DK173490B1 - Farmaceutiske bærestoffer til reduktion af transdermal flux - Google Patents

Description

1 DK 173490 B1 OPFINDELSENS OMRÅDE.

5

Opfindelsen angår en farmaceutisk formulering til indførelse af reservoirvirkning i hud og slimhinder for at forøge indtrængningen og opholdstiden for farmakologisk aktive stoffer deri.

10 OPFINDELSENS BAGGRUND.

Der er mange lokaliserede sygdomstilstande, der behandles effektivt ved lokal påføring af passende fysiologiske stoffer. For at sådanne behandlinger kan være maksimalt effektive, er det nødvendigt, at så meget som muligt af det far-15 makologisk aktive stof absorberes af huden, hvor det kan komme i kontakt med sygdomstilstanden i hudvævene uden at gå tabt ved at blive gnedet af på tøjet eller ved fordampning. Samtidig må stoffet ikke trænge så effektivt igennem huden, at det hurtigt tabes til lymfe- eller blodkredsløbet. Denne sidste faktor er navnlig vigtig, når det farmakologisk aktive stof er toksisk, når det bruges 20 systemisk.

Det ideelle bærestof for lægemidler til lokalt brug er derfor et, der kan give en "reservoirvirkning" i den hud eller de slimhinder, som påføres den lokale behandling. Denne "reservoirvirkning" defineres som en forøgelse af hudens eller 25 slimhindens evne til at absorbere og tilbageholde farmakologisk aktive stoffer, det vil sige, at forøge opholdstiden i huden eller hinden, nedsætte transittiden for lægemidlet og reducere den transdermale flux.

Forskellige stoffer vides at forøge farmakologisk aktive stoffers evne til at trænge 30 igennem huden og slimhinder, for eksempel N-bis-azacyclopentan-2-onyl-alkaner, 1-substituerede azacycloheptan-2-oner og højere alkylsubstituerede azacyclo-pentan-2-oner, så vel som dimethylsulfoxid og lavere alkylsulfoxider. Disse stoffer har imidlertid den ulempe, at de giver en hurtig spredning af de farmakologisk aktive stoffer væk fra det lokaliserede syge sted. Mange medikamenter til lokalt brug, 35 såsom retinoideme, der bruges i behandlingen af acne, og methotrexat, der 2 DK 173490 B1 bruges i behandlingen af psoriasis, er systemisk toksiske. Retinoideme for eksempel vides at skade ufødte fostre. Der er således behov for en metode til at forøge evnen hos sådanne medikamenter til at trænge ind i huden eller slimhinderne, således at der kan anvendes en lavere total dosis, samtidig med at 5 den hæmmer deres evne til at trænge fra huden og ind i det indre af kroppen.

Det problem, der udgøres af det paradoksale behov for, at et systemisk toksisk lægemiddel til lokal anvendelse skal absorberes effektivt ind i, men ikke igennem huden, har hidtil været uerkendt. Der har ikke været nogen bærestofadditiver til 10 rådighed for den farmakologiske industri, der bevirker en forøgelse af "reservoirkapaciteten" i huden og slimhinderne således, at mængden af farmakologisk aktive stoffer, der når frem til og fastholdes til det lokaliserede, syge sted maksimeres.

15 RESUMÉ AF OPFINDELSEN.

Det er derfor formålet med den foreliggende opfindelse at angive en farmaceutisk formulering til at indføre en reservoireffekt i hud og slimhinder for at forøge indtrængningen og tilbageholdelsen af lokalt påførte farmakologisk aktive 20 terapeutiske og kosmetiske stoffer deri. Det omhandlede formål opnås ved en farmaceutisk formulering, der ifølge opfindelsen er særegen ved, at formuleringen omfatter et farmakologisk aktivt stof udvalgt af gruppen bestående af NDGA (nordihydroguaiaretsyre); VP-16 (epipodophyliotoxin-beta-D-ethyliden giuco-pyranosidetoposid); VM-26 (epipodo-phyllotoxin-beta-D-thenyliden glucopyrano-25 sidteniposid); ^-demethylepipodophyllotoxin; diethyistilbøstrol; dithranol; cyclo- phosphamid; mitomycin; daunomycin; cisdiamindichloridplatin; adriamycin og allopurinol samt en effektiv mængde af en vandopløselig, zinkhoidig forbindelse.

Additiverne ifølge denne opfindelse er vandopløselige, zinkholdige forbindelser, 30 fortrinsvis zinkhalogenider, zinksulfat, zinknitrat, zinkacetat og/éfier zinkstearat, og mest foretrukket zinkchlorid.

Ved at indføre en reservoirvirkning i huden og slimhinderne for at reducere den transdermale flux, så lægemidler absorberes og tilbageholdes deri i større 35 mængder og i længere tidsrum end det hidtil har været muligt, virker de vandopløselige, zinkholdige forbindelser ifølge opfindelsen potentierende på de 3 DK 173490 B1 farmakologisk aktive stoffer. Potentiering defineres som elimination eller reduktion af uønskede virkninger, såsom systemisk toksicitet og udvidelse af effektivitetsområdet for det farmakologisk aktive stof eller begge dele.

5 Effektiviteten af indførelsen af NDGA (nordihydroguaiaretsyre) fremgår af det neden for angivne eksempel 2, medens effektiviteten af de øvrige stoffer fremgår af det efterfølgende eksempel 3 og den tilhørende tabel 3.

BESKRIVELSE AF TEGNINGEN.

10

Tegningen er en grafisk afbildning af forsøgsresultater, som viser hudreser-voirvirkningen opnået ved fremgangsmåden ifølge denne opfindelse ved at benytte nordihydroguaiaretsyre med zinkchlorid sammenlignet med den samme forbindelse uden zinkchlorid. Nordihydroguaiaretsyren blev mærket med carbon-15 14 med henblik på radiotraceranalyse. Den grafiske afbildning viser omgående absorption og længere tilbageholdelse af større mængder af nordihydroguaiaretsyren med zinkchlorid tilstede end uden. Tilgængeligheden af nordi-hydroguaiaretsyre, der er en lipoxygenaseinhibitor, til terapeutisk at virke på lokaliserede sygdomstilstande, både med og uden zinkchlorid tilsat, måles ved 20 arealerne under de respektive kurver. Det fremgår, at hudbiotilgængeligheden er stærkt forøget ved tilstedeværelsen af en zinkholdig forbindelse. Fluxhastigheden for lægemidlet kan beregnes som en funktion af arealet under kurven ved at dividere dette areal med dosis. Som det fremgår er fluxhastigheden for lægemidlet stærkt nedsat over hele dosisintervallet ved tilsæjning af zinkchlorid.

25 DETALJERET BESKRIVELSE AF OPFINDELSEN.

De zinkholdige forbindelser ifølge denne opfindelse er i almindelighed et hvilket som helst vandopløseligt, organisk eller uorganisk zinksalt, der dissocierer i det til 30 lokalt brug beregnede bærestof, således at der fremkommer zinktoner til kompleksdannelse eller chelatdannelse med de farmakologisk aktive stoffer, der er tilstede i bærestoffet. Eksempler på velegnede zinkholdige forbindelser er zinkhalo genid, zinksulfat, zinknitrat, zinkacetat og/eller zinkstearat. Den mest foretrukne zinkholdige forbindelse er zinkchlorid.

35 4 DK 173490 B1 Sådanne vandopløselige zinkholdige forbindelser kan fremstilles ved metoder, der er kendt inden for.faget, og mange er kommercielt tilgængelige.

Præparaterne til lokalt brug med forøgede reservoirdannende egenskaber ifølge 5 denne opfindelse kan fremstilles ved at blande en vandopløselig, zinkholdig forbindelse i det farmaceutiske præparat eller bærestof, hvori en reservoirdannende egenskab ønskes frembragt ved hjælp af midler der er kendt inden for faget for at fremme kompleksdannelse eller chelatdannelse med de farmakologisk aktive stoffer deri med zinkioner. Tilstedeværelsen af andre metalioner, der på u-10 gunstig måde ville konkurrere med zink om bindingsstederne til kompleksdannelse eller chelatdannelse, bør undgås. Zinksaltet kan også blandes med det phamakologisk aktive stof under dannelse af et chelat eller et kompleks, som derefter blandes i det farmaceutiske bærestof.

15 De zinkholdige forbindelser er fortrinsvis tilstede i et forhold equimofært med de farmakologisk aktive stoffer for at bevirke maksimal kompleksdannelse eller chelatdannelse. Hvor ødelæggelse af stratum comeum, d.v.s afhoming, ønskes, kan der benyttes et overskud af sådanne zinkholdige forbindelser, der også virker som ætsmidler, for eksempel zinkchlorid. (/Umindeligvis vil zinkchtorid-20 koncentrationer på 35% (0,257 mol pr. 100 g) eller mere forårsage vævsødelæggelse ved lokal anvendelse.) Normalt vil brug af equimolære koncentrationer af zinkchlorid og det farmakologisk aktive stof ikke indebære brugen af ætsende mængder af zinkchlorid, imidlertid bør mindre end 35% zinkchlorid betragtes som en øvre grænse, når ingen ætsvirkning ønskes..Mindre end equimolært forhold af 25 zinkholdig forbindelse i forhold til farmakologisk aktivt stof kan anvendes, når det ikke ønskes, at alt medikamentet skal absorberes i huden eller slimhinderne, for eksempel i forbindelse med mundskyinings- og udskylningspræparater, hvor angreb på fritsvømmende organismer også ønskes.

30 Andre ingredienser kan sættes til præparaterne inklusive farvestoffer, stabilitetsforbedrende stoffer, antioxidanter og lignende. Fortrinsvis konkurrerer disse tilsætningsstoffer ikke med det farmakologisk aktive stof om zinken, når det imidlertid er nødvendigt, kan overskud af zinkholdig forbindelse bruges for at kompensere for den zinkkompleksdannende eller chelerende effekt hos sådanne 35 additiver.

5 DK 173490 B1

De farmakologisk aktive stoffer ifølge denne opfindelse er sådanne, der er beregnet til lokal påføring for at opnå lokaliseret terapeutisk eller kosmetisk virkning.

5 Mekanismen, hvorved den reservoirdannende virkning ifølge denne opfindelse fremkommer, kendes ikke; imidlertid foretrækkes det, at de farmakologiske stoffer indeholder hydro xy, oxo, sulfydryl, amin, carboxyl eller andre anioniske grupper eller kombinationer deraf i konformationer, som muliggør kompleksdannelse og/eller chelatdannelse med zinkioner.

10

Farmakologisk aktive stoffer ifølge opfindelsen en

De antineoplastiske stoffer NDGA (nordihydroguaiaretsyre), VP-16 (epipodo-phyllotoxin-beta-D-ethyliden glucopyranosid-etoposid), VM-26 (epipodophyilotoxin-beta-D-thenyliden glucopyranosid-teniposid), 4’-demethylepipodophyllotoxin1 di-15 ethylstilbøstrol, dithranol, cyclophosphamid, mitomycin, daunomycin, cis-diamin- dichlorplatin, adriamycin, allopurinol, 5-fluoruracil og methotrexat.

Dispenseringsformer for lokal anvendelse kan omfatte lotioner, salver, cremer, geler, suppositorier, næsedråber, mundskyllemidler, sprøjtevæsker, aerosoler og 20 lignende. Typiske bærestoffer, der udgør de foregående dispenseringsformer omfatter vand, acetone, isopropylaikohol, stearylalkohol, freoner, ethylalkohol, polyvinylpyrrolidon, propylenglycol, polyethylenglycol, duftstoffer, geldannende stoffer, mineralolie, stearinsyre. spermacet, sorbitan, monoleat, polysorbater, "Tweens", sorbitol, methylcellulose, etc. r 25 Mængden af formuleringen, og således af det farmakologisk aktive stof, der skal administreres deri, vil naturligvis være en effektiv mængde til opnåelse af det ønskede resultat, der ventes deraf. Dette vil naturligvis blive fastslå et af den praktiserende læge ved hjælp af hans almindelige viden. Efter almindelig god 30 formuleringspraksis anvendes indledningsvis en dosering i den lave ende af det brugbare interval for et bestemt stof, og doseringen forøges, som den iagttagede virkning viser behov for.

6 DK 173490 B1

Foretrukne formuleringer illustreres i de følgende eksempien EKSEMPEL 1

5 ANTINEOPLASTISKE PRÆPARATER

To formuleringer indeholdende zinkchlorid, nordihydroguaiaretsyre (NDGA), syre (EDTA), butylhydroxytolulen (BHT), stearylalkohol, renset vand, polyethylenglycol med en gennemsnitlig molekylvægt på 400 (PEGO 400), og polyethylengiycol 10 med en gennemsnitlig molekylvægt på 3350 (PEGO 3350) blev fremstillet på følgende måde: det rensede vand blev anbragt i en ren glasbeholder af passende størrelse. Vandet blev opvarmet til omkring 80-90°C under omrøring og zinkchloridet blev sat til det opvarmede vand, idet omrøringen blev fortsat indtil zinkchloridet gik i opløsning. Ethylendiamintetraeddikesyre blev derefter langsomt 15 tilsat under omrøring indtil den var opløst. I en anden glasbeholder af passende størrelse blev polyethylenglycol 400 opvarmet til omkring 80-90°C under omrøring.

NDGA blev tilsat, og derefter BHT, og denne blanding blev sat til zinkchlorid-ethylendiamintetraeddikesyreopløsningen under omrøring. Hele blandingen blev så afkølet til omkring stuetemperatur og kørt gennem en valsemølle nummer 3 20 indtil den var jævn. Polyethylenglycol 3350 blev så opvarmet til omkring 80-90°C i en passende beholder og de møllede ingredienser blev tilsat under blanding.

Den endelige sammensætning i vægt/vægt% varsom følgen TABEL 1 -* 25 _Blanding_

Sammensætning_A_B_

Zinkchlorid 29,8 10,0 NDGA 4,6 4,6 EDTA 14,7 4,93 BHT 1,1 1,1

Stearylalkohol 0,5 0,5 H20 18,3 18,3 PEGO 400 26,4 26,4 PEGO 3350 4,5 4,5 EKSEMPEL 2 7 DK 173490 B1

RESERVOIRVIRKNING

5 Denne undersøgelse blev planlagt for at tilvejebringe grundlæggende farmakokinetiske data om, hvad der sker med carbon 14 (14C) mærket nordihydroguaiaretsyre (NDGA), der påføres huden i de modificerede blandinger A og B, der beskrives i eksempel 1. Desuden blev fordelingen af zink målt for den dermalt påførte blanding A.

10 14C-NDGA forbindelsen havde en specifik radioaktivitet på 20,2 Ci/mol (66,9 pCi/mg) og en renhed på 96,9% ifølge massespektrometri og ved radioautografi af tyndtlagsplader udviklet i benzen:isopropanol:eddikesyre:vand (25:5:2:10).

15 Herefter blev 25,1 mg af 14C-NDGA forbindelsen (66,9 pCi/mg) blandet med 12,35 g af blanding A. Tredobbelte analyser af slutblandingen for 14C ved tælling og for NDGA ved højttryksvæskechromatografi (HPLC) viste homogenitet med et indhold på 51 pg af 14C-NDGA-forbindelse/mg af blanding A. Den specifikke radioaktivitet for NDGA var 3,00 x 103 pCi/pg.

20

Tilsvarende blev 26,3 mg af den originale 14C-NDGA-blanding (66,9 pCi/mg) blandet med 12,55 g af blanding A uden Zn og EDTA for at få en blanding til undersøgelsen af den dermale indtrængning af NDGA fra blanding A uden Zn og EDTA. Analyser af tredobbelte prøver af den modificerede blanding A viste, at 25 slutblandingen var homogen med hensyn til 14C og NDGA. Den indeholdt 53 pg 14C-NDGA-forbindelse/mg bærestof. Den specifikke radioaktivitet af det fortyndede NDGA var 3,41 x 10"3 pCi/pg.

Blandingerne blev anbragt på huden af unge voksne Sprague- Dawiey rotter efter 30 følgende protokol: under etheranæsthesi blev rygskindet af rotten forberedt ved at fjerne hårene fra et 5 x 5 cm område med en klippemaskine og de tilbageværende hårstubbe blev fjernet ved hjælp af en depileringsvoks. Huden blev så trukket af gentagne gange (5x) med selvklæbende tape indtil stratum comeum var fjernet.

Så blev 0,5 g af formuleringen afvejet på et stykke polypropylenfolie på 5 x 5 cm, 35 som blev anbragt på huden. Det blev holdt på plads ved hjælp af hypoallergen tape. Til sidst blev bandagen viklet ind i plaster. Efter behandling blev rotterne sat i 8 DK 173490 B1 bur hver for sig i metabolismebure, der gav fri adgang til foder og vand og var indrettet til separat opsamling af urin og fæces.

Undersøgelsen af blanding A med 14C-NDGA blev udført på 15 Sprague-Dawley 5 han-rotter (middelvægt 339 ± 16 g). De fik i gennemsnit 0,520 (± 0,032) g af blanding A indeholdende 14C-NDGA. Middeldosis af 14C-NDGA var 78,5 (± 7,0) mg/kg legemsvægt. Rotterne blev opstaldet individuelt i metabolismebure, der gav fri adgang til foder og vand og var indrettet til separat opsamling af urin og fæces. Grupper å tre rotter blev aflivet efter 4, 24, 48, 72 og 96 timer og ekskreta blev 10 opsamlet fra hver rotte i perioder af 24 timer. I tilgift til den sædvanlige udtagning af vævsprøver, blev huden fra appllcationsstedet skåret ud efter aftøring af stedet med vandfugtede renseservietter. Materialet fra aftørringerne blev føjet til bandagerne, som blev neddyppet i en lille beholder med acetone.

15 Undersøgelsen af blanding A uden zink og EDTA blev udført på 15 Sprague-Dawley han-rotter (middelvægt 241 ± 7 g). De fik i gennemsnit 0,390 (± 0,019) g zinkfri C205 indeholdende 14C-NDGA. Gennemsnitsdosis af 14C-NDGA var 83,2 mg/kg legemsvægt. Grupper å tre rotter blev aflivet ved forblødning og vævsprøver blev taget 4, 24, 48, 72 og 96 timer efter doseringen. På hvert 20 aflivningstidspunkt blev der også fra de rotter, som det var planlagt at aflive næste gang, taget blodprøver fra sinus orbitaiis på en sådan måde, at de ikke døde af det. Bandagerne og renseservietterne fra aftørring af hudområdet på aflivningstidspunktet blev taget fra og lagt i acetone, som beskrevet ovenfor.

25 Resultaterne af undersøgelserne er anført i tabel 2A for blanding A med indhold af 14C-NDGA og tabel 2B for Zn-fri blanding A med indhold af 14C-NDGA. Analyseresultaterne for vævsfordelingen af zink som procent af dosis I rotter doseret med blanding A med indhold af 14C-NDGA er anført i tabel 2C.

TABEL2A

g DK 173490 B1 Vævsfordeling af 14C som procent af dosis i rotter doseret dermalt med blanding A med indhold af 14C-NDGA.

5 _Middel (±S.D) * procent af dosis af 14C fundet efter (timer) Væv_4_ 24_48_72_96

Organer 4,62 7,55 10,29 10,43 13,45 (%) (±2,27) (±1,85) (±8,8) (±6,94) (±3,45)

Hudområde 20,8 19,6 11,1 8,58 7,01 (%) (±8,4) (±5,2) (±1,4) (±5,41) (±2,28)

*N = 3 TABEL2B

Vævsfordeling af 14C som procent af dosis i rotter doseret dermalt med Zn-fri 10 blanding A med indhold af 14C-NDGA.

_Middel (±S.D) * procent af dosis af UC fundet efter (timer) Væv_4_24_48 72_96

Organer 10.28 11,08 10,47 5,41 8,03 (%) (±6,12) (±9,65) (±10,33) (±4,21) (±1,48)

Hudområde 4,15 12,20 7.86 4,72 1.43 (%) (±0,76) (±5,9) (±3,75) (±3,18) (±0,55) *N = 3

TABEL 2C

10 DK 173490 B1 Vævsfordeling af Zn som procent åf dosis i rotter doseret dermalt med blanding A.

Middel (±S,P) * procent af dosis af 14C fundet efter (timer) Væv_4_24_48_72_96

Organer (%) 3,28 6,54 6,79 11,47 12,69

Hudområde 10,5 11,8 9,58 6,46 4,99 (%) *N = 3 5

Undersøgelsen blev fortsat for at prøve Blanding B med 14C- NDGA, Zn- og EDTA-fri blanding B; og modificeret blanding B uden BHT og 0,10 EDTA. Den følgende tabel 2D viser sammensætningerne af blandingerne og mængderne af stoffer brugt til fremstilling af blandinger indeholdende 14C-NDGA. Disse 10 blandinger blev analyseret for 14C ved scintillationtælling og for NDGA ved væskechromatografi.

TABEL 2D

u DK 173490 B1 __Sammensætning (%)_

Modificeret

Blanding B Zn-fri Blanding B Blanding B

Bestanddel_Formulering_Formulering_Formulering

Forbindelse, Zn 10,00 0,00 10,00

Forbindelse, EDTA 4,93 0,00 0,10

Forbindelse, NDGA 4,60 4,60 4,60

Forbindelse, BHT 1,10 ; 1,10 0,00

Vand, renset 18,32 18,32 19,42 PEG 400 2,60 14,50 14,19 PEG 8000 53,45 49,39 46,69

Stearylalkohol_5,00_;_12,09_5,00_ 100% 100% 100%

Blandinger Indeholdende 14C-NDGA:

Mg 14C-NDGA 25,75 25,40 25,20 g Formulering 12,55 12,55 12,75 % NDGA i slutblandingen 4,80 4,79 4,78 5

Rotternes middelvægt, den gennemsnitlige dosis af formuleringerne og middeldosis af 14C-NDGA i mg/kg legemsvægt for de tre nærværende protokoller van 297 ± 15 g (standard afvigelse), 512 ± 28 mg, og 82,7 ± 2,0 mg/kg for blanding B; 325 ± 12 g, 570 ± 26 mg, og 84,0 ±1,4 mg/kg for Zn-fri blanding B; og 10 328 ± 27 g, 575 ± 45 mg, og 84,2 ± 2,8 mg/kg for modificeret blanding B. Der blev benyttet 15 rotter til hver undersøgelse og grupper å tre rotter blev aflivet efter 4, 24,48,48, 72 og 96 timer efter dosering. Hver gang blev blod, lever, hudområde, tarme med indhold, kroppen og bandager samt renseservietter fra aftørringen isoleret. Fra grupperne, der blev aflivet efter 24, 48, 72 og 96 timer blev urin, 15 fæces og vaskevand fra burene også isoleret

Resultaterne af undersøgelserne er vist i tabel 2E for blanding B, tabel 2F for Zn-fri blanding B og tabel 2G for modificeret blanding B.

20

TABEL2E

12 DK 173490 B1 * ·** Vævsfordeling af 14C som procent af dosis i rotter doseret dermalt med blanding B med Indhold af 14C-NDGA.

S

_Middel (±S.D) * procent af dosis af 14C fundet efter (timer) Væv_4 24_48_72_96

Organer 1,92 4,41 4,31 3,38 1,87 (%) (±1,34) (±1,44) (±2,5) (±0,52) (±1,1)

Hudområde 16,3 11,9 8,92 6,55 5,11 (%) (±9,2) (±6,1) (±4,10) (±1,76) (±3,01)

*N = 3 TABEL2F

Vævsfordeling af 14C som procent af dosis i rotter doseret dermalt med Zn-fri 10 blanding B med indhold af 14C-NDGA.

Middel (±S.D) * procent af dosis af 14C fundet efter (timer) Væv_4_24_48_72_96

Organer 1,16 2,29 2,38 7,39 7,73 (%) (±0,92) (±2,26) (±1,73) (±10,05) (±10,9)

Hudområde 2,21 4,45 6,07 18,6 12,0 (%) (±1,44) (±4,36) (±2,90) (±6,3) (±4,99) *N = 3

TABEL2G

13 DK 173490 B1 Vævsfordeling af 14C som procent af dosis i rotter doseret dermalt med modificeret blanding B med indhold af 14C-NDGA.

5

Middel (±S.D) * procent af dosis af 14C fundet efter (timer) Væv_4_24_48_72_96

Organer 4,35 1,65 4,41 2,54 0,97 (%) (+3,06) (±0,68) (±3,57) (±2,05) (±0,19)

Hudområde 14,4 23,0 17,1 16,3 17,7 (%) (±7,1) (±5,5) (±4,7) . (±0,6) (±6,2) *N = 3

De ovenstående resultater viser at tilsætningen af den vandopløselige zinkholdige forbindelse får det organiske molekyle til at absorberes hurtigere I huden i større mængder og til at blive tilbageholdt i huden længere end når den zinkholdige 10 forbindelse ikke er tilstede.

EKSEMPEL 3

FORØGELSE AF ANTINEOPLASTISK VIRKNING

15

Af de i listen anførte organiske forbindelser blev der af de forbindelser der har to eller flere benzenringe brugt 0,0145 mol pr. 100 cm3, og af dem, der har en eller ingen benzenringe, blev der brugt 0,029 mol pr. 100 cm3. Den organiske forbindelse blev afmålt i et rent hætteglas og PEGO 400 blev tilsat under omrøring 20 indtil den gik i opløsning.

Til de testblandinger, der indeholdt zinkchlorid, blev zinkchlorid først opløst i PEGO 400 til fremstilling afen stamopløsning, der indeholdt 0,69 % zinkchlorid, og denne opløsning blev tilsat under omrøring til de hætteglas, der indeholdt de 25 organiske forbindelser, der var under afprøvning.

Disse forbindelser blev undersøgt med og uden zinkchlorid og deres effektivitet som antitumormidler over for heterotransplantater af human brystadenocarcinom.

14 DK 173490 B1 MX-1, dyrket i thymusløse (nøgne) mus med Balb/c afstamning ved intratumoral injektion efter den følgende protokol: hvert dyr blev podet intradermalt på ryggen nærved nakken med 0,05 ml af et MX-1 tumorhomogenat Vægten af tumorerne i mg blev beregnet ud fra måling af længden, bredden og højden i mm af tumorerne 5 ved hjælp af formlen (LxBx H)/2. Dyrene blev randomiseret i grupper for at sikre fordelingen af mindre og større tumorer. Tumorerne bfev behandlet ved intratumoral injektion af 0,05 ml af hver testblanding. Hver blanding blev undersøgt på fem dyr. Dyrene blev kun behandlet én gang. Resultaterne er vist i tabel 3.

10 TABEL3

Organisk forbindelse Tumorfri For tidligt Tumor ved Tumor

Forbindelse kendt Anti- 60 dage døde død tilbagefald cancermiddel _ VP-16 Zn-fri 2 2 3 0 VP-16+ Zn 5 0 0 0 ‘1/5 VP-16+ Zn 3 0 2 2 VM-26 Zn-fri 0 0 5 0 VM-26 + Zn 5 0 0 0 * 1/5 VM-26 + Zn 5 0 0 0 4'-demethylepipodophyilo- 10 4 3 toxin Zn-fri 4’-demethylepipodophyllo- 5 0 0 0 toxin+ Zn

Diethylstilbøstrol Zn-fri 0 2 5 0

Diethylstilbøstrol + Zn 3 0 2 1

Dithrano! Zn-fri 10 4 0

Dithranol + Zn 4 Ότ 1 1

Cyclophosphamid Zn-fri 0 0 5 0

Cydophosphamid + Zn 3 2 0 0

Mitomycin Zn-fri 14 2 0

Mitomycin+Zn 5 0 0 0

Daunomycin Zn-fri 3 2 5 3

Daunomycln Zn 5 0 0 0 TABEL 3 (fortsat) 15 DK 173490 B1

Organisk forbindelse Tumor fri Fortidligt Tumor ved Tumor

Forbindelse kendt Anti- 60 dage døde død tilbagefald cancermiddel________

Cisdiamindichloridplatin Zn- 1 0 4 0 fri

Cisdiamindichloridplatin + Zn 5 0 0 0

Adriamycin Zn-fri 0 12 4 *1/10 Adriamycin Zn-fri 2 12 2

Adriamycin + Zn 4 0 1 1 *1/10 Adriamycin + Zn 13 11

Allopurino! Zn-fri** 0 - 5 *5/2 Allopurinol + Zn 0 0 5 0

Aliopurinol + Zn 10 4 4 *5/2 Allopurinol+ Zn 10 4 4 * Dosisniveau forhøjet eller sat ned som anført.

5 ** Alle aflivet på dag 25.

Disse resultater viser den reducerede toksicitet og forøgede antineoplastiske virkning opnået ved tilsætning af zinkioner.

10 EKSEMPLERNE 4-9 POTENTIERING AF ANTINEOPLASTISKE MIDLER BEREGNET TIL LOKALT BRUG _ t 15 I eksemplerne 4-9, hvori der henvises til afprøvningen af blandinger for antitumoraktivitet mod B-16 melanom og Sarcom-180 fast tumorvækst i mus blev følgende fremgangsmåder benyttet. I den udstrækning at et bestemt eksempel modificerede fremgangsmåden, vil sådan modification blive anført ved det enkelte eksempel.

20

Begge typer af tumorer blev dyrket intradermalt eller subcutant i musene. B-16 melanom blev dyrket i BDFi mus og S-180 tumoren blev dyrket i ICR mus. Hver mus blev injiceret intradermalt på et barberet område bag på musens hals med omkring 0,01 ml afen saltvandssuspension indeholdende omkring 1 x 10® celler af 25 tumorcedeme pr. 0,01 ml. Tumorerne fik lov til at vokse til de havde nået en 16 DK 173490 B1 * % omtrentlig størrelse på omkring 25-100 mg, beregnet ved at multiplicere længden af tumoren med -bredden og højden målt i mm og dividere produktet med 2. På den første behandlingsdag blev dyrene med tumorstørrelse uden for størrelsesintervallet sorteret fra og de resterende dyr blev tilfældigt delt i kontrol-5 og forsøgsgrupper. Når tumorerne havde nået en passende størrelse, sædvanligvis omkring dag 6, blev tumorerne punkteret ens, og derpå behandlet med enten en testblanding eder en kontrol ved lokal· påføring på overfladen af tumoren. Sædvanligvis blev der foretaget to lokale påføringer med 24 timers mellemrum. Stofferne blev påført således, at der opnåedes et lag på fra omkring 1 10 til omkring 2 mm over hele overfladen af tumoren. Dyrene blev derefter observeret og deres vægt og størrelsen af deres tumor blev målt periodisk.

Resultaterne fra hvert af eksperimenterne omfatter følgende: (a) begyndelsesantallet (n) af dyr i hver behandlingsgruppe af et forsøg; 15 (b) den gennemsnitlige tumorstørrelse i mg på de dyr, der blev behandlet med blandingen og den gennemsnitlige tumorstørrelse for kontroldyrene; 20 (c) forholdet ganget med 100 af gennemsnitsstørrelsen af tumorerne hos de behandlede dyr i forhold til hos kontroldyrene (T/C), hvor T » gennemsnitsstørrelse af behandlede mus og C « gennemsnitstumorstørrelse hos kontroimus; 25 (d) procentdel af både behandlede og kontroldyr uden tumor; (e) procentdel af dyr af det oprindelige antal, der overlevede.

De sidste tre målinger fra et bestemt eksperiment blev alle foretaget på samme tid 3° og varierer i almindelighed fra 21 til omkring 33 dage efter tumorpodning. En T/C værdi på 42 eller mindre viser aktivitet, i alle de følgende tabeller for eksemplerne 4-9 er kontrolresultaterne givet i parentes.

35 17 DK 173490 B1 EKSEMPEL 4

Der blev fremstillet to meso-NDGA formuleringer med et PEGO grundlag. Deres sammensætninger er som vist i tabel 4.

5 TABEL 4

Blanding_NDGA (meso)_HgO_EtOH_PEGO 3350 1 3,6 24,3 48,5 23,4 2 6,9 0 0 93.1

Blanding nr. 1 blev fremstillet ved at opløse NDGA i absolut ethanol ved 10 opvarmning og omrøring; derefter blev vandet langsomt sat til NDGA opløsningen.

Blandingen blev opvarmet for at fordampe tilstrækkeligt meget af opløsningsmidlet til at man fik en blanding med omkring 130 % af NDGA's vægt, og den blev så blandet i PEGO grundlaget. Blanding nr. 2 blev fremstillet ved simpelthen at opløse NDGA i PEGO grundlaget ved opvarmning og omrøring.

15 EKSEMPEL 5 NDGA formuleringerne fia eksempel 4 blev undersøgt for potentiel antitumoraktivitet mod B-16 melanom dyrket i mus. Den benyttede 20 fremgangsmåde var den, der er beskrevet tidligere. Resultaterne er vist i tabel 5.

TABEL 5 ' -i 18 DK 173490 B1

Tumorstørreise % Tumorfri Overievende _n_ T/C1_(kontrol)_(kontrol)_(kontrol) 9 87 954±698 0 33 (1091 ±547) (0) (80) 9 114 748±621 0 77 (645±335) (0) (77) 10* 24 138199 20 100 (5751270) (0) (60) 1T/C forholdet blev beregnet mellem dag 21 og dag 24.

5 * Dyr behandlet én gang ved en 0,05 ml intratumoral injektion dag 6 efter tumorpodning.

EKSEMPEL 6 10 Adskillige formuleringer af zinkchlorid i et PEGO grundlag blev fremstillet ved først at opløse zinkchloridet i vand og så blande zinkchloridopløsningen i PEGO grundlaget Formuleringerne havde omtrent de følgende vægt/vægt% sammensætninger, som er vist i tabel 6.

15 TABEL 6 T

Blanding_ZnCI2_HjjO_PEGO_ 3 41,9 11,6 46,5 4 30 16 53,8 5 14,6 4,1 81,3 6 28,6 7,9 63,5 7 46,1 13,8 40 8 15 8 77 9 13,8 9,2 77 10 5,5 3.7 90,8 19 DK 173490 Bl « EKSEMPEL 7

Blandingerne fra eksempel 6 blev undersøgt for potentiel antitumoraktivitet mod B-16 melanom og S-180 fast tumorvækst i mus i overensstemmelse med de 5 fremgangsmåder, der tidligere er beskrevet. Resultaterne er vist i tabel 7.

TABEL7 S-180

Tumorstørrelse % tumorfri Overlevende Blanding_n_T/C1_(kontrol) (kontrol) (kontrol) 3 8 51 559±476 25 100 (1095±360) (10) (100) 3 10 40 366±345 11 90 (934±656) (10) (100) 6 8 48 524±462 12 100 (1095±360) (10) (100) 6 10 115 1074±687 10 100 (934±656) (10) (100) 7 5 0 0 100 80 (752±511) (0) (100) 7 10 0 α - 100 90 (550±184) (0) (100) 7 10 0 0 100 100 (997±421) (0) 10 8 74 815±472 0 87 (1095±360) (10) (100) 1T/C forholdet blev beregnet mellem dag 20 og dag 23.

TABEL 7 (fortsat) 20 OK 173490 Bl B-16

Tumorstørrelse % tumorfri Overlevende Blanding_n_T/C1_(kontrol)_(kontrol) (kontrol) 3 10 6 162±253 60 100 (2505±1844) (0) (100) 4 10 16 106±114 30 100 (644±342) (0) (70) 5 10 47 1191±764 22 90 (2505±1844) (0) (100) 6 10 4 94±217 80 100 (2505±1844) (0) (100) 7 9 15 169±216 37 88 (1091 ±547) (0) (80) 7 9 0 0 100 88 (654±335) (0) (77) 7 10 2 31±100 90 100 (1805±968) (0) (80) 8 10 43 277±209 10 40 (644±342 (0) (70) 9 10 1,0 25±63 80 90 (1733±2254) (70) (80) 1T/C forholdet blev beregnet mellem dag 21 og dag 25.

5 EKSEMPEL 8

Blandinger af zinkchlorid, EDTA og NDGA, blev fremstillet og formuleret i et PEGO grundlag. Blandingerne blev fremstillet ved at opløse NDGA og EDTA i en del af PEGO grundlaget ved opvarmning og omrøring indtil det var i opløsning.

10 Zinkchloridet blev opløst i vand og opvarmet. Den varme zinkchloridopløsning blev 21 DK173490 B1 % * v' sat til den varme PEGO indeholdende NDGA og EDtA og omrørt til det var afkølet til stuetemperatur. Sammensætningen af blandingerne er givet i omtrentlig vægt/vægt%, som vist i tabel 8.

5 TABEL 8

Blanding ZnCI2 NDGA EDTA H2O PEGO

11 27,5 6,9 14,7 18,3 32,6 12 28 6,81 14,7 18,2 32,9 EKSEMPEL 9 10 Blandingerne fra eksempel 8 blev undersøgt for deres potentielle antitumoraktivitet mod B-16 melanom dyrket i mus i overensstemmelse med den fremgangsmåde, der tidligere er beskrevet. Resultaterne er vist I tabel 9.

TABEL 9 15 B-16

Tumorstørrelse % tumorfri Overlevende Blanding_n_T/C1 (kontrol)_(kontrol) (kontrol) 11 10 8 51±118 70 100 (711±286) (0) (100) 12 10 0 0 60 100 (7111286) (0) (100) 1T/C forholdet beregnet på dag 24 undtagen for blanding 11, hvor den blev beregnet på dag 21.

20 De foregående eksempler 4-9 viser den potentierende virkning af zinkchlorid på antineoplastiske midler, der påføres lokalt idet de viser forbedring i forhold til den antineoplastiske virkning af zinkchlorid alene og i forhold til sammenlignelige mængder af NDGA, selv når NDGA injiceres i tumoren.

25 EKSEMPEL 10 22 DK 173490 B1 * ♦

Passende humanmodeller og dyremodeller vælges for de sygdomstilstande, der .» behandles med de følgende forbindelser, som beskrevet ovenfor, og forbindelserne undersøges for at bestemme den effektive og den toksiske dosis med og uden tilsætning af equimolære mængder af zinkchlorid, zinkiodid, 5 zinkbromid,zinksulfat, zinknitrat, zinkstearat og zinkacetat Ud fra resultaterne beregnes det terapeutiske index, der er lig med forholdet mellem den toksiske og den effektive dosis, og dette index for forbindelser med og uden zinktilsætning sammenlignes for at vise en forøgelse i terapeutisk index for forbindelser med indhold af zinkforbindelser i sammenligning med forbindelserne uden sådan til 10 sætning; NDGA (nordihydroguaiaretsyre), VP-16 (epipodophyllotoxin-beta-D-ethyliden glucopyranosid-etoposid), VM-26 (epipodophyllotoxin-beta-D-thenyliden glucopyranosid-teniposid), ^-demethylepipodophyllotoxin, diethylstilbøstrol, dithranol, cydophosphamid, mitomycin, daunomycin, cis-diamindichlorplatin, adriamycin og allopurinol.

15

Claims (2)

23 DK 173490 B1

1. Farmaceutisk formulering, der giver forøget tilbageholdelse I hud dg slimhinder, kendetegnet ved, at formuleringen omfatter et farmakologisk aktivt stof udvalgt af 5 gruppen bestående af NDGA (nordihydroguaiaretsyre); VP-16 (epipodop-hyllotoxin-beta-D-ethyliden glucopyra-nosidetoposid); VM-26 (epipodophyllotoxin-beta-D-thenyliden glucopyranosid-teniposid); 4'-demethylepipodo-phyllotoxin; diethylstilbøstrol; dithranol; cyclophos-phamid; mitomycin; dauno-mycin; cisdiamin-dichloridplatin; adriamycin og allo-purinol samt en effektiv mængde af en 10 vandopløselig, zinkholdig forbindelse.

2. Formulering ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den zinkholdige forbindelse er zinkdorid. 15