DK162241B - Fremgangsmaade til detektering og isolering af en mikroorganisme - Google Patents

Description

i DK 162241 3

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til detektering og isolering af en mikroorganisme, der producerer og sekreterer et ønsket stof, hvorved en mikroorganisme dyrkes på en steril semipermeabel membran anbragt på overfladen af et 5 agarmedium, og opfindelsen angår også en fremgangsmåde til detektering af en mikroorganisme, der producerer et ikke-sekreteret, ønsket stof, hvorved en mikroorganisme dyrkes på en steril semipermeabel membran anbragt på overfladen af et agarmedium.

10 Mikroorganismer, der er i stand til at producere stofskifteprodukter og proteiner, får stedse større betydning i industrien på så forskellige områder som produktion af industrielle kemikalier, mejeriprodukter, antibiotika og ved industrielle anvendelser.

15 Mikroorganismer kan fås ved rutinemæssig screening af jordprøver, ved klassisk genetisk manipulationsteknik, f.eks. ultraviolet bestråling og udvælgelse af mutanter, eller ved rekombinant-DNA-teknologi, der involverer overførsel af genetisk materiale fra én mikroorganisme til en 20 værtsmikroorganisme til ændring af værtsmikroorganismens genetiske karakteristika.

I hvert enkelt tilfælde skal der screenes en række mikroorganismer til detektering af en mikroorganisme, der har den ønskede egenskab. Sådan screening og isolering af 25 mikroorganismer involverer almindeligvis dyrkning og undersøgelse af et stort antal kolonier af mikroorganismer og er arbejdskrævende og tidsforbrugende.

Detekteringen og isoleringen af en mikroorganisme, der har en ønsket genetisk egenskab eller producerer et 30 ønsket stof, omfatter dyrkning af mikroorganismen på et egnet agarmedium og anvendelse af en eller anden teknik til detektering af den ønskede mikroorganisme. Denne mikroorganisme fjernes derpå fra kolonierne af andre mikroorganismer og isoleres.

35 I nogle bakteriestammer eksisterer der et middel til "primær" selektion, f.eks. hvis den ønskede mikroorganisme

DK 162241 B

2 er resistent overfor et bestemt antibiotikum, idet den mikroorganisme, der skal undersøges, da kan dyrkes i nærværelse af et sådant antibiotikum, og de mikroorganismer, der overlever, kan udvælges og isoleres. I modsætning hertil bærer 5 nogle mikroorganismer ikke en "primær" selektions-egenskab. Sådanne mikroorganismer må screenes og isoleres ved hjælp af biokemiske metoder, der betegnes som screenings-teknik. Eksempelvis kan mikroorganismer, der producerer enzymet a-amylase, screenes ved inkorporering af stivelse i et agar-10 medium, dyrkning af mikroorganismerne, tilvejebringelse af kontakt mellem agaren og iod og iagttagelse af agaren for klare zoner, der indicerer tilstedeværelsen af stivelseshydrolyse forårsaget af en mikroorganisme, der sekreterer θ'-amylase.

15 Undersøgelse af mikroorganismer, der dyrkes i et agarmedium, og som omfatter enten en primær udvælgelig egenskab eller en biokemisk screeningstest, er besværlig og tidsrøvende under anvendelse af konventionel teknik. Der findes standardbestemmelsesmetoder, der kan anvendes i for-20 bindelse med et forholdsvis lille antal kolonier, der dyrkes på en agarplade.

I US patentskrift nr. 3.929.583 beskrives anvendelsen af et membranfilter, der er egnet til at tilbageholde mikroorganismer på dets overflade, når en flydende prøve ledes 25 gennem filteret. Membranfilteret er påtrykt et barrieremateriale i et mønster, der bevirker isolering af cellerne og hindrer kolonier i at spredes. Efter inokulering anbringes den nævnte membran på overfladen af en næringsgel eller på en pude gennemvædet med en næringsopløsning i en petriskål.

30 Anvendelsen af dette membranfilter hævdes at lette kolonidetektering og -tælling.

I US patentskrift nr. 4.237.223 beskrives anvendelsen af et adhæsivt ark til bestemmelse af tilstedeværelsen af mikroorganismer på en overflade. Den overflade, der skal 35 testes for mikroorganismer, bringes i kontakt med den adhæsive side af arket. Dette anbringes derpå på et sterilt

DK 162241 B

3 dyrkningsmedium med den adhæsive side opad. Efter inkubering analyseres arket for nærværelsen af mikroorganismer.

I de to nævnte patentskrifter er der ikke tale om nogen fremgangsmåde, ved hvilken et stof produceret af en 5 mikroorganisme anvendes til at detektere nærværelsen af organismen; i begge skrifter er der således tale om tælling af den faktiske kolonivækst.

Der er således behov for en forbedret metode til detektering af en ønsket mikroorganisme. Det er således et 10 formål med opfindelsen at tilvejebringe en hurtig og økonomisk metode til undersøgelse af et stort antal mikroorganismer, der dyrkes i et agarmedium, og udvælgelse af en mikroorganisme, der producerer et ønsket stof, idet der anvendes et lille antal manipulationstrin og få materialer.

15 Den foreliggende opfindelse angår således som nævnt en fremgangsmåde til detektering og isolering af en mikroorganisme, der producerer enten en sekreteret eller et ikke-sekreteret stof, hvorved en mikroorganisme dyrkes (og i det første tilfælde tilbageholdes) på en steril semipermeabel 20 membran anbragt på overfladen af et agarmedium.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til detektering og isolering af en mikroorganisme, der producerer og sekreterer et ønsket stof, er af den allerede angivne art og er ejendommelig ved (a) overlejring af en steril semipermeabel 25 membran på overfladen af et agarmedium i en forudbestemt orientering i forhold til agaroverfladen, idet agaren indeholder et reagens, der kan reagere med stoffet, (b) dyrkning af mikroorganismer på membranen, hvorhos man tillader stoffet at passere ind i agarmediet, medens mikroorganismerne 30 tilbageholdes på membranen, (c) fjernelse af membranen fra overfladen og opretholdelse af membranen i et sterilt miljø, (d) iagttagelse af en detekterbar reaktion mellem stoffet og reagenset, (e) udnyttelse af den forudbestemte orientering til identifikation af positionen af en mikroorganisme, der 35 producerer stoffet, og (f) fjernelse af mikroorganismen fra membranen og isolering af mikroorganismen. Alternativt er

DK 162241 B

4 det ikke nødvendigt, at agaren indeholder reagenset, men kan bringes i kontakt med et reagens. Hvis det ønskede produkt ikke kan detekteres ved hjælp af reaktion mellem produktet og et enkelt reagens, kan agarmediet bringes i kontakt 5 med en række reagenser, og der kan iagttages en detekterbar reaktion mellem stoffet og mindst ét af reagenserne.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til detektering af en mikroorganisme, der producerer, men ikke sekreterer et ønsket stof, er af den ovenfor angivne art og er ejendommelig 10 ved (a) overlejring af en steril semipermeabel membran på overfladen af et agarmedium i en forudbestemt orientering i forhold til agaroverfladen, hvorhos agaren indeholder et reagens, der kan reagere med stoffet, (b) dyrkning af mikroorganismer på membranen, (c) lysering af mikroorganismerne 15 in situ for at forårsage frigørelse af stoffet og tillade det at passere ind i agarmediet, (d) fjernelse af membranen fra agarmediet, (e) iagttagelse af en detekterbar reaktion mellem stoffet og reagenset, og (f) udnyttelse af den forudbestemte orientering til detektering af den mikroorganisme, 20 der producerer det nævnte stof, fra et replica-pladesæt. Alternativt er det ikke nødvendigt, at agaren indeholder reagenset, men kan bringes i kontakt med et reagens. Såfremt det ønskede, ikke-sekreterede produkt ikke er detekterbart ved hjælp af en reaktion mellem produktet og et enkelt rea-25 gens, kan agarmediet bringes i kontakt med en række reagenser, og en detekterbar reaktion mellem stoffet og mindst ét af reagenserne kan iagttages.

Afhængigt af den involverede mikroorganismes vækstkrav og egenskaberne er det bredt udvalg af agarmedier egnede 30 til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Egnede medier er velkendte i teknikken og omfatter Spizizen's mini-mal-salte, tryptose-blodagarbasis og næringsagar.

Semipermeable membraner, der tillader diffusion af det stof, der produceres af mikroorganismen, ind i agar-35 mediet, idet mikroorganismen samtidig tilbageholdes, er egnede. Skønt semipermeable membraner tidligere er blevet DK 162241 3 5 anvendt til at lette isolering og detektering af mikroorganismer, har man ikke tidligere anvendt et stof, der produceres af en mikroorganisme, til detektering og tælling af store antal kolonier. Eksempelvis egner sig en semipermeabel 5 membran med en porestørrelse i området fra ca. 1 x 10“4 μ til ca. 0,45 μ. Desuden skal den semipermeable membran være kemisk indifferent overfor det produkt, der produceres af mikroorganismen. Egnede membraner kan fremstilles af cellulose, nitrocellulose, derivatiseret nitrocellulose, cello luloseacetat, nylon og copolymere af hexafluorpropylen og tetrafluorethylen.

ATCC-numre angivet i det følgende henviser til mikroorganisme-kulturer, der er tilgængelige fra American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. BGSC-numre angivet 15 i det følgende refererer til mikroorganisme-kulturer, der er tilgængelige fra Bacillus Genetic Stock Center, Ohio State University, Columbus, Ohio.

Stoffer, der produceres af mikroorganismer, omfatter enzymer, såsom amylaser, f.eks. a-amylase, proteaser, f.eks.

20 alkaliske proteaser, cellulaser og jB-lactamaser. Andre stoffer omfatter produkter såsom antibiotika, f.eks. penicillin, streptomycin og erythromycin. Omfattet er også metaboliter såsom pyrodruesyre, ascorbinsyre og immunogene proteiner såsom caps id-proteiner og /3-galactosidase.

25 Egnede mikroorganismer, der danner de ovennævnte stoffer, er angivet i den følgende tabel.

30 35

DK 162241 B

6

Stof Kilde

α-Amylase Bacillus amyloliquefaciens H

Protease (BGSC nr. 10A2) 5 Bacillus licheniformis a-amylase (ATCC nr. 27811) /3-Galactosidase E. coli K12 (ATCC nr. 10798)

Cellulase Trichoderma viride (ATCC nr. 32086)

10 ^-Lactamase Bacillus licheniformis 749/C

(ATCC nr. 25972)

Penicillin Penicillium chrysogenum (ATCC nr. 9480)

Erythromycin Streptomyces erythreus 15 (ATCC nr. 11635)

Ascorbinsyre Saccharomyces cerevisiae

Pyrodruesyre (ATCC nr. 7754)

Methionin Saccharomyces cerevisiae (Aminosyre) (ATCC nr. 32049) 20 Φ29 Bakteriofag (BGSC nr. 1P19) (capsid-protein)

Som illustreret i det følgende omfatter egnede reagenser sådanne, der er reaktive overfor det ønskede stof, der produceres af en mikroorganisme, og frembringer en detek-25 terbar reaktion. Sådanne reaktioner er velkendte i teknikken.

Den detekterbare reaktion kan gennemføres ved anvendelse af ét enkelt reagens, fortrinsvis inkorporeret i agarmediet. Alternativt kan der anvendes en række reagenser, hvoraf ét reagerer med det ønskede produkt til opnåelse af en detek-30 terbar reaktion. Et første reagens kan inkorporeres i agarmediet, og efter at stoffet har fået lov at passere ind i agarmedietbringes dette medium i kontakt med ét eller flere reagenser. Alternativt kan man, efter at stoffet har fået lov at passere ind i agarmediet, bringe dette medium i 35 kontakt med ét eller flere reagenser.

Egnede enkeltreagenser, der kan inkorporeres i agar-mediet, omfatter casein, der frembringer en detekterbar

DK 162241 B

7 reaktion med protease. En række reagenser omfatter et system, hvori der anvendes stivelse og iod til detektering af a-amylase, og polyvinylalkohol, I2, Kl, natriumtetraborat og penicillin til detektering af /3-lactamase, og trichlored-5 dikesyre, 4,7-diphenyl-l-10-phenanthrolin og ferroioner til detektering af ascorbinsyre samt polyvinylalkohol, I2, Kl, natriumtetraborat og /3-lactamase til detektering af penicillin.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere i 10 de følgende eksempler.

Eksempel 1 DNA fra en stamme af Bacillus licheniformis, der producerer og sekreterer α-amylase (Amy+), klones ind i en 15 stamme af Bacillus subtilus (GBSC, stamme nr. 1A289), der ikke oprindeligt producerer eller sekreterer a-amylase (Amy“), under anvendelse af rekombinant-DNA-teknik som beskrevet i USA-patentansøgning nr. 438.544 af 1.11. 1982, hvortil der henvises, og transformanterne undersøges for a-20 amylase-producerende mikroorganismer som beskrevet i det følgende.

Der anvendes en Bacillus subtilis (BGSC stamme nr.

1A289), der oprindeligt er sensitiv for chloramphenicol (Cms), Amy”.

25 Bacillus subtilis-cellerne transformeres ved hjælp af en kollektion af rekombinante plasmid-DNA-molekyler, der hvert meddeler chloramphenicol-resistens (CmR) og indeholder et tilfældigt udvalg af fremmed DNA-fragmenter eller -gener. Indførsel af sådanne plasmider i Bacillus subtilis-celler 30 resulterer i en population af celler, der er CmR-transfor-manter. CmR-transformanterne screenes derpå for evnen til at producere α-amylase (Amy+), der er et resultat af indførelsen af det α-amylase-gen, der bæres af et plasmid. En sådan kloningsproces nødvendiggør en screening af ca. 1 x 35 107 Bacillus subtilis-kolonier med hensyn til Amy+-pheno- typen.

DK 162241 B

8

Ved konventionelle metoder, dvs. screening af celler på agarplader uden anvendelse af membraner, kan der kun analyseres 100 kolonier eller mindre på hver agarplade. De tætvoksende kolonier på agaroverfladen eliminerer muligheden 5 for at kunne iagttage de påfølgende reaktioner til detektering af de ønskede produkter. Cellerne kan også dræbes under reaktionstrinene.

Ved anvendelse af membraner bliver det muligt at screene fra 10.000 til 10 millioner kolonier på hver agar-10 plade. Fjernelse af den membran, der indeholder cellerne, bevirker, at reaktioner i agaren bliver let synlige, og cellerne bevares i en levedygtig tilstand.

Et typisk forsøg, der kræver screening af 1 million kolonier, ville kræve manipulation af 10.000 agarplader ved 15 anvendelse af konventionel teknik. Anvendelse af den i det følgende beskrevne membranteknik tillader udførelse af en sådan screening med kun 10 plader.

Et agarmedium af tryptose-blodagarbasis, 0,1% cas-aminosyrer (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) og 5 20 jLtg/ml chloramphenicol, hvori der inkorporeres 1,0 procent (vægt/rumfang) stivelse som et reagens for α-amylase, fremstilles. En højtrenset, egnet stivelse er en stivelse, der betegnes som værende "specific for Diastatis Power and a-amylase determination" og kan fås fra American Society of 25 Brewing Chemists, Inc., St.Paul, Minnesota 55121. En portion af mediet på 25 ml anbringes på en 100 mm petriskål (plade). Pladerne kan opbevares i tillukkede plasthylstre ved 4°c i op til 3 uger uden nogen ødelæggende virkninger.

Semipermeable membraner med en porestørrelse på 0,45 30 μπι anvendes som beskrevet i det følgende. En egnet membran er kommercielt tilgængelig fra Millipore Corporation, Bedford, Massachusetts, under handelsbetegnelsen "Hybridization Membrane Filter Discs".

Der udføres to snit med en længde på ca. 5 mm og 35 under rette vinkler med hverandre, og disse snit skal tjene som orienteringsmærker til anbringelse af membranen på sti-

DK 162241 B

9 velsesagarpladerne. Askefrit filtrerpapir udskæres i tynde strimler (ca. 5 mm x ca. 50 mm) og anbringes mellem membranerne under sterilisering. De opstablede membraner nedsænkes i vand i en glaspetriskål og autoklaveres i 30 minutter ved 5 120°C.

De sterile membraner anbringes oven på agaroverfladen af stivelsespladerne ved aseptisk overføring med sterile filter-pincetter. På et plade-drejebord anvendes der en steril glasstav til at fjerne de rynker og de luftblærer, 10 der hindrer nær kontakt mellem membranen og agar over fladen. Positionerne af indsnittene i filteret mærkes på undersiden af hver plade. Det er kritisk for effektiviteten af bestemmelsen, at stivelsespladerne er nye og fri for bobler eller blærer til sikring af, at der er nær kontakt mellem membranen 15 og alle arealer af agaren.

Under anvendelse af den procedure til transformation af Bacillus subtilis 1A289, der er refereret i det foregående, anbringes der i et lag direkte oven på membranerne 0,1 ml celler indeholdende ca. 1 x 105 kolonidannende enheder 20 pr. ml. Pladerne inkuberes ved 37°C i 12-18 timer med plade-retsiden opad. Dette tidsrum er tilstrækkeligt til at tillade, at al a-amylase, der produceres af mikroorganismerne, kan passere gennem membranen.

Efter inkubationsperioden fjernes membranerne aseptisk 25 med filter-pincetter. Membranen fjernes og overføres til en steril petriskål og mærkes på passende måde.

Hver stivelses-agar-plade holdes med handsker direkte over ioddamp i 4-7 sekunder. loddampene fungerer som et andet reagens. Fjernelse af membranen tillader undersøgelse 30 af agaren med hensyn til nærværelsen af α-amylasen, uden at kolonierne udsættes for iod, der kan være ødelæggende for kolonierne i høje koncentrationer. Dernæst anbringes den på en lyskilde til synliggørelse af den detekterbare reaktion mellem α-amylasen og iod, hvorved der dannes klare zoner 35 hidrørende fra stivelseshydrolyse mod den blå stivelses-iod-baggrund. Én amylase-producerende koloni i et felt med

DK 162241 B

10 1 x 105 Amy“-kolonier kan detekteres ved denne teknik. Positionerne af zonerne markeres direkte på pladebunden umiddelbart efter, at pladen er blevet iod-fremkaldt. Dette er nødvendigt, fordi farven begynder at svinde bort efter 7-15 5 sekunder. I stedet for ioddamp-trinet kan der anvendes 2 ml af en vandig iodopløsning (2%'s kaliumiodid, 0,2% iod) til synliggørelse af zonerne. Anvendelsen af iod på denne måde resulterer i en farvning, der bibeholdes længere, end når der anvendes dampmetoden.

10 Til udvinding af de amylase-producerende kolonier identificeres membranen indeholdende Amy+-cellerne og føres tilbage til dens oprindelige stivelse-iod-agarplade, idet man anvender indsnittene i membranen til genorientering og opnåelse af en korrekt anbringelse. Ved at holde pladen 15 over en lyskilde kan de mærkede zoner ses gennem filteret og korreleres med en koloni på filteret.

Kolonien fjernes fra filteret ved skrabning med en steril tandstikker og suspendering af cellerne i 0,1 ml Tryptose Beef Broth: 1% tryptose, 0,3% oksekødsekstrakt, 20 0,5% NaCl og 0,1% casaminosyrer. Der fremstilles seriefor tyndinger, og 0,1 ml celler anbringes på filtre over TBAB (TBAB = Tryptose Blood Agar Base)+stivelse+chloramphenicol-plader som før. Den ovenfor beskrevne filterdetekteringsbestemmelse gentages, indtil det er fastslået, at der er 25 opnået en ren kultur af Amy+, CmR Bacillus subtilis-cel-ler. Ved denne metode detekteres og isoleres der én klon, der producerer amylase, fra ialt ca. 1 x 107 kolonier, som underkastes analyse.

Detekteringsmetoden ifølge opfindelsen udnyttes i 30 det følgende eksempel til detektering af mikroorganismer, der producerer enzymet jS-lactamase, der er til stede i en population af celler, som ikke producerer /3-lactamase.

Eksempel 2 35 Bacillus licheniformis-stammen 749/C (BGSC) er en stamme, der producerer og udskiller Ø-lactamase. Bacillus

DK 162241 B

11 subtilis A12 (BGSC) er en asporogen stamme, der ikke producerer Ø-lactamase.

Begge mikroorganismer dyrkes ved 37'C i et næringsmedium bestående af 10 g/1 trypton (Difco Laboratories, 5 Detroit, Michigan), 5 g/1 gærekstrakt (Difco), 5 g/1 NaCl og 4 g/1 glucose. Bacillus licheniformis 749/C dyrkes til en koncentration på ca. 1 x 107 celler pr. ml, og Bacillus subtilis A12 dyrkes til en koncentration på ca. 1 x 108 celler pr. ml. Cellekoncentrationerne bestemmes ved anbring-10 else af lag af passende fortyndinger på agarplader indeholdende tryptose-blodagarbasis (Difco), 0,1% casaminosyrer (Difco) og 0,75% polyvinylalkohol (Sigma Chemical Co.,

St.Louis, Missouri).

Der fremstilles semipermeable membraner som beskrevet 15 i eksempel 1. Sæt af 100 ml petriskåle, der hver indeholder 25 ml tryptose-blodagarbasis, 0,1% casaminosyrer og 0,75% polyvinylalkohol (som et første reagens for jø-lactamase), overlejres med sterile semipermeable membranfiltre ved hjælp af sterile pincetter og glasstave til sikring af fuldstændig 20 kontakt- mellem membraner og agaroverfladen. Positionerne af indsnittene i filteret markeres på bunden af hver plade. Passende fortyndinger af Bacillus subtilis A12-kulturen fremstilles således, at 0,1 ml af de fortyndinger, der anbringes som lag på filteroverfladen, indeholder 1 x 105, 1 25 x 106 eller 1 x 107 celler. Der fremstilles et sæt af fire plader af hver fortynding. Passende fortyndinger af Bacillus licheniformis 749/C-kulturen fremstilles således, at 0,1 ml af de fortyndinger, der anbringes på filteroverfladen, indeholder 1, 10, 40 eller 100 celler. Én af hver sådanne 30 fortyndinger anbringes på hver af de pladesæt, der tidligere er påført et lag af Bacillus subtilis A12-celler. Pladerne inkuberes ved 37°C i 12-18 timer med plade-retsiden opad.

Dette tidsrum er tilstrækkeligt til at tillade, at /3-lac-tamase, der produceres af mikroorganismerne, passerer gennem 35 membranen.

Efter inkubationsperioden fjernes membranerne aseptisk

DK 162241 B

12 med filterpincetter og overføres til en steril petriskål og mærkes på passende måde. Hver plade overhældes derpå med 3-5 ml af en opløsning indeholdende 0,08 N I2 i 0,32 N Kl og 1% (vægt/rumfang) natriumtetraborat i 30-60 sekunder, idet 5 I2, Kl og natriumtetraborat i kombination fungerer som det andet reagens. Der dannes et mørkeblåt polyvinylalkohol-iod-kompleks i agaren. Pladerne befries derefter for væske og overhældes dernæst med 3-5 ml af en 1%'s (vægt/rumfang) opløsning af penicillin G som et tredie reagens i 0,1 M 10 kaliumphospha tpuf fer med en pH-værdi på 6,8. Pladerne anbringes på en lyskilde til synliggørelse af de klare zoner, der viser sig på den mørke baggrund. De klare zoner dannes ved hydrolysen af penicillin G med /3-lactamase i agaren. Zonerne optælles og mærkes. Det er muligt at detektere én jS-lac-15 tamase-producerende koloni blandt en baggrund af 1 x 107 kolonier pr. plade, som ikke producerer /3-lactamase.

Detekteringsmetoden ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes som beskrevet i det følgende eksempel til detektering og isolering af mikroorganismer, der producerer et 20 protease-enzym, som er til stede i en population af mikroorganismer, der ikke producerer protease.

Eksempel 3

Bacillus subtilis SR22 (BGSC-stamme 1S10) er en mikro-25 organisme, der ikke producerer protease. Bacillus amylo-liquefaciens H (BGSC-stamme 10A2) er en mikroorganisme, der producerer protease.

Der fremstilles et agarmedium af 1,0% Bacto-nærings-agar (Difco), og medens det endnu er flydende, blandes det 30 med en steril opløsning af en ikke-fedtholdig "instant"-tørmælk (som et reagens), ækvilibreret til en pH-værdi på 8,0 med "tris" således, at det færdige medium indeholdende 2,5% (vægt/rumfang) tørmælk. Et egnet "instant"—tørmælksprodukt kan fås fra Galloway-West Co., Fond du lac, Wiscon-35 sin, under handelsbetegnelsen Peake. En portion på 25 ml af dette medium udhældes i hver petriskål.

13

DK 162241 B

Der fremstilles sterile, semipermeable membraner, og disse mærkes og anbringes i position på overfladen af agarpladerne som beskrevet i eksempel 1. Et rumfang på 0,1 ml af en suspension indeholdende 1 x 104 Bacillus subtilis 5 S22-celler og 1 x 10 Bacillus amyloliquefaciens H-celler anbringes som et lag direkte på filtrene. Pladerne inkuberes i 48 timer ved 37“C med retsiden opad. Efter inkubationsperioden, der er tilstrækkelig til at tillade, at protease, der produceres af mikroorganismerne, passerer gennem mem-10 branen, fjernes membranerne aseptisk, overføres og mærkes som beskrevet i eksempel l.

Agarpladerne undersøges derpå ved direkte visuel inspektion for klare zoner på den uklare baggrund af koaguleret mælkeprotein i agaren. De klare zoner indicerer hydro-15 lyse af mælkeprotein (casein) ved en reaktion mellem den producerede protease, der sekreteres af Bacillus amyloliquefaciens H - mikroorganismen, og det reagens, der er til stede i agaren.

De Bacillus amyloliquefaciens-protease-producerende 20 mikroorganismer isoleres fra membranen som beskrevet i eksempel 1.

Andre substrater for protease og casein kan inkorporeres i agarmediet som et reagens. Ét sådant substrat er okseserumalbumin (BSA-fraktion V, Miles Laboratories, Inc., 25 Elkhart, Indiana) . Efter vækst af mikroorganismerne behandles agaren, der indeholder BSA som et reagens, med en opløsning af 3%'s (rumfang/rumfang) eddikesyre til synliggørelse af hydrolysezonerne (se Biochemica et Biophysica Acta, 580. 339-355 (1979)).

30 Den i det følgende beskrevne procedure kan anvendes til detektering af gær eller andre mikroorganismer, der producerer og sekreterer ascorbinsyre, som er til stede i en population af mikroorganismer, der ikke producerer og udskiller ascorbinsyre.

35 14

DK 162241 B

Eksempel 4

Bagerigær, Saccharomyces cerevisia ATCC 7754, er en gærstamme, der producerer og udskiller ascorbinsyre.

Stammen dyrkes i et egnet næringsmedium til en kon-5 centration på ca. 1 x 107 eller 1 x 108 celler pr. ml.

Der fremstilles semipermeable membraner som beskrevet i eksempel 1. Der fremstilles sæt af 100 mm-petriskåle, der hver indeholder 25 ml Tryptose-blodagarbasis og 0,1% cas-aminosyrer. Agarpladerne overlejres med en semipermeabel 10 membran som beskrevet i eksempel 1, og der fremstilles passende fortyndinger af Saccharomyces cerevisiae således, at 0,1 ml af fortyndingerne anbragt som et lag på membranoverfladen indeholder fra 1 x 105 til 1 x 107 celler.

Pladerne inkuberes i ca. 12 til ca. 18 timer ved 15 37°C med plade-retsiden opad for at tillade, at ascorbinsyre, der produceres af mikroorganismerne, kan passere gennem membranen.

Efter inkubationsperioden fjernes membranerne som beskrevet i eksempel 1. Hver plade overhældes med følgende 20 serie reagenser; 4,0 ml 5,0%'s trichloreddikesyre, 2,0 ml ethanol, 1,0 ml 0,4%'s phosphorsyre i ethanol, 2,0 ml 0,5%'s 4,7-diphenyl-l,10-phenanthrolin i ethanol og 1,0 ml 0,03%'s FeCl3 i ethanol.

Pladerne inkuberes ved 30°C og anbringes på en lys-25 kilde til synliggørelse af dannelse af ét rødt farvet chelat mellem ferroionerne og phenanthrolinen, hvilket indicerer nærværelse af ascorbinsyre. De ascorbinsyre-producerende kolonier kan fjernes og isoleres som beskrevet i eksempel 1.

En test til detektering og isolering af mikroorganis-30 mer, der producerer og sekreterer penicillin, der er til stede i en population af mikroorganismer, der ikke producerer og udskiller penicillin, kan udføres på basis af den /3-lac-tamase-procedure, der er beskrevet i eksempel 2.

35

DK 162241 B

15

Eksempel 5

Penicillium chrysogenum ATCC 9480 dyrkes i et egnet agarnæringsmedium til en koncentration på ca. l x 108 celler pr. ml.

5 Der fremstilles semipermeable membraner som beskrevet i eksempel 1. Der fremstilles sæt af 100 mm petriskåle, der hver indeholder 25 ml Tryptose-blodagarbasis og 0,1% cas-aminosyrer, og 0,75% polyvinylalkohol som et første reagens.

Pladerne inkuberes derpå som beskrevet i eksempel 2 10 for at tillade, at penicillin, der produceres af mikroorganismerne, kan passere gennem membranen.

Den semipermeable membran fjernes derefter og overføres til en steril petriskål og mærkes på passende måde.

Hver plade overhældes derpå med en opløsning af 0,80 N I2, 15 0,32 N Kl og 1% natriumtetraborat, der fungerer som et andet reagens, og der iagttages dannelse af et mørkeblåt polyvinyl-alkohol-iod-kompleks. Pladerne befries for væske og overhældes dernæst med en opløsning af /3-lactamase. Pladerne anbringes på en lyskilde til synliggørelse af de klare zoner, som 20 viser sig på den mørke baggrund på grund af hydrolysen af penicillin forårsaget af /?-lactamasen.

De penicillin-producerende kolonier kan fjernes og isoleres fra membranen som beskrevet i eksempel l.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes til 25 at detektere en E.coli-mikroorganisme, der producerer β-galactosidase, der er til stede i en population af mikroorganismer, der ikke producerer /J-galactosidase. I dette tilfælde er grundlaget for detekterings-bestemmelsen, at enzymet β-galactosidase også fungerer som et immunogent protein.

30

Eksempel 6

En bank af /3-galactosidase-deficiente (lac”) E.coli-celler (se Methods in Enzymology, 68, 432 (1979)) indeholdende plasmider, der bærer et tilfældigt udvalg af muse-gener, 35 fremstilles i overensstemmelse med standard-rekombinant-DNA-teknik. Ved hjælp af rekombinant-DNA-teknik kan der

DK 162241 B

16 fremstilles et lille antal /3-galactosidase-producerende organismer, der er et resultat af kloningen af muse-genet for /3-galactosidase.

Agarmediet består af 0,5% NaCl, 0,4% casaminosyrer, 5 10 μg thymin pr. ml og 1,5% Bacto-agar (Difco). Medens agar mediet stadig er smeltet (45*C), tilsættes der en passende mængde renset eller råt antiserum, der er specifikt for /3-galactosidase, som et reagens. Anvisninger til fremstillingen af antiserum og bestemmelse af koncentrationen, der kræves 10 til bestemmelsen, kan findes i Methods in Enzymology, 68, 430-431, 435-436 og 437-438. Mediet hældes derpå ud i 100 mm plastpetriskåle i en mængde på 12 ml pr. plade til dannelse af et tyndt lag.

Sterile semipermeable membraner fremstilles, mærkes 15 og anbringes i position på overfladen af pladerne som beskrevet i eksempel 1.

E.coli-cellerne udspredes på membranerne og inkuberes ved 37°C i 24 timer. Efter vækst af cellerne fjernes afdækningerne fra pladerne, og pladerne vendes om over en kilde 20 til chloroform- eller toluen-damp til lysering af kolonierne på membranerne. Alternativt kan pladen sprøjtes med en fin tåge af toluen eller chloroform. Pladerne henstilles derpå under et aftræks-stinkskab for at tillade fordampning af resterende chloroform eller toluen. Efter ca. 4 timer, i 25 løbet af hvilket tidsrum /3-galactosidasen er diffunderet gennem membranen og ind i agarpladen, fjernes membranerne, mærkes og opbevares.

Agarpladerne inspiceres derefter over en lyskilde med hensyn til uklare arealer hidrørende fra "precipitin"-30 dannelse, dvs. dannelse af et præcipitat mellem /3-galac-tosidasen og antistoffet, der er til stede i det rå antiserum, hvilket indicerer tilstedeværelsen af /3-galactosidase i et kompleks med det antistof, der er til stede i agaren.

Den korrekte membran genorienteres på agaroverfladen, og 35 positionen af den /?-galactosidase-producerende koloni fastslås på denne måde.

17

DK 162241 B

Detektering af /3-galactosidasen i agarpladen kan også udføres ved at overlejre agaroverfladen med 2 ml af en opløsning bestående af 0,6% agar og 80 μg/ml 5-brom-4-chlor- 3-indolyl-/?,d-galactosid (XG) (Bachero, Marina Del Ray, Cali-5 fornien), efterfulgt af inkubering ved 37°C i 90 minutter. XG-materialet virker som et substrat for /3-galactosidase og vil danne en blå zone ved hydrolyse forårsaget af enzymet.

Levende celler af den korrekte E.coli-koloni, identificeret ved den ovennævnte metode, udvindes fra et replica-10 sæt af plader, fremstillet med den samme orientering som det afprøvede sæt, der ikke er blevet udsat for chloroform eller toluen.

Som tidligere angivet kan den her omhandlede fremgangsmåde anvendes i forbindelse med andre stoffer, der i 15 sig selv er immunogene, eller som kan gøres immunogene ved kobling til et egnet hapten.

20 25 30 35

Claims (10)

1. Fremgangsmåde til detektering og isolering af en mikroorganisme, der producerer og sekreterer et ønsket stof, hvorved en mikroorganisme dyrkes og tilbageholdes på en 5 steril semipermeabel membran anbragt på overfladen af et agarmedium, kendetegnet ved (a) overlejring af en steril semipermeabel membran på overfladen af et agarmedium i en forudbestemt orientering i forhold til agaroverfladen, idet agaren indeholder et rea- 10 gens, der kan reagere med stoffet, (b) dyrkning af mikroorganismer på membranen, hvorhos man tillader stoffet at passere ind i agarmediet, medens mikroorganismen tilbageholdes på membranen, (c) fjernelse af membranen fra overfladen og opretholdelse 15 af membranen i et sterilt miljø, (d) iagttagelse af en detekterbar reaktion mellem stoffet og reagenset, (e) udnyttelse af den forudbestemte orientering til identifikation af positionen af en mikroorganisme, der producerer 20 stoffet, og (f) fjernelse af mikroorganismen fra membranen og isolering af mikroorganismen derfra.

2. Fremgangsmåde til detektering og isolering af en mikroorganisme, der producerer og sekreterer et ønsket stof, 25 hvorved en mikroorganisme dyrkes og tilbageholdes på en steril semipermeabel membran anbragt på overfladen af et agarmedium, kendetegnet ved (a) overlejring af en steril semipermeabel membran på overfladen af et agarmedium i en forudbestemt orientering i 30 forhold til agaroverfladen, (b) dyrkning af mikroorganismer på membranen, hvorhos man tillader stoffet at passere ind i agarmediet, medens mikroorganismerne tilbageholdes på membranen, (c) fjernelse af membranen fra overfladen og opretholdelse 35 af membranen i et sterilt miljø, (d) tilvejebringelse af kontakt mellem agaren og ét eller DK 162241 B flere reagenser og iagttagelse af en detekterbar reaktion mellem stoffet og mindst ét af reagenserne, (e) udnyttelse af den forudbestemte orientering til identifikation af positionen af mikroorganismen, der producerer 5 stoffet, og (f) fjernelse af mikroorganismen fra membranen og isolering af mikroorganismen derfra.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at der anvendes agar indeholdende et reagens.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 2 eller 3, ken detegnet ved, at mikroorganismen er udvalgt fra gruppen bestående af Bacillus sp., Streptomyces sp., Lactobacillus sp., Streptococcus sp. samt gær.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 2 eller 3, k e n -15 detegnet ved, at stoffet er udvalgt fra gruppen bestående af et protein, et enzym, et antibiotikum, et im-munogent stof og en metabolit.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at reagenserne er udvalgt fra gruppen 20 bestående af et substrat, et antistof og en kemisk forbin--delse.

7. Fremgangsmåde til detektering af en mikroorganisme, der producerer et ikke-sekreteret, ønsket stof, hvorved en mikroorganisme dyrkes på en steril semipermeabel membran 25 anbragt på overfladen af et agarmedium, kendetegnet ved (a) overlejring af en steril semipermeabel membran på overfladen af et agarmedium i en forudbestemt orientering i forhold til agaroverfladen, hvorhos agaren indeholder et 30 reagens, der kan reagere med stoffet, (b) dyrkning af mikroorganismer på membranen, (c) lysering af mikroorganismerne in situ for at forårsage frigørelse af stoffet og tillade det at passere ind i agarmediet , 35 (d) fjernelse af membranen fra agarmediet, (e) iagttagelse af en detekterbar reaktion mellem stoffet DK 162241 B og reagenset, og (f) udnyttelse af den forudbestemte orientering til detektering af den mikroorganisme, der producerer det nævnte stof, fra et replica-pladesæt.

8. Fremgangsmåde til detektering af en mikroorganisme, der producerer et ikke-sekreteret, ønsket stof, hvorved en mikroorganisme dyrkes på en steril semipermeabel membran anbragt på overfladen af et agarmedium, kendetegnet ved 10 (a) overlejring af en steril semipermeabel membran på overfladen af et agarmedium i en forudbestemt orientering i forhold til agaroverfladen, (b) dyrkning af mikroorganismer på membranen, (c) lysering af mikroorganismerne in situ til at forårsage 15 frigørelse af stoffet og tillade det at passere ind i agarmediet, (d) fjernelse af membranen fra agarmediet, (e) tilvejebringelse af kontakt mellem agaren og ét eller flere reagenser og iagttagelse af en detekterbar reaktion 20 mellem stoffet og mindst ét af reagenserne og (f) udnyttelse af den forudbestemte orientering til detektering af den mikroorganisme, der producerer det nævnte stof, fra et replica-pladesæt.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8,kendeteg-25 net ved, at agaren indeholder et reagens.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 7, 8 eller 9, k e n -detegnet ved, at mikroorganismen er en E.coli.