DK155967B - Fremgangsmaade samt kit til bestemmelse af antistoffer mod oploeselige antigener - Google Patents
Fremgangsmaade samt kit til bestemmelse af antistoffer mod oploeselige antigener Download PDFInfo
- Publication number
- DK155967B DK155967B DK196282A DK196282A DK155967B DK 155967 B DK155967 B DK 155967B DK 196282 A DK196282 A DK 196282A DK 196282 A DK196282 A DK 196282A DK 155967 B DK155967 B DK 155967B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- antigen
- process according
- reagent
- solid phase
- antibodies
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 59
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 59
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 59
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 29
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 18
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 13
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 9
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 9
- 125000001894 2,4,6-trinitrophenyl group Chemical group [H]C1=C(C(*)=C(C([H])=C1[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O)[N+]([O-])=O 0.000 claims description 7
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims description 7
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 7
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 2
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 claims 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 2
- 229940046528 grass pollen Drugs 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- HVGAOLHAWVNIQU-UFLZEWODSA-N 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoic acid;pyrrolidine-2,5-dione Chemical compound O=C1CCC(=O)N1.N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 HVGAOLHAWVNIQU-UFLZEWODSA-N 0.000 description 2
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- 229960004784 allergens Drugs 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J tetrasodium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
- G01N33/537—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody
- G01N33/538—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase with separation of immune complex from unbound antigen or antibody by sorbent column, particles or resin strip, i.e. sorbent materials
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds
Description
DK 155967 B
i
Opfindelsen angår en fremgangsmåde til bestemmelse af antistoffer mod opløselige antigener i en vandig prøve, navnlig i legemsvæsker, såsom blodserum eller blodplasma, ved hvilken fremgangsmåde prøven kontaktes med et antigen in vitro, hvorved antistoffer, hvis de er 5 til stede, bindes til antigenerne.
Opfindelsen angår ydermere et kit til bestemmelse og påvisning af antigenspecifikke antistoffer i en homogen, vandig opløsning, hvilket kit er egnet til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge 10 opfindelsen.
Ved medicin- og veterinærdiagnostik er der ofte behov for bestemmelse af antistoffer mod potentielle patogener i f.eks. blodserum, f.eks. mikroorganismer, toxiner, allergener eller andre antigener.
15 Disse antistoffer er proteiner med immunoglubolin (Ig) egenskaber, hvilket gør dem erkendelige med anti-Ig-reagenser. Disse anti-Ig-reagenser kan gøres påviselige ved konjugation med en radioaktiv isotop, et enzym, et fluoroscerende farvestof, o.s.v.
20 Sådanne anti-Ig-reagenser differentierer ikke mellem antistoffer bundet til et dertil passende antigen (d.v.s. antigen-antistof-kom-plekser) på den ene side og andre immunogluboliner (frit Ig) på den anden side. For antistofbestemmelser baseret på mærkede anti-Ig-reagenser er det derfor vigtigt at opnå en fysisk adskillelse mellem 25 antigen-antistof-komplekser og fri Ig. Når antigenet i sin native tilstand er væsentligt større end Ig, er antigen-antistofkomplekset også meget større end frit Ig. Et eksempel er analysen af ikke-aglutinerende antistoffer mod antigener på røde blodlegemer, hvor frie og bundne antistoffer kan separeres ved centrifugering.
30 I tilfælde med mindre antigener anvendes ofte kunstig forstørrelse af antigenet; vel etablerede procedurer er polymerisering af antigenet eller kobling af antigenet til et uopløseligt bæremateriale.
En elegant løsning er adsorptionen af antigenet til indersiden af et 35 reagensglas eller til overfladen af en plastkugle. I andre procedurer anvendes kemisk reaktive bærematerialer, f.eks. CNBr-aktiverede papirskiver, til hvilke antigenet kobles via en kovalent binding.
I beskrivelsen til hollandsk patentskrift nr. 162.209 omtales en 2
DK 155967 B
fremgangsmåde af den ovenfor nævnte type, hvor der anvendes et antigen, som er blevet bundet til en uopløselig bærerpolymer på en sådan måde, at der ikke sker eluering ved vask. Når det således forstørrede antigen inkuberes med forsøgsprøven, kan der let foretages en 5 fysisk separation mellem bundet og frit Ig. Frit Ig kan vaskes væk, hvorimod bundet antistof kan påvises og kvantiteres med et mærket anti-Ig-reagens.
En væsentlig ulempe ved den ovenfor nævnte fremgangsmåde er, at et 10 stort antal antigenmolekyler koncentreret på en overflade kontaktes med den antistofholdige opløsning. Dette betyder, at reaktionsbetingelserne er væsentligt forskellige fra de fysiologiske betingelser, hvor antigenet er i opløsning, når det reagerer med antistoffet.
15 En anden vigtig ulempe ved den ovenfor nævnte fremgangsmåde er af praktisk art: Når forsøgsprøverne skal analyseres for antistofaktivitet mod et stort antal antigener, er det indlysende, at et stort antal fastfasekoblede antigener skal fremstilles, opbevares og uddeles.
20
Opfindelsens formål er at tilvejebringe en fremgangsmåde samt et kit, hvorved de ovenfor nævnte ulemper elimineres.
Dette formål opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hvilken 25 fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der anvendes et antigen, der er modificeret med en genkendelig gruppe, at det modificerede antigen er opløseligt i forsøgsprøven, således at der sker en gensidig påvirkning mellem antigen og antistof i en homogen opløsning, at det modificerede antigen med bundet antistof, hvis dette er 30 til stede, separeres fra opløsningen med et udfældningsmiddel eller et uopløseligt reagens, som vekselvirker med den genkendelige gruppe, og at ethvert bundet antistof derefter påvises og/eller kvantiteres ved velkendte metoder.
35 Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes der et modificeret, men opløseligt antigen i stedet for et fastfaseantigen, hvilket muliggør virkning eller vekselvirkning mellem antigen og antistof i en homogen opløsning. Antigenet modificeres på en sådan måde, at antigenet sammen med bundet antistof, hvis dette er til stede, kan 3
DK 155967 B
separeres fra opløsningen under betingelser, hvor ikke-bundet Ig forbliver i opløsningen.
Modifikationen medfører indføringen af en genkendelig gruppe (H) i 5 antigenet. Separationen fra opløsningen udføres med et udfældningsmiddel eller et uopløseligt reagens, som vekselvirker med den genkendelige gruppe (H); dette reagens vil blive kaldet "anti-H".
Det er vigtigt for denne metode, at følgende fire betingelser for 10 reaktionen mellem H og anti-H er opfyldt: 1. Vekselvirkningen mellem det modificerede antigen og antistoffet må ikke forstyrres.
15 2. Frit Ig reagerer ikke med anti-H.
3. Andre stoffer i forsøgsprøven intefererer ikke væsentligt.
4. Ig-determinanterne skal forblive tilgængelig for en efter- 20 følgende vekselvirkning med anti-Ig.
En vigtig fordel ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er, at vekselvirkningen mellem antigen og antistof finder sted i en homogen opløsning. En anden fordel er, at selvom antistoffer mod et stort 25 antal antigener skal undersøges, kræves kun et enkelt udfældningsmiddel eller fastfasereagens.
Der opnås gode resultater, når der anvendes en hapten som den genkendelige gruppe (H), og anti-hapten antistof er koblet til en fast 30 fase som anti-H-reagens.
Som hapten anvendes fortrinsvis en trinitrophenylgruppe.
Der opnås ligledes gode resultater, når biotin anvendes som den 35 genkendelige gruppe, og avidin er koblet til et fastfase bæremateriale som uopløseligt reagens.
Som fastfase anvendes almindeligvis plastkugler, f.eks. polystyrenkugler.
4
DK 155967 B
En mi krotiterp!ade tilvejebringer også en tilfredsstillende fast fase.
Ydermere kan kemisk aktiverede uopløselige polymerer anvendes med 5 held, navnlig CNBrakti verede agarosekugler.
Vekselvirkningen mellem H og anti-H kan være baseret på en kovalent kemisk binding, f.eks. reaktionen mellem en aldehydgruppe og en hydrazidgruppe, eller på ikke-kovalent vekselvirkning, f.eks.
10 vekselvirkningen mellem biotin og avidin eller mellem hapten og anti-hapten-anti stof.
Anvendelsen af et uopløseligt anti-H-reagens i en immunoanalyse er omtalt i beskrivelserne til EPA 0 005 271 og FR-A nr. 2.415.301. De 15 i disse patentskrifter omtalte metoder er kompetitive immunoanaly- ser, hvor et antistof er blevet modificeret med en hapten eller med biotin, og ved hvilken metode der anvendes et mærket antigen, som konkurrerer med ikke-mærket antigen i forsøgsprøven. I modsætning hertil angår fremgangsmåden ifølge opfindelsen en ikke-kompetitiv 20 immunoanalyse, hvor et antigen er blevet modificeret, f.eks. med en hapten eller med biotin, og hvor der anvendes et mærket anti-Ια. som forenes med antistoffet i forsøgsprøven.
Opfindelsen angår ydermere et kit til analyse og bestemmelse af 25 antistoffer rettet mod visse antigener i en homogen, vandig opløsning, hvilket kit er egnet til brug ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Dette kit indeholder et første reagens bestående af et med en genkendelig gruppe modificeret, i vandig opløsning opløseligt antigen, et andet reagens bestående af et udfældningsmiddel eller et 30 uopløseligt reagens, som kan vekselvirke med den genkendelige gruppe, samt et tredie reagens bestående af et mærket anti-Ig.
Ifølge en foretrukket udførelsesform er et eller flere af reagenserne frysetørret.
Opfindelsen vil nu blive illustreret ved følgende eksempler: 35
DK 155967 B
5
EKSEMPEL I
I dette eksempel beskrives et forsøg, hvor IgE antistofer mod et antigen i græspollen påvises; dette antigen modificeres ved indfø-5 ring af trinitrophenyl-(TNP-)grupper; anti-H-reagenset består af anti-TNP-antistoffer koblet til en fast fase (plastkugler).
TNP-græspollen fremstilledes ved at omsætte 0,125 mg trinitroben-zensulfonsyre med 5,0 mg dialyseret og frysetørret græspolleoeks-10 trakt i 0,2 M natriumboratpuffer, pH 9,0, i et slutvolumen på 0,85 ml.
Efter en reaktionstid på 2 timer ved 20-24°C og 16 timer ved 0-4°C dialyseredes opløsningen mod phosphatpufferet saltvandsopløsning 15 (PBS).
Anti-TNP-antiserum tilvejebragtes ved at immunisere et får med TNP-substitueret bovintserumalbumin ifølge standardprocedurer. Fra denne antiserum isoleredes antistofferne ved adsorption på TNP-20 Sepharose i overensstemmelse med kendte metoder; de adsorberede antistoffer elueredes med en puffer bestående af 0,1 M glycin, 0,15 M NaCl og 10% (vægt/vol umen) dioxan, pH 2,5. De eluerede antistoffer overførtes til PBS ved gelfiltrering på Sephadex G25.
25 Den optiske densitet ved 280 nm af den opnåede opløsning var 0,400.
Disse anti-TNP-antistoffer adsorberedes på polystyrenkugi er (diameter 0,6 mm) ved 16 timers inkubation ved 20-24°C i en 1:20 fortynding af den antistofholdige opløsning i 0,1 M NaHCO^-puffer, pH
9,0.
30
Til bestemmelse af antistoffer af IgE-klassen mod græspollen tilsattes 50 /ti serum fra en høfeberpatient P eller fra en kontroldonor C til 200 /il af en TNP-græspollenopløsning fortyndet 1:4000 i PBS indeholdende 0,5% BSA og 0,02% Tween-20, og blandingen inkuberedes 35 derefter i 6 timer ved 20-24°C.
Polystyrenkuglerne belagt med anti-TNP-antistoffer vaskedes til fjernelse af ikke-adsorberet anti-TNP-antistoffer og overførtes til reaktionsblandingen af serum og TNP-pollenekstrakt. Efter 16 timers
DK 155967 B
6 inkubation ved 20-24°C fjernedes ikke-bundet materiale ved vask af kuglerne; bundne IgE-antistoffer til græspollen påvistes og kvanti - 125 teredes med et I-mærket anti-IgE-reagens.
5
Hofeberpatient (PI. fortyndinger % binding af mærket anti-Ia-reaaens 50 μλ - 50,2 50 /il - 1:25 35,5 50 μΐ - 1:50 27,8 10 50 /il - 1:100 17,5 50 /il - 1:200 11,6 50 /il - 1:400 7,6 50 /il - 1:800 4,6 50 /il - 1:1600 3,1 15 50 ./il - 1:3200 2,5 50 /il - 1:6400 1,9 50 /il - 1:12800 1,5 50 /il (kontroldonor) 1,0 20
EKSEMPEL II
Glycoproteinet avidin har en høj affinitet for biotin (K=10~*5M~*). Binding af avidin til en fast fase og kobling af biotin til et 25 antigen gør det muligt at separere antigenbundet immunoglobulin og fri immunoglobulin.
Avidin kobledes kovalent til CNBr-aktiveret Sepharose-4B i overensstemmelse med kendte metoder; 3,5 mg avidin kobledes til 1 ml 30 Sepharose; reaktionsproduktet suspenderedes i 350 ml PBS.
Biotin-græspollen fremstilledes ved at omsætte 1 mg græspollen i 0,5 ml PBS med 240 /tg biotin-succinimid i 20 /ti di methyl formamid i 4 timer ved 20-24°C.
35
Ikke-koblet og inaktiveret biotin-succinimid fjernedes ved dialyse mod PBS i 16 timer.
Til bestemmelse af antistoffer af IgE-klassen mod græspollen tilsat- 7
DK 155967 B
tes 50 /il serum fra en høfeberpatient P eller fra en kontrol donor C til 50 μ1 af en opløsning af biotin-græspollen fortyndet 1:100 i PBS indeholdende 0,5% BSA og 0,02% Tween-20 og inkuberedes derefter i 1 time ved 20-24°C. Derefter tilsattes 0,5 ml avidin-Sepharose-suspen-5 s i on og 250 /il PBS, som indeholdt bovi ntserumal bumi n og natrium- EDTA. Blandingen inkuberedes i 16-24 timer på et rotationsapparat.
Sepharose-proteinkomplekset separeredes fra suspensionen ved centrifugering. Ikke-bundet Ig fjernedes ved vask af Sepharosekuglerne med 10 en 0,9% saltvandsopløsning.
Kvantitativ bestemmelse af bundet IgE udførtes ved tilsætning af 125 I-mærkede anti-IgE-antistoffer til suspensionen af Sepharose-protei nkompleks.
15 Høfeberpatient (PI. fortyndinger % binding af mærket anti-Iq-reaqens 50 /il - 1:25 32,7 50 /il - 1:50 20,6 20 50 /il - 1:100 15,1 50 /il - 1:250 6,4 50 /il - 1:500 4,9 50 /ti (kontroldonor) 0,5 25 30 35
Claims (10)
1. Fremgangsmåde til bestemmelse af antistoffer mod opløselige antigener i en vandig prøve, navnlig i legemsvæsker, såsom blodserum 5 eller blodplasma, ved hvilken fremgangsmåde prøven kontaktes med et antigen in vitro, hvorved antistoffer, hvis de er til stede, bindes til antigenerne, kendetegnet ved, at der anvendes et antigen, der er modificeret med en genkendelig gruppe, at det modificerede antigen er opløseligt i forsøgsprøven, således at der 10 sker en gensidig påvirkning mellem antigen og antistof i en homogen opløsning, at det modificerede antigen med bundet antistof, hvis dette er til stede, separeres fra opløsningen med et udfældningsmiddel eller et uopløseligt reagens, som vekselvirker med den genkendelige gruppe, og at ethvert bundet antistof derefter påvises 15 og/eller kvantiteres ved velkendte metoder.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der som den genkendelige gruppe anvendes en hapten, og at der som uopløseligt reagens anvendes anti-hapten-antistof koblet til en fast 20 fase.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at der som hapten anvendes en trinitrophenylgruppe.
4. Fremgangsmåde i-følge krav 1, kendetegnet ved, at der som den genkendelige gruppe anvendes biotin og som uopløseligt reagens avidin koblet til et fastfasebæremateriale.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 2-4, kendetegnet ved, at der 30 som fast fase anvendes plastkugler.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 2-4, k e n d e t e g n e t ved, at der som et fastfasebæremateriale anvendes en mi krotiterplade.
7. Fremgangsmåde ifølge krav 2-4, kendetegnet ved, at der som et fastfasebæremateriale anvendes kemisk aktiverede, uopløselige polymerer.
8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at der DK 155967 B som uopløselig polymerer anvendes CNBr-aktiverede agarosekugler.
9. Kit til påvisning og bestemmelse af antistoffer rettet mod bestemte antigener i en homogen, vandig opløsning, hvilket kit er 5 egnet til brug ved fremgangsmåden ifølge kravene 1-8, kendetegnet ved, at det indeholder et første reagens bestående af et med en genkendelig gruppe modificeret, i vandig opløsning opløselig antigen, et andet reagens bestående af et udfældningsmiddel eller et uopløseligt reagens, som kan vekselvirke med den genkendelige 10 gruppe, samt et tredie reagens bestående af et mærket anti-Ig.
10. Kit ifølge krav 9, kendetegnet ved, at et eller flere af reagenserne er frysetørret. 15 20 25 30 35
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL8102178A NL8102178A (nl) | 1981-05-02 | 1981-05-02 | Werkwijze voor het aantonen van tegen bepaalde antigenen gerichte antistoffen, alsmede inrichting en reagentia voor het uitvoeren van deze werkwijze. |
| NL8102178 | 1981-05-02 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK196282A DK196282A (da) | 1982-11-03 |
| DK155967B true DK155967B (da) | 1989-06-05 |
| DK155967C DK155967C (da) | 1989-10-16 |
Family
ID=19837436
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK196282A DK155967C (da) | 1981-05-02 | 1982-04-30 | Fremgangsmaade samt kit til bestemmelse af antistoffer mod oploeselige antigener |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4468470A (da) |
| EP (1) | EP0064318B1 (da) |
| JP (1) | JPS589071A (da) |
| AT (1) | ATE15274T1 (da) |
| AU (1) | AU8317482A (da) |
| CA (1) | CA1177391A (da) |
| DE (1) | DE3265768D1 (da) |
| DK (1) | DK155967C (da) |
| ES (1) | ES512498A0 (da) |
| IE (1) | IE53059B1 (da) |
| NL (1) | NL8102178A (da) |
| NO (1) | NO160474C (da) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3225027A1 (de) * | 1982-07-05 | 1984-01-05 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Immunchemisches messverfahren |
| GB8422452D0 (en) * | 1984-09-05 | 1984-10-10 | Serono Diagnostics Ltd | Assay |
| US4806311A (en) * | 1985-08-28 | 1989-02-21 | Miles Inc. | Multizone analytical element having labeled reagent concentration zone |
| US5262334A (en) * | 1986-01-30 | 1993-11-16 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Method for immunoselection of cells using avidin and biotin |
| US5225353A (en) * | 1986-01-30 | 1993-07-06 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Method for immunoselection of cells using avidin and biotin |
| JP2505179B2 (ja) * | 1986-12-16 | 1996-06-05 | 日本碍子株式会社 | 高強度常圧焼結窒化珪素焼結体およびその製造方法 |
| US4859612A (en) * | 1987-10-07 | 1989-08-22 | Hygeia Sciences, Inc. | Metal sol capture immunoassay procedure, kit for use therewith and captured metal containing composite |
| US5202267A (en) * | 1988-04-04 | 1993-04-13 | Hygeia Sciences, Inc. | Sol capture immunoassay kit and procedure |
| DE4140142A1 (de) * | 1991-12-05 | 1993-06-09 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim, De | Multivalentes dextranreagenz zum einsatz in praezipitationstests |
| US5518882A (en) * | 1993-12-21 | 1996-05-21 | Biotex Laboratories, Inc. | Immunological methods of component selection and recovery |
| FR2716263B1 (fr) * | 1994-02-11 | 1997-01-17 | Pasteur Institut | Procédé d'alignement de macromolécules par passage d'un ménisque et applications dans un procédé de mise en évidence, séparation et/ou dosage d'une macromolécule dans un échantillon. |
| DE4434093A1 (de) * | 1994-09-23 | 1996-03-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum qualitativen oder/und quantitativen Nachweis einer zu bestimmenden Substanz |
| US5773224A (en) * | 1996-02-12 | 1998-06-30 | Grandics; Peter | Immunoselection system for cell elution |
| US6436722B1 (en) * | 2000-04-18 | 2002-08-20 | Idexx Laboratories, Inc. | Device and method for integrated diagnostics with multiple independent flow paths |
| EP1195606A1 (en) * | 2000-10-03 | 2002-04-10 | VBC-Genomics Forschungsges.m.b.H. | Allergen-microarray assay |
| JP4880188B2 (ja) * | 2001-01-23 | 2012-02-22 | プレジデント アンド フェロウズ オブ ハーバード カレッジ | 核酸プログラム型タンパク質アレイ |
| WO2004051280A2 (de) * | 2002-11-29 | 2004-06-17 | Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin | Bestimmung agonistischer autoantikörper |
| DE10327066A1 (de) * | 2002-11-29 | 2004-09-16 | Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin | Bestimmung agonistischer Autoantikörper |
| US20050260653A1 (en) * | 2004-04-14 | 2005-11-24 | Joshua Labaer | Nucleic-acid programmable protein arrays |
| US8178316B2 (en) * | 2006-06-29 | 2012-05-15 | President And Fellows Of Harvard College | Evaluating proteins |
| AU2016358111B2 (en) | 2015-11-18 | 2021-11-18 | Formycon Ag | Pre-filled pharmaceutical package comprising a liquid formulation of a VEGF-antagonist |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE341239B (da) * | 1967-09-06 | 1971-12-20 | Pharmacia Ab | |
| US3773625A (en) * | 1971-04-08 | 1973-11-20 | Us Army | Soluble antigen-antibody complexes |
| US3966898A (en) * | 1973-06-28 | 1976-06-29 | Pharmacia Diagnostics Ab | Method and reagent for determining immunologic materials |
| US4230797A (en) * | 1975-04-28 | 1980-10-28 | Miles Laboratories, Inc. | Heterogenous specific binding assay employing a coenzyme as label |
| US4021534A (en) * | 1975-12-12 | 1977-05-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Radioimmunoassay |
| SE427505B (sv) * | 1977-03-04 | 1983-04-11 | Pharmacia Diagnostics Ab | Reagens till anvendning vid immunkemiska bestemningsmetoder |
| IL51667A (en) * | 1977-03-16 | 1979-10-31 | Miles Yeda Ltd | Immunoassay for the determination of a hapten |
| US4271140A (en) * | 1978-01-23 | 1981-06-02 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Method and composition for double receptor, specific binding assays |
| JPS5510590A (en) * | 1978-05-04 | 1980-01-25 | Wellcome Found | Enzyme immunity quantity analysis |
| US4228237A (en) * | 1978-09-21 | 1980-10-14 | Calbiochem-Behring Corp. | Methods for the detection and determination of ligands |
| US4495296A (en) * | 1979-05-21 | 1985-01-22 | New York Blood Center, Inc. | Labeled anti-hapten antibodies and their use as a universal reagent for solid phase radio- and/or enzyme-immunoassays |
-
1981
- 1981-05-02 NL NL8102178A patent/NL8102178A/nl not_active Application Discontinuation
-
1982
- 1982-04-30 IE IE1027/82A patent/IE53059B1/en unknown
- 1982-04-30 DE DE8282200517T patent/DE3265768D1/de not_active Expired
- 1982-04-30 NO NO821431A patent/NO160474C/no unknown
- 1982-04-30 DK DK196282A patent/DK155967C/da not_active IP Right Cessation
- 1982-04-30 AT AT82200517T patent/ATE15274T1/de active
- 1982-04-30 AU AU83174/82A patent/AU8317482A/en not_active Abandoned
- 1982-04-30 JP JP57071591A patent/JPS589071A/ja active Pending
- 1982-04-30 US US06/373,644 patent/US4468470A/en not_active Expired - Lifetime
- 1982-04-30 ES ES512498A patent/ES512498A0/es active Granted
- 1982-04-30 CA CA000402054A patent/CA1177391A/en not_active Expired
- 1982-04-30 EP EP82200517A patent/EP0064318B1/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO160474B (no) | 1989-01-09 |
| NO821431L (no) | 1982-11-03 |
| NL8102178A (nl) | 1982-12-01 |
| EP0064318B1 (en) | 1985-08-28 |
| NO160474C (no) | 1989-04-19 |
| IE53059B1 (en) | 1988-05-25 |
| JPS589071A (ja) | 1983-01-19 |
| EP0064318A1 (en) | 1982-11-10 |
| US4468470A (en) | 1984-08-28 |
| ES8304314A1 (es) | 1983-02-16 |
| DK155967C (da) | 1989-10-16 |
| DE3265768D1 (en) | 1985-10-03 |
| ATE15274T1 (de) | 1985-09-15 |
| DK196282A (da) | 1982-11-03 |
| ES512498A0 (es) | 1983-02-16 |
| AU8317482A (en) | 1982-11-11 |
| CA1177391A (en) | 1984-11-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK155967B (da) | Fremgangsmaade samt kit til bestemmelse af antistoffer mod oploeselige antigener | |
| US4298685A (en) | Diagnostic reagent | |
| Mannik et al. | Deposition of antibodies to the collagen‐like region of C1q in renal glomeruli of patients with proliferative lupus glomerulonephritis | |
| Salama et al. | Immune‐mediated agranulocytosis related to drugs and their metabolites: mode of sensitization and heterogeneity of antibodies | |
| AU720123B2 (en) | Antigen-specific IgM detection | |
| US4894347A (en) | Erythrocyte agglutination assay | |
| JP2000510581A (ja) | 血小板顆粒蛋白質を用いた血小板数アッセイ | |
| JPH11511851A (ja) | 細胞計数イムノアッセイ | |
| AU640635B2 (en) | Avidin-biotin assisted immunoassay | |
| Witkin et al. | Demonstration of IgG Fc receptors on spermatozoa and their utilization for the detection of circulating immune complexes in human serum. | |
| JPH02503714A (ja) | ＩｇＡ腎臓病の診断のための方法及びキツト | |
| US4623618A (en) | Simultaneous quantitative immunoassay for different antigens or antibodies | |
| Peterman et al. | The immunochemistry of sandwich-ELISAs IV. The antigen capture capacity of antibody covalently attached to bromoacetyl surface-functionalized polystyrene | |
| JP2004531724A (ja) | 血液細胞抗原および該抗原に対して指向される抗体の検出方法 | |
| CA1218299A (en) | Antibodies against bacterial peptidoglycans, processes for preparing them and methods of quantitively measuring them | |
| AU625344B2 (en) | Chlamydia half-sandwich immunoassay | |
| EP0308242B1 (en) | Agglutination assay | |
| JPH08304397A (ja) | 病原体感染の検出方法 | |
| WO1988009933A1 (en) | Immunoassay method | |
| Kilgallon et al. | Anti-C1q column: ligand specific purification of immune complexes from human serum or plasma. Analysis of the interaction between C1q and immune complexes. | |
| JPH03170058A (ja) | イムノアッセイ用試薬複合体 | |
| EP0260079A1 (en) | Method of assay | |
| Jonsson et al. | An extractable nuclear antigen not attaching to tannic acid-treated erythrocytes. | |
| CA1243944A (en) | Reagent and process for quantitatively measuring antibodies | |
| JPH08193999A (ja) | 免疫測定法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |