DK156113B - Fremgangsmaade til deling af haemoglobin i et haem-complex og globin - Google Patents

Description

DK 156113 B

Den foreliggende opfindelse angâr en fremgangsmâde til deling af blodets hæmoglobin i hæm og globin ved at suspendere blodlegemer, som er skilt fra blodet, i en sur oplosning, i hvilken hæmoglobinet hydrolyseres til hæm og globin, udfælde hæm'et og udskille bundfaldet 5 fra den vandige oplosning af globin.

Det er kendt, at blod indeholder jem, og hovedparten af dette jem findes i form af jem-protoporphyrin i hæmoglobin. Nâr plasmaet skilles fra blodet, forbliver ca. 80% af det samlede proteinindhold i blodet i blodlegemefraktionen. Blodlegemefraktionen indeholder ca.

10 38% râprotein, og hæmoglobinet udgor ca. 80% af torstoffet af dette râprotein hos kvæg og ca. 87% hos svin. Hæmoglobin indeholder ca. 6% hæm, der for sin del indeholder ca. 9% jern, og de resterende 94% er globin. Interessen for jern fra organisk hæm er blevet stærkt fore-get, eftersom det i forskellige undersegelser har vist sig at blive 15 bedre absorberet i tarmene end uorganiske jernforbindelser. Endvidere har visse uorganiske jernforbindelser vist sig at hâve skadelige virkninger. Som folge af den stærke farve, lugt og smag af blodlegemefraktionen og dens forgængelighed er dens anvendelse som medicinsk jerntilskud udelukket.

20 Hæm er tidligere blevet adskilt fra globin i laboratoriemâlestok chromatografisk eller ved ekstraktion, i hvilket tilfælde der er blevet anvendt methylethylketon, acetone og dimethylformamid som oplasningsmiddel.

Anvendelsen af oplosningsmiddelmetoder i industriel mâlestok medforer 25 betydelige omkostninger i forbindelse med oplosningsmidler og regene-rering deraf.

Desuden er de anvendte oplosningsmidler brandfarlige, og fjernelsen af oplasningsmiddelrester fra slutprodukterne har vist sig at være vanskelig, hvis slutprodukterne skal anvendes til foder eller 30 lægemidler.

I svensk offentliggorelsesskrift nr. 7.407.882-5 beskrives en frem-gangsmàde til udskillelse af hæm fra globin, ved hvilken en sur hæmoglobinoplesning afkoles, og der tilsættes en stor mængde éthanol i to trin for at udfælde globinet, hvorefter det skilles fra ved 35 centrifugering. Denne fremgangsmâde har ogsâ en ulempe, fordi det er

DK 156113 B

nodvendigt at anvende store mængder af oplosningsmidlet, som til syvende og sidst skal fjernes fra slutproduktet. Endvidere mà arbej-det udfares ved lav temperatur, hvilket forer til betydelige yderli-gere udgifter.

5 Det er tillige kendt at adskille blodets globin fra hæm chromatogra-fisk ved hjælp af carboxymethylcellulose. Ved denne fremgangsmâde fores den hæmolyserede og syrehydrolyserede blodlegemefraktion gennem en ioribyttersojle fyldt med carboxymethylcellulose, hvorved hæm'et adsorberes til carboxymethylcellulose. Imidlertid er de mængder hæm, 10 som kan skilles fra globinet pâ denne mâde, sâ smâ, at denne fremgangsmâde ikke er anvendelig i industriel mâlestok.

Den foreliggende opfindelse angâr en fremgangsmâde til deling af blodets hæmoglobin i hæm og globin, ved hvilken de ovennævnte ulemper er blevet elimineret, og ved hvilken det vundne slutprodukt er et 15 hæm-holdigt produkt, der som sâdant kan anvendes som râmateriale til fremstilling af medicinske jerntilskud, og et globinprotein, der kan anvendes som en foderbestanddel uden de ulemper, der forârsages af oplosningsmidler.

Opfindelsens hovedkarakteristika er angivet i krav 1.

20 Ifolge opfindelsen hæmolyseres den blodlegemefraktion, som udskilles fra plasmaet, ved at blive fortyndet med vand, og den syrehydroly-seres ved at indstille dens pH-værdi til under 3 for at bryde bindin-gerne mellem globinet og hæm'et. Derefter udfældes hæm'et fra den sure vandige oplosning ved at tilsætte det en vandig oplosning af 25 carboxymethylcellulose (CMC), fordelagtigt i en sâdan mængde, at vægtforholdet CMC/globin minimalt er 1:10, men fortrinsvis maksimalt er 1:1000. Det jern, som er indeholdt i hæm'et, danner i dette tilfælde sandsynligvis en complex binding med carboxylgrupperne i CMC, der fuldstændigt protoniseres i det pH-omrâde, som anvendes 30 ifolge opfindelsen. Det udfældede hæm-CMC-complex skilles slutteligt fra globinproteinoplosningen ved hjælp af fx centrifugering.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstâende eksempler.

EKSEMPEL 1 3

DK 156113 B

En hæmoglobinholdig blodlegemefraktion, som er skilt fra plasmaet, fortyndes med en mængde vand, der er mindst det dobbelte af vægten af blodlegemefraktionen, og den vundne oplesnings pH-værdi indstilles 5 til en sà lav værdi ved tilsætning af 0,1 M HCl, at den vandige oplesnings pH-værdi forbliver under 3, nâr der til oplesningen sættes en vandig oplesning af CMC. Der tilsættes en vandig oplesning af carboxymethylcellulose i en sâdan mængde, at vægtforholdet mellem carboxymethylcellulose og globinprotein i den vandige oplesning er 10 ca. 1:10. Det dannede bundfald udskilles fra oplesningen ved centri-fugering (8000 x g i 15 minutter). Bundfaldet indeholder 1,8% jern, og den lyse oplesning indeholder hejst 0,07% jern beregnet ud fra vægten af terstoffet.

EKSEMPEL 2 15 Hæmoglobinholdige blodlegemer skilt fra blodplasma opslæmmes i vand (vægtforhold 1:2). Oplesningens pH-værdi indstilles ved hjælp af 1 M saltsyre til 1,5, og en 5 gange sâ stor mængde af en 0,3%'s vandig oplesning af carboxymethylcellulose sættes til den sure vandige oplesning, idet vægtforholdet mellem CMC og globinprotein er 2:10 i 20 den vandige oplesning. Blandingen lades henstâ i 15 minutter, og det udfældede hæm-CMC-complex udskilles fra globinproteinoplesningen ved centrifugering i en halv time (8000 x g). Proteinfraktionen indeholder ca. 70% af de oprindelige globinproteiner, og mindre end 0,05 vægtprocent af terstoffet deri er jern.

25 EKSEMPEL 3

Blodlegemer skilt fra plasma fortyndes med vand (vægtforhold 1:3). Oplesningens pH-værdi indstilles ved hjælp af IM saltsyre til 1,5, og der tilsættes et 4 gange sâ stort volumen af en 0,3%'s vandig oplesning af carboxymethylcellulose, idet vægtforholdet mellem CMC og 30 globinprotein er 1,9:10. Blandingen lades henstâ i 15 minutter, og det udfældede hæm-CMC-complex udskilles fra globinproteinoplesningen ved centrifugering i en halv time (8000 x g). Proteinfraktionen inde-

Claims (4)

5 Oplasningens pH-værdi indstilles ved hjælp af en 1 M vandig oplesning af saltsyre til 1,5, og der tilsættes et 3 gange sâ stort volumen af en 0,35%'s vandig oplosning af CMC, idet vægtforholdet mellem CMC og globin er 1,7:10 i den vandige oplesning. Blandingen lades henstâ i 15 minutter, og det udfældede hæm-CMC-complex udskilles fra pro-10 teinoplesningen ved centrifugering i en halv time (8000 x g). Globinproteinfraktionen indeholder ca. 80% af de oprindelige pro-teiner, og kun ca. 0,07 vægtprocent af terstofindholdet er jern. EKSEMPEL 5 Blodlegemer skilt fra plasma fortyndes med vand (vægtforhold 1:5). 15 Oplesningens pH-værdi indstilles ved hjælp af en 1 M vandig oplesning af saltsyre til 1,4, og der tilsættes et 3 gange sâ stort volumen af en 0,06%'s vandig oplasning af CMC (substitutionsgrad mindst 1,1) i et forhold mellem CMC og protein pâ 1:75. Blandingen lades henstâ i 15 minutter, og det udfældede hæm-CMC-complex udskilles fra prote-20 inoplesningen ved centrifugering. Globinproteinfraktionen indeholder ca. 90% af de oprindelige proteiner og 10% af den oprindelige hæm-fraktion.

1. Fremgangsmâde til deling af blodets hæmoglobin i hæm og globin ved 25 at suspendere blodlegemer, der er skilt fra blodet, i en sur vandig oplosning, udfælde hæm'et og udskille bundfaldet fra den vandige oplesning af globin, kendetegnet ved, at carboxymethylcellulose sættes til den vandige oplesning for at udfælde hæm-CMC-complexet. DK 156113 B

2. Fremgangsmâde ifalge krav1, kendetegnet ved, at en vandig oplasning af carboxymeth-ylcellulose sættes til den sure vandige oplasning i en sâdan mængde, at vægtforholdet mellem CMC og globin ligger i omrâdet 1:1000-2:10.

3. Fremgangsmâde ifalge krav 1, kendetegnet ved, at en vandig oplasning af carboxymeth-ylcellulose sættes til den sure vandige oplasning i en sâdan mængde, at vægtforholdet mellem CMC og globin er mindst 1:10, fortrinsvis hajst 2:10.

4. Fremgangsmâde ifalge krav 1, 2 eller 3, kendetegnet ved, at den sure vandige oplasnings pH-værdi hoIdes pâ en maksimumværdi pâ 3 under udfældningen af hæm.