DK162060B - Fremgangsmaade til screening af en blodsammensaetning for tilstedevaerelse af retroviruspartikler - Google Patents
Fremgangsmaade til screening af en blodsammensaetning for tilstedevaerelse af retroviruspartikler Download PDFInfo
- Publication number
- DK162060B DK162060B DK492185A DK492185A DK162060B DK 162060 B DK162060 B DK 162060B DK 492185 A DK492185 A DK 492185A DK 492185 A DK492185 A DK 492185A DK 162060 B DK162060 B DK 162060B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- activity
- reverse transcriptase
- nanbh
- blood
- hepatitis
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
- G01N33/56988—HIV or HTLV
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/82—Hepatitis associated antigens and antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
DK 162060 B
Den foreliggende opfindelse angår en screeningtest til påvisning og diagnose af non-A, non-B hepatitis i bloddonorer ved bestemmelse af tilstedeværelsen af omvendt transkriptase-akti-vitet i legemsvæsken, fortrinsvis i et blodbank-program. En 5 fordel ved den foreliggende opfindelse er at undgå overførsel af retrovirusbeslægtet infektion via et bloddonor-(transfu-sion)-program eller via piasma-beslægtede produkter ved identifikation af sådant blod, serum, plasma eller produkter afledt heraf, som kan være bærere af retrovirus, ved anvendelsen 10 af den her beskrevne test.
Non-A, non-B hepatitis formodes at skyldes et eller flere agenser, som er serologisk forskellige fra hepatitis A virus og hepatitis B virus. Diagnosticeringen af denne sygdom base-15 res på den serologiske udelukkelse af hepatitis A, hepatitis B, cytomegalovirus og Epstein-Barr virus.
Non-A, non-B hepatitisinfektion er blevet rapporteret over hele verden. Den tegner sig for 20% af sporadiske tilfælde af 20 hepatitis hos voksne. I de Forenede Stater udgør denne type hepatitis 90% af post-transfusions-hepatitis. En foruroligende andel på 50% af disse tilfælde udvikler sig til kronisk hepatitis, og de pågældende personer forbliver potentielle smitte-ki Ider.
25
Tilstedeværelsen af et overførbart agens ved denne sygdom er blevet påvist. Imidlertid findes der for tiden ikke nogen test til identifikation af non-A, non-B agenset eller -agenserne.
Den foreliggende opfindelse påviser for første gang, at non-A, 30 non-B hepatitis skyldes et retrovirus eller retrovirus-1ignen-de agens, og angår en fremgangsmåde til screening for dette i et klinisk program, især i et program af blodbank-typen.
Den foreliggende opfindelse tager derfor sigte på at angive en 35 fremgangsmåde til screening af blod eller bloddonorer, som kan være i stand til at overføre retrovirus-1ignende infektioner, som kan være sygdomsfremkaldende.
2
DK 162060 B
Opfindelsen tager endvidere sigte på at angive én fremgangsmåde til påvisning af tilstedeværelsen af virus med omvendt transkriptase-aktivitet i blod, serum, plasma eller plasmaafledte produkter.
5
Et andet formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en fremgangsmåde til påvisning af tilstedeværelsen af et agens, som forårsager non-A, non-B hepatitis.
10 Endnu et formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en kit til påvisning af sygdomsfremkaldende eller smitsomme retrovirus indbefattende et agens, som forårsager non-A, non-B hepatitis uanset dets epidemiologi.
15 Andre formål og fordele vil fremgå af den efterfølgende detaljerede beskrivelse af opfindelsen.
Oisse og andre formål, træk og mange af de ledsagende fordele ved den foreliggende opfindelse vil blive forstået bedre ved 20 at læse den følgende detaljerede beskrivelse, når denne anskues i sammenhæng med' den medfølgende tegning, hvor:
Fig. 1 viser bånd af podestof I dannet af sucrose-massefylde-gradient og lokalisering af omvendt transkriptase-aktivitet.
25
Disse og andre formål og fordele ved den foreliggende opfindelse opnås ved en screeningtest til påvisning af tilstedeværelse af vira indeholdende omvendt transkriptase i serum eller blod, især i et bloddonor-program.
30
Den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde til screening af en blodsammensætaing for tilstedeværelse af retrovirusparti kl er, der er associeret med non-A, non-B hepatitis, og fremgangsmåden er kendetegnet ved, at man 35 a) isolerer nævnte retroviruspartikler fra en prøve af blodsammensætningen,
DK 162060B
3 b) opbryder eller lyserer de isolerede retroviruspartikler til derved at frigøre den omvendte transkriptase derfra, c) analyserer omvendt transkriptase-aktiviteten, 5 d) identificerer NANBH-viruset i denne omvendt transkriptase-aktivitet ved podning af chimpanser med omvendt transkrip-tase-positive fraktioner, 10 e) sammenligner den i trin d) analyserede NANBH-aktivitet med den i en på lignende måde behandlet kontrolprøve analyserede, og f) konkluderer tilstedeværelse af retroviruspartikler, der er 15 associeret med non-A, non-B hepatitis, i nævnte blodsam mensætning, når omvendt transkriptase-aktiviteten i blodsammensætningen er ca. dobbelt så stor som i kontrolprøven .
20 Med betegnelsen "blod" menes i det følgende ikke blot blod som sådant, men også serum, plasma og hvilke som helst andre produkter eller fraktioner, der er tilvejebragt ud fra eller afledt af blod eller blodkomponenter.
25 Selvom den her beskrevne screeningtest påviser tilstedeværelsen af omvendt transkriptase af en hvilken som helst oprindelse, bør det bemærkes, at den her beskrevne omvendt transkriptase (RT) i retroviraene er partikel-associeret, dvs. at RT findes indkapslet i viruset.
30
Med henblik på at påvise RT består et første afgørende trin således i at isolere viruspartiklerne fra en opløselig blodfraktion. De isolerede viruspartikler opbrydes derpå eller lyseres for at frigive RT, og den specifikke enzymaktivitet 35 måles.
Det må derfor være klart, at den her omhandlede RT specifikt er af viral oprindelse og ikke et opløseligt protein, som fin- des i forbindelse med normale dele af legemet, væv eller le gemsvæsker.
DK 162Q60B
A
Så vidt det vides findes RT i forbindelse med alle testede 5 retrovira. Den må derfor i denne henseende betegne« som en markør for sådanne vira. Viraene, som hører til denne gruppe, og som er klinisk mere signifikante, er imidlertid især de humane T-Celle lymfocytotrope typer I, II og III (HTLV I, II og III) samt non-A, non-B hepatitisvirus. Det bør bemærkes, at 10 den foreliggende opfindelse for første gang viser, at non-A, non-B hepatitis er af retroviral oprindelse og derfor påviselig ved RT-analyse. e
Det bemærkes, at betegnelsen "retrovirus" som heri benyttet 15 indbefatter retrovirus-1ignende agenser eller entiteter, som har samme densitet og udviser RT-aktivitet, således som fundet i de ovenfor nævnte retrovira.
Selvom enhver egnet metode til påvisning af RT-aktivitet kan 20 anvendes ved udøvelsen af den foreliggende opfindelse,· bør det bemærkes, at de foretrukne metoder omfatter enhver form for radioaktivt mærket enzymatisk analyse, histologisk analyse, radioimmuno-analyse, fluorescens-analyse, antigen-antistof-analyse, ELISA (enzymkoblet immunosorbentanalyse) og lignende.
25 Monoklone eller polyklone antistoffer mod oprenset RT eller nedbrydningsprodukter af RT er særligt foretrukne. Sådanne analysemetoder er velkendte og nærliggende for fagmanden. Alle nedenfor omtalte litteratursteder eller publikationer medtages heri ved henvisningen dertil. Foretrukne fremgangsmåder og 30 materialer beskrives i det følgende.
De anvendte forkortelser er som følger: NANBH, non-A, non-B heptatitis; RT, omvendt transkriptase; ALT, alanin-aminotrans-ferase; PEG, polyethylenglycol 6000; HAV, hepatitis A virus; 35 HBV, hepatitis B virus; RSV, Rous sarcoma virus; CMV, cytomegalovirus; EBV, Epstein-Barr virus; HTLV III, human T-celle lymfocytotrop virus type III; AIDS, erhvervet immundefekt syndrom.
DK 162060 B
s
Infektiøse sera og plasmaafledte produkter.
Fire serumpodestoffer og to plasmaafledte produkter blev undersøgt. De havde hver især tidligere vist sig at overføre 5 NANBH til mennesker og/eller chimpanser samt at vare fri for HAV, HBV, CMV og EBV.
De fire podestoffer var sera fra patienter med NANBH. Podestof 1 var et veldefineret serum, som var tilvejebragt fra en pa-10 tient med kronisk NANBH, erhvervet efter blodtransfusion. Det var kendt, at dette podestof havde overført NANBH til et andet menneske ved utilsigtet podning og til chimpanser. Podestofferne SE og RP er sera tilvejebragt fra to patienter under den akutte fase af NANBH, hvilke patienter begge udviklede kronisk 15 NANBH. Podestof SE hidrører fra en patient med blodtransfu sionassocieret NANBH, og podestof RP stammer fra en mandlig homosexuel. Hvert af disse sera overførte NANBH til chimpanser, som er gyldige stedfortrædere for mennesker til testformål. Det fjerde podestof (podestof H) var et veldefineret 20 serum, som var tilvejebragt fra en patient med kronisk NANBH, og som havde vist sig at overføre NANBH til chimpanser.
To podestoffer var plasmaafledte produkter fremstillet i USA, henholdsvis antihæmofil faktor og fibrinogen. De havde begge 25 været impliceret i overførsel af NANBH til patienter, og de havde begge vist sig at overføre NANBH til chimpanser.
NANBH patienter og sundhedskontrol.
30 Serumprøver fra 12 patienter, hver med klinisk, histologisk og (ved udelukkelse) serologisk bekræftet NANBH, blev undersøgt. Disse patienter omfattede modtagere af blodtransfusion (3 patienter, der alle udviklede kronisk NANBH), brugere af intravenøse medikamenter (fire patienter, 35 5 6
DK 16206 OB
hvoraf tre udviklede kronisk NANBH), og sporadiske tilfælde uden nogen kendt udsættelse for hepatitisagenser (fem patienter, hvoraf to udviklede kronisk NANBH). NANBH diagnosen blev stillet hos hver af diisse patienter baseret på serum ALT aktivitet (mindst fem gange den øverste grænse for 10 normal, 40 IU/ml), leverhistologi stemmende overens med viral hepatitis og fravær af serologiske markører for HAV (anti-HAV-antistoffer af IgM-typen), HBV (HBsAg i serum eller kun anti-HBc i serum), CMV.eller EBV.
15
Kontrolsera blev tilvejebragt fra 49 raske personer, hvoraf 13 arbejdede i et laboratorium for forskning i og kontrol af plasmaderivater, og 36 var betalte plasmapherésis-donorer. Det er for begge disse grupper kendt, at de er udsat for en noget højere risiko med hensyn til NANBH end den øvrige be- 20 folkning.
Chimpanser
To chimpanser (Pan troglodytes), 1278 og 1284 blev tilveje-25 bragt fra en avlskoloni som beskrevet af Tabor et al. i Lancet, 1978, 1, 463 og Tabor et al. i N. Engl. J. Med., 1980, 303, 140.
Påvisninq af omvendt transkriptase-(RT)-aktivitet 30 “---- RT-analyse. Serumprøver (100 jul) , negativt kontrolmateriale (oksefosterserum) og positivt kontrolmateriale (Rous sarcoma virus, 1 x 10^ partikler) blev alle indledningsvis centrifugeret i 5 ml 35% glycerol i 0,5 M Tris-HCl, pH 7,0 ved 35 77.000 x g i 1 time ved 4°C for at pelletere virale partikler fra serum-proteiner, således som det er beskrevet af Samgadharan et al. i Methods Cancer Res., 1976, 12, 3.
7
DK 162060 B
5 Pellet blev behandlet med 0,25% octylphenol-ethylenoxid- kondensat (Nonidet P40) for at nedbryde virus-partiklerne.
Hver behandlet prøve blev dernæst tilsat til 40 μΐ opløsning, indeholdende 60 mM Tris-HCl, pH 8,3, 8 mM MgCl, 80 mM KCl, 20 mM dithiothreitol, 0,1 pg actinomycin D, 80 pM_af hvert 10 umærket deoxyribonukleosid-triphosphat, 20 μΜ [?hJ TTP (thy- midin-triphosphat, specifik aktivitet 1,2 Ci/mmol) og 1 pg poly(rA) p(dT)^Q som skabelon-primer. Reaktionen blev inkuberet ved 37°C i en time og afsluttet ved tilsætning af 40 pi af en 1 mg/ml gær tRNA-opløsning og 5 ml 10% TCA inde-15 holdende 0,2 mM natriunpyrophosphat. Efter 30 minutter blev den fældbare radioaktivitet opsamlet på glasfiberfiltre, tørret, og radioaktiviteten blev bestemt ved væskescintillation.
Prøven blev betragtet som værende positiv, hvis prøvens cpm var to gange højere end den negative kontrols cpm (mid-20 delværdi 0,35 x 10 ). Denne positive afskæring (cut-off) 3 (0,7 x 10 cpm) baseret på en titrering af RSV-partikler, repræsenterer RT-aktiviteten, som findes i forbindelse med 4 1 x 10 RSV-partikler. Et groft skøn over virus-titer i et givet inokulum kan derfor opnås ved at sammenligne den RT-25 aktivitet i cpm, som findes i forbindelse med forskellige antal RSV-partikler, med den cpm, som opnås for inokulummet.
Det produkt, som måles, er det radioaktivt mærkede DNA.
Lokalisering af RT i fraktioner fra sucrose-gradient-ultra-30 centrifugering af infektiøse sera
En ml af hver af inokulum I og inokulum SE blev centrifugeret hver for sig i en SW41 rotor ved at blive lagt oven på 11 ml af en 10% til 60% (vægt) sucrose-gradient fremstillet i 10 mM 35 Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl og 1 mM EDTA og centrifugeret ved 30.000 o/m i 19 timer ved 4°C i en Beckman LB-70 ultra-centrifuge. Fraktioner (hver på 0,7 ml) blev opsamlet fra bunden af gradienten, og absorbansen ved 260 nm blev bestemt
DK 162060B
8 5 ved hjælp af en LKB UVcord. Efter at have fjernet sucrose ved centrifugering blev fraktionerne analyseret for RT-aktivitet som beskrevet.
Inokulering af RT-positive fraktioner fra ultracentrifugering 10 i chimpanser
Fraktioner fra hver enkel gradient# som indeholdt RT-aktivitet# blev hældt sammen (fraktionerne 12-15 i 2#8 ml)# filtersteriliseret (0#22 μΜ filter) og injiceret intravenøst i 15 chimpanser 1278 (inokulum I) og 1280 (inokulum SE) . Fra begge chimpanser blev udtaget blod en gang om ugen for at følge serumenzymaktiviteter (ALT og AST) og serologiske markører for hepatitis. Desuden blev foretaget leverbiopsi'er hver anden uge# som blev undersøgt ved elektronmikroskopi for 20 specifikke ultrastrukturelle forandringer i NANBH.
Biofysisk og biokemisk karakterisering af RT
I tre serumprøver (inokulum I# SE og RP) blev RT-akti vi teten 25 målt efter behandling med 6#5% polyethylenglycol 6000 (PEG) som beskrevet af Welsh et al. i Nucl. Acids Res., 1980, 8, 2340 og i en separat analyse ved tilstedeværelsen af 5 μg RNase A og to forskellige exogene skabelon-primere som beskrevet af Goodman et al. i Proc. Natl. Acad. Sci.# USA# 30 1971, 68, 2203 og Milstein et al. i J. Clin. Microbiology, 1975# 1, 353.
Resultater 35 Partikel-associeret RT-aktivitet blev påvist i alle seks in- fektiøse NANBH-materialer og i alle 12 sera fra patienter med akut eller kronisk NANBH. RT-aktiviteten varierede fra 0,85 9
DK 162060 B
3 3 5 x 10 cpm til 16f6 x 10 cpm. I modsætning hertil havde 47 ud af 49 sera (96%) fra raske kontrolpersoner ingen enzym- 3 3 aktivitet (cpm varierede fra 0/2 x 10 til 0,56 x 10 ). Sera 3 fra to raske kontrolpersoner gav henholdsvis 1,2 x 10 og o 1,0 x 10 cpm og blev betragtede som svagt positive (af- 3 10 skæring 0,7 x 10 cpm) . Tabel I viser data fra disse under søgelser.
Tabel I
Omvendt-transkriptase-(RT)-aktivitet 15 _____
Antal Antal RF-aktivitet / CCJtl)
Undersøgte materiale afprøvede positive (%) (græ8^^ „w.vbp) 20 Sera, som er vist in- . 4fja fektive i tidligere 4 4 (100%) middel* 5 95 NANBH-studier imooei.
Plasmaafledte produkter, . _ 1 „ scm er vist infektive i 2 2 (100%) . ί na tidligere NANBH-studier 25 Serurrpiøver fra NANBH- n fif: - 9 patienter, tilvejebragt 12 12 (100%) middel· 1 49 under infektionens ' ' akutte fase
Serurrprøver fra raske . n , ,»b laboratarieartejdere cg 49 2 (4%) midctel:'l,l 30 betalte plasmapheresis- dcnorer a) Denne værdi repræsenterer RT-aktiviteten i 100 jul af en -4 10 gange fortynding af inokulum H.
35 b) Disse værdier repræsenterer RT-aktiviteten i de to posi tive prøver. De negative prøver har værdier, der varierer fra 0,21 x 10^ til 0,56 x 10^ cpm.
DK 162060B
10 - -· i
' . I
i / i 5 !
Som det er. vist i figur 1 er top-RT-aktiviteten for inoku- | lum I indeholdt i et bånd ved 1,14 g/ml i en sucrose-gradient. Lignende bånd-mønstre opnåedes med to andre serum-inokula. Top-RT-aktiviteten er for inokulum SE og inokulum RP ligeledes indeholdt i bånd ved 1,14 g/ml.
10
Efter inokulation af chimpanser med RT-positive sucrose-gradient- fraktioner fra enten inokulum I (chimpanse 1278) eller inokulum SE (chimpanse 1284) udviklede begge dyr NANBH, hvilket blev fastslået ved forhøjede serum-ALT-aktiviteter 15 (mindst 3 gange basisniveau), histologiske beviser på hepatitis ved lysmikroskopi og specifikke ultrastrukturelle cyto-plasmatiske ændringer (type c-III tubuli) ved elektronmikroskopi .
20
De biofysiske og biokemiske karakteristika ved den ved den her beskrevne metode påviste RT-aktivitet fremgår i tabel II
Tabel II
Naturen af omvendt-transkriptase-(RT)-aktiviteten 25
Tilsætning b eller behandling u'S^m/Lalyse) 30 Komplet a 4,09
Actinomycin D, 100 Mg 4,01 6,5% PEG pellet ° 4,11
Poly (rA) *p(dT) 1Q, 1 »g 7,29 35 Poly (dA) *p(dT) 10, 1 Mg 3.64
Poly(rA) ‘p(dT)10, 1 M9 og RNase A, 5 M9 4,34 11
DK 162060 B
5 a) Dette komplette system repræsenterer standard-RT- reaktionen, beskrevet i materialer og metoder med undtagelse af den exogene skabelon. Aktiviteten repræsenterer syntese ved anvendelse udelukkende af den endogene skabelon.
10 b) Tilsat til den komplette reaktion beskrevet ovenfor.
c) PEG fældning af virale partikler forud for tilsætning til det komplette system.
15 Foruden at det findes i bånd ved en bestemt densitet, så er RT-aktiviteten forbundet med virale partikler eftersom den blev genvundet fuldstændigt i 6,5% PEG-bundfaldet. RT-aktiviteten udviste en præference for poly(rA)p(dT)frem for poly(dA)p(dT)som skabelon-primer, et særtræk, som ad-20 skiller det virale enzym fra cellulære DNA-polymeraser.
Ydermere var inkorporeringen af TTP ikke følsom overfor actinomycin D, som hæmmer DNA-afhængig DNA-syntese. Det virale RT-aktivitet med endogen skabelon-primer var følsom < overfor digestion med RNase A, hvorimod reaktionen med 25 exogen skabelon-primer poly(rA)p(dT)ikke påvirkes.
Opdagelsen af partikel-associeret RT-aktivitet i fire infek-tiøse sera og i to infektiøse plasmaafledte produkter såvel som i tolv serumprøver fra den akutte eller kroniske fase af 30 NANBH viste, at denne sygdom forårsages af en virus eller vi rus-lignende agens, som indeholder dette enzym. Lokaliseringen af denne RT-aktivitet i sucrose-gradient-fraktioner (top-aktivitet ved 1,14 g-ml) og overførslen af typisk NANBH til chimpanser ved inokulation af RT-positive sucrose-gradient-35 fraktioner udgør beviser på, at NANBH-agenset i de undersøgte sera og plasmaafledte produkter (så vel som i de undersøgte patientsera) er retrovirus eller retrovirus-lignende agens. Opdagelsen af RT-aktivitet i sera fra to ud af 49 kontrol-
DK 162060B
12 5 personer, som fandtes i bånd ved en densitet, som er i over ensstemmelse med densiteten for retrovirus, antyder kraftigt, at disse individer er inficerede med retrovirus eller retrovirus -lignende agens. Faktisk var alle disse 49 kontrolpersoner udsat for højere risiko for NANBH end den almindelige 10 befolkning.
Opdagelsen af RT-aktivitet i alle 12 sera fra patienter med forskellige epidemiologiske typer NANBH viste, at en eller flere retrovira eller retrovirus-lignende agenser var årsag 15 til alle 12 NANBH-tilfælde. Fraværet af RT-aktivitet i 47 ud ' af 49 sera fra raske laboratoriearbejders og betalte plasmadonorer, hvor alle har en forøget risiko for at få NANBH fremfor den almindelige befolkning, underbygger specificiteten i den her anvendte RT-analysemetode. Yderligere bevis 20 pi denne specificitet er den præference, som udvises overfor poly(rA)p(dT)som skabelon-primer, fældningen af RT med PEG, følsomheden for inaktivering af den endogene skabelon med RNase A, reaktionsproduktets modstandsdygtighed overfor alkalisk hydrolyse og lokaliseringen af RT-aktiviteten og 25 infektiviteten i sucrose-gradienter ved en densitet, som er i overensstemmelse med den, som er rapporteret for retrovirus som citeret i Sarngadharan et al. som ovenfor.
Kendte karakteristika for NANBH og for agenset eller agenser-30 ne, som forårsager denne sygdom, synes at være i overensstem melse med etiologien for en retrovirus eller retrovirus-lignende agens. Inaktivering af NANBH-agens er opnået ved anvendelse af formalin, varme eller chloroform, hvilket ligeledes er i overensstemmelse med, at de kan være retrovirus.
35 Kroniske infektioner er almindelige som følge af infektion med NANBH-agens, især sådanne som er erhvervet via blodtransfusion. Retrovirus forårsager karakteristisk kroniske infektioner. Antigen-antistof-systerner, som er beskrevet i tilknytning til NANBH, er i overensstemmelse med udviklingen
DK 162060B
13 5 af antistoffer til både ydre og indre retrovirus-antigener, hvor alle synes at optræde sammen med infektive vira i serum. Mindst et antigen, som er påvist ved modelektrophorese og oprenset fra inokulum I, synes at være et glycoprotein, der ligfter et som er beskrevet af Schupback et al. i Science,
10 1984, 224, 503, og som findes på overfladen af HTLV III
retrovirus.
Specifikke cy tb plasmatiske ultrastruktureIle forandringer er samstemmende blevet set ved NANBH i chimpanser. Til-15 svarende forandringer er blevet rapporteret i lymphocytteme hos patienter med erhvervet immundefekt-syndrom (AIDS), et syndrom som sammenknyttes med retrovirus HTLV III som beskrevet af Schaff et al. i Lancet, 1983, 1, 1336.
20 Ydermere blev en kendt mængde human T-celle lymfocytotrop virus, type III (HTLV III), tilsat til humant plasma, påvist ved omvendt-transkriptase-aktivitet. Tre produkter, som stammer fra plasma, der indeholdt HTLV III, antihæmofil-faktorkoncentrat, fibrinogen og plasmaprotein-fraktion, vistes 25 også at indeholde omvendt-transkriptase-aktivitet. Omvendt- transkriptase-aktivitet blev direkte sammenholdt med virus-titer, hvilket viste anvendeligheden af at anvende omvendt-transkriptase-aktivitet til at vurdere HTLV III virus-titer i plasma.
30
Det fremgår tydeligt af ovenstående, at den foreliggende opfindelse nu gør det muligt for blodbanker og fabrikanter af blodbeslægtede produkter at afsøge alle bloddonorer og blodprodukter, og identificere dem, som kan overføre sygdoms-35 tilstande, der er forårsaget af retrovirus, inklusive NANBH
og AIDS. En enkelt screeningtest, der anvender den foreliggende opfindelse, muliggør påvisning, diagnose og udelukkelse af retrovirusforårsagede smitsomme eller infek-tiøse sygdomstilstande.
Claims (4)
1. Fremgangsmåde til screening af en blodsammensætning for 15 tilstedeværelse af retroviruspartikler, der er associeret med non-A, non-B hepatitis, kendetegnet ved, at man a) isolerer nævnte retroviruspartikler fra en prøve af blod-sammensætn i ngen, 20 b) opbryder eller lyserer de isolerede retroviruspartikler til derved at frigøre den omvendte transkriptase derfra, c) analyserer omvendt transkriptase-aktiviteten, 25 d) identificerer NANBH-viruset i denne omvendt transkriptase-aktivitet ved podning af chimpanser med omvendt transkrip-tase-positive fraktioner, 30 e) sammenligner den i trin d) analyserede NANBH-aktivitet med den i en på lignende måde behandlet kontrolprøve analyserede, og f) konkluderer tilstedeværelse af retroviruspartikler, der er 35 associeret med non-A, non-B hepatitis, i nævnte blodsam mensætning, når omvendt transkriptase-aktiviteten i blodsammensætningen er ca. dobbelt så stor som i kontrol prøven. DK 162060 B
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at blodet omfatter serum, plasma eller en fraktion eller et produkt hidrørende derfra.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at blodet er tilvejebragt fra en donor i et blodbank-program.
4. Fremgangsmåde til påvisning af non-A, non-B hepatitis i et individ, kendetegnet ved at man analyserer for 10 omvendt transkriptase-aktivitet i en legemsprøve hidrørende fra dette individ, og at NANBH-viruset i denne omvendt tran-skriptase-aktivitet identificeres ved podning af chimpanser med omvendt transkriptase-positi ve fraktioner. 20 25 30 35
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US66540084 | 1984-10-26 | ||
| US06/665,400 US4707439A (en) | 1984-10-26 | 1984-10-26 | Screening test for reverse-transcriptase containing virus such as non-A, non-B hepatitis, NANBH |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK492185D0 DK492185D0 (da) | 1985-10-25 |
| DK492185A DK492185A (da) | 1986-04-27 |
| DK162060B true DK162060B (da) | 1991-09-09 |
| DK162060C DK162060C (da) | 1992-02-10 |
Family
ID=24669956
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK492185A DK162060C (da) | 1984-10-26 | 1985-10-25 | Fremgangsmaade til screening af en blodsammensaetning for tilstedevaerelse af retroviruspartikler |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4707439A (da) |
| EP (1) | EP0186526B1 (da) |
| JP (1) | JPS61104799A (da) |
| AT (1) | ATE51029T1 (da) |
| AU (1) | AU591072B2 (da) |
| CA (1) | CA1263304A (da) |
| DE (1) | DE3576529D1 (da) |
| DK (1) | DK162060C (da) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9309574B1 (en) | 1984-08-22 | 2016-04-12 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Molecular cloning of HIV-1 from immortalized cell lines |
| US6534285B1 (en) | 1984-12-24 | 2003-03-18 | Genentech, Inc. | Molecularly cloned acquired immunodeficiency syndrome polypeptides and their methods of use |
| US5853978A (en) * | 1985-12-04 | 1998-12-29 | Genentech, Inc. | Molecularly cloned acquired immunodeficiency syndrome polypeptides and methods of use |
| US5218099A (en) * | 1986-04-01 | 1993-06-08 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Post-transfusion, non-A, non-B hepatitis virus polynucleotides |
| US4942122A (en) * | 1987-02-24 | 1990-07-17 | Research Education Institute, Inc. | Aids prognosis test detecting the presence of antibodies inhibiting HIV reverse transcriptase |
| US5350671A (en) * | 1987-11-18 | 1994-09-27 | Chiron Corporation | HCV immunoassays employing C domain antigens |
| US5698390A (en) * | 1987-11-18 | 1997-12-16 | Chiron Corporation | Hepatitis C immunoassays |
| EP0322922A3 (en) * | 1987-12-31 | 1990-06-06 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Detection of avian and mammalian retrovirus infections |
| JPH04501203A (ja) * | 1988-07-06 | 1992-03-05 | ジェネラブズ インコーポレイティド | 後―輸血性，非―ａ，非―ｂ型肝炎ウィルス及び抗原 |
| IL91371A0 (en) * | 1988-08-24 | 1990-04-29 | Us Commerce | Clones or vectors bearing dna sequences of non-a and non-b hepatitis and a method for detecting these materials in blood |
| US5191064A (en) * | 1988-09-30 | 1993-03-02 | The Research Foundation For Microbial Diseases (Osaka University) | Non-a, non-b hepatitis virus antigen peptide |
| DE69021425T2 (de) * | 1989-04-14 | 1996-04-25 | Asahi Chemical Ind | Verfahren zur Messung von Reverse-Transcriptase mit nichtradioaktiven Substanzen. |
| BR9006422A (pt) | 1989-12-18 | 1991-09-24 | Wellcome Found | Processo para preparar um polipeptidio viral pt-nanbh e processo para detectar o mesmo |
| US7166287B1 (en) | 1989-12-18 | 2007-01-23 | Glaxo Wellcome Inc. | Viral agent |
| IT1241154B (it) * | 1990-05-18 | 1993-12-29 | Slavo | Metodo e composizione reagente per la determinazione dell'alanina amminotrasferasi e dell'antigene hbsag in uno stesso campione biologico |
| JP3011987B2 (ja) * | 1990-10-11 | 2000-02-21 | 旭化成工業株式会社 | 固相化プライマーを用いる逆転写酵素の測定法 |
| WO1993016201A1 (en) * | 1992-02-10 | 1993-08-19 | Baxter International Inc. | Method for testing blood units for viral contamination |
| DE69604051T2 (de) * | 1995-01-27 | 1999-12-16 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary | Verfahren zum sensitiven nachweis von reverser transcriptase |
| US6225053B1 (en) | 1997-12-12 | 2001-05-01 | Digene Corporation | Detection of hepatitis B virus |
| SE0001132D0 (sv) * | 2000-03-29 | 2000-03-29 | Cavidi Tech Ab | Method of concentrating and recovering a viral enzyme activity from biological samples |
| SE0101219D0 (sv) * | 2001-04-05 | 2001-04-05 | Cavidi Tech Ab | Recovery of enzyme activity from enveloped viruses |
| ATE316150T1 (de) * | 2001-06-14 | 2006-02-15 | Cavidi Tech Ab | Prüfung der arzneistoffempfindlichkeit von viren |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4379839A (en) * | 1977-05-23 | 1983-04-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for detecting cancer |
| US4356164A (en) * | 1979-05-21 | 1982-10-26 | Govt. of the U.S., as represented by the Secretary, Dept. of Health & Human Services | Detection of non-A, non-B hepatitis associated antigen |
| US4464474A (en) * | 1980-07-09 | 1984-08-07 | Connaught Laboratories Limited | Non-A, non-B hepatitis assay and vaccine |
| US4446237A (en) * | 1981-03-27 | 1984-05-01 | Life Technologies, Inc. | Method for detection of a suspect viral deoxyribonucleic acid in an acellular biological fluid |
| JPS58183629A (ja) * | 1982-04-21 | 1983-10-26 | Eisai Co Ltd | 非ａ非ｂ型肝炎関連モノクロナ−ル抗体および診断薬 |
| US4556643A (en) * | 1982-07-26 | 1985-12-03 | Agracetus | Assay method and probe for polynucleotide sequences |
| US4515890A (en) * | 1982-11-08 | 1985-05-07 | Abbott Laboratories | Immunoassay of terminal deoxynucleotidyl transferase |
| GB8324800D0 (en) * | 1983-09-15 | 1983-10-19 | Pasteur Institut | Antigens |
| US4520113A (en) * | 1984-04-23 | 1985-05-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Serological detection of antibodies to HTLV-III in sera of patients with AIDS and pre-AIDS conditions |
-
1984
- 1984-10-26 US US06/665,400 patent/US4707439A/en not_active Expired - Fee Related
-
1985
- 1985-10-10 AU AU48490/85A patent/AU591072B2/en not_active Ceased
- 1985-10-18 DE DE8585402020T patent/DE3576529D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-10-18 AT AT85402020T patent/ATE51029T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-10-18 EP EP85402020A patent/EP0186526B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-10-25 JP JP60237804A patent/JPS61104799A/ja active Pending
- 1985-10-25 CA CA000493911A patent/CA1263304A/en not_active Expired
- 1985-10-25 DK DK492185A patent/DK162060C/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4707439A (en) | 1987-11-17 |
| ATE51029T1 (de) | 1990-03-15 |
| CA1263304A (en) | 1989-11-28 |
| AU4849085A (en) | 1986-05-01 |
| EP0186526A1 (en) | 1986-07-02 |
| DK492185D0 (da) | 1985-10-25 |
| DK492185A (da) | 1986-04-27 |
| AU591072B2 (en) | 1989-11-30 |
| EP0186526B1 (en) | 1990-03-14 |
| DK162060C (da) | 1992-02-10 |
| DE3576529D1 (de) | 1990-04-19 |
| JPS61104799A (ja) | 1986-05-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK162060B (da) | Fremgangsmaade til screening af en blodsammensaetning for tilstedevaerelse af retroviruspartikler | |
| Vitvitski et al. | Detection of virus-associated antigen in serum and liver of patients with non-A non-B hepatitis | |
| Marion et al. | Hepatitis E virus genotype 3 and capsid protein in the blood and urine of immunocompromised patients | |
| Almeida Neto et al. | Significance of isolated hepatitis B core antibody in blood donors from Sao Paulo | |
| Zhevachevsky et al. | Dynamic study of HBsAg and HBeAg in saliva samples from patients with hepatitis B infection: diagnostic and epidemiological significance | |
| Mathiesen et al. | Hepatitis A virus in the liver and intestine of marmosets after oral inoculation | |
| Crespo et al. | Severe clinical course of de novo hepatitis B infection after liver transplantation | |
| Arraes et al. | The biological meaning of anti-HBC positive result in blood donors: relation to HBV-DNA and to other serological markers | |
| Rodríguez‐Torres et al. | Occult hepatitis B virus infection in the setting of hepatitis C virus (HCV) and human immunodeficiency virus (HIV) co‐infection: Clinically relevant or a diagnostic problem? | |
| Alter | Non-A, non-B hepatitis: sorting through a diagnosis of exclusion | |
| Muratori et al. | Detection of anti-liver cytosol antibody type 1 (anti-LC1) by immunodiffusion, counterimmunoelectrophoresis and immunoblotting: comparison of different techniques | |
| Ndjomou et al. | Hepatitis C virus infection and genotypes among human immunodeficiency virus high‐risk groups in Cameroon | |
| World Health Organization | Advances in viral hepatitis: report of the WHO Expert Committee on Viral Hepatitis [meeting held in Geneva from 11 to 16 October 1976] | |
| Tiwari et al. | Head-to-head comparison of Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) and Enhanced Chemiluminescence Immunoassay (ECLIA) for the detection of Transfusion Transmitted Disease (TTD) Markers; HIV, HCV and HBV in blood donors, in India | |
| Van Thiel et al. | Cryoglobulinemia: a cause for false negative polymerase chain reaction results in patients with hepatitis C virus positive chronic liver disease | |
| DATTA et al. | Acute sporadic non‐A, non‐B viral hepatitis of adults in India—Epidemiological and immunological studies | |
| Hussein | Evaluation of infectious disease markers in multitransfused Egyptian children with thalassemia | |
| Allain | Will genome detection replace serology in blood screening for microbial agents? | |
| Ali et al. | Detection Of Torque Teno Virus Antigen and Associated Risk Factors Among Hemodialysis Patients | |
| Mas et al. | Hepatitis B Virus and Hepatitis D Virus Replication in Hbsag–Positive Fulminant Hepatitis | |
| Duermeyer et al. | An enzyme‐linked immunosorbent assay for an antigen related to non‐a, non‐b hepatitis and its antibody: Partial characterization of the antigen and chimpanzee transmission | |
| Smith et al. | Outcome of post-transfusion hepatitis C: disease severity in blood-component recipients and their implicated donors. | |
| Anjum et al. | Review of lab diagnosis in modern era, current instruments used for diagnosis of hepatitis | |
| Prince et al. | The etiology of chronic active hepatitis in Korea. | |
| Leon et al. | Diagnostic tools in the evaluation of patients with viral hepatitis undergoing liver transplantation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |