DK168812B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af dispersion af liposomer - Google Patents

Description

i DK 168812 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af liposomer.

Det er velkendt, at visse lipoider er i stand til i nærværelse af vand at danne mesomorfe faser, hvis til-5 standsform er midt imellem den krystallinske tilstand og den flydende tilstand. Blandt de lipoider, der er i stand til at danne mesomorfe faser, er det allerede vist, at visse kan kvælde i vandig opløsning, hvorved der dannes små kugler, der er dispergeret i det vandige miljø. Disse kug-10 ler består af multimolekylære lag og fortrinsvis af bimolekylære lag, der har en tykkelse på ca. 3 til 10 nm (se især artiklen af Bangham, Stadish og Watkins, J. Mol. Biol., 13,238 (1965)).

Indtil nu har det kun været muligt at opnå lipoidkug-15 ler, der har bestået af koncentriske lag, ved at anvende lipoider, der indeholder en hydrofil iongruppe og en lipo-fil gruppe, og de fremstillingsmåder, som man har beskrevet, medførte at man opnåede kugler, der havde en middeldiameter, der var mindre end 100 nm. Fremgangsmåden til frem-20 stilling af disse kugler består i at frembringe en dispersion, hvor dispersionsfasen indeholder den lipoide forbindelse, der er i stand til at danne kuglerne, og at underkaste denne dispersion en ultralydbehandling. For at frembringe den dispersion, der skal underkastes ultralydbehand-25 ling, kan man først ved fordampning frembringe en tynd film af den lipoidforbindelse, der skal dispergeres, på en skærm, dernæst kan man bringe den således dækkede skærm i kontakt med den kontinuerte fase af den dispersion, der skal fremstilles og endelig for det tredje omrøre for at 30 opnå den dispersion, der skal behandles med ultralyd. Ved en anden fremgangsmåde beskrevet i den franske patentbeskrivelse 2.221.122 kan man ligeledes for at opnå en dispersion, der skal underkastes ultralydbehandling, tilsætte lipoidet, der skal danne kuglernes vægge, til en vandig 35 fase, dernæst opvarme let og omrøre kraftigt ved rystning. Kuglerne, der består af koncentriske lag, som man opnår på denne måde, og som har en maximumdiameter på ca. 100 nm.

2 DK 168812 B1 kaldes sædvanligvis liposomer.

Man har allerede foreslået at anvende liposomer til at indeslutte vandige opløsninger indeholdende aktive forbindelser i de vandige rum, der findes mellem de dobbelte 5 lipoidlag for på denne måde at beskytte de indkapslede forbindelser mod de ydre påvirkninger, (se især artiklen af Sessa og Weismann, J. Lipid Res., 9,310 (1968) og artiklen af Magee og Miller, Nature, Vol 235 (1972).

Også DE-OS 2249552 beskriver en fremgangsmåde til 10 fremstilling af liposomer med en maksimal diameter på 100 nm. Denne fremgangsmåde består i, at man ved en første variant sætter et lipoid til en vandig fase, opvarmer svagt og ryster kraftigt og til slut behandler med ultralyd. Ved en anden variant overfører man en i et egnet opløsningsmid-15 del opløst dispers fase i en tynd film ved fordampning af opløsningsmidlet og bringer denne tynde film i kontakt med en vandig eller ikke-vandig fase under kraftig agitation. Derefter foretages en ultralydsbehandling. De på denne måde opnåede liposomer er egnede til at indelukke opløsninger af 20 kemiske stoffer.

Da liposomerne kan være af varierende størrelse i området under 100 nm, kan man variere deres indtrængnings-evne i det menneskelige legeme, hvilket tillader utallige anvendelser inden for pharmacien, ligesom deres elektriske 25 ladning tillader en udvælgelse af deres fastgørelsessted (Biochem. J. (1971), 124p.58P). Anvendelsen af kugler med en diameter mindre end 100 nm er inden for det kosmetiske område tilbøjelig til at frembyde visse ulemper på grund af risikoen for at produktet trænger gennem huden. Det er så-30 ledes klart, at i det mindste til dette anvendelsesformål ville det være ønskeligt at kunne frembringe kugler med koncentriske lipoidlag med en diameter, der er større end 100 nm.

Yderligere har de hidtil kendte fremgangsmåder til 35 opnåelse af liposomer, der indeslutter aktive forbindelser mellem deres koncentriske lipoidlag, betydelige ulemper: for det første er den aktive forbindelse, der befinder sig DK 168812 B1 3 i den kontinuerte dispersionsfase, som man underkaster ultralydbehandling, kun indkapslet mellem liposomernes lipo-idlag for en meget lille dels vedkommende, da en meget lille del af den kontinuerte dispersionsfase befinder sig ind-5 kapslet mellem disse lag. Dersom man ønsker at isolere ind-kapslingsliposomerne er det nødvendigt at lade dispersionen, som man har underkastet ultralydbehandling, passere gennem en separationskolonne af typen "Sephadex", i hvilket tilfælde'liposomerne udvindes som en stærkt fortyndet dis-10 persion. Dette resulterer på den ene side i, at det med den hidtil kendte teknik er bogstavelig talt umuligt at opnå en kraftig koncentration af liposomer, og at på den anden side den aktive forbindelse kun er indesluttet for en lille dels vedkommende og tabes ved elueringen i separati-15 onskolonnen uden at det er praktisk muligt at genvinde den på en enkel måde. Dette medfører en betydelig forøgelse af fabrikationsprisen for de aktive forbindelser, der er indkapslet i liposomerne. Det er derfor ønskeligt at råde over en fabrikationsmetode til fremstilling af kugler af koncen-20 triske lag, der muliggør, at man kan få en dispersion med stor koncentration af kugler med et reduceret tab af det produkt, der er indkapslet mellem kuglernes lag.

Endelig har de fabrikationsmetoder for liposomer, der er beskrevet indtil nu, angivet, at man kun kunne anvende 25 visse særlige kategorier af lipoider: indtil nu har man inden for teknikken nævnt anvendelsen af phosphor lipoider, lipoider, der bærer en hydrofil iongruppe og en lipofil gruppe, og fede umættede syrer.

Den foreliggende opfindelse har til formål at tilve-30 jebringe en fremgangsmåde til fremstilling af en vandig dispersion af kugler med en diameter, der er mindre eller større end 100 nm, i forøgede koncentrationer og med større stabilitet og mindre permeabilitet, idet disse kugler kan indkapsle de aktive forbindelser med et stort indkapslings-35 udbytte.

I den foreliggende beskrivelse med krav er ordet "indkapsling" anvendt for at angive, at man har anbragt en 4 DK 168812 B1 vandig fase inden i en kapsel, der udgøres af lipoidkugler-ne.

Det er ved opfindelsen tilsigtet at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af en dispersion af liposo-5 mer, der består af molekylære lag af ioniske lipoidforbin-delser med formlen X-Y, hvor X betegner en hydrofil ionisk gruppe og Y en lipofil gruppe, som indeslutter en vandig fase, ved hvilken man blander mindst en i vand dispergerbar flydende lipoidforbindelse med ovenstående formel og en 10 vandig fase, som skal indesluttes i liposomerne, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man vælger et lipoid med et lipofil/hydrofil-forhold, der er således, at lipoi-det kvælder i den vandige fase, der skal indesluttes, og under omrøring eller bevægelse danner en lamelagtig fase, 15 og ved at man derpå tilsætter et overskud af en disperge-ringsvæske til den opnåede lamelagtige fase og derefter ryster eller bevæger kraftigt i fra 15 minutter til 3 timer.

Ved en foretrukken udførelsesform andrager vægtfor-20 holdet mellem den vandige fase, der skal indesluttes og som bringes i kontakt med lipoidet, og lipoidet, som danner den lamelagtige fase, fra 0,1 til 3; den vandige fase, der skal indesluttes, kan være vand eller en vandig opløsning af et aktivt produkt; vasgtforholdet mellem dispersionsfasen, som 25 man tilsætter, og den lamelagtige fase, som man disper-gerer, kan være fra 2 til 100; dispersionsfasen og den vandige fase, der skal indesluttes, kan være isoosmotiske; dispersionsfasen kan fortrinsvis være en vandig opløsning; •bevægelsen eller omrøringen af den sidste fase ved frem-30 gangsmåden kan gennemføres med et rysteapparat; og fremgangsmåden gennemføres ved stuetemperatur eller ved en højere temperatur, i tilfælde af at lipoidet er fast ved stuetemperatur, fortrinsvis ved en temperatur, der er mindst lige så høj som lipoidets smeltepunkt.

35 For at danne den lamellære fase kan man anvende et enkelt lipoid eller en blanding af lipoider. Lipoidet/erne, som man anvender, bærer en lang lipofil kæde, der indehol- DK 168812 B1 5 der 12 til 30 carbonatomer, hvilken kæde er mættet eller umættet forgrenet eller lineær. Man kan specielt vælge kæder fra olein-, lanolin-, tetradecyl-, hexadecyl-, isoste-aryl- eller laurylalkohol eller oleyl-, lanolyl-, tetrade-5 cyl-, isostearyl-, lauryl- eller alkylphenylkæder. Fortrinsvis er forbindelsen X-Y en asparaginforbindelse med to lipofile kæder eller en sammenslutning af to organiske ioner med lange kasder og omvendt fortegn.

Man kan anvende en vandig fase til indkapsling inde-10 holdende aktive forbindelser af alle arter og især sådanne forbindelser, der er af farmaceutisk eller levnedsmiddel-mæssig interesse eller forbindelser, der har kosmetisk virkning. De aktive forbindelser kan f.eks. være, når det drejer sig om kosmetik: forbindelser, der er egnet til hu-15 dens eller hårets pleje f.eks. fugtighedsbevarere som glycerin, sorbitol, pentaerythritol, inositol, pyrrolidon-carboxylsyren og dens salte; midler til kunstig bruning som f.eks. dihydroxyacetone, erythrulose, glyceraldehyd, 6-di-aldehyder såsom tartaraldehyd (forbindelserne kan eventuelt 20 være associeret med farvestoffer): vandopløselige solbeskyttende forbindelser, antiperspirationsmidler, deodoranter, astringenter, svalende forbindelser, tonika, ardannen-de midler, keratolyserende midler, afhåringsmidler, parfumerede vande, ekstrakter af animalske eller vegetabilske 25 celler såsom proteiner, polysaccharider, amnionvæsker, vandopløselige farvestoffer, skælhæmmende midler, anti-seboroiske midler, oxideringsmidler (affarvningsmidler) såsom hydrogenperoxid, reduktionsmidler som f.eks. thiogly-colsyren og dens salte. Som aktive farmaceutiske forbin-30 delser kan nævnes: vitaminer, hormoner, enzymer (f.eks. peroxiddismutase) vacciner, anti-inflammatoriske midler (f.eks. hydrocortison), antibiotika, bakterier der.

Det er klart, at man vil vælge, afhængig af den aktive substans indeholdt i den vandige fase, der skal ind-35 kapsles, de lipoider, der er i stand til på stabil måde at indkapsle den vandige fase, det drejer sig om. For at de lipoider, der udgør den lamellære fase, giver stabile kug- DK 168812 Bl 6 ler, er det nødvendigt, at der findes en tilstrækkelig gensidig lateral påvirkning mellem lipoidets kæder som, anbragt side om side, udgør lagene eller bladene i kuglerne, dvs. at de Van der Waalske kræfter mellem kæderne sikrer en 5 tilstrækkelig cohæsion af bladene. Denne betingelse er tilfredsstillet for de lipoider, der har de karakteristika, der er angivet i den generelle beskrivelse for fremgangsmåden, der er angivet nedenfor. Lipoideme, som anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hører til den kate-10 gori af emulsionsdannere, som er af typen vand i olie.

I en foretrukken udførelsesform er den vandige fase, der skal indkapsles, en vandig opløsning af en aktiv forbindelse. Den vandige fases aktive forbindelser, der skal indkapsles, er forbindelser med kosmetisk virkning. Disper-15 sionens kontinuerte fase er en vandig fase. Vægtforholdet mellem kuglerne og dispersionens kontinuerte fase, er mellem ca. 0,01 og ca. 0,5. Dispersionens kontinuerte fase er fordelagtig isoosmotisk med den vandige fase, der er indkapslet i kuglerne.

20 De vandige dispersioner, der defineres nedenfor, har en speciel interesse inden for kosmetikken, fordi anvendelsen af kugler med store dimensioner formindsker risikoen for, at visse præparater trænger gennem huden.

Det bør bemærkes, at anvendelsen af de omhandlede 25 vandige dispersioner inden for kosmetikken, frembyder store fordele sammenlignet med den hidtil kendte anvendelse af emulsioner. Dersom man ønsker at anvende præparater, der på én gang indeholder fede materialer og vand, er det nødvendigt for at sikre emulsionens stabilitet at anvende ampho-30 file emulgeringsmidler. Det er velkendt, at visse emulgeringsmidler kan fremkalde nogen irritation, dersom de påføres huden. Man har under arbejdet med de omhandlede forbindelser fundet, at denne virkning af emulgeringsmidler, for en given kemisk opbygning, i høj grad afhænger af, 35 hvordan de anvendes. Man har således kunnet vise, at en emulsion olie/vand bestående af 42% perhydrosqualen, 8% emulgeringsmiddel og 50% vand er særdeles irritationsfrem- DK 168812 B1 7 kaldende, medens en vandig dispersion af 8% af det samme emulgeringsmiddel udviser en irritationspåvirkning, der er praktisk taget ubetydelig, og at perhydrosqualenet er fuldstændigt uskadeligt. Det fremgår heraf, at der er en irri-5 tationssynergi, når man har et emulgeringsmiddel og en oliefase til stede. De omhandlede vandige dispersioner muliggør at undgå samtidig anvendelse af et emulgeringsmiddel og en olie, hvilket er et afgørende fremskridt inden for kosmetikken.

10 Det bør bemærkes, at man til de omhandlede dispersio ner af kugler kan tilsætte forskellige hjælpestoffer for at forandre udseendet eller den organoleptiske karakter, såsom uklarhedsdannende midler, geleringsmidler, aromastoffer, parfumer eller farvestoffer.

15 De omhandlede forbindelser muliggør indførslen af hy drofile forbindelser i et i det væsentlige lipofilt miljø. Dette bevirker under disse forhold, at forbindelserne befinder sig maskerede eller beskyttede over for forskellige midler, der kan påføre mulige ændringer: oxideringsmidler, 20 fordøjelsessafter og mere generelt reaktive forbindelser over for de indkapslede forbindelser. Penetrationen og/el-ler fixeringen af de aktive forbindelser kan ændres ved at forandre kuglernes størrelse og deres elektriske ladning. Deres virkning kan endvidere forsinkes (protraheret virk-25 ning). Det, at de er maskerede, gør, at man i vid udstrækning kan undertrykke eller forandre deres organoleptiske karakter, især deres smag. Endelig besidder lipoiderne i disse præparater i sig selv en gavnlig virkning f.eks. blødgørende, smørende, eller glansgivende.

30 Opfindelsen beskrives nærmere i de efterfølgende eksempler.

Eksempel 1 I en rundbundet kolbe på 50 ml bringer man 300 mg 35 sphingomyelin i kontakt med 0,350 ml af en 0,3 molær opløsning af glucose. Man homogeniserer blandingen. Forsøget udføres ved stuetemperatur.

8 DK 168812 B1

Herefter tilføjer man 5 ml af en opløsning på 0,145 molær (NaCl, KC1). Man anbringer kolben i et rysteapparat og omryster kraftigt i 2 timer.

Den opnåede dispersion er mælkeagtig. Kuglernes dia-5 meter er ca. 2 mikron.

Eksempel 2 I en rundbundet kolbe på 50 ml bringes 300 mg sphingomyelin i kontakt med 0,350 ml af en 0,3 molær opløsning 10 af ascorbinsyre. Man homogeniserer blandingen. Forsøget udføres ved stuetemperatur.

Hertil tilsætter man 2,650 ml af en opløsning på 0,145 molær (NaCl, KC1). Kolben anbringes i rysteapparatet, og man omryster energisk i 4 timer.

15 Den opnåede dispersion er mælkeagtig. Kuglernes dia meter er ca. 2 mikron.

Dersom det ønskes, kan dispersionen filtreres på en gelkolonne "Sephadex G 50 grov", der er kvældet i en opløsning af 0,145 molær NaCl, KC1.

20

Eksempel 3 I en rundbundet kolbe på 50 ml opløses 142 mg af natriumsaltet af N^-( alkoylolein) -N-dodecyl-N(N', N' -diethyla-minoethyl) -asparagin i 2 ml af en blanding af chloroform-25 methanol i forholdet 2:1. Man af damper opløsningsmidlet ved hjælp af en roterende af damper. Herefter fjerner man de sidste spor af opløsningsmiddel ved at underkaste produktet i 1 time for reduceret tryk, der frembringes med en vinge-pumpe.

30 Man bringer 10 ml af en opløsning af 0,3 molær gluco se i kontakt med lipoidet.

Kolben anbringes på et rysteapparat, og man ryster kraftigt i 4 timer. Forsøget udføres ved stuetemperatur. Kuglernes størrelse er ca. 1 mikron. Dispersionen filtreres 35 herefter på en gelkolonne "Sephadex G 50 grov", der er kvældet i en opløsning af 0,145 molær (NaCl, KC1).

Claims (8)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en dispersion af liposomer, der består af molekylære lag af ioniske lipoid-forbindelser med formlen X-Y, hvori X betyder en hydrofil 5 ionisk gruppe og Y en lipofil gruppe, der omslutter en vandig fase, ved hvilken man blander mindst en i vand disper-gerbar flydende lipoidforbindelse med ovenstående formel og en vandig fase, som skal indesluttes i liposomerne, kendetegnet ved, at man vælger et lipoid med et lipo-10 fil/hydrofil-forhold, således at lipoidet kvælder i den vandige fase, som skal indesluttes, og under omrøring eller bevægelse danner en lamelagtig fase, og ved at man derpå tilsætter en dispergeringsvæske i overskud til den opnåede lamelagtige fase og i mellem 15 minutter og 3 timer bevæger 15 eller ryster kraftigt.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man anvender den vandige fase, som skal indesluttes og som bringes i kontakt med lipoidet, og lipoidet, som danner den lamelagtige fase, i et vægtforhold mellem fra 20 0,1 til 3.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at man som vandig fase, der skal indesluttes, anvender vand.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kende-25 tegnet ved, at man som vandig fase, der skal indesluttes, anvender en vandig opløsning af et aktivt produkt.

5. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1-4, kendetegnet ved, at man anvender dispergerings-' væsken og den lamelagtige fase, der skal dispergeres, i et 30 vægtforhold mellem 2 og 100.

6. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1-5, kendetegnet ved, at man anvender en dispergeringsvæske, der er isoosmotisk med den vandige fase, der skal indesluttes.

7. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1-6, kendetegnet ved, at man som dispergeringsvæske anvender en vandig opløsning. DK 168812 B1

8. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af kravene 1-7, kendetegnet ved, at man arbejder ved en temperatur, der er mindst lige så høj som smelte temperaturen for lipoiderne eller lipoidet. 5