DK160547B - Fremgangsmaade til fremstilling af carboxylsyreamidgruppe-holdige forbindelser, isaer peptider - Google Patents

Description

DK 160547 B

Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af carboxylsyreamidgruppe-holdige forbindelse, især peptider. Fremgangsmåden er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del angivne.

5 Til fremstillingen af carboxylsyreamid- og peptidbin dinger kendes et stort antal fremgangsmåde, jvf. f.eks. Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, bind XV, del II, s. 1-364 samt Angew. Chemie 92, 129 (1980). Alle disse fremgangsmåder sigter med forskelligt resultat på tilvejβίο bringelse af de til syntese af peptider nødvendige kriterier for racemiseringsfriheden, den enkle og skånende gennemførlighed ved høje udbytter og med let tilgængelige, såvidt muligt ufarlige udgangsmaterialer.

Fra EP-A-14.834 (som svarer til DK patentansøgning 15 nr. 209/80) kendes en fremgangsmåde til fremstilling af carboxylsyreamider og peptider, der er karakteriseret ved, at forbindelser, der indeholder en fri arainogruppe, i nærværelse af anhydrider af alkanphosphonsyrer omsættes med forbindelser, der indeholder en fri carboxylgruppe.

20 Det har nu vist sig, at carboxylsyreamidgruppeholdige forbindelser, især oligopeptider, under milde betingelser kan fremstilles i godt udbytte ved, at forbindelser, der indeholder en fri aminogruppe, især aminocarboxylsyrederivater eller peptider, hvis carboxylgruppe er beskyttet, i 25 nærværelse af anhydridet af en dialkylphosphinsyre omsættes med forbindelser, der indeholder en fri carboxylgruppe, især aminocarboxyl syrer eller peptider, hvis aminogruppe er acy leret.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen udgør en ny metode 30 til at optimere de i indledningen nævnte betingelser til en økonomisk syntese af peptider og amider.

Anhydridbindingen i de pyrophosphonsyrer, der formodentlig optræder som mellemprodukter ved fremgangsmåden ifølge EP-A-14.534, er meget reaktionstræg. Den spaltes 35 først ved kogning i vandig opløsning (jf. Houben-Weyl, bind XII/lf side 608, afsnit B), medens phosphinsyreanhydriderne (jf. Houben-Weyl, bind VII/1, side 266, næstsidste sætning

DK 160547 B

2 af afsnit g) hydrolyseres i løbet af relativt kort tid til de frie phosphinsyrer. De fra EP-A-14.834 kendte kondensationsmidler hydrolyseres ligeledes meget hurtigt med vand under dannelse af oligo- og pyrophosphonsyrer, således at 5 koblingen skal gennemføres under udelukkelse af vand.

Det er derfor meget overraskende og kunne ikke udledes af den kendte teknik, at fremgangsmåden ifølge opfindelsen ikke blot kan gennemføres i vandfrie indifferente opløsningsmidler, men også i blandinger af vand og et med vand bland-10 bart organisk opløsningsmiddel, selvom reaktionen formelt forløber under fraspaltning af vand, og dialkylphosphinsyre-anhydriderne som bekendt hydrolyseres relativt let. Udbytterne er gode, uafhængigt af reaktionsmediet, og racemiserings-graden er ringe.

15 De til beskyttelsen af de funktionelle grupper ind førte grupper kan i tilfælde, hvor der syntetiseres peptider, derefter fraspaltes på gængs måde.

Ved anhydrider af dialkylphosphinsyrer forstås forbindelser med formlen 20 R R

I I

O = P-O-P = O (I) i i

R R

25 hvori R betyder alkyl. De i formlen viste substituenter R kan være ens eller forskellige. Der foretrækkes anhydrider, hvorved de to phosphoratomer er ens substitueret.

Særligt egnede ifølge opfindelsen er anhydrider med formlen (I) , hvori R hver gang betyder lavere alkyl, for-30 trinsvis med 1-4 carbonatomer.

De ifølge opfindelsen anvendte dialkylphosphinsyrean-hydrider er farveløse væsker. De er stabile ved stuetemperatur og kan destilleres uden sønderdeling ved formindsket tryk. De er let opløselige i de fleste ikke vandige opløs-35 ningsmidler, især i lipid-opløsningsmidler, f.eks. chloroform eller methylenchlorid, men også i polære opløsningsmidler,

DK 160547 B

3 f.eks. DMF og DMA.

Som eksempler på anhydrider af dialkylphosphinsyreme skal nævnes methylethylphosphinsyreanhydrid, methylpropyl-phosphinsyreanhydrid, methylbutylphosphinsyreanhydrid, di-5 ethylphosphinsyreanhydrid, di-n-propylphosphinsyreanhydrid og di-n-butylphosphinsyreanhydrid.

Fremstillingen af dialkylphosphinsyreanhydriderne kan ske på i og for sig kendt måde, eksempelvis ved omsætning af dialkylphosphinsyrechloriderne med dialkylphosphinsyreal-10 kylestere ved 150-160°C, jvf. Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, G. Thieme Veri., Stuttgart 1963, bind XII, s. 266 ff. Der foretrækkes især fremgangsmåder, hvorved dialkylphosphinsyrer, deres salte eller estere omsættes med phosgen, jvf. DE-B 2.129.583 og DE-A 2.225.545.

15 Omsætningen ifølge opfindelsen gennemføres fortrinsvis i neutralt eller svagt alkalisk medium. Det er lettest at indstille pH-værdien i mediet ved tilsætning af aliphatiske eller cycloaliphatiske, tertiære baser, f.eks. N-methylmor-pholin, N-ethylmorpholin eller trialkylaminer med indtil 6 20 carbonatomer pr. alkylgruppe. Når der arbejdes i blandet vandigt system kan der i stedet for de organiske baser også anvendes som buffersystemer virkende alkaliske salte, f.eks. salte af kulsyre eller phosphorsyre.

Til fremstillingen af oligopeptider ved fremgangsmåden 25 ifølge opfindelsen anvendes der som udgangsmaterialer på den ene side en aminosyre eller et peptid med en blokeret carboxygruppe og på den anden side en aminosyre eller et peptid med en blokeret aminogruppe.

Til beskyttelsen af carboxygrupperne kan alle i pep-30 tidsyntesen gængse beskyttelsesgrupper anvendes. Især egner sig estere af ligekædede eller forgrenede, aliphatiske alkoholer, såsom methanol, ethanol og tert.butanol. Også estere af araliphatiske alkoholer, såsom benzylalkohol eller diphe-nylmethylcarbinol, kan finde anvendelse.

35 Til beskyttelsen af aminogrupperne kan ligeledes tjene alle i peptidsyntesen gængse beskyttelsesgrupper. Som

DK 160547 B

4 særligt egnede skal eksempelvis nævnes carbobenzoxygruppen og carbo-tert.butyloxygruppen.

Som opløsningsmiddel kan alle i peptidsyntesen gængse, vandfri, indifferente opløsningsmidler, f.eks. methylenchlo-5 rid, chloroform, dimethylformamid, dimethylacetamid, dioxan eller tetrahydrofuran, finde anvendelse.

Syntesen lader sig også gennemføre i blandet vandige opløsningsmiddel-systemer. Herved forstås blandinger af vand og et med vand blandbart, organisk opløsningsmiddel, f.eks.

10 dioxan/vand, tetrahydrofuran/vand eller dimethylformamid/-vand. Anvendelsen af sådanne systemer er især fordelagtig ved sammenknytningen af overvejende vandopløselige peptider.

Reaktionen forløber som regel tilstrækkelig hurtigt ved stuetemperatur. Let opvarmning skader ikke. Højere tempe-15 raturer, dvs. over 50°C, kan især ved peptidsyntesen på grund af racemiseringsrisiko ikke anbefales.

Dialkylphosphinsyreanhydriderne ifølge opfindelsen anvendes fortrinsvis i overskud, fra ca. 2 til ca. 2,5 mol dialkylphosphinsyreanhydrid pr. mol peptidbinding, der skal 20 dannes. De kan som sådanne dryppes ufortyndet til reaktionsblandingen.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen viser i forhold til de for tiden gængse en række fordele.

Dialkylphosphinsyreanhydriderne giver efter syntesen 25 ingen tungtopløselige biprodukter, en fordel der udmærker fremgangsmåden ifølge opfindelsen i forhold til den for tiden hyppigt anvendte peptidsammenknytning under anvendelse af dicyclohexylcarbodiimid.

Dialkylphosphinsyreanhydriderne er lettere tilgænge-30 lige og også lettere at håndtere end de fleste til dette formål gængse, racemiseringsfattige reagenser.

I forhold til de hidtil beskrevne fremgangsmåder til peptidsyntese under anvendelse af aktiveringsmidler på basis af tri- eller pentavalent phosphor, eksempelvis peptidsynte-35 sen efter phosphorazometoden, jvf. Liebigs Ann. Chem. 580, s. 68, syntesemetoderne under anvendelse af diethylchlorphos-

DK 160547 B

5 phit eller tetraethylpyrophosphit, jvf. J. Am. Chem. Soc. 74, 5304 (1952) og J. Am. Chem. Soc. 74, 5307 og 5309 (1952), og syntesemetoden under anvendelse af polyphosphorsyreestere, jvf. Ber. 91, (1958) s. 1073-1082, har fremgangsmåden ifølge 5 opfindelsen fordelen ved den ringere racemisering.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er enkel at gennemføre og giver peptider med høj optisk renhed og i højt udbytte. Desuden er den økonomisk og miljøvenlig.

Dialkylphosphinsyreanhydriderne er lavmolekylære, 10 lette at få og at rense og viser en høj andel af reaktive grupper pr. vægtenhed samt en god lipophilitet. Dialkylphos-phinsyreanhydriderne og de tilhørende dialkylphosphinsyrer er lipidopløselige. Dette muliggør en oparbejdning af vandopløselige peptidderivater via et første fældningstrin med 15 egnede lipid-opløsningsmidler.

De ud fra dialkylphosphinsyreanhydridet i løbet af peptidsyntesen fremkomne dialkylphosphinsyrer kan genvindes ud fra restopløsningerne fra syntesereaktionen. En genvinding af dialkylphosphinsyrerne fra en større mængde vandig synte-20 se-moderlud kan ske ved ekstraktion med opløsningsmidler, såsom chloroform og isobutanol, og efterfølgende destillativ oparbejdning. Herved er det af særlig teknisk interesse, at dialkylphosphinsyrerne kan destilleres i vakuum uden sønderdeling. De således udvundne, genoparbejdede dialkylphosphin-25 syrer kan dernæst let overføres ved fremgangsmåden i DE-A 2.225.545 til de tilsvarende dialkylphosphinsyreanhydrider.

Ved den beskrevne blandet vandige arbejdsgang kan de organiske baser erstattes af i vandig opløsning alkalisk reagerende salte af kulsyre eller phosphorsyre, hvilket 30 forenkler den tidligere beskrevne genoparbejdning af dialkylphosphinsyrerne efter syntesen. I dette tilfælde kan der renonceres på ekstraktionstrinnet. Dialkylphosphinsyrerne kan derpå efter frigøring direkte destilleres fra den afdara-pede syntese-moderlud.

35 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres i de følgende eksempler. I disse eksempler er betydningen af de

DK 160547 B

6 anvendte forkortelser følgende: Phe = phenyl, Boc = tert.bu-tyloxycarbonyl, Z = carboxybenzoxy, Et = ethyl, Bu*- = tert.-butyl, Gly = glycin, Val = valin, Tyr = tyrosin, His = histi-din, Pro = prolin, Ala = alanin, Lys = lysin, Asp = aspara-5 ginsyre, Thr = threonin, Arg = arginin, Trp = tryptophan,

Phg = phenylglycin.

Eksempel 1 Z-Gly-Gly-OEt.

10 Til en opløsning af 10,5 g (0,05 mol) carbobenzoxy- glycin i 20 ml dimethylformamid sættes der under omrøring og god afkøling i rækkefølge ved 0°C 7,0 g (0,05 mol) H-Gly-0C2H5.HC1, 15 ml N-ethylmorpholin og 20 g methylethylphosphinsyre-anhydrid. Der opvarmes under yderligere omrøring til 15 stuetemperatur. Efter 16 timers henstand ved stuetemperatur afdestilleres opløsningsmidlet ved stuetemperatur i vakuum, og remanensen optages i en blanding af 200 ml eddikesyreester og 100 ml 5%'s kaliumbisulfat-opløsning. Eddikesyreester-opløsningen vaskes yderligere to gange 20 med 100 ml mættet natriumbicarbonat, tørres over natriumsulfat og afdampes i vakuum.

Udbytte: 12,0 g, svarende til 81% af det teoretiske, Z-dipeptidester med et smeltepunkt på 80°C.

25 Eksempel 2 Z-Val-Tyr (But)-His-OCH3

Til en suspension af 11,5 g H-His-OCH^.HC1 i 100 ml dimethylformamid sættes der i rækkefølge ved 0°C under omrøring 30 ml N-ethylmorpholin, 21,5 g 30 Z-Val-Tyr (But)-OH og 20 g methylethylphosphinsyrean-hydrid. Den efter hendøen af den eksoterme reaktion praktisk taget klare reaktionsopløsning henstår natten over ved stuetemperatur. Derpå afdampes opløsningen i vakuum ved stuetemperatur, og der sættes en blanding af 35 100 ml mættet natriumhydrogencarbonat og 200 ml eddike- syreethylester til remanensen. Råproduktet overføres un-

O

DK 160547 B

7 der rystning til eddikesyreester-fasen. Denne vaskes med lidt vand, tørres over natriumsulfat og bringes til tørhed i vakuum. Den i remanensen tilbageblivende Z-tripep-tidester størkner ved digerering med diethylether.

5 Udbytte: 21 g med smeltepunkt 188-190°C, [α]β: 8,2° (c=l,DMF).

Fra moderluden kan der ved afdampning af opløsningsmidlet og udfældning på ny fra eddikesyreethyles-ter/diethylether udvindes yderligere 2,5 g peptid.

10 Samlet udbytte: 76% af det teoretiske.

Eksempel 3 Z-Pro-Ala-Lys(Boc)-Phe-NH2 19,1 g (0,044 mol) Η-Lys(Boc)-Phe-NE^.HCl opløses 15 i 100 ml dimethylformamid, og der tilsættes ved 0°C under omrøring 26 ml N-ethylmorpholin, 16,0 g (0,005 mol) Z-Pro-—Ala—OH og 17,5 g methylethylphosphinsyreanhydrid. Reaktionsblandingen henstår i 48 timer ved stuetemperatur og bringes derpå til tørhed i vakuum. Remanensen digereres 20 med 100 ml 2 N sodaopløsning, 100 ml 10%'s vandig citronsyre og 100 ml destilleret vand og tørres i vakuum over phosphorpentaoxid.

Udbytte: 30,4 g, svarende til 89% af det teoretiske, smeltepunkt: 163°C, [a]^: 27° (c=l,DMF) 25

Eksempel 4 Z-Asp (OBut)-Phe-NH^ 1,6 g (0,01 mol) H-Phe-N^ opløses sammen med 28 ml N-ethylmorpholin ved 0°C i 20 ml dimethylformamid.

30 Til denne opløsning sættes der under afkøling og omrøring 3,23 g (0,01 mol) Z-Asp (OBut)OH og :4 g methylethyl-phosphinsyreanhydrid. Den således fremstillede reaktionsopløsning henstår natten over ved stuetemperatur og oparbejdes derpå på gængs måde ved ekstraktion i eddikesy-35 reester, vask med vand, vandig natriumcarbonat og 5%'s 1 j

O

DK 160547 B

8 vandig kaliumhydrogensulfat, inddampning af den over natriumsulfat tørrede eddikesyreester-opløsning og fældning af slutproduktet med diethylether.

Udbytte: 4,0 g, svarende til 85% af det teoretiske, 5 smeltepunkt: 162 °C, [a]D:-33,l° (c=l, CH^OH).

Eksempel 5 Z-Gly-Thr (Bu1') -Phe-OCH3 I 120 ml dimethylsulfoxid (p.A.Merck) opløses der 10 i rækkefølge 18,6 g (0,05 mol) H-Thr(Bufc)-Phe-0CH3.HC1, 30 ml (0,238 mol) N-ethylmorpholin og 10,4 g (0,05 mol) Z-Gly-OH. Derpå tilsættes der portionsvis under isafkøling og fugtighedsudelukkelse 4 g methylethylphosphinsy-reanhydrid under omrøring. Der omrøres i yderligere 24 15 timer ved stuetemperatur, hvorpå reaktionsopløsningen hældes i 500 ml mættet natriumcarbonat. Herved udfældes reaktionsproduktet. Der dekanteres fra den overstående opløsning, og fældningen optages i eddikesyreethylester. Eddikesyreester-opløsningen vaskes med vand, tørres over 20 magnesiumsulfat og inddampes i udstrakt grad i vakuum, og slutproduktet udfældes med petroleumsether. Det krystalliserer natten over ved 4°C.

Udbytte: 18,0 g, svarende til 75% af det teoretiske, smeltepunkt: 95°C, [a]D: +26° (c=l,DMF) .

25

Eksempel 6 Z-Phe-cyclohexylamid 30 g (0,01 mol) Z-Phe-OH, 1,0 g (0,01 mol, 1,2 ml) cyclohexylamin og 5 ml N-ethylmorpholin opløses i 30 ml 30 DMF, og der tilsættes under isafkøling og omrøring 4 g methylethylphosphinsyreanhydrid. Efter hendøen af den ek-soterme reaktion (temperaturstigning til 10°C) opvarmes opløsningen under omrøring til stuetemperatur, hvorpå reaktionsblandingen oparbejdes som beskrevet under eksempel 35 1.

O

DK 160547 B

9

Udbytte: 3,3 g, svarende til 85% af det teoretiske, smeltepunkt: 167°C, [a]-2,8° (c=l,DMF).

Eksempel 7 5 Z-Phe-Arg-Trp-Gly-OCH3 2,26 g (0,005 mol) Z-Phe-Arg-OH og 1,55 g (0,005 mol) H-Trp-Gly-OCH^.HCl opløses under tilsætning af 5 ml N-ethylmorpholin ved 0°C i 10 ml dimethylformamid. Derpå tildryppes der under omrøring ved denne temperatur 10 2 g methylethylphosphinsyreanhydrid. Der omrøres i yder ligere 1 time ved stuetemperatur, og blandingen henstår i 20 timer ved stuetemperatur. Efter afdestillation af dimethylformamidet i vakuum ved stuetemperatur digere-res remanensen med 30 ml mættet natriumcarbonat, og det 15 således fremkomne faste stof tørres i vakuum over

Udbytte: 3,0 g, svarende til 90% af det teoretiske, [a]D: -28° (c=l,DMF).

Eksempel 8 20 H-Phe-Arg-Trp-Gly-OCH3.2HC1 3 g carbobenzoxy-tetrapeptid opløses i 200 ml methanol, luften i reaktionskarret fortrænges med nitrogen, og der tilsættes 1 g 10% Pd/bariumsulfat-katalysator. Der hydrogeneres på gængs måde under omrøring og gennemledning 25 af hydrogen. pH-værdien i reaktionsopløsningen, der be stemmes ved elektrometrisk måling, holdes ved tilsætning af 1 N methanolisk saltsyre på 4,0. Den hydrogenerende fraspaltning af carbobenzoxygruppen er afsluttet efter

2,5 timer, hvilket kan fastslås ved forbruget af 1 N

qn methanolisk saltsyre og ved ophøret af CC^-udviklingen.

Derpå fortrænges hydrogenet i reaktionskarret med nitrogen, og der skilles fra katalysatoren ved sugning under nitrogen. Opløsningen bringes i vakuum ved stuetemperatur til tørhed, og remanensen digereres med ab-35 solut diethylether.

DK 160547 B

10 o

Udbytte efter tørring i højvakuum: 2,5 g (praktisk taget kvantitativt), [a]D: +5,5° (c=l, iseddike).

5 Eksempel 8a

Bestemmelse af racemiseringsgraden med højtryks-væskechromatografi.

På separationskolonnen af en væskechromatograf

R

(søjlemål: 0,4 x 25 cm, søjlefyldning: Spherosil XOA R

10 600 Normatom 5 pn), der er ækvilibreret med opløsnings middel-blandingen chloroform/methanol/vand/myresyre/am-moniumformiat (900:400:30:7:2,5), sættes der 25 p 1 af en 0,4%'s opløsning af peptidderivatet fra eksempel 8, hvorpå søjlechromatogrammet udvikles ved pumpning af det nævn-15 te opløsningsmiddel gennem søjlen med en gennemstrømning shastighed på 2 ml/minut ved et tryk på 141 bar. De på søjlen adskilte diastereomere peptider bestemmes kvantitativt i gennemstrømningsfotometer ved deres absorption ved 280 nm. D-Arg-diastereomeren af det frem-20 stillede tetrapeptidester-hydrogenchlorid elueres ved de nævnte betingelser ca. 10 minutter efter påbegyndelsen af søjleadskillelsen, L-diastereomeren viser sig efter ca. 15 minutter. Mængden af D-Arg-diastereomeren udgør 2% af det påsatte tetrapeptidester-hydrogenchlo- 25 rid.

Eksempel 9 Z-Trp-Gly-OCH3

Til en blanding af 3,35 g (0,05 mol) Z-Trp-OH og 30 1,25 g H-Gly-OMe.HCl i 15 ml dioxan/vand (1:1) sættes der ved 0°C under omrøring 6,5 ml N-ethylmorpholin. Til den fremkomne opløsning dryppes der ved den angivne temperatur under omrøring 4 g methylethylphosphinsyre-anhydrid. Blandingen henstår i 10 timer ved stuetempe-35 ratur, hvorpå opløsningsmidlet afdestilleres i vakuum ved

DK 160547 B

11 o stuetemperatur. Remanensen optages i en blanding af 25 ml vand og 70 ml eddikesyreester. Eddikesyreester-ekstraktet skilles fra, og den vandige opløsning ekstraheres endnu to gang med hver gang 10 ml eddikesyreester. Derefter 5 vaskes de samlede eddikesyreester-ekstrakter to gange med hver gang 7 ml vand, 5%'s kaliumsulfat (indtil sur reaktion) og med mættet natriumhydrogencarbonat (indtil svag alkalisk reaktion). Efter tørring over magnesiumsulfat og klaring med aktivt kul afdestilleres opløsnings-10 midlet i udstrakt grad i vakuum, og remanensen digereres med diisopropylether.

Udbytte efter tørring i vakuum over phosphorpen-taoxid: 2,86 g, svarende til 70% af det teoretiske, farveløse krystaller med smeltepunkt 157°C, [α]β: -12,5° 15 (c=l, iseddike).

Eksempel 10 Z-Trp-Gly-OCH^

Til en suspension af 3,35 g (0,01 mol) Z-Trp-OH 20 og 1,25 g (0,01 mol) H-Gly-OCH3 i 15 ml dimethylformamid sættes der ved 0°C portionsvis i alt 7 ml vand og derefter 5,1 g fint pulveriseret natriumbicarbonat. Suspensionen klares i udstrakt grad ved tildrypning af 4 ml methylethylphosphinsyreanhydrid. En med vand fortyndet 25 prøve af reaktionsopløsningen reagerer neutralt. Efter opvarmning til stuetemperatur efteromrøres der natten over, hvorpå opløsningsmidlet afdestilleres i højvakuum ved stuetemperatur. Remanensen optages i en blanding af 25 ml vand og 70 ml eddikesyreester, eddikesyreester-30 -ekstraktet skilles fra, og den vandige fase ekstraheres endnu to gange med hver gang 10 ml eddikesyreester. Derefter vaskes de samlede eddikesyreester-ekstrakter to gange med hver gang 7 ml vand, 5%'s kaliumbisulfat (indtil sur reaktion) og med mættet natriumbicarbonat (ind-35 til svag alkalisk reaktion). Efter tørring over magne- 12

DK 160547 B

O

siumsulfat afdestilleres eddikesyreester-opløsningen i udstrakt grad i vakuum, og remanensen digereres med diisopropylether.

Udbytte efter tørring i vakuum over phosphorpen-5 taoxid: 3,0 g, svarende til 73% af det teoretiske, smeltepunkt: 157°C, [α]β: -12,9° (c=l, iseddike).

Eksempel 11 Z-Trp-Gly-OCH3 10 Til en blanding af 3,35 g (0,01 mol) Z-Trp-OH, 1,25 g (0,01 mol) H-Gly-OCH^.HC1 og 15 ml dimethylform-amid sættes der under omrøring ved 0°C en opløsning af 7,0 g K^PO^.^O i 8 ml vand. Derpå tildryppes der under yderligere omrøring 4,0 ml methylethylphosphinsyreanhy-15 drid, hvorefter der under omrøring opvarmes til stuetemperatur. Efter 24 timers omrøring ved stuetemperatur af-destilleres opløsningsmidlet i vakuum ved stuetemperatur. Remanensen optages i en blanding af 25 ml vand og 80 ml eddikesyreethylester, den tilbageblivende vand-20 fase ekstraheres yderligere én gang med 20 ml eddikesyreester, og de samlede eddikesyreester-ekstrakter udrys-tes to gange med hver gang 8 ml 5%'s kaliumbisulfat og mættet natriumbicarbonat. Efter tørring af eddikesyre-ester-opløsningen med natriumsulfat isoleres produktet 25 ved afdampning af opløsningsmidlet og digerering af remanensen med lavtkogende petroleumsether (kogepunkt: 40-80°C).

Udbytte efter tørring i højvakuum over phosphor-pentaoxid: 3,0 g, svarende til 73% af det teoretiske, 30 smeltepunkt: 157°C, [a]D: -12,9° (c=2, iseddike).

35

O

DK 160547 B

13

Eksempel 12 Z-Phe-Gly-OEt

Til en opløsning af 3,0 g Z-Phe-OH, 1,4 g H-Gly-OEt,-HC1 og 6 ml N-ethylmorpholin i 15 ml dimethylformamid sættes 5 der dråbevis under omrøring ved -4 til 0°C 4,0 g methyl-ethylphosphinsyreanhydrid. Der henstilles derefter 16 timer ved stuetemperatur, og derefter afdestilleres opløsningsmidlet vidtgående i vakuum ved stuetemperatur. Efter optagelse af remanensen i en blanding af eddikesyreethylester og mæt-10 tet natriumhydrogencarbonatopløsning vaskes eddikeesterop-løsningen yderligere 2 gange med 30 ml natriumhydrogencar-bonatopløsning og 2 gange med 30 ml 5%'s kaliumhydrogensul-fatopløsning. Reaktionsproduktet krystalliserer ved inddamp-ning af eddikeesteropløsningen. Det digereres med en blan-15 ding af diethylether og n-hexan i forholdet 1:1, fraskilles ved sugning og tørres i vakuum over phosphorpentoxid.

Udbytte: 3,26 g (85% af det teoretiske), smp.: 112°C.

[a3D = +17,1° (c = 1, ethanol).

20 Eksempel 13 Z-Ala-Thr(But)-Phe-OCH3 4,0 ml methylpropylphosphinsyreanhydrid sættes dråbevis ved 0°C under omrøring til en opløsning af 2,23 g (0,01 mol) Z-Ala-OH, 3,72 g H-Thr(Bu1)-Phe-OCH3,HC1 og 6,5 ml N-25 -ethylmorpholin i 25 ml dimethylformamid. Derefter opvarmes der under omrøring til stuetemperatur, og reaktionsopløsningen inddampes vidtgående ved stuetemperatur efter henstand natten over i vakuum. Reaktionsproduktet ekstraheres efter tilsætning af 30 ml vand med 200 ml eddikeester. Eddikeester-30 opløsningen vaskes successivt med mættet natriumhydrogencar-bonatopløsning og 5%'s kaliumhydrogensulfatopløsning, tørres derefter over natriumsulfat og inddampes til 15 ml i vakuum. Titelforbindelsen fås som et farveløst fast stof efter tilsætning af 30 ml ether og 250 ml letkogende petroleumsether.

35 Udbytte: 4,34 g (80% af det teoretiske), smp. 137-138°C.

[a]D = +21,9° (c = 1, dimethylformamid).

O

14

DK 160547 B

Eksempel 14

Boc-Ala-Pro-OBzl

Til en opløsning af 18,9 g Boc-alanin, 24,1 g prolin-benzylester-hydrochlorid og 65 ml N-ethylmorpholin i 100 ml 5 dimethylformamid sættes der dråbevis ved -4 til 0°C under omrøring 40 g methylethylphosphinsyreanhydrid. Derefter opvarmes der til stuetemperatur, og efter 20 timers henstand ved stuetemperatur inddampes der i vakuum ved maksimalt 30°C. Remanensen optages i en blanding af eddikeester og natrium-10 hydrogencarbonatopløsning, hydrogencarbonatfasen ekstraheres flere gange med frisk eddikeester, og de forenede eddikeester-ekstrakter vaskes med 5%'s kaliumhydrogensulfatopløsning.

Efter tørring af eddikeesteropløsningen over natriumsulfat og inddampning i vakuum fås slutproduktet som en svagt gul, 15 tyndtlagschromatografisk ensartet olie.

Udbytte: 74,2 g (91% af det teoretiske).

Eksempel 15 H-Ala-Pro-OBzl,HC1 20 18,8 g af det ovenfor beskrevne Boc-Ala-Pro-OBzl op løses i 200 ml af en 4N opløsning af HC1 i dioxan. Opløsningen omrøres i 30 minutter ved stuetemperatur, og derefter af-destilleres opløsningsmidlet i vakuum ved stuetemperatur. Den faste remanens digereres med absolut diethylether, og det 25 farveløse hygroskopiske pulver tørres i vakuum over phos-phorpentoxid.

Udbytte: 12,9 g (83% af det teoretiske), smp.: 163°C.

[a]D = -83°C (c = 1, methanol).

30 Eksempel 16 Z-Trp-Leu-Pro-Phg-OBut

Til en opløsning af 4,52 g (0,01 mol) Z-Trp-Leu-OH, 3,41 g (0,01 mol) H-Pro-Phg-OBu*",HC1 og 6,5 ml N-ethylmorpholin i 15 ml dimethylformamid sættes dråbevis ved +4°C under 35 omrøring 4,0 ml methyl-n-propylphosphinsyreanhydrid. Der opvarmes under omrøring til stuetemperatur og henstilles i 24 15

DK 160547 B

O

timer ved denne temperatur. Efter afdampning af opløsningsmidlet i vakuum ved stuetemperatur optages remanensen i en blanding af 200 ml eddikeester og 40 ml mættet natriumhydrogen-carbonatopløsning. Den vandige fase ekstraheres endnu en gang 5 med eddikeester og de forenede eddikeesteropløsninger vaskes successivt med mættet natriumhydrogencarbonatopløsning, 5%'s kaliumhydrogensulfatopløsning og vand. Efter tørring af eddikees teropløsningen over magnesiumsulfat og afdampning af opløsningsmidlet i vakuum fås der et delvis krystallinsk 10 råprodukt.

Ved omkrystallisation fra isopropanol/vand fås 6,4 g (88% af det teoretiske udbytte) af tetrapeptidderivatet med smp. 127°C og [a]^ = -20,0°(c = 1, dimethylformamid).

15 20 25 30 35

Claims (3)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af carboxylsyre-amidgruppe-holdige forbindelser, især peptider, kendetegnet ved, at forbindelser, der indeholder 5 en carboxygruppe, i nærvær af dialkylphosphinsyreanhy-drider omsættes med forbindelser, der indeholder en fri aminogruppe, og eventuelt til beskyttelse af andre funktionelle grupper indførte grupper fraspaltes.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg- 10 net ved, at reaktionen gennemføres i blandet vandigt medium.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at reaktionsmediet buffes med alkalimetalsalte af kulsyre og/eller phosphorsyre. 15 20 25 30 35