えば、修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子は、センス方向で、ＳＲＲＳ’の第１の対が上流および下流に隣接した機能性Ａｃｖｒ１エクソン７と、アンチセンス方向で、ＳＲＲＳ’の第２の対が上流および下流に隣接した改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７と、を含み得、ＳＲＲＳ’の第１および第２の対は、リコンビナーゼが、改変Ａｃｖｒ１エクソン７をセンス方向に反転させ、機能性Ａｃｖｒ１エクソン７を削除すことができるように配向される。いくつかの実施形態では、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７は、Ｒ２５８Ｇ変化をコードし、機能性Ａｃｖｒ１エクソン７は、Ｒ２５８をコードする実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７である。
いくつかの実施形態では、第２のげっ歯類は、誘導性リコンビナーゼを含む。いくつかの実施形態では、誘導性リコンビナーゼは、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼである。いくつかの実施形態では、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼは、タモキシフェンまたはその機能的誘導体もしくは類似体などのリガンドの結合によって誘導されるＣｒｅ−ＥＲＴ２リコンビナーゼである。
いくつかの実施形態では、子孫げっ歯類は、誘導性リコンビナーゼを含む。いくつかの実施形態では、誘導性リコンビナーゼは、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼである。いくつかの実施形態では、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼは、Ｃｒｅ−ＥＲＴ２リコンビナーゼである。
いくつかの実施形態では、誘導性リコンビナーゼは、細胞または組織、例えば、子孫げっ歯類の選択された細胞または組織で発現される。いくつかの実施形態では、発現されたリコンビナーゼは、細胞または組織中で作用し、改変Ａｃｖｒ１エクソン７をセンス配向に反転させ、機能性Ａｃｖｒ１エクソン７を削除し、それによって、改変エクソン７を含む改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子が発現すことができる。
また、本明細書に開示される育種方法から取得される子孫げっ歯類が本明細書に提供される。
さらに別の態様では、改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子を発現する遺伝子修飾げっ歯類動物が、異所性骨化症のモデルとして使用される。一実施例では、異所性骨化症は、進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）である。いくつかの実施形態では、改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子を発現する遺伝子修飾げっ歯類動物を使用して、候補化合物がげっ歯類における異所性骨形成の発生を阻害することができるかを決定するための候補治療化合物を評価する。
Ａｃｖｒ１野生型からＲ２５８ＧＦｌＥｘの概略図を示す。上の概略図は、ノックインおよびＮｅｏ削除後のＡｃｖｒ１ゲノム領域を示す。下の概略図は、Ｃｒｅ介在性反転および削除後のゲノム領域を示し、変異エクソンをその正常な位置および方向に配置する。ヒトエクソン（白抜きのボックス）および隣接するイントロン（白抜きのバー）配列を使用して、転写中の逆位マウスエクソン／イントロン（縞模様のボックス／縞模様のバー）配列によるヘアピン形成を低減した。マウスエクソンとの配列同一性をさらに低減させるために、ヒトエクソンに追加のヌクレオチド変更を行った。 Ａｃｖｒ１［Ｒ２５８Ｇ］ＦｌＥｘ／＋；Ｇｔ（ＲＯＳＡ２６）ＳｏｒＣｒｅＥＲｔ２／＋マウスが、タモキシフェン治療後に異所性骨化（ＨＯ）を発症したことを示す。４匹のＡｃｖｒ１［Ｒ２５８Ｇ］ＦｌＥｘ／＋；Ｇｔ（ＲＯＳＡ２６）ＳｏｒＣｒｅＥＲｔ２／＋マウスに、１日５回４０ｍｇ／ｋｇのタモキシフェン注射を投与した。２週間後、全てのマウスはＨＯ形成を示した。 抗アクチビンＡ遮断抗体が、Ａｃｖｒ１Ｒ２５８Ｇ条件付きノックインマウスにおけるＨＯ形成を阻害することを示す。
進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）は、異所性骨形成の常染色体優性障害である。およそ９５％のＦＯＰは、アクチビンＡＩ型受容体（Ａｃｖｒ１）におけるＲ２０６Ｈ変異により引き起こされる。しかしながら、Ｒ２５８Ｇを含むＧＳドメインまたはキナーゼドメインのいずれかにおけるいくつかの他の変異は、より重度の表現型を伴う非定型ＦＯＰを引き起こすことが報告されている。Ｒ２５８Ｇ変異を有する２人の患者は、出生後の異所性骨化の発症に加えて、深刻な発達異常を有する（Ｋａｐｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｇｅｎｅｔ Ａ．２０１５；１６７（１０）：２２６５−２２７１）。
異所性骨形成を特徴とする障害、例えばＦＯＰをもたらす変化を含むＡｃｖｒ１タンパク質を発現することができる遺伝子修飾げっ歯類が提供される。いくつかの実施形態では、改変Ａｃｖｒ１タンパク質を発現するげっ歯類は、キメラではないげっ歯類、例えば、そのゲノムが、一旦発現されるとげっ歯類において異所性骨形成をもたらす条件付き改変を含む修飾Ａｃｖｒ１遺伝子を担持するげっ歯類を含む。
機能性エクソンの条件付き削除および機能性エクソンの改変エキソンによる置換を提供するＦｌＥｘ設計を含む遺伝子修飾げっ歯類が提供される。機能性エクソンは、機能性である、すなわち、その期待される生物学的機能を果たすタンパク質のアミノ酸をコードする。いくつかの実施形態では、機能性エクソンは、天然に発生する野生型エクソンである。いくつかの実施形態では、機能性エクソンは、野生型エクソンと同じアミノ酸をコードする。ＦｌＥｘは、アンチセンス鎖内の改変エクソン（ここでは「逆改変エクソン」と称される）をコードする核酸配列を、後に削除される機能性エクソンの隣に配置することにより、条件付き対立遺伝子を形成することを可能にする。選択された部位特異的リコンビナーゼ認識部位（ＳＲＲＳ’）を利用することにより、それらの同族リコンビナーゼの存在下で、逆改変エクソンがセンス鎖に運ばれ、したがって残りの遺伝子と共にフレーム内にも取り込まれ、機能性エクソンは削除される。このＦｌＥｘアプローチは、機能性および改変エクソンを囲む互換性のないＳＲＲＳ’（例えば、ｌｏｘ２３７２およびｌｏｘＰ）の配置に依存する。したがって、ＦｌＥｘアプローチの１つの利点は、ＦｌＥｘ対立遺伝子が選択されたリコンビナーゼ（複数可）によって作用されない限り、（周産期／胚性）致死性変異は発現しないことである。このＦｌＥｘアプローチの別の利点は、選択されたリコンビナーゼへの曝露時に機能エクソンを永久的に除去することであり、したがって、逆転後のゲノムに逆方向反復が残らないため、野生型アレルを再生成する可能性が排除される。またＦｌＥｘアプローチの別の利点は、２つの異なる型のＳＲＲＳのそれぞれのうちの１つ（例えば、２つのｌｏｘ２３７２部位のうちの１つ、およびｌｏｘＰ部位のうちの１つ）の除去から生じる、センス鎖における改変エクソンの永久固定である。また、野生型げっ歯類エクソンのヒト化によって誘導される機能エクソンは、逆方向反復配列を最小化し、それによってクローニングステップを容易にし、標的化中および標的化後の再配列の懸念、ならびに対応するｍＲＮＡの成熟中のＲＮＡスプライシングアーティファクトを軽減する。いくつかの実施形態では、実質的なヒト野生型エクソンが、ＦｌＥｘ設計に使用される。「ヒト野生型エクソン」または「ヒトエクソン」は、ヒト由来の天然に発生する機能性エクソンを指す。「実質的なヒト野生型エクソン」または「実質的なヒトエクソン」という用語は、天然に発生する、機能性ヒトエクソンおよびその修飾形態の両方を含み、天然に発生するヒトエクソンの１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上）ヌクレオチドが改変されている。特定の実施形態では、１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上）ヌクレオチドは、コードされたアミノ酸（本質的な改変コドン選択）を変更することなく改変されており、げっ歯類エクソンとの配列同一性を減少させ、これにより、逆方向反復配列がさらに最小化され、再構成の可能性が低減される。
ＦｌＥｘ対立遺伝子を保有するげっ歯類をリコンビナーゼ含有げっ歯類と育種させた場合、改変対立遺伝子が子宮内の子孫で発現され、改変が周産期／胚性致死性改変である場合、対立遺伝子を発現する研究可能な動物を作製する目的が損なわれ得る。したがって、ＦｌＥｘ対立遺伝子を保有するげっ歯類は、非制御リコンビナーゼ含有げっ歯類と育種されない。代わりに、ＦｌＥｘ対立遺伝子を保有するげっ歯類は、その活性が誘導性である（例えば、誘導物質に応答する）（すなわち、誘導性リコンビナーゼ）リコンビナーゼを発現するげっ歯類と育種される。誘導性リコンビナーゼは、リコンビナーゼをタンパク質のリガンド結合ドメインと融合することによって作製することができ、その同族リガンドまたは同族リガンドの機能的誘導体と結合すると、タンパク質を機能的にする（例えば、タンパク質を安定化することによって）。同族リガンドの機能的誘導体は、構造が類似しており、同族リガンドと実質的に同じ機能（すなわち、同じ受容体への結合）を実行する化合物を指す。かかるリガンド結合ドメインの例には、ステロイド受容体、グルココルチコイド受容体、レチノイド受容体、および甲状腺受容体のリガンド結合ドメインが含まれるが、これらに限定されない（Ｅｉｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４０：６６−６８、Ｐｉｃａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｃｅｌｌ ５４：１０７３−１０８０）。いくつかの実施形態では、誘導性リコンビナーゼは、Ｃｒｅと、Ｔ２変異（Ｃｒｅ−ＥＲＴ２対立遺伝子によりコードされる）で修飾されたエストロゲン受容体（ＥＲ）との間の融合タンパク質である。この融合タンパク質では、Ｃｒｅリコンビナーゼは、ＥＲのリガンドの非存在下では不活性であり（Ｉｎｄｒａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７（２２）：４３２４−４３２７、Ｆｅｉｌ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３７：７５２−７５７、米国特許第７，１１２，７１５号）、Ｃｒｅリコンビナーゼは、ＥＲのリガンド、例えば、タモキシフェン、またはタモキシフェンの機能的誘導体と共に提供されると活性になる。したがって、本明細書に記載されるようにＣｒｅ応答性ＳＲＲＳ’で構築され、Ｃｒｅ−ＥＲＴ２対立遺伝子を含有する条件付き対立遺伝子を含むげっ歯類は、げっ歯類がＥＲのリガンドに曝露されてＣｒｅ活性を誘導しない限り、機能エクソンを含む対立遺伝子を発現することになる。このようにして、げっ歯類は、その生殖系列内に修飾Ａｃｖｒ１遺伝子を含有するが、げっ歯類がＥＲ（例えば、タモキシフェン）のリガンドに曝露されない限り、かつ曝露されるまで、対応するバリアントＡｃｖｒ１タンパク質を発現しないげっ歯類が生成される。リガンドへの曝露後、Ｃｒｅ−ＥＲＴ２融合タンパク質が活性化され、条件付き対立遺伝子が対応する改変対立遺伝子に変換される。
リガンドは、非経口および非経口でない投与経路を含む、リコンビナーゼの活性を誘導するために様々な経路を介してげっ歯類に投与することができる。非経口経路には、例えば、静脈内、動脈内、門脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄内、髄腔内、脳室内、頭蓋内、胸膜内、または他の注射経路が含まれる。非経口でない経路には、例えば、経口、鼻、経皮、肺、直腸、頬側、膣、眼球が含まれる。特定の実施形態では、リガンドは、腹腔内注射を介してげっ歯類に投与される。
様々な実施形態では、改変対立遺伝子への変換は不可逆的であり、機能性エクソンが削除される。このようにして、致死性Ａｃｖｒ１変異を含有するげっ歯類系統は、実質的に無期限に維持され、所望される遺伝子病変および所望されるときにいつでも付随する表現型を生成することができる。
本明細書で提供されるげっ歯類には、例えば、マウス、ラット、およびハムスターが含まれる。育種実施形態では、げっ歯類は、マウスまたはラットである。特定の実施形態では、げっ歯類は、マウスである。Ａｃｖｒ１は、種間で高度に保存されており、Ｒ２５８は、マウスおよびラットで保存されており、同じ位置である。
いくつかの実施形態では、げっ歯類は、Ｃ５７ＢＬ系統、例えば、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスである。別の実施形態では、げっ歯類は、１２９系統、例えば、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９／ＳｖＪａｅ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２からなる群から選択される１２９系統のマウスである（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０：８３６、Ａｕｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９（５）：１０２４−１０２８，１０３０，１０３２を参照されたい）。いくつかの実施形態では、げっ歯類は、前述の１２９系統および前述のＣ５７ＢＬ／６系統を混合したマウスである。特定の実施形態では、マウスは、前述の１２９系統の混合（すなわち、交雑）、または前述のＣ５７ＢＬ系統の混合、またはＣ５７ＢＬ系統および１２９系統の混合である。特定の実施形態では、当該マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６系統と１２９系統の混合である。特定の実施形態では、マウスは、ＶＧＦ１系統であり、これは、Ｃ５７ＢＬ／６および１２９の交雑であるＦ１Ｈ４系統としても知られる。他の実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統、例えばＢＡＬＢ／ｃ系統である。いくつかの実施形態では、マウスは、ＢＡＬＢ系統および別の前述の系統の混合である。
いくつかの実施形態では、げっ歯類は、ラットである。特定の実施形態では、ラットは、Ｗｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉから選択される。他の実施形態では、ラットは、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、およびＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される２つ以上の系統の混合である。
Ｒ２５８Ｇ変化を含む条件付きＡｃｖｒ１対立遺伝子は、ＦｌＥｘ法を利用して操作することができる。例えば、Ｓｃｈｎｕｔｇｅｎ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：５６２−５６５、および米国特許第７，２０５，１４８号を参照されたい。ＦｌＥｘは、同じリコンビナーゼ（Ｃｒｅ）によって認識されるが、互いに反応せず、Ａ−Ｂ／［Ａ−Ｂ］構成で配置された、ＦｌＥｘアレイと称される変異Ｌｏｘ部位の対を採用しており、「［Ａ−Ｂ］」は「Ａ−Ｂ」に対して反対の鎖にあり、アレイに隣接するＤＮＡ配列の反転を可能にする。いくつかの実施形態において、ＬｏｘＰ−Ｌｏｘ２３７２の対は、本明細書に記載される条件付き対立遺伝子に対する変異Ｌｏｘ部位の組み合わせとして使用される。これら２つの変異Ｌｏｘ部位は、交差反応性を示さない。各アレイ内、すなわち各アレイのＬｏｘＰとＬｏｘ２３７２部位との間に含まれる配列は、Ｃｒｅによって作用が行われると削除される。条件付き対立遺伝子の一実施形態が図１に示される。
マウスＡｃｖｒ１は、様々なスプライスバリアント（例えば、Ａｃｖｒ１−２０１、２０２、２０３、２０４）を示す。ＦＯＰで変異したエクソンは、Ａｃｖｒ１の全てのタンパク質コード化スプライスバリアントによって共有される。一実施形態では、アイソフォームＡｃｖｒ１−２０１のエクソン７（ＥＮＳＭＵＳＥ００００１２３２４４９）の修飾を含む条件付きＡｃｖｒ１対立遺伝子が本明細書に開示される。
Ａｃｖｒ１［Ｒ２５８Ｇ］ＦｌＥｘ対立遺伝子は、げっ歯類Ａｃｖｒ１（例えば、ＥＮＳＭＵＳＥ００００１２３２４４９）のアミノ酸２５８コード化エクソンの改変版をアンチセンス鎖に配置することによって操作することができ、それにより改変エクソンはＡｃｖｒ１の転写物に組み込まれない。エクソン７によってコードされる配列がＡｃｖｒ１機能に必要とされるため、機能性エクソン７も設計に組み込まれることが必要である（エクソン７は、Ａｃｖｒ１のすべてのタンパク質コード化スプライスバリアントによって共有される）。さらに、エクソンは補助イントロン配列なしではそのように認識されないため、エクソンの上流および下流の配列も、改変および機能性アミノ酸２５８コード化エクソンの両方に組み込まれる。しかしながら、そうすることで、大きな逆方向反復が生成され、かかるＤＮＡ構造は、標的化ベクターの構築に必要な遺伝子操作ステップ、および標的化後のインビボでの両方で、本質的な組換えを起こしやすい傾向がある（Ｈｏｌｋｅｒｓ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４０：１９８４−１９９９）。さらに、アミノ酸２５８コード化エクソンの野生型げっ歯類配列、およびエクソンと関連する上流および下流のイントロン配列が無傷で保持され、改変げっ歯類エクソンに先行する場合、この野生型領域は、相同性アームとして作用し、げっ歯類ＥＳ細胞における標的化中に利用され得、それによって、改変エクソンが標的化対立遺伝子から除外される。
したがって、Ａｃｖｒ１［Ｒ２５８Ｇ］ＦｌＥｘ対立遺伝子は、以下のような様式で設計できる：
ａ）大きな逆方向反復は回避される。これを達成するために、Ｒ２５８コード化エクソン（例えば、ＥＮＳＭＵＳＥ００００１２３２４４９）ならびに関連する上流および下流のイントロン配列を、ヒトＡＣＶＲ１からの対応する領域と置換することができる。
ｂ）Ｒ２５８コード化エクソン（例えば、ＥＮＳＭＵＳＥ００００１２３２４４９）の野生型げっ歯類配列は、タンパク質レベルで保存される。エクソンＥＮＳＭＵＳＥ００００１２３２４４９およびＥＮＳＥ００００１００９６１７によってコードされるマウスおよびヒトのタンパク質配列はそれぞれ同一である。しかしながら、可能な場合、ヒトエクソン配列（例えば、ＥＮＳＥ００００１００９６１７）内のコドンは、エクソンによってコードされるアミノ酸を改変することなく、げっ歯類とヒトエクソンとの間のヌクレオチド配列同一性をさらに減少させるように改変され得る。
ｃ）導入されたヒト配列は、Ｃｒｅによる作用で完全に削除される。したがって、Ａｃｖｒ１［Ｒ２５８Ｇ］変異遺伝子が転写される「条件付きオン」状態においては、ヒト配列は残らず、結果として生じる表現型は、無関係な配列の存在に起因するものではない。
より詳細には、例として、ｍｍｕＡｃｖｒ１におけるヌクレオチド５８４６８３９９〜５８４６８７７０（すなわち、マウス染色体２のヌクレオチド５８４６８３９９〜５８４６８７７０、ＧＲＣｍ３８／ｍｍ１０）により囲まれた領域を、ｈｓａＡＣＶＲ１エクソンＥＮＳＥ００００１００９６１７を含む導入された配列が、結果として生じる修飾Ａｃｖｒ１［Ｒ２５８Ｇ］ＦｌＥｘ座の一部として転写されるような方法で、ｈｓａＡＣＶＲ１のヌクレオチド１５７７７０２５２〜１５７７７０６２５（すなわち、ヒト２番染色体のヌクレオチド１５７７７０２５２〜１５７７７０６２５、ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）で構成される核酸に置換した。さらに、コドン選択を改変することにより、ヒトエクソンＥＮＳＥ００００１００９６１７のヌクレオチド配列を改変し、コードされたタンパク質を改変することなく、マウスとヒトエクソンとの間の配列同一性を低減した。この導入したヒト配列を、以降、ｈｓａ＿ｅ７＋と称した。したがって、ＦｌＥｘ要素（改変エクソンＥＮＳＭＵＳＥ００００１２３２４４９ならびに関連する上流および下流のイントロン配列−以下を参照）の反転の前に、結果として生じる座Ａｃｖｒ１［Ｒ２５８Ｇ］ＦｌＥｘは、野生型として機能するべきである。
Ｒ２５８Ｇ変化を、ヌクレオチド５８４６８５３０〜５８４６８５３２によって定義されるコドンをＡＧＧ（アルギニンをコードする）からＧＧＧ（グリシンをコードする）に改変することにより、対応する位置でエクソンＥＮＳＭＵＳＥ００００１２３２４４９を改変することによってモデル化した。得られた変異エクソンを、隣接するイントロン配列と共に、ｈｓａ＿ｅ７＋の３’側およびｍｍｕＡｃｖｒ１のアンチセンス鎖に配置した。さらに、ＬＯＡプローブに対応する小さな削除を作製するために、ｍｍｕＡｃｖｒ１のヌクレオチド５８４６８７７１〜５８４６８８１５を削除した（Ｇｏｍｅｚ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６：ｅ１１７、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：６５２−６５９）。この導入した変異マウス配列は、以後、ｍｍｕ＿ｅ７Ｒ２５８Ｇ＋と称した。
ヒトエクソン７、Ｒ２５８Ｇをコードする改変マウスエクソン７、および改変ヒトエクソン７の例示的な配列を、上流および下流イントロン配列と共に以下に要約し、配列表に記載する。
配列番号の説明
１ ヒトエクソン７
２ コドン改変を有するヒトエクソン７
３ コドン改変エクソン７および周囲のイントロンを含むヒト配列
４ Ｒ２５８Ｇをエンコードするマウス改変エクソン７
５ マウス改変エクソン７（構築物中で逆転）
６ 改変エクソン７および周囲のイントロンを含むマウス配列
７ 改変エクソン７および周囲のイントロンを含むマウス配列（構築物中で逆転）
８ ヒトエクソン７
ｍｍｕ＿ｅ７Ｒ２５８Ｇ＋のＣｒｅ依存性反転およびｈｓａ＿ｅ７＋の同時削除を可能にするために、ＬｏｘアレイのようなＦｌＥｘの組み合わせを以下のように使用した：
ａ）ｈｓａ＿ｅ７＋は、ＬｏｘＰ部位が前にあり、Ｌｏｘ２３７２部位がそれに続く。この点において、ｈｓａ＿ｅ７＋は５’ＬｏｘＰ−Ｌｏｘ２３７２ ＦｌＥｘ様アレイに収容される。
ｂ）ｍｍｕ＿ｅ７Ｒ２５８Ｇ＋は、３’ＬｏｘＰ−Ｌｏｘ２３７２ ＦｌＥｘ−様アレイが続くが、このアレイは、５’ＬｏｘＰ−Ｌｏｘ２３７２ ＦｌＥｘ−様アレイに対する鏡像構成になるように設計されている。これにより、Ｃｒｅによるｍｍｕ＿ｅ７Ｒ２５８Ｇ＋のセンス鎖への永続的な反転が可能になる。
得られた対立遺伝子Ａｃｖｒ１［Ｒ２５８Ｇ］ＦｌＥｘがＣｒｅに曝露されると、ｈｓａ＿ｅ７＋は削除され、ｍｍｕ＿ｅ７Ｒ２５８Ｇ＋はセンス鎖に反転される。結果として、Ａｃｖｒ１［Ｒ２５８Ｇ］はＡｃｖｒ１の代わりに表現される。
上述のＡｃｖｒ１ ＦｌＥｘ対立遺伝子を含む標的化核酸構築物は、げっ歯類ゲノム内にＡｃｖｒ１ ＦｌＥｘ対立遺伝子を導入するために作製することができる。Ａｃｖｒ１ ＦｌＥｘ配列（センス方向および周囲のイントロン配列の実質的なヒトエクソン７、アンチセンス方向でＲ２５８Ｇをコードし、周囲のイントロン配列の改変げっ歯類エクソン７、ならびに組換え認識部位）に加えて、核酸構築物は、内因性げっ歯類Ａｃｖｒ１座へのＡｃｖｒ１ＦｌＥｘ配列の相同組換えおよび組み込みを媒介することができるように、好適な長さであり、内因性げっ歯類Ａｃｖｒ１座でげっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子配列と相同である隣接配列を含むことができる。
いくつかの実施形態では、Ａｃｖｒ１ ＦｌＥｘ対立遺伝子を含む標的化核酸構築物は、げっ歯類胚性幹（ＥＳ）細胞に導入され、ＥＳ細胞のゲノムを修飾する。マウスＥＳ細胞およびラットＥＳ細胞の両方が当技術分野で記載されている。例えば、米国特許第７，５７６，２５９号、第７，６５９，４４２号、および第７，２９４，７５４号、ならびに米国公開第２００８／００７８０００ Ａ１号（その全ては参照により本明細書に組み込まれる）は、マウスＥＳ細胞および遺伝子修飾マウスを作製するためのＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）方法を記載しており、米国公開第２０１４／０２３５９３３ Ａ１号および米国公開第２０１４／０３１０８２８ Ａ１号（その全ては参照により本明細書に組み込まれる）は、ラットＥＳ細胞および遺伝子修飾ラットを作製する方法を記載しているので参照されたい。
内因性げっ歯類Ａｃｖｒ１座位内に組み込まれたＡｃｖｒ１ＦｌＥｘ対立遺伝子を有するＥＳ細胞を選択することができる。次に、ゲノムに組み込まれたＡｃｖｒ１ ＦｌＥｘ対立遺伝子を有するＥＳ細胞は、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法（例えば、米国特許第７，５７６，２５９号、第７，６５９，４４２号、および第７，２９４，７５４号、ならびに米国公開２００８／００７８０００ Ａ１号を参照されたい）、または米国公開第２０１４／０２３５９３３ Ａ１号および第２０１４／０３１０８２８ Ａ１号に記載される方法を使用して、桑実胚前期胚（例えば、８細胞期胚）に注射するためのドナーＥＳ細胞として使用される。ドナーＥＳ細胞を含む胚は、胚盤胞期まで培養し、次に代理母に移植して、完全にドナーＥＳ細胞に由来するＦ０げっ歯類を産生する。ＦｌＥｘ対立遺伝子を持つげっ歯類の子は、例えば、対立遺伝子アッセイの喪失を用いて、尾部断片から単離されたＤＮＡの遺伝子型決定によって特定することができる（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．，前述）。
様々な実施形態では、Ａｃｖｒ１ ＦｌＥｘ対立遺伝子を含む遺伝子修飾げっ歯類は、ＦｌＥｘ対立遺伝子を含むようにげっ歯類ＥＳ細胞を修飾し、誘導性リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ−ＥＲＴ２）をコードする遺伝子を含むように同じＥＳ細胞を修飾し、ＥＳ細胞をドナー細胞として使用して、ＦｌＥｘ対立遺伝子および誘導性リコンビナーゼをコードする遺伝子を含むげっ歯類を作製することによって作製される。いくつかの実施形態では、Ａｃｖｒ１ ＦｌＥｘ対立遺伝子を含む遺伝子修飾げっ歯類は、誘導性リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ−ＥＲＴ２）をコードする遺伝子を既に含むげっ歯類ＥＳ細胞を使用して作製され、かかるげっ歯類ＥＳ細胞を修飾してＦｌＥｘ対立遺伝子を含むように作製される。他の実施形態では、Ａｃｖｒ１ ＦｌＥｘ対立遺伝子を含む遺伝子修飾げっ歯類が作製され、誘導性リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ−ＥＲＴ２）をコードする遺伝子を含むげっ歯類と交配されて、ＦｌＥｘ対立遺伝子および誘導性リコンビナーゼをコードする遺伝子を含む子孫が取得される。
Ａｃｖｒ１Ｒ２５８ＧＦｌＥｘ／＋；Ｇｔ（ＲＯＳＡ２６）ＳｏｒＣｒｅＥＲｔ２／＋成体マウスは表現型は正常であったが、Ｒ２５８Ｇコード化Ａｃｖｒ１対立遺伝子の全身の活性化は進行性骨化をもたらし、米国特許第９，５１０，５６９号に記載されるＡｃｖｒ１Ｒ２０６Ｈ Ｆｌｅｘマウスで見られるのと同様の方法で、タモキシフェン投与後２週間という早い時期にエックス線撮影で明らかとなった。図２も参照されたい。
本明細書に提供されるげっ歯類は、ＦＯＰなどの異所性骨障害の発生の根底にある分子機構をよりよく理解することを可能にする。さらに、かかるげっ歯類は、ＦＯＰを含む異所性骨障害の阻害、予防、および／または治療のための治療化合物のスクリーニングおよび開発に使用することができる。
いくつかの実施形態では、候補治療化合物は、本明細書に開示されるげっ歯類、すなわち、Ａｃｖｒ１ ＦｌＥｘ対立遺伝子を保有するげっ歯類に化合物を投与することによって、インビボで試験される。
候補治療化合物は、これらに限定されないが、小分子化合物、抗体、阻害性核酸、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。特定の実施形態では、化合物は、抗体またはその抗原結合断片、例えば、抗Ａｃｖｒ１抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、化合物は、アクチビン受容体１、アクチビン受容体２Ａ型、およびアクチビン受容体２Ｂ型のうちの１つ以上のアンタゴニストを含む。任意のかかるアンタゴニストは、抗体を含み得る。いくつかの実施形態では、化合物は、アクチビンＡに対する抗体を含む。アクチビン受容体１に対する、アクチビン受容体２Ａ型に対する、アクチビン受容体２Ｂ型に対する、またはアクチビンＡに対するアンタゴニストまたは抗体は、米国特許 第２０１８／０１１１９８３号に記載または例示される任意のアンタゴニストまたは抗体であり得る。
化合物の投与は、げっ歯類におけるリコンビナーゼ活性の誘導の前、最中、または後に実施して、変異Ａｃｖｒ１対立遺伝子の発現を可能にし得る。候補治療化合物は、非経口および非経口でない投与経路を含む任意の所望の投与経路を介して投与することができる。非経口経路には、例えば、静脈内、動脈内、門脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄内、髄腔内、脳室内、頭蓋内、胸膜内、または他の注射経路が含まれる。非経口でない経路には、例えば、経口、鼻、経皮、肺、直腸、頬側、膣、眼球が含まれる。投与は、連続注入、局所投与、インプラント（ゲル、膜など）からの持続放出、および／または静脈内注射によるものであり得る。
記載したげっ歯類動物から得られた試料を使用して、投与された化合物の薬物動態特性を決定するために、様々なアッセイを実施することができる。薬物動態特性としては、これらに限定されないが、非ヒト動物がどのように薬剤を処理して様々な代謝物にするか（または、限定されないが有毒代謝物を含む１つ以上の薬剤代謝物の有無の検出）、化合物の半減期、循環レベル（例えば、血清濃度）、抗化合物応答（例えば、抗体）、吸収および分布、投与経路、排泄および／またはクリアランスの経路が含まれる。
いくつかの実施形態では、アッセイを行うことは、化合物が投与された変異げっ歯類動物と、化合物が投与されていない変異げっ歯類動物との間の差を決定すること、および化合物がげっ歯類における異所性骨形成の発症および／または進行を阻害できるかを決定することが含まれる。
本明細書は、限定するものとして解釈すべきではない以下の実施例により、さらに例示される。全ての引用参考文献（本出願全体で引用される文献参照、発行特許、および公表された特許出願を含む）は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
実施例１
ｍｍｕＡｃｖｒ１におけるヌクレオチド５８４６８３９９〜５８４６８７７０（すなわち、マウス染色体２のヌクレオチド５８４６８３９９〜５８４６８７７０、ＧＲＣｍ３８／ｍｍ１０）により囲まれた領域を、ｈｓａＡＣＶＲ１エクソンＥＮＳＥ００００１００９６１７を含む導入された配列が、結果として生じる修飾Ａｃｖｒ１［Ｒ２５８Ｇ］ＦｌＥｘ座の一部として転写されるような方法で、ｈｓａＡＣＶＲ１のヌクレオチド１５７７７０２５２〜１５７７７０６２５（すなわち、ヒト２番染色体のヌクレオチド１５７７７０２５２〜１５７７７０６２５、ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）で構成される核酸に置換した。さらに、コドン選択を改変することにより、ヒトエクソンＥＮＳＥ００００１００９６１７のヌクレオチド配列を改変し、コードされたタンパク質を改変することなく、マウスとヒトエクソンとの間の配列同一性を低減した。この導入したヒト配列を、以降、ｈｓａ＿ｅ７＋と称した。したがって、ＦｌＥｘ要素（改変エクソンＥＮＳＭＵＳＥ００００１２３２４４９ならびに関連する上流および下流のイントロン配列−以下を参照）の反転の前に、結果として生じる座Ａｃｖｒ１［Ｒ２５８Ｇ］ＦｌＥｘは、野生型として機能するべきである。
Ｒ２５８Ｇ変化を、ヌクレオチド５８４６８５３０〜５８４６８５３２によって定義されるコドンをＡＧＧ（アルギニンをコードする）からＧＧＧ（グリシンをコードする）に改変することにより、対応する位置でエクソンＥＮＳＭＵＳＥ００００１２３２４４９を改変することによってモデル化した。得られた改変エクソンを、隣接するイントロン配列と共に、ｈｓａ＿ｅ７＋の３’側およびｍｍｕＡｃｖｒ１のアンチセンス鎖に配置した。さらに、ＬＯＡプローブに対応する小さな削除を作製するために、ｍｍｕＡｃｖｒ１のヌクレオチド５８４６８７７１〜５８４６８８１５を削除した（Ｇｏｍｅｚ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６：ｅ１１７、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１：６５２−６５９）。この導入した変異マウス配列は、以後、ｍｍｕ＿ｅ７Ｒ２５８Ｇ＋と称した。
ｍｍｕ＿ｅ７Ｒ２５８Ｇ＋のＣｒｅ依存性反転およびｈｓａ＿ｅ７＋の同時削除を可能にするために、ＬｏｘアレイのようなＦｌＥｘの組み合わせを以下のように使用した：
ａ）ｈｓａ＿ｅ７＋は、ＬｏｘＰ部位が前にあり、Ｌｏｘ２３７２部位がそれに続く。この点において、ｈｓａ＿ｅ７＋は５’ＬｏｘＰ−Ｌｏｘ２３７２ ＦｌＥｘ様アレイに収容される。
ｂ）ｍｍｕ＿ｅ７Ｒ２５８Ｇ＋は、３’ＬｏｘＰ−Ｌｏｘ２３７２ ＦｌＥｘ−様アレイが続くが、このアレイは、５’ＬｏｘＰ−Ｌｏｘ２３７２ ＦｌＥｘ−様アレイに対する鏡像構成になるように設計されている。これにより、Ｃｒｅによるｍｍｕ＿ｅ７Ｒ２５８Ｇ＋のセンス鎖への永続的な反転が可能になる。
得られた対立遺伝子Ａｃｖｒ１［Ｒ２５８Ｇ］ＦｌＥｘがＣｒｅに曝露されると、ｈｓａ＿ｅ７＋は削除され、ｍｍｕ＿ｅ７Ｒ２５８Ｇ＋はセンス鎖に反転される。結果として、Ａｃｖｒ１［Ｒ２５８Ｇ］はＡｃｖｒ１の代わりに表現される。
ホモ接合性Ａｃｖｒ１［Ｒ２５８Ｇ］ＦｌＥｘ／Ｒ２５８Ｇ］ＦｌＥｘ］マウスは、このマウスではスプライシングが正常であり、野生型Ａｃｖｒ１が発現していたことを示唆して、予想したメンデル比で出生した。
実施例２
Ａｃｖｒ１［Ｒ２５８Ｇ］ＦｌＥｘマウスにおいてＦＯＰを誘導する
Ａｃｖｒ１［Ｒ２５８Ｇ］ＦｌＥｘ対立遺伝子の時間制御されるが全身での反転を可能にするために、Ａｃｖｒ１［Ｒ２５８Ｇ］ＦｌＥｘマウスをＧｔ（ＲＯＳＡ２６）ＳｏｒＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスと交配させ、Ａｃｖｒ１［Ｒ２５８Ｇ］ＦｌＥｘ；Ｇｔ（ＲＯＳＡ２６）ＳｏｒＣｒｅＥＲＴ２／＋を生成した。これらは、混合−Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ−１２９Ｓ６／ＳｖＥｖＴａｃバックグラウンドでヘテロ接合性に維持された。全ての実験は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎの動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）に従って実施した。雄および雌マウスは共に８〜１１週齢で使用したが、マウスは年齢および性別を群間で一致させた。年齢および性別に関連する表現型は認められなかった。モデルは、Ｒ２５８Ｇコード化エクソンをセンス鎖に反転させることによって開始され、これはＡｃｖｒ１［Ｒ２５８Ｇ］ＦｌＥｘ；Ｇｔ（ＲＯＳＡ２６）ＳｏｒＣｒｅＥＲＴ２／＋マウスを、油中の４０ｍｇ／ｋｇのタモキシフェン（Ｓｉｇｍａ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）に５日間処理することによって達成した（ＣｒｅＥＲＴ２を活性化するため）。異所性骨形成を評価するために、マウスをイソフルオランで麻酔し、インビボμＣＴ（Ｑｕａｎｔｕｍ ＦＸ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、６０ｍｍ×１２０ｍｍの視野で全身スキャンした。Ｘ線源を、電流１６０μＡ、電圧９０ ｋＶｐ、ボクセルサイズ１２０または２４０μｍに設定した。
Ａｃｖｒ１Ｒ２５８ＧＦｌＥｘ／＋；Ｇｔ（ＲＯＳＡ２６）ＳｏｒＣｒｅＥＲｔ２／＋成体マウスは表現型は正常であったが、Ｒ２５８Ｇ変異Ａｃｖｒ１対立遺伝子の全身の活性化は進行性骨化をもたらし、米国特許第９，５１０，５６９号に記載されるＡｃｖｒ１Ｒ２０６ＨＦｌｅｘマウスで見られるのと同様の方法で、タモキシフェン投与後２週間という早い時期にエックス線撮影で明らかとなった。図２も参照されたい。
マウスの抗体投与
治療試験では、Ａｃｖｒ１［Ｒ２５８Ｇ］ＦｌＥｘ／＋；ＲｏｓａＣｒｅＥＲＴ２マウスを、分離し、群間で年齢と性別の一致を確認し、タモキシフェン投与と同日に治療を開始した。マウスに、ヒトアクチビンＡに対して生成された中和抗体（米国特許出願第２０１５／００３７３３９号）またはアイソタイプ対照抗体のいずれか２５ｍｇ／ｋｇを週に１回、６週間皮下（ｓ．ｃ．）注射した。異所性骨形成をインビボμＣＴイメージングによって週に１回モニタリングした。
図３に示すように、アイソタイプ対照抗体を受容したマウスは、４週間でＨＯを発症し、アクチビンＡを遮断する抗体を受容したマウスは、４週間後にμＣＴバックグラウンドを上回るＨＯ形成を検出しなかった。
要約すると、ＡＣＶＲ１Ｒ２０６ＨまたはＡＣＶＲ１Ｒ２５８Ｇの条件付きノックイン対立遺伝子は、マウスなどのげっ歯類における進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）を忠実にモデル化し、アクチビンＡ中和抗体は、かかるげっ歯類モデルにおける異所性骨化の発症を遮断する。
さらなる実施形態
１．遺伝子修飾げっ歯類は、そのゲノムが、内因性げっ歯類Ａｃｖｒ１座内の修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含み、修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子が、
ａ）部位特異的リコンビナーゼ認識部位（ＳＲＲＳ’）の第１の対に隣接したセンス方向の実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７であって、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７が、ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と同じアミノ酸をコードする、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７と、
ｂ）ＳＲＲＳ’の第１の対とは異なるＳＲＲＳ’の第２の対に隣接した、アンチセンス方向でＲ２５８Ｇをコードする改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７と、を含み、
第１および第２のＳＲＲＳ’が、リコンビナーゼが、変異げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７をセンス方向に反転させ、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７を削除し、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７を含む改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子が発現できるように配向される。
２．項目１に記載の遺伝子修飾げっ歯類は、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７が、ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と少なくとも１ヌクレオチド異なり、ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７との間の配列同一性と比較して、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７との配列同一性が低減されている。
３．項目１に記載の遺伝子修飾げっ歯類は、リコンビナーゼをコードする遺伝子が、遺伝子修飾げっ歯類のゲノム中にあり、リコンビナーゼの活性が、誘導性である。
４．項目１〜３のいずれか１つに記載の遺伝子修飾げっ歯類は、リコンビナーゼが、Ｃｒｅである。
５．項目４に記載の遺伝子修飾げっ歯類は、Ｃｒｅが、エストロゲン受容体（ＥＲ）のリガンド結合ドメインと融合され、その結果、Ｃｒｅの活性が、ＥＲとのリガンド結合によって誘導される。
６．項目５に記載の遺伝子修飾げっ歯類は、ＥＲのリガンド結合ドメインが、Ｔ２変異を含む。
７．項目５または６に記載の遺伝子修飾げっ歯類は、リガンドが、タモキシフェンである。
８．項目１〜７のいずれか１つに記載の遺伝子修飾げっ歯類は、遺伝子修飾げっ歯類が、修飾Ａｃｖｒ１遺伝子に対してホモ接合性である。
９．項目１〜８のいずれかに記載の遺伝子修飾げっ歯類に由来する変異げっ歯類は、変異げっ歯類が、センス方向の改変エクソン７を含む改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子を含むゲノムを有し、改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子が、異所性骨形成をもたらす変異げっ歯類で発現される。
１０．項目１〜９のいずれかに記載のげっ歯類は、マウスまたはラットから選択される。
１１．核酸は、修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含み、修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子が、
ａ）部位特異的リコンビナーゼ認識部位（ＳＲＲＳ’）の第１の対に隣接したセンス方向の実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７であって、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７が、ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と同じアミノ酸をコードする、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７と、
ｂ）ＳＲＲＳ’の第１の対とは異なるＳＲＲＳ’の第２の対に隣接した、アンチセンス方向でＲ２５８Ｇをコードする改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７と、を含み、
第１および第２のＳＲＲＳ’が、リコンビナーゼが、変異げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７をセンス方向に反転させ、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７を削除できるように配向される。
１２．項目１１に記載の核酸は、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７が、ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と少なくとも１１ヌクレオチド異なり、ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７との間の配列同一性と比較して、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７との配列同一性が低減されている。
１３．項目１１に記載の核酸は、リコンビナーゼの活性が、誘導性である。
１４．項目１１〜１３のいずれか１つに記載の核酸は、リコンビナーゼが、Ｃｒｅである。
１５．項目１４に記載の核酸は、Ｃｒｅが、エストロゲン受容体（ＥＲ）のリガンド結合ドメインと融合され、その結果、Ｃｒｅの活性が、ＥＲとのリガンド結合によって誘導される。
１６．項目１５に記載の核酸は、ＥＲのリガンド結合ドメインが、Ｔ２変異を含む。
１７．項目１５または１６に記載の核酸は、リガンドが、タモキシフェンである。
１８．項目１１〜１７のいずれか１つに記載の核酸は、げっ歯類が、マウスまたはラットである。
１９．げっ歯類ゲノムは、項目１１または１２に記載の核酸を含む。
２０．項目１９に記載のげっ歯類ゲノムは、ＳＲＲＳ’を認識し、改変エクソンを反転させるリコンビナーゼをコードする遺伝子をさらに含む。
２１．項目２０に記載のげっ歯類ゲノムは、リコンビナーゼの活性が、誘導性である。
２２．項目２１に記載のげっ歯類ゲノムは、リコンビナーゼが、Ｃｒｅである。
２３．項目２２に記載のげっ歯類ゲノムは、Ｃｒｅが、エストロゲン受容体（ＥＲ）のリガンド結合ドメインと融合され、その結果、Ｃｒｅの活性が、ＥＲとのリガンド結合によって誘導される。
２４．項目２３に記載のげっ歯類ゲノムは、ＥＲのリガンド結合ドメインが、Ｔ２変異を含む。
２５．項目２３または２４に記載のげっ歯類ゲノムは、リガンドが、タモキシフェンである。
２６．項目１９〜２５のいずれか１つに記載のげっ歯類ゲノムは、げっ歯類ゲノムが、修飾Ａｃｖｒ１遺伝子に対してホモ接合性である。
２７．項目１９〜２６のいずれか１つに記載のげっ歯類ゲノムは、げっ歯類が、マウスまたはラットである。
２８．単離されたげっ歯類組織または細胞は、項目１９〜２７のいずれか１つに記載のげっ歯類ゲノムを含む。
２９．項目２８に記載の単離されたげっ歯類組織または細胞は、げっ歯類が、マウスまたはラットである。
３０．項目２８または２９に記載の単離されたげっ歯類組織または細胞は、げっ歯類細胞が、胚性幹細胞である。
３１．げっ歯類ゲノム中のＡｃｖｒ１遺伝子の標的修飾のための核酸構築物は、
ａ）部位特異的リコンビナーゼ認識部位（ＳＲＲＳ’）の第１の対に隣接したセンス方向の実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７であって、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７が、ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と同じアミノ酸をコードする、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７と、
ｂ）ＳＲＲＳ’の第１の対とは異なるＳＲＲＳ’の第２の対に隣接した、アンチセンス方向でＲ２５８Ｇをコードする改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７と、を含み、
第１および第２のＳＲＲＳ’が、リコンビナーゼが、変異げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７をセンス方向に反転させ、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７を削除し、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７を含む改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子が発現できるように配向される。
３２．項目３１に記載の核酸構築物は、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７が、ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と少なくとも３１ヌクレオチド異なり、ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７との間の配列同一性と比較して、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７との配列同一性が低減されている。
３３．項目３１に記載の核酸構築物は、ＳＲＲＳの第１の対および第２の対が、Ｌｏｘ２３７２およびＬｏｘＰであるか、またはその逆である。
３４．項目３１に記載の核酸構築物は、リコンビナーゼが、Ｃｒｅである。
３５．項目３４に記載の核酸構築物は、Ｃｒｅが、エストロゲン受容体（ＥＲ）と融合され、その結果、Ｃｒｅの活性が、ＥＲとのリガンド結合によって誘導される。
３６．項目３５に記載の核酸構築物は、ＥＲが、Ｔ２変異を含む。
３７．項目３５に記載の核酸構築物は、リガンドが、タモキシフェンである。
３８．項目３１〜３７のいずれか１つに記載の核酸構築物は、げっ歯類が、マウスまたはラットから選択される。
３９．遺伝子修飾げっ歯類を作製する方法は、内因性げっ歯類Ａｃｖｒ１座内の修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含むようにげっ歯類ゲノムを修飾することを含み、修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子が、
ａ）部位特異的リコンビナーゼ認識部位（ＳＲＲＳ’）の第１の対に隣接したセンス方向の実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７であって、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７が、ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と同じアミノ酸をコードする、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７と、
ｂ）ＳＲＲＳ’の第１の対とは異なるＳＲＲＳ’の第２の対に隣接した、アンチセンス方向でＲ２５８Ｇをコードする改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７と、を含み、
第１および第２のＳＲＲＳ’が、リコンビナーゼが、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７をセンス方向に反転させ、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７を削除し、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７を含む改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子が発現できるように配向される。
４０．項目３９に記載の方法は、げっ歯類ゲノムが、
ａ）げっ歯類胚性幹（ＥＳ）細胞に核酸構築物を導入することであって、核酸構築物が、
ＳＲＲＳ’の第１の対に隣接したセンス方向の実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７と、
ＳＲＲＳ’の第２の対に隣接したアンチセンス方向でＲ２５８Ｇをコードする改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７と、を含み、
核酸構築物が、内因性げっ歯類Ａｃｖｒ１座内に修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子をもたらす内因性げっ歯類Ａｃｖｒ１座を標的とする、導入することと、
ｂ）そのゲノムが修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含む遺伝子修飾げっ歯類ＥＳ細胞を取得することと、
ｃ）ｂ）からの遺伝子修飾げっ歯類ＥＳ細胞を使用して遺伝子修飾げっ歯類を作製することと、を含むプロセスによって修飾される。
４１．項目３９または４０に記載の方法は、遺伝子修飾げっ歯類が、修飾Ａｃｖｒ１遺伝子に対してホモ接合性である。
４２．項目４０または４１に記載の方法は、げっ歯類ＥＳ細胞が、リコンビナーゼをコードする遺伝子をさらに含む。
４３．項目３９〜４２のいずれか１つに記載の方法は、リコンビナーゼの活性が、誘導性である。
４４．項目３９〜４３のいずれか１つに記載の方法は、リコンビナーゼが、Ｃｒｅである。
４５．項目４４に記載の方法は、Ｃｒｅが、エストロゲン受容体（ＥＲ）のリガンド結合ドメインと融合され、その結果、Ｃｒｅの活性が、ＥＲとのリガンド結合によって誘導される。
４６．項目４５に記載の方法は、ＥＲのリガンド結合ドメインが、Ｔ２変異を含む。
４７．項目４５または４６に記載の方法は、リガンドが、タモキシフェンである。
４８．項目４３〜４７のいずれか１つに記載の方法は、げっ歯類の細胞または組織においてリコンビナーゼの活性を誘導することをさらに含み、リコンビナーゼが、改変エクソン７を反転させ、実質的なヒトエクソン７を削除し、それによって、改変エクソン７を含む改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子が、細胞または組織で発現されることを可能にする。
４９．項目４０〜４８のいずれか１つに記載の方法は、げっ歯類が、マウスまたはラットから選択される。
５０．育種する方法は、そのゲノムが修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含む第１のげっ歯類を第２のマウスと育種させ、そのゲノムが修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含む子孫げっ歯類をもたらすことを含み、修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子が、
ａ）部位特異的リコンビナーゼ認識部位（ＳＲＲＳ’）の第１の対に隣接したセンス方向の実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７であって、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７が、ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と同じアミノ酸をコードする、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７と、
ｂ）ＳＲＲＳ’の第１の対とは異なるＳＲＲＳ’の第２の対に隣接した、アンチセンス方向でＲ２５８Ｇをコードする改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７と、を含み、
第１および第２のＳＲＲＳ’が、リコンビナーゼが、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７をセンス方向に反転させ、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７を削除し、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７を含む改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子が発現できるように配向される。
５１．項目５０に記載の方法は、第１のげっ歯類が、修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子に対してホモ接合性である。
５２．項目５０または５１に記載の方法は、第２のげっ歯類が、誘導性リコンビナーゼを含む。
５３．項目５２に記載の方法は、誘導性リコンビナーゼが、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼである。
５４．項目５３に記載の方法は、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼが、タモキシフェン誘導性Ｃｒｅ−ＥＲＴ２リコンビナーゼを含む。
５５．項目５２〜５４のいずれか１つに記載の方法は、子孫げっ歯類の細胞または組織において誘導性リコンビナーゼを誘導することをさらに含み、その結果、誘導されたリコンビナーゼが、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７をセンス方向に反転させ、細胞または組織中の実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７を削除し、それによって、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７を含む改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子を生成する。
５６．項目５０〜５５のいずれか１つに記載の方法は、げっ歯類が、マウスまたはラットである。
５７．子孫げっ歯類は、項目５０〜５６のいずれか１つに記載の方法に従って生成される。
５８．異所性骨形成を治療するための候補治療化合物を試験する方法は、
項目１〜８および１０のいずれか１つに記載の遺伝子修飾げっ歯類を提供することと、
改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７を含む改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子が発現できるように、げっ歯類においてリコンビナーゼの活性を誘導することと、
候補化合物をげっ歯類に投与することと、
候補化合物が、げっ歯類における異所性骨形成の発症を阻害するかを決定することと、を含む。
５９．項目５８に記載の方法は、候補化合物が、リコンビナーゼ活性の誘導の前、間、または後にげっ歯類に投与される。
６０．項目５８に記載の方法は、候補化合物が、小分子化合物である。
６１．項目５８に記載の方法は、候補化合物が、核酸である。
６２．項目５８に記載の方法は、候補化合物が、抗体またはその抗原結合断片である。
６３．項目６２に記載の方法は、抗体またはその抗原結合断片が、アクチビン受容体１に対する抗体またはその抗原結合断片である。
６４．項目６２に記載の方法は、抗体またはその抗原結合断片が、アクチビン受容体２Ａ型に対する抗体またはその抗原結合断片である。
６５．項目６２に記載の方法は、抗体またはその抗原結合断片が、アクチビン受容体２Ｂ型に対する抗体またはその抗原結合断片である。
６６．項目６２に記載の方法は、抗体またはその抗原結合断片が、アクチビンＡに対する抗体またはその抗原結合断片である。
６７．項目５８〜６６のいずれか１つに記載の方法は、げっ歯類が、マウスまたはラットである。

Claims (67)

  1. 遺伝子修飾げっ歯類であって、そのゲノムが、内因性げっ歯類Ａｃｖｒ１座内の修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含み、前記修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子が、
    ａ．部位特異的リコンビナーゼ認識部位（ＳＲＲＳ’）の第１の対に隣接したセンス方向の実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７であって、前記実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７が、ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と同じアミノ酸をコードする、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７と、
    ｂ．前記ＳＲＲＳ’の第１の対とは異なるＳＲＲＳ’の第２の対に隣接した、アンチセンス方向でＲ２５８Ｇをコードする改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７と、を含み、
    前記第１および第２のＳＲＲＳ’が、リコンビナーゼが、変異げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７をセンス方向に反転させ、前記実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７を削除し、前記改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７を含む改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子が発現できるように配向される、遺伝子改変げっ歯類。
  2. 前記実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７が、前記ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と少なくとも１ヌクレオチド異なり、前記ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と前記改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７との間の配列同一性と比較して、前記改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７との配列同一性が低減されている、請求項１に記載の遺伝子修飾げっ歯類。
  3. 前記リコンビナーゼをコードする前記遺伝子が、前記遺伝子修飾げっ歯類のゲノム中にあり、前記リコンビナーゼの活性が、誘導性である、請求項１に記載の遺伝子修飾げっ歯類。
  4. 前記リコンビナーゼが、Ｃｒｅである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子修飾げっ歯類。
  5. 前記Ｃｒｅが、エストロゲン受容体（ＥＲ）のリガンド結合ドメインと融合され、その結果、前記Ｃｒｅの活性が、前記ＥＲとのリガンド結合によって誘導される、請求項４に記載の遺伝子修飾げっ歯類。
  6. 前記ＥＲの前記リガンド結合ドメインが、Ｔ２変異を含む、請求項５に記載の遺伝子修飾げっ歯類。
  7. 前記リガンドが、タモキシフェンである、請求項５または６に記載の遺伝子修飾げっ歯類。
  8. 前記遺伝子修飾げっ歯類が、修飾Ａｃｖｒ１遺伝子に対してホモ接合性である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の遺伝子修飾げっ歯類。
  9. 請求項１〜８のいずれかに記載の遺伝子修飾げっ歯類に由来する変異げっ歯類であって、前記変異げっ歯類が、センス方向の改変エクソン７を含む改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子を含むゲノムを有し、前記改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子が、異所性骨形成をもたらす前記変異げっ歯類で発現される、変異げっ歯類。
  10. マウスまたはラットから選択される、請求項１〜９のいずれかに記載のげっ歯類。
  11. 核酸であって、修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含み、前記修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子が、
    ａ．部位特異的リコンビナーゼ認識部位（ＳＲＲＳ’）の第１の対に隣接したセンス方向の実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７であって、前記実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７が、ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と同じアミノ酸をコードする、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７と、
    ｂ．前記ＳＲＲＳ’の第１の対とは異なるＳＲＲＳ’の第２の対に隣接した、アンチセンス方向でＲ２５８Ｇをコードする改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７と、を含み、
    前記第１および第２のＳＲＲＳ’が、リコンビナーゼが、変異げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７をセンス方向に反転させ、前記実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７を削除できるように配向される、核酸。
  12. 前記実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７が、前記ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と少なくとも１１ヌクレオチド異なり、前記ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と前記改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７との間の配列同一性と比較して、前記改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７との配列同一性が低減されている、請求項１１に記載の核酸。
  13. 前記リコンビナーゼの活性が、誘導性である、請求項１１に記載の核酸。
  14. 前記リコンビナーゼが、Ｃｒｅである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の核酸。
  15. 前記Ｃｒｅが、エストロゲン受容体（ＥＲ）のリガンド結合ドメインと融合され、その結果、Ｃｒｅの活性が、前記ＥＲとのリガンド結合によって誘導される、請求項１４に記載の核酸。
  16. 前記ＥＲの前記リガンド結合ドメインが、Ｔ２変異を含む、請求項１５に記載の核酸。
  17. 前記リガンドが、タモキシフェンである、請求項１５または１６に記載の核酸。
  18. 前記げっ歯類が、マウスまたはラットである、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の核酸。
  19. 請求項１１または１２に記載の核酸を含む、げっ歯類ゲノム。
  20. 前記ＳＲＲＳ’を認識し、改変エクソンを反転させる前記リコンビナーゼをコードする遺伝子をさらに含む、請求項１９に記載のげっ歯類ゲノム。
  21. 前記リコンビナーゼの活性が、誘導性である、請求項２０に記載のげっ歯類ゲノム。
  22. 前記リコンビナーゼが、Ｃｒｅである、請求項２１に記載のげっ歯類ゲノム。
  23. 前記Ｃｒｅが、エストロゲン受容体（ＥＲ）のリガンド結合ドメインと融合され、その結果、前記Ｃｒｅの活性が、前記ＥＲとのリガンド結合によって誘導される、請求項２２に記載のげっ歯類ゲノム。
  24. 前記ＥＲの前記リガンド結合ドメインが、Ｔ２変異を含む、請求項２３に記載のげっ歯類ゲノム。
  25. 前記リガンドが、タモキシフェンである、請求項２３または２４に記載のげっ歯類ゲノム。
  26. 前記げっ歯類ゲノムが、前記修飾Ａｃｖｒ１遺伝子に対してホモ接合性である、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載のげっ歯類ゲノム。
  27. 前記げっ歯類が、マウスまたはラットである、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載のげっ歯類ゲノム。
  28. 請求項１９〜２７のいずれか一項に記載のげっ歯類ゲノムを含む、単離されたげっ歯類組織または細胞。
  29. 前記げっ歯類が、マウスまたはラットである、請求項２８に記載の単離されたげっ歯類組織または細胞。
  30. 前記げっ歯類細胞が、胚性幹細胞である、請求項２８または２９に記載の単離されたげっ歯類組織または細胞。
  31. げっ歯類ゲノム中のＡｃｖｒ１遺伝子の標的修飾のための核酸構築物であって、
    ａ．部位特異的リコンビナーゼ認識部位（ＳＲＲＳ’）の第１の対に隣接したセンス方向の実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７であって、前記実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７が、ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と同じアミノ酸をコードする、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７と、
    ｂ．前記ＳＲＲＳ’の第１の対とは異なるＳＲＲＳ’の第２の対に隣接した、アンチセンス方向でＲ２５８Ｇをコードする改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７と、を含み、
    前記第１および第２のＳＲＲＳ’が、リコンビナーゼが、変異げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７をセンス方向に反転させ、前記実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７を削除し、前記改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７を含む改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子が発現できるように配向される、核酸構築物。
  32. 前記実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７が、前記ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と少なくとも１ヌクレオチド異なり、前記ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と前記改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７との間の配列同一性と比較して、前記改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７との配列同一性が低減されている、請求項３１に記載の核酸構築物。
  33. 前記ＳＲＲＳの第１の対および第２の対が、Ｌｏｘ２３７２およびＬｏｘＰであるか、またはその逆である、請求項３１に記載の核酸構築物。
  34. 前記リコンビナーゼが、Ｃｒｅである、請求項３１に記載の核酸構築物。
  35. 前記Ｃｒｅが、エストロゲン受容体（ＥＲ）と融合され、その結果、前記Ｃｒｅの活性が、前記ＥＲとのリガンド結合によって誘導される、請求項３４に記載の核酸構築物。
  36. 前記ＥＲが、Ｔ２変異を含む、請求項３５に記載の核酸構築物。
  37. 前記リガンドが、タモキシフェンである、請求項３５に記載の核酸構築物。
  38. 前記げっ歯類が、マウスまたはラットから選択される、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の核酸構築物。
  39. 遺伝子修飾げっ歯類を作製する方法であって、内因性げっ歯類Ａｃｖｒ１座内の修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含むようにげっ歯類ゲノムを修飾することを含み、前記修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子が、
    ａ．部位特異的リコンビナーゼ認識部位（ＳＲＲＳ’）の第１の対に隣接したセンス方向の実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７であって、前記実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７が、ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と同じアミノ酸をコードする、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７と、
    ｂ．アンチセンス方向でＲ２５８Ｇをコードする改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７であって、前記ＳＲＲＳ’の第１の対とは異なるＳＲＲＳ’の第２の対に隣接した、改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７と、を含み、
    前記第１および第２のＳＲＲＳ’が、リコンビナーゼが、前記改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７をセンス方向に反転させ、前記実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７を削除し、前記改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７を含む改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子が発現できるように配向される、方法。
  40. 前記げっ歯類ゲノムが、
    ａ．げっ歯類胚性幹（ＥＳ）細胞に核酸構築物を導入することであって、前記核酸構築物が、
    前記ＳＲＲＳ’の第１の対に隣接したセンス方向の前記実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７と、
    前記ＳＲＲＳ’の第２の対に隣接したアンチセンス方向でＲ２５８Ｇをコードする前記改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７と、を含み、
    前記核酸構築物が、前記内因性げっ歯類Ａｃｖｒ１座内に前記修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子をもたらす前記内因性げっ歯類Ａｃｖｒ１座を標的とする、導入することと、
    ｂ．そのゲノムが前記修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含む遺伝子修飾げっ歯類ＥＳ細胞を取得することと、
    ｃ．ｂ）からの前記遺伝子修飾げっ歯類ＥＳ細胞を使用して遺伝子修飾げっ歯類を作製することと、を含むプロセスによって修飾される、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記遺伝子修飾げっ歯類が、修飾Ａｃｖｒ１遺伝子に対してホモ接合性である、請求項３９または４０に記載の方法。
  42. 前記げっ歯類ＥＳ細胞が、前記リコンビナーゼをコードする遺伝子をさらに含む、請求項４０または４１に記載の方法。
  43. 前記リコンビナーゼの活性が、誘導性である、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記リコンビナーゼが、Ｃｒｅである、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記Ｃｒｅが、エストロゲン受容体（ＥＲ）のリガンド結合ドメインと融合され、その結果、前記Ｃｒｅの活性が、前記ＥＲとのリガンド結合によって誘導される、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記ＥＲの前記リガンド結合ドメインが、Ｔ２変異を含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記リガンドが、タモキシフェンである、請求項４５または４６に記載の方法。
  48. 前記げっ歯類の細胞または組織において前記リコンビナーゼの活性を誘導することをさらに含み、前記リコンビナーゼが、改変エクソン７を反転させ、実質的なヒトエクソン７を削除し、それによって、前記改変エクソン７を含む改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子が、前記細胞または組織で発現されることを可能にする、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記げっ歯類が、マウスまたはラットから選択される、請求項４０〜４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 育種する方法であって、そのゲノムが修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含む第１のげっ歯類を第２のマウスと育種させ、そのゲノムが前記修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子を含む子孫げっ歯類をもたらすことを含み、前記修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子が、
    ａ．部位特異的リコンビナーゼ認識部位（ＳＲＲＳ’）の第１の対に隣接したセンス方向の実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７であって、前記実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７が、ヒトＡＣＶＲ１エクソン７と同じアミノ酸をコードする、実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７と、
    ｂ．前記ＳＲＲＳ’の第１の対とは異なるＳＲＲＳ’の第２の対に隣接した、アンチセンス方向でＲ２５８Ｇをコードする改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７と、を含み、
    前記第１および第２のＳＲＲＳ’が、リコンビナーゼが、前記改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７をセンス方向に反転させ、前記実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７を削除し、前記改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７を含む改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子が発現できるように配向される、方法。
  51. 前記第１のげっ歯類が、前記修飾げっ歯類Ａｃｖｒ１遺伝子に対してホモ接合性である、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記第２のげっ歯類が、誘導性リコンビナーゼを含む、請求項５０または５１に記載の方法。
  53. 前記誘導性リコンビナーゼが、誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼである、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼが、タモキシフェン誘導性Ｃｒｅ−ＥＲＴ２リコンビナーゼを含む、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記子孫げっ歯類の細胞または組織において前記誘導性リコンビナーゼを誘導することをさらに含み、その結果、誘導されたリコンビナーゼが、前記改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７をセンス方向に反転させ、前記細胞または組織中の前記実質的なヒトＡＣＶＲ１エクソン７を削除し、それによって、前記改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７を含む改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子を生成する、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 前記げっ歯類が、マウスまたはラットである、請求項５０〜５５のいずれか一項に記載の方法。
  57. 請求項５０〜５６のいずれか一項に記載の方法に従って生成される子孫げっ歯類。
  58. 異所性骨形成を治療するための候補治療化合物を試験する方法であって、
    請求項１〜８および１０のいずれか一項に記載の遺伝子修飾げっ歯類を提供することと、
    前記改変げっ歯類Ａｃｖｒ１エクソン７を含む改変Ａｃｖｒ１対立遺伝子が発現できるように、前記げっ歯類において前記リコンビナーゼの活性を誘導することと、
    前記候補化合物を前記げっ歯類に投与することと、
    前記候補化合物が、前記げっ歯類における異所性骨形成の発症を阻害するかを決定することと、を含む、方法。
  59. 前記候補化合物が、前記リコンビナーゼ活性の誘導の前、間、または後に前記げっ歯類に投与される、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記候補化合物が、小分子化合物である、請求項５８に記載の方法。
  61. 前記候補化合物が、核酸である、請求項５８に記載の方法。
  62. 前記候補化合物が、抗体またはその抗原結合断片である、請求項５８に記載の方法。
  63. 前記抗体またはその抗原結合断片が、アクチビン受容体１に対する抗体またはその抗原結合断片である、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記抗体またはその抗原結合断片が、アクチビン受容体２Ａ型に対する抗体またはその抗原結合断片である、請求項６２に記載の方法。
  65. 前記抗体またはその抗原結合断片が、アクチビン受容体２Ｂ型に対する抗体またはその抗原結合断片である、請求項６２に記載の方法。
  66. 前記抗体またはその抗原結合断片が、アクチビンＡに対する抗体またはその抗原結合断片である、請求項６２に記載の方法。
  67. 前記げっ歯類が、マウスまたはラットである、請求項５８〜６６のいずれか一項に記載の方法。
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