DK163525B - Fremgangsmaade til rensning af raat chymopapain - Google Patents

Description

i

DK 163525 B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til rensning af råt chymopapain til fremstilling af renset chymopapai n med reduceret toksicitet.

5

Chymopapain er et enzym, som er den væsentligste proteo= lytiske komponent af den rå latex af Carica papaya, carica= ceae. Det karakteriseres som et sulfhydrylenzym, der ligner papain, men er forskellig herfra med hensyn til 10 substratspecificiteter, elektroforetisk mobilitet, stabilitet og opløselighed. Det blev først karakteriseret og beskrevet af Jansen og Balls, J. Biol. Chem., vol.

137, pp. 459-60 (1041) og i U.S. patentskrift nr.'2.313.875 (1943). Se The Merck Index, 9. udgave, Entry No. 2261, 15 side 293.

Jansen og Balls fremgangsmåden til fremstilling af chymopa= pain er i alt væsentlig en udsaltningsmetode, som består af syrning af en opløsning af den opløselige del af latex= en af papaya til en pH-værdi på ca. 2, adskillelse af den 20 uopløselige proteinfraktion fra den flydende fase, forøgelse af pH-værdien til 4, fjernelse af mere protein, mætning af den bevarede væskefase med natriumchlorid og derpå reduktion af pH-værdien til ca. 2 til udfældning af chymopapain.

25 Andre forskere på dette område har angivet, at Jansen og Balls metoden, når den anvendes til en kommerciel papaya= latex, ikke giver et enkelt krystallinsk protein som beskrevet deri. Se f.eks. Cayle og Lopez-Ramos, Abstracts of Papers of the 140th Meeting of til Am. Chem. Soc'y., 30 Chicago, side 19C (1961); Ebata og* Yasunobu, J. Biol.

Chem, vol 237, side 1086-94 (1962); Kunimitsu og Yasunobu, Biochim. Biophys. Acta, vol. 139, side 405-16 (1967). Chymopapain separeret fra papaya ved saltfraktionering og/ 2

DK 163525 B

eller opløsningsmiddelfraktionering, og/eller pH-værdijustering eller ved anvendelse af lignende metoder benævnes i det følgende som'råt chymopapain. Råt chymopapain har en udpræget "svovlagtig" lugt såvel som en udpræget gulbrun 5 farve i opløsning.

Råt chymopapain indeholder i virkeligheden en række stoffer af proteinagtig karakter, hvoraf kun to er ensartet aktive proteolytiske faktorer.

I Stern U.S. patentskrift nr. 3.558.433 10 er der f.eks. beskrevet en fremgangsmåde til rensning og identifikation af komponenterne af råt chymo= papain indeholdende tre komponenter, nemlig to aktive proteolytiske fraktioner kendt som chymopapain I og II og en proteolytisk inaktiv proteinagtig komponent.

15 Fremgangsmåden ifølge U.S. patentskrift nr. 3.558.433 angiver anvendelsen af en kromatografisøjle af carboxymethyl= substitueret tværbundet dextrancopolymer-bytterharpiks, der forud er bragt i ligevægt med en vandig pufferopløsning ved en pH-værdi på ca. 8 til ca. 8,5, hvortil det 20 rå chymopapain blev tilført og derpå elueret ved at lede en vandig puffer af opløsningen gennem en bytter med samme pH-værdi, men en større ionstyrke end den pufferopløsning, der blev anvendt til at bringe kromatografisøjlen i ligevægt i første tilfælde. Det ved hjælp af denne frem-25 gangsmåde opnåede chymopapainprodukt blev, selv om det var renere end det rå chymopapain ifølge Jansen og Balls, aldrig anvendt til behandlingen af hernierede disciinterverte-bralis som beskrevet i U.S. patentskrift nr. 3.320.131.

Stern patentet, U.S. patentskrift nr. 3,558.433, angiver 30 at det rensede chymopapain, der blev fremstillet ved hjælp af den deri beskrevne fremgangsmåde, optræder i alt væsentligt som et enkelt protein på grund af dannelsen af en enkelt

DK 163525B

3 symmetrisk grænse i den analytiske ultracentrifuge og ved dannelsen af en enkelt udfældningszone i en immunodiffusionstest gennemført i et agargeldiffusionssystem.

Det har for nylig vist sig, at den første fraktion 5 af chymopapain, der blev elueret fra kromatografisøjlen ved hjælp af den i Stern patentet beskrevne metode, hvor den beskrives som proteolytisk "inaktiv", i tilfældet med nogle papayaekstrakter fremstillet ved hjælp af nyere fremgangsmåder [Barnes et al., Biochim. J. 177, 541-48 10 (1979)], faktisk er proteolytisk aktiv afhængigt af kilden for råmaterialet.

Selv om Stern patentet identificerer forskellige komponenter af chymopapain ved hjælp af absorptionsspidseluerings-middel-maxima som vist på tegningerne, viser eksemplet 15 fra patentet,at alle fraktionerne af chymopapaineluerings-midlet blev forenet, dialyseret med destilleret vand og lyofiliseret til fremstilling af det rensede chymopapain-produkt.

Det bemærkes, at det ved hjælp af Jansen og Balls frem-20 gangs måden fremstillede chymopapain i vid udstrækning blev anvendt i kliniske undersøgelser til ved kemonukleolyse at reducere hernierede Slisci i humane patienter ved hjælp af Smith-metoden, U.S. patentskrift nr. 3.320.131, dvs. injektionen af en hernieret discisintervertebralis i et dyr 25 med chymopapainet i en mængde, som er tilstrækkelig til selektivt at opløse nævnte skives kernepulposus. Disse kliniske undersøgelser indicerer imidlertid nærværelsen af signifikante og potentielt livstruende allergiske bireaktioner hos ca. 0,5% af patienterne. Desuden fik'nogle 30 få af patienterne senere allergiske reaktioner, hvilket kan have været så meget som ca. 3% af de behandlede patienter. Grunden til denne store hyppighed af anafylaktiske 4

DK 163525 B

bireaktioner,som blev rapporteret af de kliniske undersøgere, under anvendelse af det da tilgængelige chymopapain fremstillet ved hjælp af Jansen og Balls metoden til reduktion og behandling af hernierede skiver,kendtes ikke spe-5 cielt og er hidtil aldrig blevet belyst eller forklaret fuldstændigt.

Det rå chymopapain ifølge Jansen og Balls, der blev anvendt i de tidligere kliniske undersøgelser, indeholder imidlertid en unødvendig anafylaktisk risikotilbøjlighed 10 på grund af nærværelsen af den første udvundne fraktion af chymopapain, som er beskrevet som proteolytisk inaktiv i Stern patentet, da det er velkendt,at injektionen af fremmed protein-antigener i pattedyr nødvendigvis medfører en risiko for et anafylaktisk chock. Jo større 15 variationen af antigener er, jo større er chancen for at patienten vil blive overfølsom. De ved hjælp af disse injektioner tilstræbte gunstige virkninger opvejer imidlertid den nødvendige risiko under visse omstændigheder såsom med vacciner, anvendt til behandlingen af rabies infektion, 20 eller tetanus antitoxin fremstillet ud fra animalske kilder.

Sund medicinsk praksis' foreskriver imidlertid, at injektionen af et proteinagtigt stof, som indeholder en yderligere eller overtallig proteinkomponent, som kan have 25 potentielle letale toksiske udslag, og hvor effektiviteten af den yderligere komponent til medicinsk behandling er tvivlsom, indebærer en unødvendig,uacceptabel anafylaktisk risiko for patienten, som udsættes for en sådan behandling.

Da injektionen af medicinsk indicerede fremmed protein-30 midler såsom rå chymopapain i pattedyrsystemer altid indebærer en vis risiko, er det til opnåelse af den størst mulige gavn af en sådan behandling ønskeligt kun at have de aktive proteinholdige enzymkomponenter i en så ren og 5

DK 163525 B

så koncentreret form som mulig til de indicerede medicinske formål, og at de er i alt væsentlig fri for komponenter, som mistænkes for at være sensitiviserende antigener for derved at formindske proteinimmunogenicitet og deraf 5 følgende anafylaktiske chock i patienten.

Reduktion til et minimum af farvede proteinmaterialer, og duftende stoffer, som findes i det rå chymopapain, reducerer yderligere patienternes risiko for anafylaktiske chock på grund af,at disse egenskaber sædvanligvis er 10 under mistanke i immunogen'reaktioner.

Det er også blevet bemærket, at den kendte teknik beskriver behandlingen af skader eller unormale skiver ved reguleret opløsning med rå chymopapainopløsninger, som indeholder natriumbisulfit tilsat som konserveringsmiddel som beskrevet 15 i U.S. patentskrift nr. 4.039.682 (1977).

En sådan anvendelse af natriumbisulfit medfører imidlertid også en uacceptabel risiko for mutagen virkning.

F. Mukai et al. viste f.eks. i Biochim. Biophys. Res. Comm. 39, 983-988 (1970), at nogen mutagen virkning blev kon-20 stateret ved behandlingen af E. Coli med natriumbisulfit, hvilket resulterer i en signifikant forøgelse af antallet af reversioner. Shapiro, Mutagen Research, vol. 39, 149-176 (1977) anførte også,at bisulfit i lave koncentrationer hæmmede DNA-syntese, celledeling og mitose ud over at frem-25 kalde kromosom-aberrationer og-mutationer. Sussmuth et al., Mutagen Res. 40, 229-36 (1976) viste ligeledes 4.500 mu= tanter pr. million overlevende (0,1%) af E. Coli B., behandlet med natriumbisulfit ved en pH-værdi på 6. Fordelene ved bisulfit som konserveringsmiddel synes følge-30 lig at medføre uacceptable og unødvendige risici for præ-cancerøse modifikationer i patienter, hvortil det administreres,specielt når der er tegn på at farmaceutisk stabilitet ikke er betinget af nærværelsen af bisulfit.

DK 163525B

6

Det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen rensede chymopapain har lavere immunogenicitet og toksicitet. Dette muliggør opnåelsen af et farmaceutisk produkt bestående i alt væsentligt af et renset chymopapain og et farmaceutisk acceptabelt ikke-tok-5 sisk reduktionsmiddel. Det farmaceutiske produkt er yderligere karakteriseret ved, at det ikke indeholder natriumbisulfit og EDTA og er uden overdreven lugt eller farve.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til frem-10 stilling af et renset chymopapain med reduceret toksicitet, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved at man (a) kontakter en vandig pufret opløsning af råt chymopapain med en svagt substitueret kationbytter omfattende en søjle af 15 carboxymethylsubstitueret tværbundet agarosegel, idet nævnte "kationbytter” forud er blevet bragt i ligevægt med vandig pufferopløsning med en pH-værdi på mellem ca. 6,5 og 7,5 og har en neutraliseringsevne fra 0,02 til 0,10 milliækvivalenter natriumhydroxid pr. kubikcentimeter, 20 (b) eluerer det på kat ionbytteren tilbageholdte chymopapain med en vandig pufferopløsning med en pH-værdi i det samme interval som den puffer, der blev anvendt til at bringe den car-boxymethylsubstituerede agarosegel i ligevægt, men med en li- 25 neært voksende ionkoncentration af et forligeligt, ikke-reak-tivt, vandopløseligt, farmaceutisk acceptabelt, neutralt uorganisk salt med hensyn til elueringsmiddelvolumen, (c) opsamler og kasserer en første række af fraktioner af elu-30 eringsmiddel fra nævnte kationbytter indeholdende en første farvet og lugtende proteinkomponent fra råt chymopapain indtil molariteten af elueringsmidlet med hensyn til nævnte opløselige salt stiger til og når intervallet fra 0,25 til 0,4, 35 (d) kontinuerlig opsamler og opbevarer en yderligere række af fraktioner af fra kat ionbytteren elueret chymopapain omfattende to proteolytiske aktive chymopapainfraktioner ved opløse 7

DK 163525 B

lige saltkoncentrationer over ca. 0,25 til 0,4 molær, indtil i alt væsentligt alt det nævnte absorberede chymopapain er udvundet , 5 (e) genforener de aktive fraktioner fra trin (d) og behandler nævnte udvundne fraktioner, der indeholder proteolytisk aktive komponenter af chymopapainet, til fjernelse af de opløste ioniske uorganiske salte og pufferkomponenter, og 10 (f) lyofiliserer den i alt væsentligt saltfrie rensende chymo- papainopløsning til fremstilling af et tørt, renset proteolytisk aktivt chymopapain, der i alt væsentligt er fri for proteolytisk inaktive eller toksiske komponenter.

15 Det rensede chymopapain fremstillet ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er yderligere karakteri seret ved, at det er fri for overdreven lugt og farve. Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan gennemføres i alt væsentligt kontinuerligt, da carboxymethy1agarosegelbytterhar-20 piksen ikke svinder i brug og ikke skal fjernes fra søjlen, men blot kan behandles med yderligere pufferopløsning til fjernelse af salte. Dette er i modsætning til hidtil kendte harpikser, såsom carboxymethy!substi tueret dextran, som svinder i brug, skal fjernes fra søjlen, vaskes med vand, tillades 25 at ekspandere igen, igen bringes i ligevægt med puffer, og derpå igen hældes i søjlen til fornyet brug.

Det ved hjælp af den ovennævnte fremgangsmåde fremstillede rensede chymopapain med reduceret immunogeni c itet er i alt 30 væsentligt fri for inaktive proteinkomponenter og er yderligere ejendommelig ved, at det ikke danner et bundfald i en sur opløsning med bariumchlorid. Dette er i modsætning til råt chymopapain, som danner et bundfald under sådanne betingelser.

Selv om man ikke kender grunden til, hvorfor et sådant bund-35 fald dannes med det urensede chymopapain, er det blevet fastslået, at dannelsen af et bundfald er karakteristisk for både råt chymopapain og også karakteristisk for den kasserede por- 8

DK 163525 B

tion af chymopapainet, som først blev elueret fra bytteren i den ovennævnte rensningsproces.

Det er nu muligt at opnå et tørt, lyofiliseret farmaceutisk 5 produkt med forbedret stabilitet omfattende et renset chymopapain, der i alt væsentligt er fri for lugt, kraftigt farvet og fri for proteolytisk inaktive eller andre komponentmaterialer, som danner et bundfald med syrnet bariumchlorid, og en inaktiverende mængde af et farmakologisk acceptabelt reduk-10 tionsmiddel emballeret i beholdere eller prøveglas under va-cuumbetingelser.

En foretrukket enhedsdosisform, som er velegnet til anvendelse ved opløsning eller behandling af det centrale parti (nu-15 cleus pulposus) af en unormal eller beskadiget discus inter-vertebralis ved injektion deri, består af ca. 10.000 - 11.500 proteolyti ske enheder af det rensede chymopapain (nominelt 10.000 enheder) fremstillet ved hjælp af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse og et natriumcysteinathydrochlo-20 ridaktiverende middel emballeret i et evakueret hætteglas. Enhed s dosisfor men består bredt sagt af 15-30 (fortrinsvis 23) milligram renset chymopapain og 3,0 - 3,6 milligram af et natri umcysteinathydrochlor id i en evakueret beholder. Reduktionsmidlet (cystein) indgår fortrinsvis i en mængde på ca. 15% 25 - bredt sagt fra 10 til 20 vægt% af chymopapainet.

Man kan nu anvise en fremgangsmåde til ved kemonukleolyse at behandle en beskadiget, forskubbet (hernieret) eller på anden måde unormal spinal discus intervertebrali s hos pattedyr, 30 hvilken fremgangsmåde giver en reduceret risiko for toksisk virkning på det pågældende pattedyr, hvilken fremgangsmåde omfatter trin til i nævnte discus at injicere en farmaceutisk acceptabel vandig opløsning af det før nævnte rensede chymopapain i en mængde, som er tilstrækkelig til selektivt at opløse 35 dele af nævnte discus.

Der anvises også en fremgangsmåde til behandling af en unormal spinal discus i et pattedyr, som den omfatter trin til: 9

DK 163525 B

(i) indføring af en nål i nævnte discus, (i i) bekræftelse af placeringen af nævnte nål ved hjælp af røntgen, og 5 (i i i) injektion i nævnte discus af en mængde af en farmaceutisk acceptabel opløsning af et relativt ikke-toksisk, renset chymopapain, der i alt væsentligt er fri for inaktive komponenter, for selektivt at opløse det centra-10 le parti (nucleus pulposus) af nævnte discus.

Der anvises desuden den fremgangsmåde til behandling af en forskubbet (hernieret) eller på anden måde unormal discus intervertebral i s i et pattedyr ved i nævnte discus at indsprøjte 15 et renset fuldt aktivt chymopapain, som har en reduceret risiko for toksisk og/eller anafylaktisk virkning, når det indføres og injiceres som en farmaceutisk acceptabel opløsning i pattedyrsystemer i mængder, som selektivt opløser det centrale parti (nucleus pulposus) af nævnte discus. Alternativt anvises 20 en fremgangsmåde til at fremkalde kemonukleolyse af en unormal discus intervertebralis hos pattedyr.

Ved brug af det ifølge opfindelsen fremstillede rensede chymopapain kan man nu opnå et farmaceutisk produkt af kraftigt 25 koncentreret, i alt væsentligt fuldstændigt proteolytisk renset chympapain og et ikke-toksisk farmaceutisk acceptabelt reduktionsmiddel, som er velegnet til injektion i pattedyrsystemer, og som har en reduceret toksisk virkning overfor pattedyr og er i alt væsentligt fri for ikke-proteolytisk aktive 30 proteiner eller andre toksiske komponenter.

Endvidere kan man tilvejebringe et meget stabilt præparat af renset chymopapain og et reducerende middel til aktivering af nævnte chymopapain i en tør lyofi liseret form.

Af interesse er yderligere tilvejebringelsen af et renset chymopapain og et naturligt reducerende middel i form af en tør dosisenhed.

35 10

DK 163525 B

Af i nteresse er yder1 i gere ti 1vejebri ngel sen af en fremgangsmåde til fremstilling af et renset chymopapain, der i alt væsentligt er fri for farvede, lugtende, og ikke-proteolytiske eller inaktive proteinkomponenter, og som har en reduceret 5 toksisk og/eller anafylaktisk virkning, når det indføres eller indsprøjtes i pattedyrsystemer.

Af interesse er yderligere tilvejebringelsen af en fremgangsmåde til fremstilling af et renset chymopapain ved anvendelsen 10 af en carboxymethylagarosegelsøjle, som ikke komprimeres og ikke skal fjernes før brug igen.

De rå chymopapai ner, der blev anvendt som udgangsmaterialet til fremstillingen af det rensede chymopapain ved fremgangs-15 måden ifølge den foreliggende opfindelse, indeholder tre kromatografisk separerbare fraktioner eller komponenter af materiale, som udgør, hvad der kendes som chymopapain. Disse komponenter omfatter en proteolytisk inaktiv, farvet, lugtende komponent og to proteolytisk aktive komponenter, heri kaldt 20 chymopapain I og II. Det rå chymopapain opnås ved hjælp af metoden ifølge Jansen og Balls, J. Biol. Chem., bind 13, side 459-60 (1941), som omfatter behandlingen af et kommercielt pa-painkoncentrat ved dannelse af en vandig sur opløsning og mætning af opløsningen med natriumchlorid ved en højere pH-værdi, 25 reduktion af pH-værdien og derefter dialysering af en opløsning af det rå chymopapain til fremstilling af en saltfri opløsning deraf, efterfulgt af lyofi 1isering af opløsningen til opnåelse af et råt, tørt chymopapainprodukt.

30 Det rå chymopapain fremstillet ved hjælp af fremgangsmåden ifølge Jansen og Balls såvel som andre rå chymopapainer kan renses til fjernelse af inaktive, farvede, lugtende og immunogene komponenter ved hjælp af fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Det følgende eksempel belyser denne rensningsmetode 35 under anvendelse af et råt chymopapainudgangsmateriale frem stillet ved hjælp af fremgangsmåden ifølge Jansen og Balls.

11

DK 163525 B

Eksempel 1

Alle trin gennemføres ved køleskabstemperaturer. (2~8°C).

5 A. Råt chymopapain (ca. 29 g) blev opløst i 190 ml pH-værdi 7,4 natriumphosphatpuffer til opnåelse af en 5% vægt/volurnen opløsning ved 2-8eC.

B. Opløsningen af råt chymopapain i puffer blev sat til en 10 søjle af carboxymethylsusbstitueret tværbundet agarosegelharpiks af et omtrentligt volumen på 1,7 liter (omtrentlige lejedimensioner 5 x 80 cm), som forud var blevet bragt i ligevægt med 0,05M natriumphosphatpuffer. Harpiksen havde en neutraliseringsevne på ca. 0,05 mi 11iækvivalenter natriumhydroxid pr.

15 kubikcentimeter.

C. Der blev derpå til søjlen tilført en gradient af natrium-ch 1 or i dopiøsning, pufret med 0,05M natriumphosphat til pH-vær-di 7,4, således at natriumchloridkoncentrationen voksede 1 ine- 20 ært fra 0 til 1,0M med volumenet. Gradienten blev afpasset således, at når der var blevet tilført ca. 4,6 liter til søjlen var den indgående natriumchloridkoncentration 1 molær.

D. Afløbet fra søjlen blev opsamlet ved hjælp af en dråbetæl-25 ler i fraktioner på 25 ml i prøverør i løbet af ca. 40. timer.

E. Proteinindholdet og aktiviteten af hver fraktion blev analyseret. På 0,5 ml prøver udtaget fra hver fraktion blev biu-rettetesten gennemført for samlet proteinindhold. Den proteo- 30 lytiske virkning blev bestemt ved at bestemme hydrolysen af DL-a-benzoyl-argi nin-p-nitroani1 id med 0,05 ml prøver fra fraktionerne ved hjælp af Erlanger-metoden (Arch. Biochim. Biophys. 95, 271-78 (1961)) tilpasset til anvendelse med chymopapain. Det relative proteinindhold blev afbildet grafisk i 35 forhold til fraktionsnummeret for de serieopsamlede fraktioner. Protein indholdet måles hensigtsmæssigt ved at sætte 0,5 ml af hver fraktion til 5 ml bi uret-reagens og bestemme eks- 12

DK 163525 B

tinktionen (A) ved 540 (As40) efter 15 minutters forlob.

(Se fig. 1 på den medfølgende tegning).

5 F. Fraktionerne indeholdende proteinkomponenten, der først blev elueret (sammen med kraftigt brunfarvet kom- . ponenter) fra søjlen med natriumchloridkoncentrationer fra 0 til ca. 0,4 molær, blev kasseret.

G. De resterende fraktioner, udvundet ved koncentrationer fra 0,4 til 1 molær, blev forenet og dialyseret mod flere portioner destilleret vand ved 2-8°C til fjernelse af natriumchlorid og opløst puffer.

H. Det afsaltede produkt blev derpå med IN NaOH indstillet 15 til en pH-værdi på 6 og derpå lyofiliseret til opnåelse af ca. 16,3 g renset chymopapain.

Der henvises til den medfølgende tegning, som grafisk 2Q afbilleder proteinindhold (biuret test ekstinktion) af de serieopsamlede fraktioner af elueringsmiddel fra søjlen (venstre lodrette akse) mod volumenet (i milliliter) af opsamlet elueringsmiddel (vandret akse). På den samme tegning viser en punkteret linie NaCl- eller saltkoncen-25 trationen (venstre lodrette akse) udtrykt ved NaCl molari- tet fra 0 til 1 molær på en lineær gradient, afbilledet mod' elueringsmiddelvolumenet, som vist. Proteinindholdet måles hensigtsmæssigt ved at sætte 0,5 ml af hver fraktion til 5 ml biuret-reagens og bestemme ekstinktionen 30 (A) ved 540 nm (A^g) efter 15 minutters forløb. Proteo- lytisk virkning blev afbilledet ved absorption ved 410 nm (A410) af komplekset fremstillet ved en modifikation af Erlanger-metoden (ovenfor) tilpasset til chymopapain.

35 Den "første chymopapainp ro teinkomponent, spids A, blev elueret fra søjlen ved'natriumchloridmolaritet fra ca.

. 0 til ca. 0,25 til 0,4 molær og er en kraftigt farvet, duftende fraktion. Denne komponent blev kasseret. Prote- 13

DK 163525 B

inet identificeret som spids A (hyppigt proteolytisk inaktivt) , indeholder det meste af farvebestanddelene som findes i det rå chymopapain og karakteriseres også ved, at det danner et bundfald med syrnet bariumchloridopløsning. 5

Efterfølgende fraktioner af elueringsmiddel gav to yderligere og væsentlige spidser ved natriumchloridkoncentra-tioner fra 0,4 til 1 molær, som blev identificeret som chymopapain I og II.

10

Chymopapain I og II komponenterne udvundet fra søjlen som vist i eksempel 1 ovenfor, er proteolytisk aktive og dannede ikke et bundfald med syrnet bariumchloridopløsning.

15 Det rå chymopapain,som indeholdt den proteolytisk inaktive proteinkomponent,og de to proteolytisk aktive komponenter chymopapain I og II, der blev absorberet i søjlen, elueres fra søjlen ved hjælp af en saltopløsning (dvs. NaCl) gradient 'i en pufferopløsning holdt ved en pH-værdi på 6,5 - 7,5, fortrinsvis ved en pH-værdi fra 7,3 til 7,5.

Den i begyndelsen fra søjlen udludede komponent (spids A), der blev kasseret, udgør ca. 15 vægt% af det samlede materiale.

25

Resten af elueringsmidlet omfatter de proteolytisk aktive chymopapainkomponenter I og II, der udvindes ved saltkoncentrationer fra ca. 0,25 til 0,4 indtil 1 molær. De to karakteristiske hovedspidser eller proteinbestanddele 3 0 udgør ca. 85% af det opsamlede materiale og elueres ved saltkoncentrationer på ca. 0,5 og 0,8 molær som vist på tegningen.

Den ovenfor beskrevne absorptions- og elueringsproces

3 S O

gennemføres ved køleskabstemperaturer fra ca. 2 til 8 C.

Elueringsmiddelfraktionerne, der blev opsamlet, indeholdende chymopapain I og II forenes og dialyseres mod vand til fjernelse af salt, såvel som opløselige pufferkomponenter, og filtreres og steriliseres derpå. Den saltfri opløsning af 14

DK 163525 B

I og II lyofiliseres derpå. Det samlede udbytte er ca. 50-60%, beregnet på råt chymopapainudgangsmateriale. Selv om noget inaktivt materiale fjernes, forøges aktiviteten pr. vægtenhed af slutproduktet ikke, sansynligvis på grund 5 af at der går enzym (aktivitet) tabt under behandlingen.

Medens det rå chymopapain,som hidtil blev anvendt til behandlingen af unormale eller forskubbede (hemierede) skiver tilsyneladende har flere fraktioner, har fremgangsmåden 10 ifølge opfindelsen fjernet en fraktion af dette protein (spids A), som viser sig at være ansvarlig for højere toksicitet, som konstateret i dyreforsøg, hvor det rå og rensede chymopapain ifølge opfindelsen sammenlignes.

15 Som bemærket heri, kan det rensede chymopapain ifølge den foreliggende opfindelse skelnes fra det rå chymopapain ifølge den kendte teknik ved hjælp af tests med barium= chlorid i sur opløsning (HC1). Dannelse af et bundfald med bariumchlorid er karakteristisk for det hidtil kendte 20 rå (eller toksiske) chymopapain, hvorimod det rensede chymopapain ifølge den foreliggende opfindelsen ikke danner et bundfald.

Det følgende eksempel belyser bariumchloridtestmetoden 25 anvendt til at skelne mellem rå og rensede chymopapain- materialer:

Eksempel 2.

30 En 10% (vægt/volumen) vandig opløsning af hver af de følgen de chymopapainprøver blev syrnet med 1 ml IN HC1 hvortil var sat 1 ml 12% (vægt/volumen) bariumchlorid (BaCl2) ' (fremstillet som en U.S.P. testopløsning! (U.S. Pharma-copéia XX, p. 1103: 12 g BaCl2 til at danne 100 ml i destil-35 leret vand). Der blev opnået følgende resultater: 15

DK 163525 B

Rå chymopapain Resdltat

Forsøg A Moderat til kraftigt bundfald

Forsøg B Moderat bundfald

Forsøg c Moderat bundfald 5 Forsøg D Moderat til kraftigt bundfald

Renset chymopapain Resultat

Forsøg E Klar

Forsøg F Klar

Forsøg G I alt væsentligt klar (svagt uklar) 10 Forsøg H Klar

Det rensede chymopapain iføgle den foreliggende opfindelse udmærker sig også ved at have en reduceret farve og duft i sammenligning med det rå chymopapainudgangsmateriale.

Farve- og/eller duftfaktorerne, som findes i rå chymopa-15 pain,hænger sammen med den første (kasserede) komponent (A) af chymopapainet, der blev elueret fra den kromatografiske søjle, og som også danner et bundfald med bariumchlorid-opløsning som angivet ovenfor. Denne kasserede komponent, der kan udfældes, og med dens farvede og duftende kompo-20 nenter, der findes i det rå chymopapain, hænger tilsyneladende sammen med den konstaterede toksicitet (anafylak-tisk chock) af rå chymopapain overfor pattedyr, når der injiceres i deres disci.

De foreliggende rensede chymopapainprodukters reducerede 25 eller minimale farve kan sammen med disse rensede produkters manglende evne til at danne et bundfald med barium-chloridopløsning under sure betingelser tages som et mål for at de ikke indeholder de komponenter, som medfører en større risiko for toksicitet og antages at være i høj 30 grad ansvarlig for de anafylaktiske eller andre toksiske reaktioner og manifestationer, som har vist sig at optræde 16

DK 163525 B

hos en række forsøgsdyr/ der blev injiceret med det rå chy= mopapain, der blev anvendt til dette formål.

Det ved hjælp af den foreliggende fremgangsmåde fremstillede rensede chymopapain kan anvendes til at behandle syge, unor-5 male eller forskubbede disci i pattedyr ved direkte injektion med en nål i den humane eller animalske patients disci af en opløsning af det rensede chymopapain i en tilstrækkeligt mængde til at opløse det centrale parti (nucleus pulposus) af discen. Det foretrækkes sædvanligvis at 10 anvende et naturligt forekommende reducerende middel med chymopapainet såsom natriumcysteinathydrochlorid selv om andre farmakologisk acceptable reducerende midler såsom gluthation/ natriumthioglycollatf cysteinylglycinf dithio= erythritol, dithiothreitol eller isomere (Df L eller DL) 15 kan anvendes. Natriumcysteinathydrochlorid er det foretrukne aktiverende eller reducerende middel.

Selv om den kendte teknik angiver,at det til behandlingen af discus intervertebralis anvendte chymopapain fortrinsvis blev tilberedt med natriumbisulfit og EDTA som konser-20 veringsmidler, har det vist sig, at anvendelsen af disse materialer ikke blot indebærer en potentiel toksicitet men også er unødvendig. Anvendelsen af natriumbisulfit er faktisk kontrainjiceret, på grund af dets toksicitet og når hensees til dets mutagene virkning,som indebærer en 25 risiko for carcinogen virkning.

En særlig enhedsdosisform af det foreliggende rensede chymopapain tænkes at indeholde ca. 23 mg af det rensede lyofiliserede chymopapain fremstillet ved hjælp af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse med ca. 10.000 30 til 11.500 enheder af enzymaktivitet og ca. 3,5 mg natrium af cysteinathydrochlorid emballeret i et evakueret (vakuum) hætteglas yderligere karakteriseret ved fraværelse af natriumbisulfit eller EDTA ( ethylendiamintetraeddikesyre).

17

DK 163525 B

Almindeligvis anvendes cysteinet'eller andet reduktionsmiddel i mængder fra ca. 0,5 til 10 mg pr. 10.000 enzymenheder af chymopapain bestemt ved hjælp af Erlanger-analysen .

5 Det følgende er et eksempel på fremstillingen af det lyo-filiserede produkt af en typisk enhedsdosisform.

Typisk fremstilling af produktet.

1. Renset chymopapain som bestemt ved hjælp af fremgangsmåden, der omfatter DL-d-benzoyl-p-nitroanilidhydrolyse, 10 indeholdt 522 enheder pr. mg.

2. Til fremstilling af 100 hætteglas af chymopapain (renset) blev der krævet 125 ml opløsning. Hvert hætteglas fik 1,0 ml opløsning indeholdende 11.500 ensymenheder og 0,02 m mol natriumcysteinathydrochlorid. Opløsningen blev 15 holdt ved en temperatur under 10°C under behandlingen.

3. Opløsningen blev fremstillet på følgende måde: a. Til ca. 100 ml kogt og afkølet vand til injektion blev der sat L-(+) cysteinhydrochloridmonohydrat til opnåelse af 0,02 mmol pr. ml i det færdige volumen.

20 Mg krævede = 0,02 mmol/ml x 175,6 mg/mmol x 125 ml

Mg tilsat = 439

Efter tilsætning af den krævede mængde af det opløste stof blev pH-værdien justeret til ca. 5,5 med ca. 2 ml IN NaOH.

4. Chymopapain blev derpå tilsat til opnåelse af 11.500 25 enheder pr. ml i det færdige volumen:

DK 163525B

18

Mg krævede = 11 ν500-·^^Γ/ια1_χ 125 jal 522 enheder/ml

Mg tilsat = 2.753,8

Opløsningen blev omrørt for at opløse alt det opløselige stof, IN NaOH blev tilsat for at bringe pH-værdien på 6,0, 5 og der blev tilsat tilstrækkeligt vand til injektion for at bringe volumenet på 125 ml.

5. For at sterilisere blev opløsningen sendt gennem et filter med en porestørrelse på 0,2 mikron.

6. Til hvert af 100 stk. 5 ml hætteglas blev der derpå 10 sat 1,0 ml af den rensede chymopapain-cysteinopløsning.

Flækkede serumhætteglaspropper blev indført delvis, og hætteglassene blev anbragt i et lyofiliseringsapparat udrustet til automatisk lukning.

7. Hætteglassene blev holdt i lyofiliseringskammeret 15 under vakuum ved -30°C til de var frosset fuldstændigt, og vandet blev fjernet ved forsigtig opvarmning ved et tryk på ca. 90 mikron (absolut) i ca. 30 timer.

8. Propperne blev derpå anbragt fuldstændigt, vakuumet i kammeret blev udlignet, og aluminium-lågene blev an- 20 bragt.

9. Hvert hætteglas indeholdt et hvidt, fnugget produkt, som indeholdt 23 mg chymopapain og 3,5 mg natriumcvsteinat-hvdrochlorid med en enzvmaktivitet på 11.500 enheder.

X det følgende findes en række undersøcelser gennemført 25 til bestemmelse af den lave toksicitet og effektiviteten af det rensede chvmopapainprodukt.

19

DK 163525 B

Intravenøs akut toksicitet.

Undersøgelser af akut intravenøs toksicitet blev gennemført for at sammenligne råt chymopapain ifølge den kendte teknik, som blev solgt kommercielt i Canada (oprindelig 5 kilde Baxter Travenol Laboratories) (herefter benævnt forbindelse A) med det rensede chymopapain fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse (heri forbindelse B) og en kontrol, sterilt vand (forbindelse C), ved intravenøs injektion i forskellige forsøgsdyr. Forbindelse B præparatet 10 blev fremstillet ved hjælp af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse som en vandig opløsning af en lyofiliseret dosisenhedsform indeholdende 23,0 mg renset chymopapain og 3,5 mg natriumcysteinathydrochlorid fremstillet ved hjælp af den metode, der er beskrevet i eks-15 emplet ovenfor. Forbindelse A indeholdt ca. 27 mg rå chymopapain, 0,37 mg dinatrium EDTA og 3,5 mg natriumcysteinathydrochlorid .

Forsøg 1 (mus).

Ti unge fuldtudviklede mus (5 hanner og 5 hunner) af CD-I 20 stammen blev hver injiceret intravenøst med 0,01 ml/g (svarende til 20.000 og 23.000 enheder/kg legemsvægt) af henholdsvis testforbindelse A og B i opløsninger med koncentrationer på 2.000 og 2.300 enheder/ml. Det valgte injektionssted var en lateral halevene og injektions-25 hastigheden var 1 ml pr. 30 sekunder. Musene blev undersøgt 2,5 og 4 timer efter doseringen og to gange dagligt (om morgenen og om eftermiddagen) derefter i en samlet periode på 14 dage.

Fire ud af de ti mus, der var behandlet med forbindelse A, 30 døde inden 4 timer efter at de havde fået injektionen.

Halerne på seks af de overlevende mus, der blev injiceret med forbindelse A, viste tegn på necrose. Fire af de ti mus, 20

DK 163525 B

der blev injiceret med forbindelse B, døde henholdsvis efter 2 dage (1 han og 1 hun) og 4 dage (to hanner). En af de overlevende mus viste tegn på halenecrose efter undersøgelsesperiodens afslutning. Der blev ikke konstateret dødsfald 5 hos mus, der blev injiceret med kontrollen' (forbindelse C).

Undersøgelse 2 (kaniner).

Tre grupper af fire kaniner (to hanner, to hunner) blev injiceret intravenøst med 0,5 ml/kg legemsvægt af prøveforbindelserne i dosismængder på 1.000 (forbindelse A) og 10 1.150 (forbindelse B) enheder pr. kg legemsvægt. Tre af fire kaniner (to hanner, en hun) døde inden 4 timer efter injektion af forbindelse A. Alle kaninerne, der blev injiceret med forbindelse B,overlevede ligesom kaninerne, der blev injiceret med kontrollen (forbindelse C).

15 Sammenfattet viser undersøgelserne,at det hidtil kendte chymopapain har langt højere toksicitetsrisiko end det rensede chymopapain fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse.

Reducerede allergen-egenskaber.

(Marsvinehudsensibilis ering) 20 En marsvinedermalsensibiliseringstest blev gennemført på 32 fuldt udviklede han-albinomarsvin af Hartley-stammen holdt i overensstemmelse med Department Health Education and Welfare Pub. Nr. 78-23 (N.I.H) i 17 dage før undersøgelsens påbegyndelse. Forsøgsdyrne blev baberet 26-27 timer 25 før undersøgelsen for at fjerne hår fra hvert marsvins side og ryg. Eventuelle hudabormaliteter (dvs. erythema, læsioner) betød at dyret ikke blev medtaget i undersøgelsen, hvilket også var tilfældet, hvor der var nogen afvigelse i legemsvægt. 30 forsøgsdyr blev udvalgt til-30 fældigt fra den foreliggende gruppe på 32. Forbindelserne A og B,som identificeret ovenfor, blev tilberedt med sterilt 21

DK 163525 B

vand til fremstilling af injektionsopløsninger. Koncentrationen af forbindelse A (kommercielt chymopapain) var 2.000 enheder/ml. Koncentrationen af forbindelse B (renset chymopapain) var 2.300 enheder/ml. En positiv kontrol, 5 2,4-dinitro-l-chlorbenzen,blev fremstillet som en 0,1% (vægt/volumen) opløsning og identificeret som forbindelse D. En negativ kontrol (sterilt vand) blev identificeret som forbindelse C. 10 dyr blev anvendt i hver forsøgsgruppe .

10 Sensibiliseringsundersøgelser blev gennemført ved intradermal injektion af testforbindelserne A, B og den positive kontrolforbindelse D på dyrenes højre side. Negative kontrolinjektioner (forbindelse C, sterilt vand) blev intradermalt injiceret i venstre side af alle forsøgsdyr i testgrup-15 perne. Testen og kontrollerne blev injiceret hver anden dag 3 timer pr. uge,indtil der var blevet administreret 10 sensibiliserende doser. Det oprindeligt injicerede volumen var 0,05 og 0,10 ml på 9 efter hinanden følgende sensibiliserende doser.

20 2 uger efter administrationen af den 10. sensibiliserende dosis blev der administreret en prøvedosis på 0,05 ml af test- og kontrolforbindelserne på samme måde som de sensibiliserende doser.

Dyrene blev undersøgt for dødlighed 2 gange dagligt (før 25 og efter middag) i 37 dage.

De følgende undersøgelser af hudlæsioner blev foretaget 24 og 48 timer efter injektion og vurderet med hensyn til intensitet af erythema ved at måle diameter (udhugning) og'højde af ødem (vable).

30 I det følgende findes resultaterne af gennemsnittet af observationerne efter 24 og 48 timers forløb.

DK 163525 B

Ϊ2

Diameter af Højde af erythema x ødem x

Forbindelse A 14,8 mm 2,27

Forbindelse B 9,9 nra 1,73

Forbindelse D ll,06mm 2,71 5 (positiv kontrol) x Gennemsnit af 10 dyr bortset fra tilfældet med forbindelse D, hvor 2 dyr døde (gennemsnit af 8).

Resultaterne viser at det i handelen værende chymopapain-præparat har væsentlig større sensibiliseringsvirkning end ren-10 set chymopapain f ranstil let ifølge den foreliggende opfindelse.

Forbindelse A har større sensibiliseringsvirkning end den positive kontrol (D), 2,4-dinitro-l-chlorbenzen, som er et kendt sensibiliseringsmiddel. Statistisk analyse viser,at forskellene mellem forbindelserne A og B var 15 signifikante for erythema (p £ 0,025) og ødem (p < 0,002) .

Opløsning af centralt parti (nucleus pulposus).

(effektivitet)

Forsøgsforbindelserne A, B og C blev hver injiceret i den centrale del (nucleus pulposus) af 2 efter hinanden følgende lumbal bruskskiver af 4 ikke fuldtudviklede ægte 20 beaglehunde ved koncentrationer af (B) på 2.300 og af (A) på 2.000 enheder pr. ml ved dosismængder på 115 enheder (B) og 100 enheder (A) pr. discus henholdsvis. Hundene blev undersøgt ved hjælp af spinalradiografi, hematologi, klinisk kemi og nekroskopi efterfulgt af mikroskopisk 25 undersøgelse af udvalgte væv, specielt ved injektionstedet.

Efter 14 dages forløb viste røntgenfilm indsnævring af intervertebralrummet i alle 4 dyr, der blev injiceret med forbindelse B, renset chymopapain. I tilfældet med forbindel- 23

DK 163525 B

se A udviste 3 af 4 hunde indsnævring efter 14 dages forløb .

14 dage efter injektionen udviste 4 af 4 dyr, der blev injiceret med forbindelse B, tegn på ændringer af synligt 5 væv (gross tissue),i skiverne, som kan tilskrives behandling, hvorimod kun 2 ud af 4 dyr, der blev behandlet med forbindelse A, viste disse ændringer. Der sås ingen ændringer for kontrollen. Dyrene, der blev injiceret med forbindelse B, renset chymopapain, viste svag til moderat chondroplasia 10 (genvækst af nucleus pulposus) og de,der blev injiceret med forbindelse Afviste fra meget svag til svag ændring.

Af det foregående fremgår det helt klart, at det rensede chymopapain, der blev fremstillet ved hjælp af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, er en ny form 15 af chymopapain, som er signifikant mindre toksisk end det rå chymopapain ifølge den kendte teknik, specielt som vist i de ovenfor anførte marsvinesensibiliseringsunder-søgelser.

På basis af andre forskeres erfaringer er det indlysende, 20 at den nye forbedrede rensede form af chymopapain .fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse med tillid kan anvendes ved fremgangsmåden til behandling af unormale, beskadigede eller forskubbede (hernierede) skiver (disci interverte-bralis) i pattedyr, herunder mennesker.

25 Som bemærket ovenfor kan det rensede chymopapain fremstilles ved hjælp af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse på en i alt væsentligt kontinuerlig måde, da den carboxymethylsubstituerede agarosegelharpiks ikke undergår volumenreduktion under brug og ikke skal fjernes 30 fra søjlen til regenerering ved vaskning og ligevægtsindstilling igen med puffer og fornyet ekspansion, således

Claims (6)

24 DK 163525 B som det er tilfældet med ionbytterharpikser, såsom "Sephan= dex” CM-50 (en carboxymethylsubstitueret tværbundet dextran-copolymer), efterfulgt af tilbagehældning i søjlen, en kostbar og tidskrævende proces. For at gennemføre frem-5 gangsmåden ifølge opfindelsen på i alt væsentlig kontinuerlig måde regenereres søjlen af carboxymethylagarosegel in situ ved blot at hælde yderligere puffer gennem søjlen, som straks kommer i ligevægt og er klar til brug igen. Der er ikke nogen volumenreduktion af harpiksen, ligesom jq der heller ikke er brug for fjernelse, vaskning eller genopsvulmning. Andre harpiksstøttematerialer, der ikke svinder i brug, og som er velegnede til anvendelse i forbindelse med denne opfindelse, er acrylamidgelharpikser. 15 Patentkrav.

1. Fremgangsmåde til rensning af råt chymopapain til fremstilling af et renset chymopapain med reduceret toksicitet, 20 kendetegnet ved, at man a) bringer en vandig pufret opløsning af råt chympapain i kontakt med en svagt sur kationbytter omfattende en søjle af carboxymethylsubstitueret tværbundet agarosegel, idet nævnte kat-25 ionbytter forud er blevet bragt i ligevægt med vandig pufferopløsning med en pH-værdi på mellem ca. 6,5 og 7,5 og har en neutraliserende kapacitet fra ca. 0,02 til ca. 0,10 milliækvi-valenter natriumhydroxid/cms ·, 30 b) eluerer det chymopapain, der er holdt tilbage på kationbyt-teren med en vandig pufferopløsning med en pH-værdi, som er i det samme interval som den puffer, der blev anvendt til at bringe den carboxymethylsubstituerede agarosegel i ligevægt, men med en lineær voksende ionkoncentration af forligeligt, 35 ikke-reaktivt, vandopløseligt, farmaceutisk acceptabelt, neutralt uorganisk salt med hensyn til elueringsmiddelvolumen; 25 DK 163525 B c) opsamler og fjerne en første række af fraktioner af elue-ringsmiddel fra den nævnte kationbytter indeholdende en første farvet og lugtende proteinkomponent fra råt chymopapain, indtil molariteten af elueringsmidlet med hensyn til nævnte op- 5 løselige salt stiger til og når intervallet fra 0,25 til 0,4; d) kontinuerlig opsamler og tilbageholder en yderligere række af fraktioner af chymopapain, der er elueret fra kationbytte-ren, omfattende to proteolytisk aktive chymopapainkomponenter 10 ved voksende opløselige saltkoncentrationer på over ca. 0,25 til 0,4 molær, indtil i alt væsentligt alt det nævnte absorberede chymopapain er udvundet; e) genforener de aktive fraktioner fra trin (d) og behandler 15 nævnte tilbageholdte fraktioner indeholdende proteolytisk aktive komponenter af chymopapainet til fjernelse af de opløste ioniske uorganiske salte og pufferkomponenter, og f) lyofiliserer den i alt væsentlige saltfrie chymopapainop-20 løsning til fremstilling af et tørt, renset proteolytisk aktivt cymopapain, der i alt væsentligt er fri for proteolytisk inaktive eller toksiske komponenter.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 25 at den anvendte elueri ngsmiddel pufferop løsn i ng udvi ser en vandopløselig uorganisk saltkoncentrationsgradient fra 0 til 1 molær.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 30 at den opløselige saltkoncentration i trin c) når en molari- tet på ca. 0,3.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at et råt farvet chymopapain opløses i en phosphatpuffer ved 35 en koncentration (vægt/volumen) på 12 til 18%, og pufferkon centrationen med hensyn til phosphatet er ca. 0,05 molær. 26 DK 16352BB

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at en tilstrækkelig mængde af den farvede proteinkomponent af det rå chymopapain, som først blev elueret fra bytteren, fjernes, således at en syrnet vandig opløsning af resten af 5 de proteolytisk aktive chymopapainkomponeneter, der elueres og udvindes af nævnte bytter, ikke bevirker dannelse af et bundfald, når det behandles med bariumchloridopløsning (USP).

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 10 at fremgangsmåden i alt væsentligt bliver kontinuert ved, at restsalt efter udvinding af renset chymopapain fra nævnte e-lueringsmiddel fjernes fra søjlen ved tilførsel dertil af en saltfri pufferopløsning i et tilstrækkeligt volumen til at fjerne nævnte restsalt og bringe nævnte søjle i ligevægt og 15 gentage fremgangsmådetrinnene ifølge krav 1. 20 25 30 35