DK164923B

DK164923B - Fremgangsmaade til fremstilling af l-alfa-aminosyrer

Info

Publication number: DK164923B
Application number: DK161085A
Authority: DK
Inventors: Teruzo Miyoshi; Hironoshin Kitagawa; Masaaki Kato; Susumu Chiba
Original assignee: Denki Kagaku Kogyo Kk
Priority date: 1984-04-11
Filing date: 1985-04-10
Publication date: 1992-09-07
Also published as: DK161085D0; DE3582354D1; DK164923C; DK161085A; EP0159866B1; EP0159866A3; EP0159866A2

Description

i

DK 164923B

Den foreliggende opfindelse angår en mikrobiel fremgangsmåde til fremstilling af en L-a-aminosyre, hvor en 5-substitueret hydantoin eller et N-carbamylderivat af en aminosyre behandles med celler eller indholdene af celler fra en eventuelt forud 5 for behandlingen dyrket stamme, som hører til slægten Arthro-bacter, og som er i stand til at omdanne den 5-substituerede hydantoin eller N-carbamylderivatet til en tilsvarende L-a-aminosyre, hvilken aminosyre eventuelt udvindes.

10 Der er blevet foreslået mikrobielle fremgangsmåder til fremstilling af L-aminosyrer ud fra 5-substituerede hydantoiner ved hjælp af forskellige mikrobielle enzymkilder, se de japanske patentpublikationer nr. 13850/67, 2274/79 og 8749/79. Disse fremgangsmåder menes imidlertid at være utilfredsstillende 15 ud fra et effektivitetssynspunkt.

På den anden side kendes en fremgangsmåde til fremstilling af L-methionin ud fra DL-N-carbamylmethionin under anvendelse af et mikrobielt enzym: se japansk patentpublikation nr.

20 29678/80. Denne fremgangsmåde kræver separation af L-methionin fra D-N-carbamylmethionin, der også forbliver i reaktionsblandingen, og det er derfor ikke en tilstrækkeligt effektiv fremgangsmåde.

25 Endvidere kendes fra Bulletin de la Societe Chimique, vol. II, 1980, side 91-95 fremstillingen af L-o-aminosyrer ud fra DL-a-aminosyrehydantoiner eller DL-N-carbamyl-o-aminosyrer ved behandling med Arthrobacter ureafaciens. Som det fremgår af det efterfølgende sammenligningseksempel er dette dog ikke ti Ι-ΒΟ fredsstillende.

De foreliggende opfindere har fundet, at Arthrobacter sp. DK-200, er i stand til effektivt at omdanne 5-substituerede hydantoiner til L-a-aminosyrer og at omdanne N-carbamylderi-35 vater af aminosyrer til tilsvarende L-a-aminosyrer. Det har overraskende vist sig, at DK-200 altid vil give 100% ren L-form.

DK 164923 B

2

Formålet med den foreliggende opfindelse er derfor at tilvejebringe en mere effektiv fremgangsmåde til fremstilling af en L-a-aminosyre ud fra en tilsvarende 5-substitueret hydantoin og endvidere fremstilling af en L-a-aminosyre ud fra et til-5 svarende N-carbamylderivat af en aminosyre ved hjalp af mikroorganismen.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at stammen er Arthrobacter sp. DK-200, FERM P-7472 (FERM BP-730) 10 eller en mutant deraf med væsentligt samme egenskaber.

Den mikrobielle stamme, der er i stand til at omdanne 5-sub-stituerede hydantoiner og/eller N-carbamylderivater af L-, D-eller DL-aminosyrer til tilsvarende L-a-aminosyrer, og som 15 derfor kan anvendes ifølge opfindelsen, hører til slægten

Arthrobacter. Stammen er Arthrobacter sp. DK-200, der for nylig er blevet isoleret af de foreliggende opfindere.

Stammen Arthrobacter sp. DK-200 blev den 27. februar 1984 20 anbragt i the Fermentation Research Institute, Agency of

Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi l-chome Yatabe-machi Tsukuba-gun Ibaraki-ken 305, Japan, og blev tildelt FERM P-nummeret 7472, hvilket svarer til FERM BP-730. DK-200 blev deponeret i 25 overensstemmelse med Budapest-traktaten.

De taxonomiske karaktertræk for stammen Arthrobacter sp. DK-200, FERM P-7472 (FERM BP-730) er som følger.

30 l. Morphologiske egenskaber: 0,3-0,5 x 0,8-5,0 mikrometer i cellestørrelse, polymorphe, ikke bevægelige, ingen flageller, ingen sporer, negative eller let positive ved Gram-farvning, men med grampositive granula, og ikke syrefaste, 2. vækstegenskaber i dyrkningsmedier: næringsagarpladekultur: bleghvide, cirkulære, konvekse og 35 3

DK 164923B

hele kolonier, næringsagarskråkultur: moderat vækst, blanke og trådformede, næringsvæskekultur: ensartet uklart, udfældning og ingen særlig vækst på væskeoverfladen, 5 næringsgelatinestikkultur: smeltning, 3. fysiologiske egenskaber: nitrater reduceres ikke, positive i denitrifikation, negative i MR-test, negative i VP-test, producerer ikke indol, pro- 10 ducerer ikke hydrogensulfid, hydrolyserer ikke stivelse, citronsyre anvendes ikke, hverken i Koser-medium eller i Christensen-medium, både nitrater og ammoniumsalte anvendes, pigment produceres ikke, negative i ureaseaktivitet, negative i oxidaseaktivitet, positive i katalaseaktivitet, aerobe, 15 vækst ved en temperatur i intervallet fra 17,8-33,2°C og en pH-værdi i intervallet fra 5-10, oxidative i OF-test, lysin som dibasisk aminosyre i cellevæg og ikke indeholdende mesodiaminopimelinsyre og arabinose, positive i DNase-aktivi-tet, positive i caseinhydrolyse og vækst på 2% NaCl og 20 svag vækst på 5% NaCl, dannelse af syre og gas ud fra sukkerarter: 25 30 35

DK 164923B

4

Sukker Syre Gas L-arabinose D-xylose + 5 D-glucose + D-mannose + D-fructose + D-galactose + maltose ± 10 saccharose + lactose + trehalose ± D-sorbitol ± D-mannitol + 15 inositol + glycerol +

Assimilering af hydrocarboner: p-hydroxybenzoesyre 20 gluconsyre mælkesyre ” eddikesyre “ glucose + 25 saccharose + xylose + lactose mannitol + 3q Ifølge Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. udgave (1974), identificeres stammen DK-200 som tilhørende slægten Arthrobacter på basis af de taxonomiske karaktertræk, dvs.

(1) polymorph, (2) gram-positive granula indeholdt i cellen og (3) lysin indeholdt i cellevæggen og ingen mesodiamino-3g pimelinsyre eller arabinose indeholdt i cellevæggen. Desuden menes stammen DK-200 ifølge opfindelsen at høre til den nye art af slægten Arthrobacter, eftersom dens taxonomiske egenskaber er forskellige fra egenskaberne for enhver stamme hørende

DK 164923B

5 til kendte arter. DK-200 adskiller sig fra A.ureafaciens, »ed hensyn til substratspecificitet og den optiske renhed af de fremstillede aminosyrer, hvad der fremgår af det efterfølgende sammenligningseksempel.

5

Stammen DK-200 kan opformeres i store mængder ved hjælp af en hvilken som helst sædvanlig, aerob væskedyrkning i et medium indeholdende en carbonkilde, en nitrogenkilde, uorganiske salte og en lille mængde organiske næringsstoffer, der kan as-simi leres af stammen. Enzymaktiviteten kan forøges ved tilsætning af en lille mængde L-carbamyltryptophan eller lignende til dyrkningsmediet. Dyrkningen kan udføres ved en pH-værdi i intervallet fra 4-11 og ved en temperatur i intervallet fra 15-40eC i en tidsperiode på 5-120 timer.

15

Den således opnåede kultur indeholdende cellerne kan fortrinsvis anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen som den celle, der skal omdanne 5-substituerede hydantoiner eller N-carbamylderivater af aminosyrer til tilsvarende ønskede L-a-aminosyrer. Ud over cellekulturen kan der ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes behandlede celler, såsom frosne celler, lyophi1iserede celler, lydbehandlede celler, og cellerester, f.eks. homogenater og ekstrakter fra cellerne, såvel som intakte celler.

25

Nogle eksempler på 5-substituerede hydantoiner, der anvendes som udgangsmaterialer ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, omfatter 5-benzylhydantoin, 5-indolylmethylhydantoin og 5-{4-hydroxybenzyl)-hydantoin. Eksempler på N-carba»ylderivater af 3Q aminosyrer omfatter N-carbamylphenylalanin, N-carbamyltrypto-phan og N-carbamyltyrosin. Disse udgangsmaterialer kan være i en hvilken som helst form af D, L eller DL. Udgangsmaterialerne er kendte eller kan fremstilles på en hvilken som helst sædvanlig måde. DL-N-carbamylderivater kan f.eks. fremstilles 35 ved omsætning af DL-aminosyrer med kaliumcyanid, eller ved hydrolyse af DL-hydantoinderivater af aminosyrer under passende betingelser.

6

DK 164923 B

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan der anvendes 0,1-40%, fortrinsvis 1-10 vægt% 5-substitueret hydantoin eller 0,1-50 vægt% N-carbamyIderivat af aminosyre i reaktionsblandingen. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan hensigtsmæssigt 5 udføres ved en pH-værdi i intervallet fra 4 til 11, fortrinsvis fra 6 til 9. Reaktionsbetingelser uden for disse intervaller er i praksis ineffektive med hensyn til enzymaktivitet og stabilitet. pH-værdien kan variere, når reaktionen skrider frem, og derfor bør pH-værdien bibeholdes på en ønsket værdi 10 Ved tilsætning af et passende, neutraliserende middel. Reaktionstemperaturen kan være i intervallet fra 15-50*0. Desuden vil en lille mængde, f.eks. 0,1-10 mM af en metalion, såsom Mn2+, Co2+ el ler 1 ignende^ gi ve bedre resultater.

15 gen dannede L-a-aminosyre kan skilles fra reaktionsblandingen ved f.eks. at centrifugere blandingen for at fjerne uopløseligt stof, såsom cellerne, føre supernatanten gennem en kat-ionbytterharpiks af en stærk syre-H+-type, for at adsorbere L-a-aminosyrerne, efterfulgt af eluering af disse med vandig 20 ammoniak og yderligere koncentrering og afkøling for at afsætte krystaller.

Ifølge den foreliggende opfindelse kan L-a-aminosyrerne fremstilles meget effektivt ud fra 5-substituerede hydantoiner 25 eller N-carbamylderivater af aminosyrer, uafhængigt af D-, L-eller DL-formen af udgangsmaterialerne.

Opfindelsen vil blive fuldstændigt illustreret af de følgende eksempler. I disse eksempler er % baseret på vægt, med mindre andet angives.

30

Eksempel 1

En mængde medium indeholdende 0,5% glucose, 0,2% gærekstrakt, 0,1% dinatriumhydrogenphosphat, 0,05% kaliumdihydrogenphosphat 35 og 0,05% magnesiumsulfat, pH-værdi 7,5, blev fordelt i et antal testrør og steriliseret ved 120°C i 15 minutter. DL- 7

DK 164923 B

N-carbamyltryptophan, der på anden måde var blevet steriliseret, blev sat til hvert af testrørene til en endelig koncentration på 0,05%. Arthrobacter sp. DK-200-stamme blev derpå podet på mediet og dyrket under omrystning ved 30°C i 24 timer.

5

Til det dyrkede medium blev sat hver af de 5-substituerede hydantoiner, der er anført i tabel 1 nedenfor, og omrystning af kulturen blev foretaget ved 30°C i yderligere 24 timer.

Efter reaktion blev cellerne fjernet ved centrifugering. Aminosyrer i supernatanten blev analyseret kvantitativt ved hjælp af HPLC og en bioassay under anvendelse af Lactobacillus arabinosus (ATCC nr. 8014). Baseret på resultaterne af begge analyser blev hvert produkt identificeret som den respektive X-a-aminosyre, som vist i tabel 1.

15 Tabel 1 5-substitueret produkt HPLC bioassay hydantoin (0,1 M) L-aminosyre_(mM)_(mM) 20 DL-5-benzylhydantoin L-phenylalanin 58 58 DL-5-indolylmethyl- L-tryptophan 61 61 hydantoin DL-5- (4-hydroxybenzy]^· L-tyrosin 55 55 hydantoin

Eksempel 2

Til en 500 ml kolbe blev sat 100 ml medium indeholdende 0,5% 30 glucose, 0,2% gærekstrakt, 0,1% dinatriumhydrogenphosphat, 0,05% kaliumdihydrogenphosphat, 0,05% magnesiumsulfat og 0,1% DL-5-indolylmethylhydantoin, pH-værdi 7,5, og kolben blev steriliseret ved 120°C i 15 minutter. Til kolben blev podet 35 8

DK 164923 B

5 ml af en podekultur af Arthrobacter sp. DK-200, der var blevet dyrket ved 30°C i 20 timer i et medium, pH-værdi 7,5, indeholdende 0,5% glucose, 0,5% gærekstrakt, 0,5% polypepton

og 0,5% natriumchlorid. Efter 24 timers dyrkning ved 30°C

blev cellerne skilt fra dyrkningsmediet ved centrifugering 5 og vasket én gang med saltvand.

Cellerne blev suspenderet i 100 ml 0,1 M Tris HC1-puffer, pH-værdi 7,0, indeholdende 0,2 M DL-5-benzylhydantoin og 0,5 mM coboltchlorid, og inkuberet ved 35°C i 65 timer. Efter reaktion blev cellerne fjernet ved centrifugering. Supernatanten blev koncentreret til 20 ml og afkølet til udfældning af krystaller. Krystallerne blev analyseret ved hjælp af TLC, HPLC, NMR og polarimetri, og data svarende til en standardprøve ^ af L-phenylalanin blev opnået som vist i tabel 2.

Tabel 2 20 L-phenylalanin [a]D (c=2, H20) 20 -

Produkt ifølge eksempel 2 -34,6

Standardprøve -34,7 2g Eksempel 3

Celler, opnået på samme måde som i eksempel 1, blev suspenderet i 2 ml 0,1 M Tris HC1-puffer, pH-værdi 7,5, indeholdende 0,5 mM coboltchlorid, og 1 mM manganchlorid. Suspensionen blev tre gange udsat for ultralydbehandling ved 20 kHz i 3 minutter 3 0 under køling på et isbad.

35

DK 164923B

9

O

D-5-benzylhydantoin blev tilsat (0,1 M) til suspensionen indeholdende cellerester, og blandingen blev inkuberet ved 35°C i 40 timer. Efter reaktion blev uopløseligt materiale fracentrifugeret. Der opnåedes produktet L-phenylalanin fra super-5 natanten med et udbytte på 82%. Produktets identitet blev bekræftet ved HPLC og bioassay.

Eksempel 4 10 Et medium, pH-værdi 7,0, indeholdende 0,5% glucose, 0,2% gærekstrakt, 0,1% dinatriumhydrogenphosph'at, 0,05% kaliumdihydro-genphosphat og 0,05% magnesiumsulfat blev fordelt i et antal testrør, hver i en mængde på 5 ml, og steriliseret ved 120°C i 15 minutter. DL-N-carbamyltryptophan, der på anden måde 15 var blevet steriliseret, blev sat til hvert af rørene til en endelig koncentration på 0,1%. Arthrobacter sp. DK-200-stamme blev derpå podet på mediet og inkuberet ved 30°C i 24 timer under omrystning.

20

Celler, opsamlet fra mediet ved centrifugering, blev vasket

med den samme mængde saltvand og suspenderet i 5 ml 0,1 M

Tris-HCl-puffer, pH-værdi 7,5, indeholdende 0,1 mM mangan- chlorid og 0,1 M L-N-carbamylaminosyre, der alle er opført i tabel 3 nedenfor. Reaktionen blev udført ved 35°C i 20 timer. 25

Kvantitative målinger af produkterne ved bioassay med Lactobacillus arabinosus, ATCC nr. 8014, og HPLC blev udført, og resultaterne er vist i tabel 3. Som vist i tabel 3 blev de opnåede produkter identificeret som de tilsvarende respektive L-aminosyrer.

30

Tabel 3

Substrat Produkt HPLC Bioassay (0,1 M) L-a-aminosyre (mM) (mM) 35 ' .......' ' ...... ............

L-N-carbamylphenylalanin L-phenylalanin 85 85 L-N-carbamyltryptophan L-tryptophan 79 79 L-N-carbamyltyrosin L-tyrosin 84 84

DK 164923 B

10 o

Eksempel 5

Celler, der var blevet opnået på samme måde som i eksempel 4 bortset fra, at der anvendtes 500 ml Erlenmeyerkolber inde-5 holdende 100 ml medium, blev suspenderet i 100 ml 0,1 M Tris-HCl-puffer, pH-værdi 7,0, indeholdende 0,1 M D-N-carbamyl-aminosyre, opført i tabel 4 nedenfor, 0,5 mM coboltchlorid og 1 mM manganchlorid, og inkuberet ved 35°C i 60 timer. HPLC-analyse af reaktionsblandingen viste, at reaktionen var blevet 10 næsten fuldendt ved denne fremgangmsmåde.

Efter centrifugering for at fjerne cellerne blev supernatanten koncentreret til 25 ml, og ca. 5 ml ethanol blev tilsat og afkølet til 5°C for at udfælde krystaller. Krystallerne blev 15 rekrystalliseret og analyseret ved HPLC, TLC, bioassay, NMR og polarimetri. Sammenligninger af de opnåede data med de for standardprøver af de tilsvarende L-a-aminosyrer gav sikkerhed for identiteten af produkterne, som vist i tabel 4.

20

Tabel 4

Substrat Produkt Krystal specifik rotation 20 ‘ (0,1 M) L-a-ammosyre (g). [cx]D (Η2<0) 25 - D-N-carbamylphenyl- L-phenylalanin 1,2 -34,4 alanin (-34,5)1 D-N-carbamyltrypto- L-tryptophan 0,9 -33,6 phan (-33,7)1 D-N-carbamyltyrosin L-tyrosin 0,7 -11,82 (-11,8)1 standardprøve 2 i 5N HC1-opløsning 35

Eksempel 6

Fremgangsmåderne fra eksempel 5 blev gentaget bortset fra,

DK 164923B

11 o at D-N-carbamylaminosyrerne blev erstattet med DL-N-carbamyl-aminosyrer. Analyseresultaterne af de opnåede produkter svarede til de for standardprøver, som vist i tabel 5.

5 Tabel 5

Substrat Produkt Krystal specifik rotation 20

(0,1 M) L-a-aminosyre (g) [ct]D

10 DL-N-carbamyl- L-phenylalanin 1,7 -34,4 phenylalanin (-34,5)* DL-N-carbamyl- L-tryptophan 1,3 -33,6 tryptophan (-33,7)* DL-N-carbamyl- L-tyrosin 1,4 -11,8** 15 tyrosin (-11,8)* * standardprøve ** i 5N HC1-opløsning 20

Eksempel 7

Celler, opnået på samme måde som i eksempel 5, blev suspenderet i 20 ml 0,1 M Tris-HCl-puffer, pH-værdi 7,0, indeholdende 25 0,5% mM coboltchlorid og 1 mM manganchlorid. Suspensionen blev tre gange underkastet ultralydsbehandling ved 20 kHz i 3 minutter under køling på et isbad.

DL-N-carbamylaminosyre blev sat til cellerestopløsningen i en koncentration på 0,1 M, og blandingen blev inkuberet ved 30°C i 20 timer. Efter reaktion blev uopløseligt materiale fjernet ved centrifugering, og den resulterende supernatant blev analyseret ved hjælp af HPLC og bioassay. Produkterne blev således identificeret som de tilsvarende L-a-aminosyrer 35 på basis af resultaterne af analyserne, som vist i tabel 6.

Tabel 6 12

DK 164923 B

Substrat Produkt HPLC Bioassay (0,1 M) L-a-aminosyre (mM) (mM) 5 __________ DL-N-carbamylphenyl- L-phenylalanin 78 78 al an in DL-N-carbamyltryp- L-tryptophan 75 75 tophan 10 DL-N-carbamyltyrosin L-tyrosin 69 69

Sammen!iqninqseksempel 15

Sammenligningsforsøgene blev foretaget mellem stammerne A. sp. DK-200 og A. ureafaciens.

(1) Substratspecificitet.

20

Tabel 7

Relativ aktivitet (%) DK-200 A. ureafaciens 25 Hydantointryptophan 100 100

Hydantoinphenylalanin 95 97

Hydantoinmethionin < 10 44

Som det fremgår af tabel 7 ovenfor er der en signifikant for-30 skel i aktiviteten med hensyn til hydantoinmethionin.

(2) Optimal pH-værdi.

Den optimale pH-værdi for A. ureafaciens er i intervallet fra 35 7,5 til 8 (eller 7,8), idet reaktionen ikke vil foregå ved pH-værdi 6. På den anden side kan DK-200 bevare høje aktiviteter ved pH-værdi 6 eller selv ved 5,5 (se tabel 8 nedenfor).

Claims

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 5 at den 5-substituerede hydantoin er L-, D- eller DL-5-benzyl- hydantoin, og at L-a-aminosyren er L-phenylalanin.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den 5-substituerede hydantoin er L-, D- eller DL-5-indolyl- 10 methylhydantoin, og at L-a-aminosyren er L-tryptophan.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den 5-substituerede hydantoin er L-, D- eller DL-5-(4-hy-droxybenzyl)-hydantoin, og at L-a-aminosyren er L-tyrosin. 15
5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at N-carbamylderivatet er L-, 0- eller DL-N-carbamylphenyl-alanin, og at L-a-aminosyren er L-phenylalanin.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at N-carbamylderivatet er L-, D- eller DL-N-carbamyltryptophan, og at L-a-aminosyren er L-tryptophan.
7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 25 at N-carbamylderivatet er L-, D- eller DL-N-carbamyltyrosin, og at L-a-aminosyren er L-tyrosin.
8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at cellerne er en kultur af Arthrobacter sp. DK-200. 30
9. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at indholdene fra cellerne er en lydbehandlet celle, en frossen celle, en lyofiliseret celle eller et homogenat eller ekstrakt, hidrørende fra cellen. 35