DK174665B1 - Anvendelse af visse pyrethroidforbindelser til fremstilling af en sammensætning til behandling af skadedyrsangreb på fisk forårsaget af fiskelus - Google Patents

Description

i DK 174665 B1

Den foreliggende opfindelse angår anvendelse af en pyrethroidforbindelse valgt blandt cypermethrin, høj-cis-cypermethrin, lambda-cyhalothrin og delta-methrin til fremstilling af en sammensætning til behandling af skadedyrsangreb på fisk, såsom laks, forårsaget af fiskelus.

5

Skadedyrsangreb på laks med fiskelus er et anerkendt problem. Laks inficeres af fritsvømmende, umodne fiskelus i copepodid-udviklingsfasen, som fæstner sig til fiskens krop med krogformede følehorn. Når den først har fæstnet sig til fisken, udvikler lusen sig gennem fire umodne chalimusfaser, før den bliver 10 prævoksen ca. 2-3 uger efter det initiale skadedyrsangreb. Under chalimusfa-sen fæstner lusen sig til fisken med frontale filamenter, og selv om de indtager føde på fisken, forårsager de ingen stærk beskadigelse. Under deres sidste prævoksne og voksne udviklingsfaser fæstner lusen sig til fiskens krop ved fastsugning og græsning over dens overflade, især hovedet, ryggen og perils anale arealer, hvilket forårsager stærk beskadigelse og til sidst død.

Hidtil er et antal behandlinger blevet anvendt til kontrol af fiskelus, mest betydningsfuld dichlorvos, azamethiophos og hydrogenperoxid-behandlingsbade. Et fælles træk ved disse kendte behandlinger er, at de kun er effektive mod mod-20 ne lus (dvs. lus i de prævoksne og voksne faser), og er ineffektive mod lus i umodne udviklingsfaser. Nogle forskere har antydet, at hydrogenperoxid har en begrænset virkning mod umodne lus, men denne virkning er ubetydelig sammenlignet med dets virkning mod modne lus.

25 Årsagen til denne selektive aktivitet er ikke kendt, men det formodes på en måde at skyldes de væsentlige forskelle i anatomi og metabolisme mellem den umodne (copepodid og chalimus) og modne (prævoksne og voksne) lus. En teori er, at forskellene i respiration er ansvarlig, men dette er ikke fuldt dokumenteret. Hvad end den underliggende årsag til selektiviteten er, forbliver det 3 0 en empirisk regel, at de konventionelle topiske behandlinger kun er effektive mod modne lus, med den resulterende ulempe, at inficeret fisk kræver gentagne og hyppige behandlinger for at dræbe lusen, mens og når de modner.

2 DK 174665 B1

Vi har nu identificeret en gruppe af forbindelser, som er effektive til at kontrollere umodne såvel som modne fiskelus. De pågældende forbindelser er pyreth-roiderne, f.eks. cypermethrin (3-(2,2-dichlorethenyl)-2,2-dimethyl-cyclopropan-carboxy!syre-[cyano(3-phenoxyphenyl)methyl]ester). Vi har allerede foreslået 5 anvendelsen af disse forbindelser til kontrol af fiskelus i vor internationale patentansøgning, publiceret som WO 92/16106, men det formodedes tidligere, at forbindelserne kun var effektive mod modne lus, og forsøgene beskrevet i vor tidligere ansøgning anvendte udelukkende modne lus. På grund af den kendte modstandsdygtighed af umodne lus overfor alle kendte, konventionelle bad-i o behandlinger for modne lus, er identifikationen af en gruppe af forbindelser, som er effektive, når de anvendes topisk mod både modne og umodne lus, overraskende. Det er også af signifikant, praktisk betydning, at en enkelt behandling vil påvirke i det væsentlige alle lusene, som er til stede på fisken, hvad end de er modne eller umodne, hvorved hyppigheden, ved hvilken be-15 handlingerne er nødvendige, reduceres. Dette fører med tiden til en arbejdsbesparelse, et fald i møljøforureningen og minimering af stress for fisken.

1 "Pathogens of Wild and Farmed Fish”, side 275-289 (Ellis Horwood 1993 G.A.

Boxhall & D. Defaye Eds.) beskrives resultaterne af præliminære studier af ef-20 fektiviteten af pyrethroiderne resmethrin og lambda cyhalothrin over for skadedyrsangreb forårsaget af fiskelus. Dokumentet angår hovedsageligt behandling af voksne og præ-voksne fiskelus, og det anerkendes, at midler til behandling af modne fiskelus normalt er ineffektive til behandling af modne fiskelus.

Resmethrin (men ikke lambda cyhalothrin) blev bedømt med hensyn til effekti-25 vitet mod umodne fiskelus, og det konkluderes (side 286, linie 9-10), at ingen af resmethrinsammensætningerne så ud til at være toksiske i larvestadierne i koncentrationer, der kunne dræbe voksne og prævoksne fiskelus.

Vi har ladet udføre forsøg for at sammenligne virkningen af resmethrin over for 3 o copepodid- og chalimus-stadieme af fiskelus med virkningen af cypermethrin og deltamethrin over for disse stadier. Der er foretaget afprøvninger både in vitro (mht. copepodidfiskelus som er fritsvømmende) og in vivo (mht. chalimus-fiskelus som er fasthæftet til værtsfisk). Disse undersøgelser blev gennemført af det norske selskab VESO Vikan AkvaVet som er en internationalt anerkendt 3 DK 174665 B1 uafhængig virksomhed med ekspertise inden for dette specielle område. Resultaterne af disse to undersøgelser er anført i to rapporter med bilag, betegnet henholdsvis V-1250 og V-1251.

5 Resultaterne i den første rapport viser at både cypermethrin og deltamethrin har en væsentligt større virkning over for copepodidfiskelus end resmethrin ved begge afprøvede koncentrationer. Det er imidlertid kombinationen af effektivitet over for umodne fiskelus og relativt lav toxicitet over for værtsfisken der er af primær betydning, og overlegenheden af både cypermethrin og deltamethrin i io forhold til resmethrin ses bedst af in vivo dataene. Det fremgår af resultaterne i den anden rapport at resmethrin ved alle afprøvede koncentrationer var i det væsentlige lige så toxisk eller væsentligt mere toxisk over for fiskene end over for lusene, mens cypermethrin var væsentligt mere toxisk overfor lus end over for fisk i koncentrationer på 5 pg/l og derover, og deltamethrin i koncentrationer 15 på 5 pg/l og derunder. Dette peger på en væsentlig "terapeutisk margin" for både cypermethrin og deltamethrin som på basis af disse forsøgsdata ikke synes at forekomme for resmethrin.

Resultaterne for cypermethrin og deltamethrin gør det sandsynligt, at tilsvaren-20 de virkninger opnås med høj-cis-cypermethrin og lambda-cyhalothrin, eftersom cis-isomeren blot er den mere aktive isomer af cypermethrin, og cyhalothrin kun adskiller sig fra cypermethrin ved at den ene af dettes to chlorsubstituenter er erstattet af en trifluormethylsubstituent.

25 Den foreliggende opfindelse tilvejebringer derfor anvendelsen af en pyrethroid-forbindelse valgt blandt cypermethrin, høj-cis-cypermethrin, lambda-cyhalothrin og deltamethrin til fremstilling af en sammensætning til behandling af skadedyrsangreb på fisk forårsaget af chalimus- og copepodid-faser af fiskelus.

3o Subsidiært tilvejebringer opfindelsen anvendelsen af en pyrethroid-forbindelse valgt blandt cypermethrin, høj-cis-cypermethrin, lambda-cyhalothrin og deltamethrin til fremstilling af en sammensætning til forebyggende behandling af skadedyrsangreb på fisk forårsaget af prævoksne og voksne fiskelus.

4 DK 174665 B1

Opfindelsen beskrives herefter blot som eksempel med reference til de følgende eksperimentelle forsøg og de ledsagende figurer, som illustrerer resultaterne af forsøgene.

5 FORSØG 1

Forsøg 1 blev udført ved Marine Harvest International Research Establishment ved Loch Eil, Inverness-shire. De ved forsøget anvendte fisk var atlantiske laks (Salmo salar) af stammen "Marine Harvest M6" af blandet køn og med en alder ίο på omtrent 28 måneder og en vægt på omtrent 3 kg hver.

Fremstilling 316 undersøgelsesfisk blev tilvejebragt til en veterinær forundersøgelse og vi-15 ste sig at være velegnede til at deltage i undersøgelsen. Fiskene blev holdt i et enkelt opbevaringsbur i Loch Eil og blev fodret med det samme kommercielle fiskefoder (Fulmar Expanded Salmon Feed, Super energy Salmon) 10 dage forud for undersøgelsesperioden og gennem hele undersøgelsen for derved at sikre, at der ikke opstod nogen akklimatisationsproblemer. Foderet blev kastet 20 på vandoverfladen i buret ved en hastighed på omtrent 0,5 % kropsvægt dagligt. En dag før behandlingen blev 15 fisk undersøgt og talt for større faser af fiskelus (chalimus, prævoksne og voksne) og gennemsnitstællingerne blev beregnet som repræsentative forfør-behandlings-niveaueme. De resterende 301 fisk blev derefter inddelt i seks lignende grupper, 5 indeholdende 50 fisk hver 25 og den sjette indeholdende 51 (den ekstra fisk resulterede fra en fejltælling, som blev opdaget under forsøget, men blev betragtet som værende uden betydning). Der blev draget omsorg for at sikre, at alle grupper blev så ensartede som muligt med hensyn til vægt og antal af lus.

30 Fremgangsmåde

Hver gruppe fisk blev placeret i et individuelt forsøgs-havbur, der målte 5 m x 5 m x 4 m (dybde) og var fremstillet af nylonmaskenet. Burene blev forankret i 5 DK 174665 B1

Loch Eil og åbne mod havet. Tre af grupperne blev betegnet som behandlingsgrupper og tre som kontrolgrupper.

Behandlingsgrupperne blev hver udsat for behandling med cypermethrin ved 5 en koncentration på 100 pg/l i en time. Under behandlingen blev bunden af burene løftet for at give burene en vanddybde på 2 meter. Uigennemtrængelige presenninger blev anvendt for individuelt at omgive hvert af burene, og oxygen blev diffunderet ind i burene ved anvendelse af et cirkulært diffusionsapparat for at bibeholde et oxygenniveau på mindst 8 mg/l under behandlingstiden, ίο Behandlingen blev udført ved at afmåle en mængde på 2,54 vægt-% stamop-løsning af cypermethrin beregnet til at give en endelig koncentration i buret på 100 pg/l, blande denne i en spand med havvand og derefter tilsætte denne koncentrerede blanding til det rette bur adskillige steder rundt i buret. Presenningerne forblev på plads i 1 time efter tilsætning af behandlingsopløsningen til 15 burene.

Metoden blev gentaget med kontrolburene, men uden tilsætning af cypermethrin.

20 Prøveudtagning og målinger

Prøveudtagningen blev udført ved at fjerne 10 fisk fra hver tank, bedøve fiskene og tælle antallet af chalimus, prævokse og voksne lus på hver fisk i overensstemmelse med Marine Harvest International Standard Operating Procedu-25 re. De til tælling anvendte fisk blev dræbt og blev ikke returneret til forsøgsburene. Tællinger blev udført ved følgende tider:

Dag 1 (behandlingsdag): Omtrent 1 time efter fjernelse af presen ningerne fra buret.

3 o Dag 2: Omtrent 24 timer efter fjernelse af pre senningerne fra buret.

Dag 8 Dag 15 6 DK 174665 B1

Resultater

Tabel 1 nedenfor opsummerer de opnåede resultater. (Hvor antallet af lus på en fisk var større end 100, blev det registreret som >100 og som værende lig 5 100 ved dataanalyse). Resultaterne er repræsenteret grafisk i Fig. 1.

Tabel 1

Behandling Dag Gennemsnitsantal af lus (standardafvigelse i parentes)

Chalimus Prævoksen Voksen

Forbehandling 0 3,13(2,42) 4,6(1,99) 8,6(2,9)

Cypermethrin 1 2,97(2,41) 0,3(0,6) 1,93(1,48)

Kontrol 1 4,77(1,89) 3,82(1,53) 11,4(4,26)

Cypermethrin 2 3,17(2,16) 0,23(0,5) 0,03(0,18)

Kontrol 2 2,2(2,4) 1,26(1,31) 7,3(6,6)

Cypermethrin 8 1,33(1,19) 2,67(2,47) 1,5(1,7)

Kontrol 8 26,6(16,2) 10,9(8,9) 9,3(5,5)

Cypermethrin 15 87,5(20,6) 77.8(23,9) 10,5(7,1)

Kontrol 15 90,3(17,3) 76,6(25,5) 22,2(10,6) ίο Hver værdi = gennemsnit af 30 fisk; før-behandlings-værdier = gennemsnit af 15 fisk

Behandling med cypermethrin ved 100 pg/l i 1 time reducerede i det væsentlige antallet af chalimus, prævoksne og voksne lus på behandlet fisk, sammen-15 lignet med ubehandlet fisk. Virkningen sås især på dag 8 (7 dage efter behandlingen), men var i det væsentlige reduceret på dag 15. En mulig forklaring på denne mangel på forskel på dag 15 er, at reinfektion skete fra den ubehandlede til den behandlede fisk; en massiv fiskelusinfektion registreret på stedet på dag 8 kunne have medvirket til hurtig reinfektion. Alle fisk ville blive behandlet 7 DK 174665 B1 samtidig, når de anvendes kommercielt, og derfor ville alle lus blive påvirket, og reinfektion ville således ikke forventes at ske så tidligt efter behandling.

Virkningen mod voksne og prævoksne lus var forventet fra vores tidligere ar-5 bejde beskrevet i WO 92/16106, men det betydeligt lavere antal af chalimus-lus på behandlet fisk 7 dage efter behandling (dag 8) var fuldstændig uventet sammenlignet med ubehandlet fisk. Årsagerne til denne virkning er ukendt, men det er foreslået, at behandlingen dræbte en del af chalimus-lusene og også i nogen grad standsede eller forsinkede modningen af copepodider til cha-io iimus i adskillige dage. Et andet forsøg (forsøg 2) blev udført for yderligere at undersøge virkningen: FORSØG 2 15 Forsøg 2 blev udført ved Marine Harvest International Experimental Challenge Unit ved Lochailort, Invemess-shire. To undersøgelser blev udført; først et pilotforsøg (kontrol), i hvilket hastigheden af overlevelse og udvikling af fiskelus på fisk i et tankmiljø blev undersøgt; og dernæst et prøveundersøgelse for at undersøge virkningen af cypermethrin.

20

Fremgangsmåde I begge pilot- og forsøgsundersøgelser blev 60 atlantiske unglaks taget og ud-fordret med et kendt antal copepodid-fiskelus. Fisken i pilotundersøgelsen 25 (henvist til som GP1) blev talt for lus 10 dage, 21 dage og 27 dage efter initial skadedyrsangreb, mens fisk i forsøgsundersøgelsen (henvist til som GP2) blev talt for lus 10 dage efter skadedyrsangreb (umiddelbart før behandling) og 20 dage og 28 dage efter skadedyrsangreb. Tælling blev udført ved at dræbe 10 tilfældigt udvalgte fisk ved hver tælling og undersøge og identificere lusestadier 3 o ved anvendelse af et mikroskop. Antallet af lus i hver af de følgende udviklingsfaser blev registreret: Copepodid, Chalimus I, Chalimus II, Chalimus III, Chali-mus IV, Prævoksen I, Prævoksen li og Voksen.

8 DK 174665 B1

Behandlingen af fisk i forsøgsundersøgelsen GP2 blev udført i 1 time med forsøgsopløsning GPRD01 indeholdende cypermethrin ved en endelig koncentration på 5 pg/l havvand.

5 Resultater

Det gennemsnitlige totale antal af lus for de to undersøgelser er anført nedenfor i Tabel 2 og er grafisk repræsenteret i Fig. 2A.

lo Tabel 2A

Antal lus_Ubehandlet gruppe GP1 Behandlet gruppe GP2

Antal copepodider anvendt 3 500 9 500 til udfordring_

Efter udfordring tælling 1 9,5 29,9 (før behandling) (+10 dg)___

Efter udfordring tælling 2__23,5 (+21 dage)__14,2 (+20 dage)

Efter udfordring tælling 3 25,7 (+27 dage) 14,7 (+28 dage)

Tabellerne 2B og 2C nedenfor indikerer procentdelen af det totale antal fiskelus observeret i hver udviklingsfase, resultaterne er repræsenteret grafisk i Fig.

15 2B.

9 DK 174665 B1

Tabel 2B

Pilotundersøgelse GP1 - udvikling af fiskelus (ubehandlet)

Lusestadie 10dage 21 dage 27 dage efter angreb efter angreb efter angreb

Copepodider__21 %___

Chalimus I__79 %___

Chalimus II___13 %___

Chalimus III___53 %__

Chalimus IV___19%__7%

Prævoksen 1_____15 %__46 %_

Prævoksen 2____46 %_

Voksen____0,4 %

5 Tabel 2C

Forsøgsundersøgelse GP2 - udvikling af fiskelus behandlet med GPRD01 10 dage efter angreb

Lusestadie 10 dage 21 dage 28 dage __efter angreb__efter angreb__efter angreb

Copepodider _6 %_

Chalimus I__92 %_ 12 %

Chalimus II__2 %_ 54 %

Chalimus III______32 %__12%

Chalimus IV___2%__16%_

Prævoksen 1__59 %

Prævoksen 2 13%

Voksen_ ίο Resultaterne viser en markant forsinkelse i lusudvikling, når de behandles med cypermethrin.

♦ 10 DK 174665 B1

Omgivende vandtemperatur under pilotundersøgelsen GP1 (interval 8,0 til 10,5 °C) var svagt lavere end under forsøgsundersøgelse GP2 (interval 8,5 til 11,5 °C). Denne forskel ville forventes at forårsage, at GP2 lus ville overleve en smule bedre og udvikle sig en smule hurtigere end GP1 lus med det resultat, at 5 forskellene i antallet af lus og væksthastigheder mellem behandlede og ubehandlede populationer sandsynligvis ville være endnu større, hvis sammenligningsforsøg blev udført under nøjagtigt lignende betingelser.

Under pilotundersøgelse GP1 konstaterede man, at skaden forårsaget på lak-10 sen af fiskelus var moderat til svær, og omfanget af skaden var som det ville forventes i en naturlig situation. Nogle af de ubehandlede fisk led under så svære læsioner forårsaget af fiskelus 28 dage efter skadedyrsangreb, at alle tilbageværende fisk blev frasorteret af velfærdsårsager. I modsætning hertil havde fisken anvendt i forsøg GP2 ikke lidt nogen signifikant skade ved dag 15 28, da den sidste fisk blev udtaget til tælling af fiskelus.

FORSØG 3

Forsøg 3 blev udført ved et sted med havvand på Færøerne ved anvendelse af 20 hexagonale "Bridgestone"-bure med en omkreds på omkring 102 m og en dybde i størrelsesordenen 10-12,5 m.

Omtrent 200 000 atlantiske laks (Salmo salar) med en gennemsnitlig vægt på 0,96 kg blev anvendt ved forsøget og blev delt mellem to behandlingsbure (A

25 og B).

På forsøgets dag 0 blev nettene i bur B løftet til en dybde lavvandet nok til at tillade en presenning at blive placeret nedenunder. Oxygen blev dispergeret i buret for at bibeholde et oxygenniveau større end 7 mg/l. Presenningen blev 3 o derefter anvendt til at omslutte burets volumen for at skabe et bad til behand ling. Den aktuelle dybde blev målt ved at sejle med en båd ud til midten af buret og droppe et vægtbelagt reb, hvilket indikerede en dybde på tilnærmelsesvis 4 m til presenningen.

DK 174665 B1 n

Bur B blev derefter behandlet med 7001 havvand som en negativ kontrolbehandling for at bedømme den eventuelle virkning af forsøgsbetingelserne på fisken. Presenningen blev fjernet efter 60 minutter.

5 Næste dag blev fiskens dødelighed registreret og blev ikke fundet at være signifikant højere end før den negative kontrolbehandling.

På forsøgets dag 1 blev begge bure behandlet med en dosis på 1 vægt/vol.-% cypermethrin ved blanding af den nødvendige mængde (500 ml) med 700 I io havvand og tilsætning til hvert bur under anvendelse af en pumpe. Den endelige koncentration af cypermethrin viste sig ved analyse at være tilnærmelsesvis 0,9 pg/l i hvert bur. Burene forblev lukket i 60 minutter, og oxygenniveauerne blev kontrolleret.

15 Hver dag, hvor der blev foretaget tællinger af lus, blev 5 fisk fjernet fra hvert bur, dræbt med en overdosis af benzocain og placeret i individuelle polythen-poser med etiket. Fisken blev derefter frosset og opbevaret for tælling af lus.

Dette blev gjort på dag 0 og dag 1 (før behandling) og på dagene 2, 8 og 14 (efter behandling).

20

Resultater

De udtagne fisk blev talt for fiskelus af arten Lepeophtheirus salmonis i de følgende udviklingstrin: Chalimus l-ll, Chalimus lll-IV, prævoksne, voksne og 25 drægtige hunner. Antallet af fiskelus af arten Caligus elongatus blev også talt. Gennemsnitsværdier er vist i Tabel 3A og 3B nedenfor: 12 DK 174665 B1

Tabel 3A (tank A)

Pag Chalimus Chalimus Prævoks- Voksne Drægtige Caligus l-ll lil-IV ne hunner elongatus _J__2,80 2,40 1,40 1,80 1,00 0,60 __2__0,20 0,20 0,20 3,40 1,60 0,00 _8__0,00 0,60 0,00 1,00 1,00 0,00 15 1,20 0,80 0,20 0,80 0,40 0,00

Tabel 3B (tank B) 5 _ □ag Chalimus Chalimus Prævoks- Voksne Drægtige Caligus _j-ll_lll-IV ne hunner elongatus _0__1,80 1,20 2,00 2,60 3,40 1,20 _J__3,80 2,20 1,60 3,80 3,80 0,80 _2__0,20 0,40 0,00 1,40 2,40 0,00 _8__0,20 0,00 0,00 0,60 1,20 0,00 15 1,40 0,40 0,00 0,40 1,00 0,00

Gennemsnitsværdierne fra tankene A og B er vist i Tabel 3C nedenfor og illustreret grafisk i Fig. 3.

lo Tabel 3C

□ag Chalimus Chalimus Prævoks- Voksne Drægtige Caligus __NI_lll-IV ne hunner elongatus _0__1,80 1,20 2,00 2,60 3,40 1,20 _J__3,30 2,30 1,50 2,80 2,40 0,70

_2__0,20 0,30 0,10 2,40 2,00 . Q,QQ

_8__0,10 0,30 0,00 0,80 1,10 0,00 15 ] 1,30 I 0,60 0,10 0,60 0,70 0,00 13 DK 174665 B1

Statistisk analyse af resultater Tællingerne af lus blev transformeret logaritmisk og analyseret ved at anvende parametrisk statistiske metoder. Især forbehandlingstællingerne før og efter 5 den negative kontrol blev analyseret ved at anvende en two-sample t-test. Resultaterne af disse tests er anført i Tabel 3D nedenfor.

Tabel 3D

IChalimus IChalimus I Præ- I Voksne I Drægtige Caligus l-ll IH-IV voksne__hunner elongatus T-værdi -2,88 -1,41 0,83 -0,94 0,50 0,88 p-værdi 0,024 0,200 0,44 0,38 0,64 0,41

Signifikans signifi- ikke sig- ikke sig- ikke sig- ikke sig- ikke sig- kant nifikant nifikant nifikant nifikant nifikant 10

Signifikansniveau = 0,05 (5 %)

Den negative kontrol havde ingen signifikant virkning på antallet af fiskelus i nogen af livsstadierne for Lepeoptheirus salmonis eller Caligus elongatus, med 15 undtagelse af Chalimus l-ll stadierne, hvor der i virkeligheden var en signifikant forøgelse i antallet. Dette tyder på, at fisken blev kontinuerligt reinficeret med en ny generation af lus. {Den mulige virkning blev observeret dag 8 og 14 efter behandling).

20 Før-behandlings-tællingerne og efter-behandlings-tællingerne blev analyseret ved anvendelse af et randomiseret blokdesign med bure som blokke. Denne analyse tilvejebragte en test for signifikante forskelle mellem tællinger ved forskellige tidspunkter. Resultaterne er vist i Tabel 3E nedenfor: 14 DK 174665 B1

Tabel 3E

Chalimus Chalimus Præ- Voksne Drægtige Caligus l-ll lll-IV voksne hunner elongatus T-værdifor 0,001 0,026 0,002 "6,239 οΤΓΓΓ 0,001 dag___________

Signifikans signifi- signifi- signifi- ikke sig- ikke sig- signifikant kant kant_nifikant nifikant kant

Signifikansniveau = 0,05 (5%) 5

Caligus elongatus og Lepeoptheirus salmonis-faserne Chalimus I til IV og prævoksne blev signifikant reduceret ved anvendelse af cypermethrin.

Man fandt signifikant virkning med hensyn til tidsforskellen, så en Newman-10 Keuls multiple range test blev anvendt til at foretage parvise sammenligninger mellem tællinger ved forskellige tidspunkter. Resultaterne er som følger:

Chalimus l-ll 15 Der var statistisk signifikante forskelle (ved et signifikansniveau på 5 %, dvs. der var kun en 5 % chance for at finde disse resultater i random data) mellem dag 1 og 2; og 1 og 8. Dette ville indikere en reduktion i antallet ved dag 2 og derefter en forøgelse i antallet af lus mellem dag 8 og 14. Dette skyldes højst sandsynlig en reinfektion af en ny generation af lus.

20

Chalimus lll-IV

Der var statistisk signifikante forskelle (5 %) mellem dag 1 og 2; 1 og 8; og 1 og 14.

25

Prævoksne

Der var statistisk signifikante forskelle (5 %) mellem dag 1 og 2; 1 og 8; og 1 og 14.

15 DK 174665 B1

Voksne

Der var statistisk signifikante forskelle (5 %) mellem dag 1 og 2; 1 og 8; og 1 og 14.

5

Drægtige hunner

Der var ingen statistisk signifikant reduktion i lusantallet af gravide hunner. io Caligus elongatus

Der var statistisk signifikante forskelle (5%) mellem dag 1 og 2; 1 og 8; og 1 og 14.

FORSØG 4 15

Fremgangsmåde

Gravide hunlus blev indsamlet fra atlantiske laks og inkuberet ved 14 °C i 5 dage, indtil æggene var udklækket og udviklet gennem naupilusstadieme til 20 copepodider. Omtrent 100 copepodider blev tilsat til hvert af syv bægerglas med 500 ml havvand. Pyrethroider blev tilsat til seks bægerglas ved en koncentration på 5 pg pyrethroid/liter. Et bægerglas blev anvendt som kontrol. Alle bægerglas blev holdt ved 14 °C i 1 time.

25 Efter en time blev bægrene med lus siet gennem 500 pm plankton-net, og lusene blev derefter renset i frisk havvand, før de blev placeret i rene bægerglas med havvand.

Lusene blev derefter vurderet sammenlignet med kontrolbægeret. De følgende 3 o faktorer blev anvendt til vurderingen: reaktion over for lys, reaktion over for vibration og reaktion over for skygge.

16 DK 174665 B1

Reaktionen blev klassificeret som god, moderat, ringe og ingen med reference til kontrollen.

Tre subprøver, hver på 10 ml, blev udtaget fra hvert bægerglas. Det totale an-5 tal lus og antallet af mobile lus blev registreret og vist som en procentdel.

En vurdering blev udført for hvert bæger ved 1 time, 24 timer og 72 timer.

Dette eksperiment blev derefter gentaget på en senere dato med forskellige 10 copepodider ved en højere koncentration på 50 pm pyrethroid/l. Denne gang blev eksperimentet udført blindt for at undgå forudindtagethed af observanten.

17 DK 174665 B1 0 <£>_ "* < 0 ''i E o o (o $ o o § ^ o

"co co z (O

®o,_c2.c c — C

= O) ^ Q) ω < CD

ΐϊ >. ,2 O) ό o) σι 5 S D) 2 .*: (D c o z c c C3 O c 2 W ~ 2 - - - £__________ a> k— θ' C -4-1 .2 c 2 ^ c c 2 c S-S^cdojCcd <d cd ^ cd ^ 2 ,2 oo -σ ^ oo o> -o 5 o>

0 .q C? c o z c C O O C

10 > ~ 2 “ “ 2 _ *-* _ c 2 . c c _ _ c

5« >2 CD CD < CD <D 2 2 <D

i r2 O) Ό ^ O) O ° ° O) —1 O c o z c: cCDOc ” 2 “ _ 5

£ O CO CD O

E CD O) 00 CS> ° Z Z

-O

0s Φ 15 13 (- r- f— ^ ω Φ "g ω ω S < < cd^CDoo^c c c ^ ^ CO 2 2 - “ ” -g__________ 'o -C C -*- CD .2 T-, -n 2 _ cz c c tlS^^CD^CD CD 0) < < ίΟ O O ·π O nj π) ΓΤ) 22; 1 o O O o c o c Z 2 o) > 2 - - - ID__________ •M 4^ 2 2 2 c c c 52. "2 CD CD CD cd <D CD < < O* <2 "O T3 Ό O) 0)0)¾¾ —J O o o o c cc·^·^ 2 2 2 ““” •E c .g E J C δ b £ , § <D 2φ®£·-^^£οο°

1 ¥ E £ S V ω ® S E

t- I ^ I g cl tn|io|o|Q|i-|jo 18 DK 174665 B1

S

g § co r- < ^ q co oo cn E 9- 00 Z u co T- v° O" jj JJ, ø (- (-.-03.-

^ - Q) 7-1 *π V» W ^ ^ L— C

1= CD η n 0 < 0 0)030)03 τϊ >* r n rn C? 05 Cl) O) Ό O)

•S^OOo^C C C O C

2 co 2 ---^_

JZ

4—* ......

£ >> _ CL £

„,0 c C C 03 C

3 m o η η ^ 0030)03 11 2 .9 ,2 ,2 ^ O) CD CD C O)

o .g CD CD CD c c c jg C

4-* _ 2 c c c 0 c vLon<H<0 000)0 1 /n η Ό ^ 05 O) O) c O) —1 O CD o c ccjOc 5 “ - - U1 - s 2 CO CM -O- 00 CM CD ^ i E 03 cd cd r- ^ t- csi 2 z t i ? 1 Έ Έ i I I S i φ I CD O O CD ^ s~zz g__________ '2 £ c 03 O ^ _ _ © øø ^ 0 O O O O g> g)03^< £ £ CD CD CD CD ^ £ g 2 z 3. > LO___________ 2 2 c c c «ø3232øø 0 0 < < , Ό -2 ,2 Ό O) 0)0)¾¾ —> o CD CD o c c c ^ 2- 2 2 ~ _ - i -i .e i -c c £ i έ , ·§ g 2ΐω£«Ε£Ε§|^ !ν |^|[ϊ:1ο!1^1·εο1ο|ο|η1^ο 15 DK 174665 B1 19

2 CO Q ^ Q Q Q CO Q

E h- CO ° 2 ° ° ° CM 0 5? & §> _ 2 c c c c c c := σ> o o < ω q)Q)<uq> ^ >. ,9 X) O) ^ 05 0)0)0)03 15 C9 o c c c c c c oco _____ c 0

>» C

.Q _ 2 c . c c c c c O) -S ^ (I) Φ < Q) (D Q) Q) ω o. 2 ,9 ό cn ^ o) 0)0)030) ~ .a CD o c Z c c c c c S > 2“ _____

Λ _. Q) c c CCCC

52 X o) a> < cd <d α> cd cd ,9 c o) ^ o) o) o) O) en J ϋ g c ^ c _c c _c _c 15 2 CO CM O CT) 0)T-<< E co ¢3) co co ^ ·*— t— 2 21 v° O' * t e e e "g §> Π ί ί .-2 CD CD 0 CD w ο c 2: Ζ 1 to 2 ~ 2 __________ χ: «** 2 c ~

>. Ο CD 2 C

Ε Ε ο ο ^ CD 0) < < γτϊ CO Ο Ο Ο Ο CT τι π)

S £ 0 CD CD 0 £ l^jfZZ

ιο > ^ 4-* -f-* 4-> CD CO CO CO t~ r- r-

t-w.L-u.C- t_ C

OT (D Q) CD CD Q) Q) CD <C <C

i Ό Ό "Ο Ό O) 0)0)¾¾ —‘OOOOC C C ^ 2 2 2 2“ “ “ c = £ •E -i c £ % a , i

Jr _C u- i C CD CO SZ

g 0-^05 .^EEe§-Oo I £EÉ£.V«>Ki2.Qc"co CM O _2 0 it= o' >; >i ø 2 CD">» g |^|Ε|ο·|α3|ζο|ϋ|ο|μ|”ο 20 DK 174665 B1

Resultaterne viser, at alle pyrethroider syntes at have nogen virkning på fiskelusene, selv om resultaterne indikerer et varierende niveau af styrke mellem forskellige pyrethroider. Af de undersøgte formuleringer var lambda-cyhalothrin, høj-cis-cypermethrin, cypermethrin og deltamethrin de mest virkningsfulde.

5

Det er en mulighed, at effektiviteten vil variere med formuleringen såvel som med pyrethroid. Det bemærkedes i det andet eksperiment, at deltamethrinfor-muleringen ikke blev blandet godt og dannede olieagtige dråber i bægret. Py-rethroidformuleringerne, som blev blandet godt og dannede emulsioner, viste 10 sig umiddelbart at være effektive mod fiskelus.

Bifethrin blev i det andet eksperiment erstattet med trebon og lambda-cyhalothrin. Dette skyldes ganske simpelt tilgængeligheden af forbindelserne.

15 Virkningen blev vurderet på basis af nedsat mobilitet hos lusene, men der er ingen mulighed for at vurdere om lusene er døde eller blot immobile. Det kan dog formodes, at hvis de immobile lus ikke kommer sig, vil de ikke finde en vært og vil derfor dø.

20 Konklusioner

Resultaterne fra Forsøg 1 viser, at cypermethrin ved en koncentration på 100 pg/i i det væsentlige reducerer ikke kun antallet af prævoksne og voksne lus på den inficerede fisk, som det var forventet, men også overraskende antallet af 25 umodne lus. Forsøg 2 viser, at denne effekt stadig er markant, når koncentrationen af cypermethrin reduceres til 5 pg/l og yderligere, at effekten af cypermethrin ikke kun reducerer chalimus-antallet ved at dræbe en del deraf, men også forlænger udviklingstiderne af dem, som overlever, således at modningen forsinkes for de mest skadelige prævoksne og voksne faser. Det menes også, 3 0 at der kan være en virkning mht. at reducere lusenes fødeindtagelsesshastig-hed, således at skaden der forårsages af hver enkelt overlevende lus reduceres.

Forsøg 3 viser at effekten af cypermethrin stadig er statistisk signifikant, selv 35 ved koncentrationer så lave som 0,9 pg/l, og yderligere at det er effektivt ikke kun mod umodne faser af Lepeoptheirus salmonis, men også mod Caligus 21 DK 174665 B1 elongates. Det imødeses, at cypermethrin vil være effektivt i koncentrationer i intervallet fra 0,05 pg/l til 500 pg/l, idet koncentrationen fortrinsvis er i intervallet 0,5 pg/l til 100 pg/l.

5 Forsøg 4 viste virkningen af andre pyrethroidforbindelser, især lambda-cyhalothrin, høj-cis-cypermethrin og deltamethrin.

Det skal bemærkes, at betegnelsen "fiskelus" er en generel betegnelse, som kan anvendes for et antal forskellige parasitarter hos både hos havvands- og 10 ferskvands-fisk. Det er tidligere blevet fundet, at effektive behandlinger af én art generelt er effektive også mod andre arter, og opfindelsen udstrækker sig derfor til behandling af umodne fiskelus generelt, uanset art og uanset om skadedyrsangrebene er på havvands- eller ferskvands-fisk.

Claims (8)

1. 22 DK 174665 B1
2. 1. Anvendelse af en pyrethroidforbindelse valgt blandt cypermethrin, høj-cis-cypermethrin, lambda-cyhalothrin og deltamethrin til fremstilling af en sammen- 5 sætning til behandling af skadedyrsangreb på fisk forårsaget af chalimus- og copepodid-faser af fiskelus.
3. 2. Anvendelse afen pyrethroidforbindelse valgt blandt cypermethrin, høj-cis-cypermethrin, lambda-cyhalothrin og deltamethrin til fremstilling af en sammen- lo sætning til forebyggende behandling af skadedyrsangreb på fisk forårsaget af prævoksne og voksne fiskelus.
4. 3. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2, hvor sammensætningen er tilpasset til topisk indgivelse til fisken. 15
5. 4. Anvendelse ifølge krav 3, hvor sammensætningen omfatter en opløsning eller suspension af pyrethroidforbindelsen.
6. 5. Anvendelse ifølge krav 4, hvor opløsningen eller suspensionen indeholder 20 pyrethroidforbindelsen i en koncentration på mellem 0,05 pg/l og 500 pg/l.
7. 6. Anvendelse ifølge krav 5, hvor koncentrationen er mellem 0,5 pg/l og 100 pg/l. FIG. 1 DK 174665 B1 Chalimus [? 30 ........ - ----—-- ·-« ♦ Kontrol -«-Cypermettiiin 3» w Z 2U s' O’ s' 3 ,S -t-> S' •H y*' W ,U E / c s' ® ' ' ----- 0 - 0 2 4 0 b Dage efter behandling Pre - voksne P, 1,—. ------ c 14 I *- Kontrol -« CYpetcnathrtn r—Ή B 12 · u M 3 10......... / *—i Ο» 8 ......................................... - _yS!\........ ^8 .......... s'^ c ,, s' 1 4 <1> 'V yS'^ °0 2 4 0 Θ Dage efter behandling Voksne Di I ---------- ---------» 14 [-»-Kontrol -«-Cypernnatlirln ...... B «................ i.. A........ en B V ·—__.—----- " 8 \ I- \ <D \ C 2 ..............................-.................... , °0 2 4 6 B Dage efter behandling Fig. 2A Effekt af cypermethrin på Chalimus 35 -:-====== — Ubehandlet
8. 30. Behandlet o) -'- ^ 20 ......N\<^ I 15 .....^--- I 10 ............................................ o o 5 ........................................ 0 - Dag 10 Dag 20 Dag fortælling DK 174665 B1 FIG. 2B Forsøg GP1 (ubehandlet) 30------ —.......—.......— — Forbehandl. Tælling 1 — 20 -·*- Tælling 2 ^ " ---- -Il 1 % 20 3 cn 5 !5 Q.r^— Cop. Ch.l Cli.il Ch.ill Ch.IV PA I PA II Voksen Udviklingsstadie Forsøg GP2 (behandlet) 30 - ------ a — Forbehandl. Tælling 1 Tælling 2 I » Λ σι j \ i 10 / \ 0 11 J ‘ —m——, Cop. Ch.l Ch.il Ch.ill Cb.IV PA I PA!l Voksen Udviklingsstadie DK 174665 B1 FIG. 3 Antal lus 4 -- · ' — ....... · 1 —η i^-Chalimus l-ll -4-Chalimus lll-IV »· pre-voksne\ 3.5 , Voksne_Gravide hunner -*~Caligus J Da9 0 Dag 1 Dag 2 Dag 8 Dag 1 5 Behandling var på dag 1