DK153658B - Materiale og fremgangsmaade til fremstilling af en ketonkontroloploesning samt en fremgangsmaade til kalibrering af et ketonproeveinstrument - Google Patents

Description

1 DK 153658B

O

Opfindelsen angår et materiale og en fremgangsmåde til fremstilling af en ketonkontrolopløsning samt en fremgangsmåde til kalibrering af et ketonprøve-instrument.

5 Når der skal udarbejdes en metode til bestem melse af nærværelsen af en bestanddel i en prøve - uanset om metoden er gravimetrisk, volumetrisk, spektrofotometrisk eller af anden art - skal metodens effektivitet til frembringelse af pålidelige resultater på én eller anden måde 10 vurderes. I modsat fald er de opnåede data uden mening. Udarbejdelsen af en sådan metode strækker sig således langt ud over bygningen af et apparat, sammensætningen af reagenser eller udviklingen af en teknik. Udarbejdelsen må nødvendigvis omfatte en bedømmelse af forsøgsfejlene.

15 Der skal med andre ord findes en vej til forudsigelse af pålideligheden af de data, der frembringes ved hjælp af metoden.

Den letteste, mest direkte vej til studium af parametre såsom reproducerbarhed, sensitivitet, nøjagtig-20 hed og behov for kalibrering er anvendelse af metoden i forbindelse meden forsøgsprøve, hvori tilstedeværelsen og/eller koncentrationen af analyten er kendt på forhånd, dvs. en kontrolopløsning. De data, der fås ved denne procedure, kan derpå sammenlignes med kendte data, og even-25 tueile uoverensstemmelser kan behørigt bemærkes.

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes der et materiale til anvendelse ved fremstilling af en ketonkontrolopløsning, hvilket materiale omfatter en bærer, hvori der er inkorporeret en forudbestemt mængde af 30 et keton-fremkaldende middel, og dette materiale er ejendommeligt ved, at midlet omfatter

(a) en Ø-ketoalkansyreester med strukturformlen O O R'-C-CH2-C-OR

35 i hvilken R er en alkylgruppe med 1-6 C-atomer, og R' er en aliphatisk eller cyclisk gruppe med 1-7 C-atomer, og

O

2 DK 153658B

et hydrolyserende stof, der er i stand til at omdanne esteren til den tilsvarende β-ketoalkansyre, når esteren og stoffet anbringes i et opløsningsmiddel derfor, eller (b) et alkalimetalenolat af en β-ketoalkansyre-5 ester med strukturformlen OM 0

R'-C=CH-C-OR

i hvilke.il1 M er et alkalimetalatom, og R og R' har den ovenfor angivne betydning.

-10 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstil ling af en ketonkontrolopløsning er ejendommelig ved, at man bringer et forudbestemt rumfang opløsningsmiddel i kontakt med det ovenfor definerede materiale ifølge opfindelsen.

15 Endelig er fremgangsmåden ifølge opfindelsen til kalibrering af et ketonprøveinstrument ejendommelig ved, at man bringer en forudbestemt mængde opløsningsmiddel i kontakt med et materiale ifølge opfindelsen til dannelse af en kontrolopløsning, der normalt er i stand til at til-20 vejebringe et forudbestemt respons i instrumentet ved kontakt dermed, hvorpå man bringer kontrolopløsningen i kontakt med instrumentet, iagttager det faktiske respons i instrumentet, sammenligner det faktiske respons i instrumentet med det forudbestemte respons og justerer instru-25 mentet til frembringelse af det forudbestemte respons.

Acetoeddikesyre (acetyleddikesyre) er et normalt slutprodukt ved fedtsyreoxidationen i leveren. Denne syre dannes også i meget begrænset omfang ved oxidativ nedbrydning af leucin, phenylalanin og tyrosin. β-Hydroxysmør-30 syre dannes ud fra acetoeddikesyre ved reversibel reduktion. Acetone dannes ved irreversibel decarboxylering af acetoeddikesyre: 35

3 DK 153658B

O

O

II

ch3-c-ch2-cooh acetoeddikesyre

i V

jr v

v/ O

ch3-ch-ch2-cooh ch3-c-ch3

10 OH

β-hydroxysmørsyre acetone

Disse tre forbindelser benævnes almindeligvis 15 ketonstoffer ©Iler acetonestoffer.

Abnormt høje mængder ketonstoffer i urin eller blod benævnes ketonuri henholdsvis ketonæmi. Disse forhold kan forekomme som et resultat af så forskellige patologiske tilstande som diabetes mellitus og udsultning. På 20 grund af dette sygdoms-symptom-forhold er der stor interesse for bestemmelse af ketonstoffer i urin. I tilfælde af en diabetiker er detekteringen af ketonuri af stor signifikans, eftersom der ofte indikeres en ændring i insulindosis eller en anden sygdomsbehandling. I den medicinske 25 profession er der således blevet lagt stærk vægt på ketonstof analyse, hvilket har ført til udviklingen af et stort antal metoder med sensitivitet over for nærværelsen og/el-ler koncentrationer af ketonstoffer i urin.

Interessen for undersøgelsen af nærværelsen af ke-30 toner er imidlertid på ingen måde begrænset til den medicinske profession. Disse forbindelser har et overmåde stort antal industrielle anvendelser, idet de anvendes som opløsningsmidler i nitrocellulose-overtræk og vinylfilm, finder anvendelse i malingsfjernere, rensevæsker, organiske syn-35 teser, fremstilling af eksplosiver og som næringsmiddeladditiver, og inden for ethvert af anvendelsesområderne er der på ét eller andet tidspunkt behov for at udføre en ana-

4 DK 153658 B

O

lytisk procedure til bestemmelse af nærværelsen af keton og/eller koncentrationen deraf. Disse og mange andre forhold vedrørende nærværelsen af ketoner har ført til mange påvisningsmetoder for ketoner.

5 Ved en af disse tests drager man nytte af ketoners tilbøjelighed til at reagere med natriumnitroprussid til dannelse af intense farver. Når acetone behandles med nitro-prussid, frembringes der således en intens rødgul farve, der ændres til lyserød-violet ved syrning med eddikesyre, jfr. 10 Fritz Feigl, Spot Tests in Organic Analysis, 7th. Ed. (1966). Dette fænomen fremkommer som et resultat af en koblingsreaktion mellem NO-gruppen i nitroprussidet og ketonen til dannelse af en isonitrosoketon, der forbliver i reaktionsblandingen som en kompleks, farvet anion. Det trivalente jern 15 (III) i nitroprussidet reduceres til dets divalente tilstand (II). Det har vist sig, at ketoner, der ikke indeholder methyl- eller methylengrupper bundet til carbonylgrupper, ikke er reaktive. I det mindste danner de ikke farveformer med nitroprussid.

20 De samme eller lignende kemiske forhold kan findes i den keton-sensitive del af analytiske reagensstrimler, der er kendt som N-MULTISTIX® oq KET0-DIASTI2^, og i reagenstabletten ACETEST ®. Alle disse tre midler til bestemmelse af ketonstoffer er baseret på nitroprussid-keton-kom-25 pleksdannelsesfænomenet. Når der således neddyppes reagensstrimler af den nævnte art i en vandig ketonopløsning, eller når tabletten bringes i kontakt med en sådan opløsning, indikerer dannelsen af et farvet kompleks nærværelsen af en keton. Endvidere kan koncentrationen af ketonen anslås på basis 30 af den dannede farves intensitet og nuance.

Disse og andre metoder til bedømmelse af mængden af ketonstoffer kræver som ovenfor angivet en metode til bedømmelse af nøjagtigheden og desuden en kompetent person til udførelse af prøven. En af vejene hertil er anvendelsen af en 35 referenceprøve eller en kontrolprøve, dvs. en forsøgsprøve,

O

5

, DK 153658 B

i hvilken den kemiske sammensætning og de fysiske karakteristika simulerer de forsøgsprøver, der skal analyseres. Kontrollen kan således være en urinprøve, der er blevet holdt i frossen tilstand, eller den omfatter måske akku-5 muleret urin, der er blevet koncentreret ved frysetørring og senere skal fortyndes til et forudbestemt rumfang.

Et eksempel på en kommercielt tilgængelig kontrolprøve er TEK-CHEK ®, der udnytter virkningen af en bestemt pH-indikator i nærværelse af det pufferstof, der anvendes 10 i kommercielt tilgængelige reagensstrimler med keton-respons-givende reagensarealer. Under anvendelse af dette keton--substitut giver TEK-CHEK ® en kontrolopløsning, som giver en positiv prøve for ketoner med følgende produkter: BILI-LABSTIX LABSTIX ® , KETO-DIASTIX ® , KETOSTIX® , 15 MULTISTIX® , N-MULTISTIX ® og ACETEST ®. TEK-CHEK er beskrevet i den tilgængelige produktlitteratur som indeholdende lyofiliseret urin indeholdende et kemisk substitut for ketoner. Der anvendes et substitut, fordi ketoner er vanskelige at bibeholde i deres naturlige tilstand. I TEK-CHEK gø-20 res der således brug af en pH-indikator til simulering af en urin indeholdende patologiske mængder ketonstoffer.

I USA-patentskrift nr. 3.920.400 er der beskrevet en urinsyre-standardopløsning, i hvilken der anvendes et lithiumsalt af .urinsyre som kontrolstoffet, og et kompleks-25 dannelsesmiddel for polyvalente metaller i deres højere oxidationstrin er også til stede. Typiske kompleksdannelsesmidler er angivet at være malonsyre, salicylsyre, oxalsyre, glutathion, cystein, 8-oxyquinolin og ethylendiamin-tetraeddikesyre. Formålet med kompleksdannelsesmiddel-addi-30 tivet er at stabilisere og hindre sønderdeling af urinsyre, medens denne er i opløsning.

Et andet eksempel på en kontrol er den, der er beskrevet i USA-patentskrift nr. 3.920.580. Der beskrives her et flydende kontrolmiddel til glucosebestemmelse i 35 blod eller serum. Det indeholder vand, glucose og et an-tidiffunderingsmiddel indeholdende en hydrofil polymer.

6 DK 155658B

O

Visse salte af cholesterol-hemisuccinat er i USA-patentskrift nr. 3.859.047 beskrevet som værende nyttige som cholesterol-kontrolmidler.

USA-patentskrift nr. 4.193.766 angår et materiale 5 til fremstilling af ketonkontrolopløsninger under anvendelse afvisse metalionkomplekser af acetylacetone og dennes homologe som et substrat, jfr. også vesttysk offentliggørelsesskrift nr. 2.721.681. Medens nogle keton-sensitive reagenser ikke vil give respons på sådanne acetylacetona-10 ter, vil andre, mindre specifikke gøre det. Det er med de sidstnævnte ketonreagenser, at acetylacetonater kan gøre nytte som kontrolsubstrater.

Til sammenfatning af teknikkens stade forud for nærværende opfindelse kan det anføres, at der kendes 15 talrige kontrolopløsningsbestanddele. TEK-CHEK-opløs-ninger tilvejebringer en substitut for ketoner, en kendt pH-indikator, der reagerer med de pufferstoffer, som anvendes ved forskellige keton-responsgivende kemiske reaktioner, der normalt anvendes ved ketonbestem-20 melser. Andre kontroller kendes også, f.eks. for urinsyre, glucose, cholesterol og mange andre. Adskillige flydende systemer, der indeholder acetone, er for tiden på markedet. Kontrollerne ifølge den kendte teknik afyiger imidlertid væsentligt fra den foreliggende opfindelse, idet 25 der intetsteds er beskrevet et ketonkontrolmiddel, der gør brug af en kombination af (a) en β-ketoalkansyreester og et hydrolyserende stof eller (b) et alkalimetalenolat af en β-ketoalkansyreester, jfr. det foregående og det følgende.

Ifølge den foreliggende opfindelse opnås der således 30 den fordel, at det ikke længere er nødvendigt at anvende flydende præparater indeholdende acetone eller andre flydende ketoner. Ifølge opfindelsen anvendes der. nemlig som aktiv bestanddel et tørt, let opbevaringsdygtigt materiale, der, når det opløses, er direkte reaktivt med reagenserne ved et keton-sensitivitets-forsøg. Endvidere fås ifølge opfindelsen en β-ketoalkansyre in situ. Opfindelsen eli-

O

7 DK 153658 B

minerer behovet for flydende reagenser og/eller erstatninger for ketoner såsom pH-indikatorer, der giver respons på pufferen i det keton-sensitive reagenssystem. Med opfindelsen tilvejebringes der således et tørt middel, der 5 er stabilt ved opbevaring og let at håndtere, og som tilvejebringerketonkontrolopløsninger med bemærkelsesværdigt nøjagtige koncentrationer, hvilket er ensbetydende med reproducerbarhed ved den keton-sensitive testprocedure .

10 I tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.835.296 er der tale om imprægnering af en bærermatrix med substrater, der imiterer eller duplikerer patologiske stoffer i urin. Eksempelvis beskrives imprægnering af filtrerpapir med nikkel-acetylacetonat. Det tørre papir kan derpå neddyp-15 pes i et givet rumfang vand til dannelse af en opløsning med en bestemt koncentration af acetylacetonat. Omend denne forbindelse reagerer med nogle reagenssystemer, der anvendes til påvisning af β-ketosyrer, giver andre kommercielle analysematerialer intet respons på acetylacetone, 20 fordi de er specifikke for β-ketosyren og derfor er resistente mod falske positive resultater. I det nævnte tyske skrift er der imidlertid ingen omtale af de her omhandlede β-ketoestere og hydrolyserende stoffer eller de her omhandlede alkalimetalenolater.

25 Det her anvendte udtryk "bærer" skal omfatte ethvert middel, der er egnet til at transportere en nærmere bestemt mængde af esteren og det hydrolyserende stof eller af enolatet af esteren. Udtrykket omfatter en kapsel, f.eks. en gelatinekapsel, der kan opløses i vand eller på 30 anden måde kan åbnes til frigivelse af indholdet. Der kan være tale om en perforeret kapsel således, at opløsningsmiddel kan trænge ind i kapslen, når denne er i brug, og udlude de i kapslen indeholdte bestanddele. Der kan også være tale om folie eller andet materiale i form af en 35 lukket, let åbnelig pakning, hvori esteren og det hydrolyserbare stof eller enolatet af esteren er indelukket, indtil anvendelsen finder sted, hvorpå pakningen åbnes, og

8 DK 153658B

O

dens indhold udtømmes i et forudbestemt rumfang vand.

Endvidere kan bæreren også omfatte en bærermatrix, der kan omfatte et bredt udvalg af materialer. Bærermatrixen inkorporeres med metalionesteren og det hydroly-5 serende stof, og når den anvendes, neddyppes den i et forudbestemt rumfang vand i et forudbestemt tidsrum og fjernes derpå, hvorved bestanddelene efterlades i opløsning.

Når der anvendes en bærermatrix, kan den omfatte ethvert stof, der kan inkorporeres sammen med bestanddelene.

10 Matrixen kan således antage mange kendte former, f.eks. de, der anvendes til reagensstrimler til opløsningsanalyse. Eksempelvis beskrives i USA-patentskrift nr. 3.846.247 anvendelsen af filt, porøse keramiske strimler og vævede eller matterede glasfibre. Som erstatninger for papir be-15 skrives der i USA-patentskrift nr. 3.552.928 anvendelsen af træstykker, stof, svampeagtigt materiale og lerholdige stoffer. Anvendelsen af syntetiske harpiksflor og glasfiberfilt i stedet for papir er blevet foreslået i britisk patentskrift nr. 1.369.139. I et andet britisk patentskrift, 20 nr. 1.349.623, foreslås anvendelsen af et lyspermeabelt netværk af tynde filamenter som et dække for en underliggende papirmatrix. I dette patentskrift foreslås også anvendelsen af imprægnering af papiret med en del af et reagenssystem og imprægnering af netværket med andre potentielt 25 uforenelige reagenser. I fransk patentskrift nr.

2.170.397 beskrives anvendelsen af bærermatrixer med mere end 50% polyamidfibre deri. Et andet forslag til bærermatrixer er beskrevet i USA-patentskrift nr.

4.046.513, hvor princippet med trykning af reagenser på 30 en egnet bærer-matrix anvendes. I USA-patentskrift nr.

4.046.514 beskrives sammenvævning eller -knytning af filamenter, der bærer reagenser, i et reaktantsystem. Alle sådanne bærermatrixformer kan anvendes i forbindelse med den foreliggende opfindelse, men også andre kan benyttes.

35 Fortrinsvis omfatter bærermatrixen et sugende materiale, f.eks. filtrerpapir, idet en opløsning af esteren og det

O

9 DK 153658 B

hydrolyserende stof eller enolatet af esteren anvendes til imprægnering af matrixen. Matrixen kan også omfatte et system, der fysisk indeslutter de nævnte bestanddele, f.eks. polymere mikrokapsler, som derpå går itu ved kon-5 takt med forsøgsprøven. Matrixen kan omfatte et system, i hvilket bestanddelene er homogent kombineret med bærermatrixen i en fluid eller semi-fluid tilstand, der senere hærdner eller sætter sig, hvorved bestanddelene indesluttes .

10 Som eksempler på R i formlen for den anvendte β-ketoalkansyreester kan nævnes methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, cyclopropyl, n-butyl, sek.butyl, tert.butyl, isobutyl, cyclobutyl og alle pentyl- og hexylisomere.

R', der som nævnt betegner en aliphatisk eller en cyclisk 15 gruppe med 1-7 carbonatomer, kan være en mættet, umættet, aromatisk, substitueret eller usubstitueret gruppe. Særligt egnede til opfindelsens formål er sådanne estere som methyl-acetoacetat, ethylacetoacetat og ethyl-3-keto-4-phenyl-butyrat. Yderligere eksempler er 1,10-di-(acetoacetyl)-20 -decan, ethyl-2-methylacetoacetat og ethyl-p-fluorbenzoyl-acetat.

Det hydrolyserende stof, der anvendes ifølge opfindelsen, omfatter syrer eller baser af passende styrke til hydrolyse af β-ketoalkansyreesteren. Nogle syrer, der 25 er egnede til dette formål, er f.eks. toluensulfonsyrerne, benzensulfonsyre, sulfosalicylsyre og naphthalendisulfon-syrer. Basiske stoffer er på den anden side de foretrukne hydrolyserende stoffer. Disse omfatter blandt andre sådanne stoffer som kaliumcarbonat, natriumcarbonat, natrium-30 hydroxid, kaliumhydroxid og blandinger deraf, herunder blandinger af natriumbicarbonat og de nævnte forbindelser.

Den parameter, der hovedsagelig er bestemmende ved udvælgelsen af det hydrolyserende stof, er den endelige pH-værdi, der frembringes i opløsning. Såfremt der skal 35 anvendes en base, vil en for lav pH-værdi hindre hydrolyse af esteren eller give en for langsom hydrolysehastighed.

10 , DK 153658B

O

Det har vist sig, at et alkalisk stof skal være basisk nok eller til stede i tilstrækkelige mængder til tilvejebringelse af en pH-værdi på mindst ca. 10.

Tegningen viser den alkaliske pH-værdis afhæn-5 gighed af hydrolysen af methylacetoacetat, der er en fore-trukken ester til anvendelse i forbindelse med opfindelsen. Kurven viser omfanget af esterhydrolyse i relation til tiden (abscisseaksen angiver tiden t i minutter, og ordinataksen angiver den procentvise esterhydrolyse som % re-10 flektans) for vandige opløsninger af methylacetoacetat ved en koncentration på 0,150 gram pr. deciliter (g-%) ved pH-værdier på 8,8, 9,8, 10,9 og 12,7. De angivne data viser, at der praktisk taget ikke foregår nogen hydrolyse til acetoeddikesyre ved pH = 8,8, selv efter tre timer, 15 medens en næsten fuldstændig hydrolyse finder sted efter 30 minutter ved pH = 12,7. Disse data viser det kritiske tærskelpunkt ved ca. pH 10 med henblik på signifikant hydrolyse, dvs. dannelse af ketonstof-substrat til en kontrolopløsning .

20 Givet de teoretiske og eksperimentelle aspek ter i den foreliggende sammenhæng kan udvælgelsen af det bedste hydrolyserende stof afgøres ved hjælp af rutinemæssige laboratorieforsøg. Alt, hvad man behøver at gøre, er at inkorporere esteren og det hydrolyserende stof i et 25 bærermedium som her beskrevet og at fremstille en kontrolopløsning. Dannelsen af β-ketoalkansyren kan derpå følges spektrofotometrisk eller på anden kendt måde. En for ringe dannelse af ketosyren er et tegn på utilstrækkeligt hydrolyserende middel, dvs. frembringelse af en pH-værdi, 30 der er utilstrækkelig til, at esteren hydrolyseres.

Den mængde β-ketoalkansyreester, der anvendes til opfindelsens formål, dvs. inkorporeret sammen med bæreren, afhænger af flere parametre. For det første skal det analytiske system, i hvilket nærværelsen af keton-35 stoffer kan være af analytisk interesse, give respons på et bestemt område af ketonkoncentration. Dette koncentra-

u DK 153658B

O

tionsområde vil variere fra system til system. Patologiske urinprøver vil eksempelvis kræve, at det keton-sensitive areal af N-MULTISTIX giver respons på ketonkoncentrationer fra ca. 3 op til ca. 160 milligram pr. deciliter (mg-%).

5 Til et materiale til fremstilling af en kontrolopløsning for N-MULTISTIX-reagensstrimler kræves der således en estermængde, der er tilstrækkelig til tilvejebringelse af en farveændring, der indikerer ketonkoncentrationer i det pågældende område.

10 En anden bestemmende faktor er rumfanget af den kontrolopløsning, som materialet til slut skal anvendes til fremstilling af. Hvis materialet således inkorporeres sammen med mængder af bestanddele, der ved kontakt med 30 milliliter vand tilvejebringer det ønskede 15 N-MULTISTIX-reagensstrimmel-respons, vil dette samme materiale give et for kraftigt respons med 12 milliliter vand og et for svagt respons med 1 liter. Det er tilstrækkeligt at anføre, at den mængde ester, der inkorporeres sammen med bæreren, skal være i det mindste tilstrækkelig 20 til tilvejebringelse af det ønskede ketonkoncentrations område i en forudbestemt mængde opløsningsmiddel. Ved urinanalyser ligger dette koncentrationsområde fra ca. 0,1 til ca. 160 millimol pr. liter.

Bæreren kan som nævnt være inkorporeret med 25 f.eks. natriumenolatderivatet af (3-ketoalkansyreesteren.

Eksempelvis er detkendt, at de fleste alkoholer reagerer med metaller såsom natrium til dannelse af alkoxider. De sidstnævnte er yderst reaktive med vand til dannelse af alkoholen og hydroxidet af metallet. Dette anskueliggøres 30 ved ligningerne: R-0H + Na->R0Na + 1/2 H2+ (1) RONa + H20-> ROH + NaOH (2) 35

12 DK 153658 B

O

I tilfælde af β-ketoalkansyreestere giver fænomenet keton-enol-tautomeri anledning til den følgende reaktionsrækkefølge: 0 0 OH 0 5 II II I || R’-C-CH2-C-0R ^__R'-C=CH-C-0R (3) OH 0 ON-a 0

il' I II

R*-C=CH-C-0R + Na->R'-C=CH-C-0R + 1/2 H2+ (4) ,0 ONa 0 OH 0

Rr-C=CH-C-OR + H20->Rf -C=CII-C-0R + NaOH (5) OH 0 0 0 1 'i ii ji R' -C=CH-C-0R—-^±R'-C-CH2-C-0R (6) 15 Når ligningerne 5 og 6 betragtes additivt, er net-toreaktionen: ONa 0 00

on I |l II II

R’ -C=CH-C-OR + H20-^R'-C-CH2-C-0R + NaOH (7)

Ligning 7 viser, at natriumalkoxy-derivatet af en 25 β-ketoalkansyreester omdannes til esteren og natriumhydroxid ved tilsætning af vand. Denne reaktion er yderst hurtig og i det væsentlige irreversibel. Til opfindelsens formål betragtes alkalimetalenolatet af en β-ketoalkansyreester således som ækvivalent med 30 kombinationen af esteren og et hydrolyserende stof, der er i stand til at hydrolysere esteren til dannelse af den tilsvarende β-ketoalkansyre. Dette kan let indses, når højre side af ligning 7 tages et trin videre, nemlig som følger: 35

O

13 DK 153658 B

ίί II NaOH S? {/ R,-C-CH2-C-OR + H20 -»R'-C-CH^C-OH + ROH (8) 5 Det her omhandlede materiale kan således omfatte et alkalimetalenolat med strukturen

OM O

R'-C=CH-C-OR

10 i hvilken R' og R har den ovenfor angivne betydning, og M er en alkalimetalion. Nogle forbindelser, der har denne struktur, er.f.eks. ethylacetoacetat-natriumsalt og methylacetoacetat-natriumsalt. M kan betyde lithium, natrium, kalium og rubidium.

15 Ved en foretrukken metode til fremstilling af det omhandlede testmateriale imprægneres filtrerpapir i rækkefølge med det hydrolyserende stof og esteren. En strimmel filtrerpapir neddyppes således i en vandig opløsning af det hydrolyserende middel, tørres, neddyppes i en al-20 koholisk opløsning af esteren og tørres igen. Efter at papirmatrixen således er inkorporeret sammen med bestanddelene, fastgøres den derpå til en stiv eller halvstiv understøtning, f.eks. en polystyrenfilm. En dobbeltsidet adhæsiv strimmel har vist sig særlig velegnet til dette 25 formål. Inden fastgørelsen skæres det imprægnerede papir i smalle strimler, og disse anbringes på polystyrenfilm langs én kant under anvendelse af det dobbeltsidede adhæsiv. Filtrerpapir-polystyren-materialet opskæres derefter langs linier vinkelret på aksen af filterpapiret, 30 /orved der fås en aflang polystyrenstrimmel med et stykke imprægneret filtrerpapir ved den ene ende, idet den anden ende tjener som et håndgreb.

De følgende eksempler tjener til nærmere illustration af foretrukne udførelsesformer for opfindelsen.

35

14 DK 153658B

O

Eksempel 1

Hydrolyse af methylacetoacetat ved forskellige pH-niveauer

Der udføres et forsøg til studium af hydrolysefor-5 holdene for methylacetoacetat under forskellige pH-beting-elser. Der fremstilles opløsninger af methylacetoacetat i vandige puffere. Hver opløsning bedømmes med ensartede tidsintervaller med hensyn til nærværelsen af acetoacetat. Resultaterne, der er afsat i figur 1, viser, at signifikant 10 esterhydrolyse ikke finder sted førend ved opnåelse af en pH-værdi på mindst 9,8.

I dette forsøg anvendes der fire pufrede opløsninger med pH-værdier på henholdsvis 9, 10, 11 og 13. Pufferen med pH=9 fås fra Pisher Scientific Supply Company, katalog nr.

15 SO-B-114. Den indeholder en borsyre-kaliumchlorid-natrium- hydroxid-opløsning i vand. Pufferen med pH=10 fås fra J.T. Baker Chemical Company som Borate Buffer Solution

No. 1-5609. Pufferen med pH=ll fremstilles ud fra en 1 M K2CC>3-opløsning i destilleret vand ved tilsætning af 20 IN HC1, indtil en pH-værdi på 11 vises af et pH-meter.

Opløsningen med pH=13 er 0,1 N NaOH.

Til en 100 ml aliquot af hver puffer sættes der 0,15 gram methylacetoacetat. De resulterende opløsninger har endelige pH-værdier på henholdsvis 8,8, 9,8, 10,9 25 og 12,7, idet den svage sænkning af pH-værdierne i forhold til de oprindelige puffere tilskrives estertilsætningen.

Reaktionen følges under anvendelse af filtrerpapirstykker imprægneret med et keton-sensitivt reagenssystem, der giver en lyserød farve i nærværelse af acetoacetat, men som 30 ikke farves som respons på den ikke-hydrolyserede ester.

Et sådant system er fuldstændigt beskrevet i USA-patent- skrift nr. 4.147.514. Farvedannelsen følges med et spek- trofotometer, der giver respons for reflekteret lys ved 580 og 720 nanometer. Reagenspapirstykkerne er i forvejen 35 kalibreret ved måling af %-reflektans af acetoacetat-opløs-ninger med kendte koncentrationer. De opnåede data fremgår af den følgende tabel.

o

15 DK 153658 B

I figur 1 på tegningen er reflektansen for de fire opløsninger (givet i %) afsat som funktion af tiden (i minutter).; jfr. det i det foregående anførte.

5 10 15 20 25 30 35

DK 153658B

16 0\° tn

S

-μ m κ P no inomoinmoo oooooooo o o o o o o ϋ Orlrlffl OCONHNMTiO Η N O 1Λ CO O Ifl ΝΙΟίΠΟΝΙΠΟΐη (ti HrgcMfO^fin Hinnnn^'i ίο σι σ h cm cm

0 Η H i—I -P

<U

ϋ <3 m ti (ti

-P

Λ! !K

0) o kion cn^^o^HCMio ι-ιη~οοσιί^··^ιοιο κι (o ^ in o (c I—I *>*»* ». *.*.*»K»k"»·** ^

44 n- (n n n- in®n(Doino> •^,noocr\VD'>t,nr4 co H m η h o oud C

(D r-r^r'-Ln Mnm^^mmN r'-incMrorocororo ιοννννηηη -h P ti m H o\o S3

<D H

Λ iH

(ti (ti

EH

i—I

(ti

• S

ti u •H o 5 ti ^ (ti o o o o ooouooooo ooomoooo ooomoooo iti cm in co cm ro 4o σι cm co cm ro h co σ> cm oo cm no ιο σι cm oo 1«! •Η H i—1 i—ϊ Η H i—I i—1 E4

•H

'd

P

ft) > a 6 oo oo σι - r- k. >k S K k.

p co σι o cm

Q) HH

44 44 2 P4

O

17'

DK 153658B

Kurve 1 i figuren er fremkommet ved sammenstilling af de ovennævnte data ved pH=8,8. Som det ses, sker der kun en ringe hydrolyse (mindre end 8% af det teoretiske udbytte), selv efter 3 timer. Kurverne 2, 3 5 og 4 viser på den anden side signifikant hydrolyse af esteren, dvs. dannelse af acetoacetat, efter kun 20 minutter. Endvidere ses det, at når pH-værdien forøges fra 9,8 til 12,7 (jfr. kurverne 2, 3 og 4), forøges hastigheden og graden af esterhydrolyse tilsvarende.

10

Eksempel 2

Fremstilling af et foretrukkent materiale

Der udføres et forsøg til fremstilling af materialer 15 til anvendelse ved fremstillingen af en ketonkontrolopløs- ning. Hvert materiale omfatter et kvadratisk stykke filtrerpapir anbragt på den ene ende af en polystyrenstrimmel.

Papiret er imprægneret med kaliumcarbonat og methylaceto-acetat.

20 En strimmel af Eaton and Dikeman No. 222 filtrer papir med målene ca. 2,54 cm x ca. 2,54 cm neddyppes i en 2,54 M (35 gram pr. deciliter) opløsning af K2C03 i destilleret vand, fjernes efter fuldstændig mætning og tørres i en luftovn ved ca. 70°C i 15-25 minutter. Det tørrede 25 papir neddyppes derpå i en anden opløsning indeholdende 20 gram methylacetoacetat pr. 100 ml ethanol (23A), fjernes og tørres ved 70°C i 15-25 minutter i en luftovn.

Det tørrede, med bestanddelene imprægnerede papir lamineres derpå til den ene side af en papirbagklædt, dob-30 beltsidet klæbestrimmel, der er kendt som Double Stick 415 (3M Company). Papir-klæbestrimmel-materialet fastgøres derefter, idet man anvender den ubenyttede klæbestrimmeloverflade, langs en kant af et ark af aksialt orienteret polystyren. Det resulterende laminat udskæres derpå vinkel-35 ret på. papirstrimlen til opnåelse af materialer med målene ca. 8,9 cm x ca. 1,0 cm og med et ca. 1,0 x ca. 1,0 cm kvadrat af det imprægnerede papir ved den ene ende.

O

18

DK 153658B

Eksempel 3

Fremstilling af en ketonkontrolopløsning

Der udføres et forsøg til studium af fremstillingen 5 af ketonkontrolopløsninger under anvendelse af det strimmel-materiale, der fremstilles ifølge eksempel 2. En strimmel neddyppes med papirenden nedad i en kuvette indeholdende 12,0 ml destilleret vand, idet der drages omsorg for, at der fremkommer så lidt omrøring som muligt. Efter 30 mi-10 nutter omrystes strimlen og opløsningen grundigt, og strimlen fjernes. Den fremkomne ketonkontrolopløsning har en acetoeddikesyrekoncentration (acetoacetatkoncentration) på 15 mg-%.

15 20 25 1 35

Claims (9)

19 DK 153658B Patent krav.

1. Materiale til anvendelse ved fremstilling af en ketonkontrolopløsning, hvilket materiale omfatter en bærer, hvori der er inkorporeret en forudbestemt 5 mængde af et keton-fremkaldende middel, kendetegnet ved, at dette middel omfatter (a) en β-ketoalkansyreester med strukturformlen 0. r'-c-ch2-c-or 10 i hvilken R er en alkylgruppe med 1-6 C-atomer, og R' er en aliphatisk eller cyclisk gruppe med 1-7 C-atomer, og et hydrolyserende stof, der er i stand til at omdanne esteren til den tilsvarende β-ketoalkansyre, når esteren 15 og stoffet anbringes i et opløsningsmiddel derfor, eller (b) et alkalimetalenolat af en β-ketoalkansyreester med strukturformlen OM 0 R'-C=CH-C-OR 20 i hvilken M er et alkalimetalatom, og R og R' har den ovenfor angivne betydning.

2. Materiale ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R1 er en methylgruppe.

3. Materiale ifølge krav 1, kendeteg net ved, at esteren er methylacetoacetat, ethylaceto-acetat eller ethyl-3-keto-4-phenylbutyrat eller alkali-metalenolatet deraf.

4. Materiale ifølge ethvert af kravene 1-3, 30 kendetegnet ved, at bæreren er papir.

5. Materiale ifølge ethvert af kravene 1-4, kendetegnet ved, at det hydrolyserende stof er en base.

6. Materiale ifølge ethvert af kravene 1-5, 35 kendetegnet ved, at bæreren er fastgjort til et aflangt plastunderstøtningslegeme. O

20 DK 153658 B

7. Materiale ifølge ethvert af kravene 1-6, kendetegnet ved, at R og R' begge er methyl, og at M betegner Na+.

8. Fremgangsmåde til fremstilling af en keton- 5 kontrolopløsning, kendetegnet ved, at man bringer et forudbestemt rumfang opløsningsmiddel i kontakt med et materiale ifølge ethvert af kravene 1-7.

9. Fremgangsmåde til kalibrering af et ketonpr øveinstrument, kendetegnet ved, at man bringer 10 en forudbestemt mængde opløsningsmiddel i kontakt med et materiale ifølge ethvert af kravene 1-7 til dannelse af en kontrolopløsning, der normalt er i stand til at tilvejebringe et forudbestemt respons i instrumentet ved kontakt dermed, hvorpå man bringer kontrolopløsningen i kontakt 15 med instrumentet, iagttager det faktiske respons i instrumentet, sammenligner det faktiske respons i instrumentet med det forudbestemte respons og justerer instrumentet til frembringelse af det forudbestemte respons. 25 1 35