FI68469B - Medel anvaendbart vid framstaellning av ketonpaovisningsloesningar och foerfarande foer bestaemning av ketoner - Google Patents

Description

1 68469

Ketonien määritysliuosten valmistuksessa käytettävä väline ja ketonien määritysmenetelmä

Keksinnön kohteena on väline, jota voidaan käyttää 5 ketonien määritysliuosten valmistukseen, sekä menetelmä, jolla voidaan valmistaa ketonien määritysliuos. Tällaisia vertailutuloksia voidaan käyttää varmistamaan erilaisten ketonien määritysmenetelmien toiminta. Keksinnön kohteena onkin lisäksi menetelmä, jolla voidaan kalibroida ketonien 10 testauslaite.

Kun näytteen sisältämän aineen määritystä varten kehitetään menetelmä esimerkiksi gravimetrinen, volumetrinen tai spektrofotometrinen menetelmä, on tämän menetelmän kyky antaa luotettavia tuloksia varmistettava jollakin tavalla.

15 Muussa tapauksessa saadut tulokset ovat merkityksettömiä.

Näin ollen tällaisen menetelmän kehittämiseen liittyy paljon muutakin kuin pelkän koneen rakentaminen, reagenssien yhteensovittaminen ja toimintatavan kehittäminen. Siihen liittyy myös koevirheen arviointi. On myös keksittävä tapa, 20 jolla menetelmän antamien tietojen luotettavuutta voidaan ennustaa.

Helpoin ja suorin tapa tutkia sellaisia parametrejä kuten toistettavuus, herkkyys, tarkkuus ja kalibrointitar-ve on, että menetelmällä tutkitaan vertailunäyte, jossa tut-25 kittavan aineen läsnäolo ja/tai pitoisuus tiedetään etukäteen. Näin saatuja tuloksia voidaan verrata tunnettuihin tietoihin ja ottaa huomioon poikkeavuudet.

Asetoetikkahappo (asetyylietikkahappo) on normaali lopputuote, kun rasvahapot hapettuvat maksassa. Sitä muo-30 dostuu myös hyvin rajoitettuja määriä leusiinin, fenyyli-alaniinin ja tyrosiinin hapettavassa hajoamisessa.^-hyd-roksivoihappoa muodostuu asetoetikkahaposta reversiibelis-sä pelkistyksessä. Asetonia muodostuu asetoetikkahapon irreversiibelissä dekarboksylaatiossa.

2 i 6 8 4 6 9

CH3-C-CH2-COOH

5 asetoetikkahappo ^// \ vo *//$ \ ^ l// ' \ 10 CH -CH-CH„-COOH CH -C-CH, 3 | 2 3 3

OH

-hydroksihappo asetoni Näitä kolmea ainetta kutsutaan tavallisesti ketoniaineiksi tai asetoniaineiksi.

15 Jos virtsassa tai veressä on epänormaalin suuri mää rä ketoniaineita, puhutaan ketonivirtsaisuudesta ja ketoni-verisyydestä. Tällaiset tilanteet saattavat johtua erilaisista patologisista tiloista, kuten diabetes mellituksesta ja nälästä. Koska sairaudella ja oireella on tällainen var-20 sinkin diabetes mellituksessa, on olemassa voimakas mielenkiinto sellaisia menetelmiä kohtaan, joilla voidaan määrittää ketoniaineet virtsasta. Diabeetikolla ketonivirtsaisuu-den havaitseminen on tärkeää, sillä se usein indikoi muutosta insuliiniannoksessa tai muussa sairauden hoitoon liitty-25 vässä tekijässä. Näin ollen lääketieteessä on osoitettu suurta mielenkiintoa ketoniaineiden analysointiin ja tämä on johtanut useiden sellaisten menetelmien kehittämiseen, jotka ovat herkkiä virtsan sisältämien ketoniaineiden läsnäololle ja/tai pitoisuudelle.

30 Mutta mielenkiinto ketoniaineiden läsnäolon seuraami seen ei rajoitu pelkästään lääketieteeseen. Ketoneilla on hyvin suuri määrä teollisia sovellutuksia - niitä käytetään liuottimina nitroselluloosapinnoitteissa ja vinyylikalvoissa, maalinpoistoaineina, puhdistusnesteinä, orgaanisissa syntee-35 seissä, räjähdysaineiden valmistuksessa ja elintarvikkeiden lisäaineina - ja kaikissa näissä tulee jossakin vaiheessa eteen tarve määrittää ketonien läsnäolo ja/tai pitoisuus.

Nämä ja lukuisat muut tarkoitukset ovat antaneet aiheen 3 68469 useiden ketonitestien kehittämiseen.

Yksi tällainen koe käyttää hyväkseen ketonien taipumusta reagoida natriumnitroferrisyanidin kanssa niin, että 5 muodostuu voimakkaita värejä. Niinpä, kun asetonia käsitellään nitroferrisyanidilla, muodostuu voimakas punakeltainen väri, joka muuttuu vaaleanpunaisenvioletiksi, kun seos tehdään happamaksi etikkahapolla /vrt. Fritz Feigl, Spot Tests in Organic Analysis, 7. painos (1 966)_/- Tämä ilmiö johtuu 10 siitä, että nitroferrisyanidin NO-ryhmä liittyy ketoniin niin, että muodostuu isonitrosoketoni, joka pystyy reaktio-seoksessa värillisenä anionikompleksina. Nitroferrisyanidin rauta (III) pelkistyy kahdenarvoiseksi raudaksi (II). On havaittu, että ketonit, jotka eivät sisällä karbonyyliryhmiin 15 liittyneitä metyyli- tai metyleeniryhmiä, eivät ole reaktiivisia tai ne eivät ainakaan muodosta värillisiä yhdisteitä nitroferrisyanidin kanssa.

Samaan tai samanlaisiin kemiallisiin reaktioihin perustuvat ketoneille herkät reagenssiliuskat N-MULTISTIX® ja 20 KETO-DIASTIJ^ ja reagenssitabletti ACETES1®, joita kaikkia markkinoi Ames Division of Miles Laboratorien, Inc. Kaikki nämä kolme ketoriaineiden määritysvälinettä perustuvat nitroferrisyanidin ja ketonin väliseen kompleksimuodostukseen. Niinpä, kun reagenssiliuskat kastetaan ketonin vesiliuokseen 25 tai tabletti saatetaan kosketukseen tällaisen liuoksen kanssa, muodostuu värillinen kompleksi, joka ilmaisee, että keto-nia on läsnä. Lisäksi ketonin pitoisuus voidaan arvioida muodostuneen värin voimakkuuden ja sävyn mukaan.

Nämä ja muut ketoniaineiden määritysmenetelmät tar-30 vitsevat lisäksi keinon, jolla voidaan arvioida niiden tarkkuus ja koetta suorittavan henkilön pätevyys. Eräs tällainen keino on käyttää vertailunäytettä, jonka kemiallisella koostumuksella ja fysikaalisilla ominaisuuksilla simuloidaan analysoitavaa näytettä. Vertailunäyte voi olla esim. virtsa-35 näyte, jota on pidetty jäädytettynä, tai kylmäkuivaamalla vä-kevöity virtsanäyte, joka laimennetaan ennen käyttöä.

68469 Tällaisista markkinoilla olevista vertailunäytteistä voidaan mainita TEK-CHEI^, jota markkinoi Ames Division of Miles Laboratories Inc., ja jossa käytetään hyväksi tietyn pH-indikaattorin vaikutusta sellaisen puskuriaineen läsnä-5 ollessa, jota käytetään kaupallisesti saatavissa olevissa reagenssiliuskoissa, joissa on ketoneille reagoivat alueet. Näin ketonin korvikkeena käytettynä TEK-CHEK antaa vertai-luliuoksen, jolla tulee positiivinen tulos käytettäessä seu-raavia Ames Division -tuotteita: BILI-LABSTIX®, LASBSTIX®, 10 KETO-DIASTI)^, KETOSTI)^, MULTISTIX®, N-MULTISTIX® ja ACETES1®. Ames Divisionin tuotekirjallisuudessa TEK-CHEK:n kuvataan sisältävän lyofilisoitua virtsaa, jossa on ketonien kemiallista korviketta. Korvikeaineitta käytetään siksi, että ketoneja on vaikea säilyttää luonnontilassa. Näin ollen 15 TEK-CHEK:ssä käytetään pH-indikaattoria simuloimaan virtsaa, joka sisältää patologisia määriä ketoaineita.

Mutta kaupallisesti saatavissa olevia ketonien ver-tailuliuoksia markkinoivat Warner-Lambert Pharmaceutical Co. ja American Hospital Supply Co., joiden tuotteet ovat neste-20 mäisiä ja sisältävät asetonia aktiivisena ketoniaineena.

Vielä eräs tuote on KovaTrol, jota markkinoi I.C.L. Scientific of Fountain Valley, California, ja jota pitää säilyttää jääkaapissa .

US-patenttijulkaisussa nro 3 920 400 (Scheibe et ai.) 25 selostetaan virtsahappostandardiliuosta, jossa virtsahapon litiumsuolaa käytetään vertailuaineena ja läsnä on myös aine, joka muodostaa komplekseja korkeammissa hapetusasteissa olevien polyvalenttisten metallien kanssa. Tyypillisinä komp-leksimuodostaja-aineina mainitaan malonihappo, salisyylihap-30 po, oksaalihappo, glutationi, kysteiini, 8-oksikinoliini ja etyleenidiamiinitetraetikkahappo. Lisätyn kompleksointiaineen tarkoituksena on stabiloida virtsahappo ja estää sen hajoaminen liuoksessa.

Erästä toista esimerkkiä vertailuaineesta on selostet-35 tu US-patenttijulkaisussa nro 3 920 580. Kyseessä on nestemäinen vertailuaine glukoosin määritykseen verestä tai see- 5 68469 rumista. Se sisältää vettä, glukoosia ja diffuusionestoai-netta, joka on hydrofiilinen polymeeri.

Eräitä kolesteroliemisukkinaattisuoloja selostetaan hyödyllisinä kolesterolin vertailuaineina US-patenttijulkai-5 sussa 3 859 047.

US-patenttijulkaisu 4 193 766, koskee välinettä, jolla voidaan valmistaa ketonivertailuliuoksia käyttämällä substraattina tiettyjä asetyyliasetonin ja sen homologien ja ja eräiden metalli-ionien komplekseja (ks. myös DE-hakemus-10 julkaisu 27 21 681). Jotkut ketoneille herkät reagenssit eivät reagoi tällaisten asetyyliasetonaattien kanssa ja toiset vähemmän spesifiset taas reagoivat niiden kanssa. Juuri viimeksi mainittujen ketonireagenssien kohdalla asetyyliaseto-naatit toimivat vertailusubstraatteina.

15 Yhteenvetona ennestään tunnettujen ratkaisujen kohdalla voi daan mainita, että tunnetaan useita vertailuliuosten aineosia. TEK-CHEK -liuoksissa on ketonien substituenttina tunnettu pH-indikaattori, joka reagoi puskurointiaineiden kanssa, joita käytetään tavallisesti ketonimäärityksiin tarkoitetuissa 20 välineissä. Muita ennestään tunnettuja vertailuaineita ovat mm. virtsahappo, glukoosi, kolestroli jne. Monet tällä hetkellä markkinoilla olevat nestemäiset systeemit sisältävät asetonia. Missään aikaisemmissa menetelmissä ei kuitenkaan käytetä sellaisia vertailuaineita kuin nyt käsillä olevassa 25 keksinnössä. Missään ei selosteta ketonien määrityksen ver-tailuvälinettä, jossa käytetään (^-ketoalkaanihapon ja emäksisen aineen yhdistelmää, kuten nyt käsillä olevassa keksinnössä .

Tämä keksintö poikkeaa ennestään tunnetuista toteu-30 tustavoista perustavaa laatua olevalla tavalla. Enää ei tarvitse käyttää nestemäisiä valmisteita, jotka sisältävät asetonia tai jotakin muuta nestemäistä ketonia. Tässä keksinnössä käytetään aktiivisena aineena kuivaa, helposti varastoitavissa olevaa materiaalia, joka liuoksessa ollessaan on 35 välittömästi reaktiivinen ketoneille herkän testin reagens-seille. Tarkemmin sanottuna keksinnössä muodostuu (b -keto- 68469 alkaanihappoa in situ. Tämän keksinnön mukaisesti ei tarvita nestemäisiä reagenssejä ja/tai ketoneja korvaavia aineita, kuten pH-indikaattoreita, jotka ovat herkkiä ketoneille herkän reagenssisysteemin puskureille. Niinpä tämän keksinnön 5 kohteena on kuiva väline, joka on stabiili varastoinnissa ja helposti käsiteltävissä, ja jonka avulla voidaan muodostaa ketonien vertailuliuoksia, joiden tarkkuus pitoisuuden suhteen ja toistettavuus ketoneille herkässä testissä ovat erinomaiset.

10 Keksinnön mukaiselle välineelle on tunnusomaista, että se muodostuu kantimesta, johon on sisällytetty tietty määrä seosta, jossa on (a) β> -ketoalkaanihappoesteriä, jolla on kaava 15 0 0

H II

r'-c-ch2-c-or jossa R on alempi alkyyliryhmä ja R' on noin 1-7 hiiliatomia sisältävä alifaattinen tai syklinen ryhmä, ja 20 (b) hydrolysointiainetta, joka kykenee muuntamaan es terin vastaavaksi ^-ketoalkaanihapoksi, kun esteri ja hydro-lysointiaine sijoitetaan sopivaan liuottimeen.

Tässä yhteydessä käytetyllä termillä "kännin" tarkoitetaan sopivia välineitä, joihin tietty määrä esteriä ja 25 hydrolysointiainetta voidaan sijoittaa. Kyseeseen tulevat mm. kapselit, kuten liivatekapselit, jotka liukenevat veteen tai voidaan muuten avata niin, että sisältö vapautuu. Kapseli voi myös olla perforoitu niin, että käytössä liuotin tunkeutuu kapselin sisälle ja uuttaa mukanaan sisällä olevat aineet.

30 Kyseessä voi myös olla metallifolio tai muu suljettava materiaali, jonka sisällä esteri ja hydrolysointiaine ovat ennen käyttöä, ja josta aineosat avauksen jälkeen voidaan tyhjentää tiettyyn määrään vettä. Edelleen kännin voi olla kantajamat-riisi, joka voi muodostua hyvin erilaisista materiaaleista.

35 Kantajamatriisi, esteri ja hydrolysointiaine voivat olla sekoitettuina toisiinsa ja käyttöä varten ne voidaan upottaa 68469 tiettyyn määrään vettä ja matriisi poistaa niin, että rea-genssit jäävät liuokseen.

Kun käytetään kantajamatriisia, se voi olla mitä tahansa ainetta, johon reagenssit voidaan sisällyttää. Matriisi 5 voi olla esim. sellainen, jota käytetään reagenssiliuskoissa, joilla tehdään liuotinanalyysejä. Esim. US-patenttijulkaisussa nro 3 846 247 selostetaan huovan, huokoisten keramiikka-liuskojen ja kudottujen tai huokoisten kuitujen käyttöä. US-patenttijulkaisussa nro 3 552 928 selostetaan puutikkujen, 10 kankaan, sienen ja savimateriaalin käyttöä. GB-patenttijulkaisussa nro 1 369 139 ehdotetaan syntettisestä hartsista tai lasikuidusta tehtyjen huopien käyttöä paperin tilalla. Toisessa GB-patenttijulkaisussa nro 1 349 623 ehdotetaan ohutta kuitumaisen materiaalin muodostamaa kerrosta, joka on 15 paperimatriisin päällä. Tässä julkaisussa ehdotetaan myös sitä, että paperiin imeytetään osa reagenssisysteemistä ja huokoiseen osaan loput reagenssisysteemistä, jos niitä ei voida sovittaa yhteen. Ranskalaisessa patenttijulkaisussa nro 2 170 397 selostetaan sellaisten kantajamatriisien käyt-20 töä, jotka sisältävät yli 50% polyamidikuituja. Lisäksi US-patentti julkaisussa nro 4 046 513 selostetaan menetelmää, jolla reagenssit painetaan sopivaan kantajamatriisiin. US-patentti julkaisussa nro 4 046 514 ehdotetaan sitä, että rea-genssejä sisältävät kuidut kudotaan toisiinsa. Kaikkia täl-25 laisia kantajamatriisiperiaatteita voidaan soveltaa myös tähän keksintöön. Edullinen kantajamatriisi on nestettä imevää materiaalia, kuten suodatinpaperia, ja matriisin imeyt-tämisessä käytetään esterin ja hydrolysoivan aineen liuosta. Kyseeseen voi myös tulla systeemi, jossa aineosat ovat poly-30 meerisen mikrokapselien sisällä, ja mikrokapselit särkyvät joutuessaan kosketukseen näytteen kanssa. Systeemi voi myös olla sellainen, että aineosat yhdistetään kantajamatriisin nestemäisessä tai puolinestemäisessä muodossa, joka myöhemmin kovettuu niin, että aineosat kiinnittyvät.

35 Kuten jo edellä mainittiin, tämän keksinnön sisältä mä esteri on ^-ketoalkaanihapon esteri. Edellä olevassa esterin rakennekaavassa ryhmän R määritelmä "alempi alkyyli" 68469 tarkoittaa 1-6 hiiliatomia sisältäviä alkyyliryhmiä, joita ovat mm. metyyli, etyyli, n-propyyli, isopropyyli, syklopro-pyyli, n-butyyli, sek.-butyyli, tert.-butyyli, isobutyyli, syklobutyyli ja kaikki pentyyli- ja heksyyliryhmien isomee-5 rit. Sen sijaan ryhmä R' on merkitykseltään paljon laajempi. Se sisältää alifaattiset ja sykliset ryhmät, joissa on noin 1-7 hiiliatomia. Nämä voivat olla tyydytettyjä, tyydyttymät-tömiä, aromaattisia, substituoituja tai substituoimattomia. Erittäin edullisia tässä keksinnössä käytettäviksi ovat sel-10 laiset esterit kuin metyyliasetoasetaatti, etyyliasetoase-taaatti ja etyyli-3-keto-4-fenyylibutyraatti. Muita ovat 1,10-di(asetoasetyyli)dekaani, etyyli-2-metyyliasetoasetaat-ti ja etyyli-p-fluoribentsoyyliasetaatti. Myös monet muut f?> -ketoalkaanihapon esterit kuuluvat tämän keksinnön katta-15 maan alaan niin, että ainoa rajoittava seikka on se, että esterin pitää hydrolysoitua hydrolysointiaineen läsnäollessa niin, että syntyy vastaava (& -ketoalkaanihappo.

Samoin tähän keksintöön sopivia hydrosointiaineita on lukuisia. "Hydrolysointiaineella" tarkoitetaan happoa 20 tai emästä, joka hydrolysoi esterin. Joitakin tähän tarkoitukseen sopivia happoja ovat tolueenisulfonihapot, bent-seenisulfonihappo, sulfosalisyylihappo, naftaleenidisulfoni-hapot jne. Emäksiset aineet ovat kuitenkin etusijalle asetettavia. Näitä ovat mm. kaliumkarbonaatti, natriumkarbo-25 naatti, natriumhydroksidi, kaliumhydroksidi ja näiden seokset sekä natriumkarbonaatin ja mainittujen aineiden seokset.

Hydrolysointiaineen valinnan kriteerio on liuoksen lopullinen pH. Jos käytetyn emäksen antama pH on liian alhainen, ei esteri ehkä hydrolysoidu tai reaktio tapahtuu 30 liian hitaasti. On havaittu, että emäksisen aineen pitäisi olla niin voimakas tai sitä pitäisi olla läsnä niin paljon, että pH-arvoksi tulee vähintään noin 10.

Keksinnön kohteena olevalle menetelmälle, jolla voidaan valmistaa ketonien määritysliuos, onkin tunnus-35 omaista, että tietty määrä liuotinta saatetaan kosketukseen keksinnön mukaisen välineen kanssa.

9 68469

Kuviosta 1 ilmenee pH: n ja keksinnön mukaisesti edullisen metyyliasetoasetaatin hydrolysoitumisen välinen riippuvuus. Käyrästä ilmenee hydrolysoituneen esterin määrä heijastumis-suhteen (%) avulla määritettynä ajan (min) funktiona, kun 5 metyyliasetoasetaattipitoisuus on 0,150 g/dl (g-%) ja pH-arvot 8,8, 9,8, 10,9 ja 12,7. Tuloksista ilmenee, että hydrolysoitumista asetoetikkahapoksi ei tapahtunut juuri lainkaan pH-arvossa 8,8 kolmenkaan tunnin kuluessa, kun taas lähes täydellinen hydrolysoituminen tapahtui 30 minuutissa 10 pH-arvossa 12,7. Huomattavaa hydrolysoitumista alkoi tapahtua pH-arvossa 9,8. Tuloksista ilmenee, että pH*.n kynnysarvo merkittävälle hydrolysoitumiselle on 10, jolloin vertai-luliuokseen muodostuu ketonin korviketta.

Kun keksintöä tarkastellaan näiden teoreettisten ja 15 kokeellisten näkökohtien kannalta, nousee hydrosointiaineen valinta tärkeämmäksi seikaksi rutiinilaboratoriokokeita ajatellen. Tarvitsee vain sisällyttää esteri ja hydrolysointi-aine kantimeen ja valmistaa vertailuliuos. ^-ketoalkaaniha-pon kehittymistä voidaan sitten seurata spektrofotometrisesti 20 tai jollakin muulla tunnetulla tavalla. Jos ketohappoa kehittyy liian vähän, ei hydrolysointiaine ole sopiva eli pH-arvo ei ole esterin hydrolysoitumisen kannalta riittävän korkea.

Se (^-ketoalkaanihapon esterin määrä, joka tämän kek-25 sinnön mukaisesti tulee sisällyttää kantimeen, riippuu useista parametreistä. Ensinnäkin se tietty systeemi, josta ketonit halutaan analysoida, vaatii analyyttisen systeemin, joka vastaa tiettyä ketonien väkevvysaluetta. Tämä väkevyys-alue vaihtelee systeemistä toiseen. Esim. patologisia virtsa-30 analyysejä varten tarvitaan N-MULTISTIX:n ketoneille herkkä alue, joka vastaa ketonien väkevyyttä 3-160 mg/dl (mg-%). Näin ollen tarvitaan N-MULTISTIX -reagenssiliuskoja varten sellainen määrä esteriä, että värinmuutos indikoi tämän alueen ketöniväkevyyksiä.

35 Toinen määräävä tekijä on se tilavuus, jonka suurui seksi kontrolliliuos halutaan valmistaa. Niinpä, jos väli- 10 68469 neeseen on sijoitettu niin paljon aineosia, että 30 ml:11a vettä laimennettuna saadaan N-MULTISTIX -reagenssiliuskaa vastaava tulos, sama väline antaa liian voimakkaan vasteen 12 ml:11a vettä ja liian heikon vasteen 1 litralla vettä. On 5 siis sanottava, että kantimen pitää sisältää vähintään niin paljon esteriä, että saadaan haluttu ketonipitoisuus tietyllä liuotinmäärällä. Virtsa-analyyseissä tuo pitoisuusalue on noin 0,1 - 160 mmoolia/1.

Eräässä tämän keksinnön toteutustavassa kantimeen 10 sisällytetään esterin natriumenolaattijohdannaista. Tiedetään esimerkiksi ennestään varsin hyvin, että useimmat alkoholit reagoivat metallien, kuten natrium, kanssa niin, että syntyy alkoksideja. Viimeksi mainitut reagoivat erittäin helposti \eden kanssa niin, että syntyy alkoholi ja me-15 tallinen hydroksidi. Tämä voidaan esittää seuraavilla yhtälöillä: R-OH + Na-> RoNa + 1/2 HJ' (1) 20 RONa + H20-»RÖH + NaOH (2) l^-ketoalkaanihappojen esterien tapauksessa keto-enolitau-tomeriailmiö aiheuttaa seuraavan reaktiosekvenssin:

25 0 0 OH O

« i i « R'-C-CH2-C-OR^-R' -C=CH-C-OR (3)

OH O ONa O

IN I II

R' -C=CH-C-OR + Na--*R' -OCH-C-OR + 1/2 H^ (4) 30

ONa O OH O

• l i i R*-C=CH-C-OR + H2°~ -.........>R'-C=CH-C-OR + NaOH (5)

OH C OO

I h v " < 35 R'-OCH-C-OR--R '-C-CH2~C-OR (6) 68469

Kun yhtälöt 5 ja 6 yhdistetään, saadaan nettoreaktioksi ONa 0 00

Il f ti R1 -C=CH-C-0R + H20-> R'-C-CH2-C-0R + NaOH (7) 5 Yhtälöstä 7 voidaan havaita, että |^-ketoalkaanihapon esterin natriumalkoksijohdannainen muuttuu vettä lisättäessä esteriksi ja natriumhydroksidiksi. Tämä reaktio on erittäin nopea ja käytännöllisesti katsoen irreversiibeli. Niinpä tämän keksinnön kannalta katsotaan |^-ketoalkaanihapon este-10 rin alkalimetallijohdannainen samanarvoiseksi kuin yhdistelmä, joka sisältää esteriä ja hydrolysointiainetta, joka kykenee hydrolysoimaan esterin vastaavaksi ^-ketoalkaanihapoksi. Tämä voidaan helposti havaita, kun yhtälön 7 oikea puoli johdetaan askelta pidemmälle.

15 0 0 0 0 R'-C-CH2-C-0R + H20^4*R'-C-CH2-C-0H + R0H (8) Näin ollen yhdistelmä voi sisältää alkalimetallieno-laatin, jolla on seuraava rakenne 20 OM 0

I II

R1 -C=CH-C-0R

jossa R' ja R ovat edellä määriteltyjä ja M on alkalimetal- li-ioni. Tällaisia yhdisteitä ovat mm. etyyliasetoasetaatin 25 natriumsuola (Aldrich Chemical Co.) ja metyyliasetoasetaatin natriumsuola. M voi olla litium, natrium, kalium tai rubidium.

Edullisessa koevälineen valmistusmenetelmässä suodatinpaperi imeytetään perättäisestä hydrolysointiaineella ja esterillä. Niinpä suodatinpaperi upotetaan hydrolysointiai-30 neen vesiliuokseen, kuivataan, upotetaan esterin alkoholi-liuokseen ja kuivataan jälleen. Kun paperimatriisi näin sisältää tarvittavat aineosat, se kiinnitetään jäykälle tai puolijäykälle tukialustalle, kuten polystyreenikalvolle. Kaksipuolinen teippi on havaittu erittäin sopivaksi kiinni-35 tystarkoitukseen. Ennen asettamista, imeytetty paperi leikataan kapeiksi kaistoiksi. Kaistaleet kiinnitetään kaksipuo- 12 68469 lisella teipillä polyesterikalvoon sen toista reunaan pitkin. Sitten suodatinpaperin ja polystyreenin yhdistelmä leikataan kaistoiksi, joiden toisessa päässä on imeytetty suodatinpaperi ja toinen pää toimii kädensijana.

5 Keksinnön mukaiselle menetelmälle, joka voidaan kalibroida ketonien testauslaite, on tunnusomaista, että tietty määrä liuotinta saatetaan kosketukseen keksinnön mukaisen välineen kanssa niin, että syntyy määritysliuos, joka normaalisti kykenee tuottamaan tietyn vasteen testaus-10 laitteessa, kun liuos saatetaan kosketukseen sen kanssa, määritysliuos saatetaan kosketukseen laitteen kanssa, havaitaan todellinen vaste laitteessa, verrataan todellista vastetta, että se näyttää ennalta tiedettyä vastetta.

Keksintöä valaistaan seuraavilla esimerkeillä.

15 Esimerkki I

Metyyliasetoasetaatin hydrolysointi eri pH-arvoilla

Kokeessa tutkittiin metyyliasetoasetaatin hydrolysoitumista eri pH-arvoilla. Metyyliasetoasetaatista valmistettiin liuoksia vesipuskureihin. Asetoasetaattia seurattiin 20 liuoksista tietyin aikavälein. Kuviossa 1 esitetyistä tuloksista ilmenee, että hydrolysoitumista ei merkittävässä määrin tapahtunut ennen kuin oli saavutettu pH 9,8.

Tässä kokeessa käytettiin neljää puskuriliuosta, joiden pH:t olivat 9, 10, 11 ja 13. pH 9-puskuri saatiin fir-25 malta Fisher Scientific Supply Company, Catalogue No. SO-B-114. Se sisältää boorihapon, kaliurakloridin ja veden vesiliuosta. pH 10-puskuri saatiin firmalta J.T. Baker Chemical Company, Borate Buffer Solution No. 1-5609. pH 11-puskuri valmistettiin 1M ^CO^in vesiliuoksesta lisäämällä siihen 30 IN HC1, kunnes pH-mittari näytti arvoa 11. pH 13-liuos oli 0,1N NaOH.

100 ml:aan kutakin puskuria lisättiin 0,15 g metyy-liasetoasetaattia. Lopulliset pH-arvot olivat 8,8, 9,8, 10,9 ja 12,7, jolloin pienet alenemat johtuivat esterin lisää-35 misestä. Reaktion kulkua seurattiin käyttämällä apuna suo-datinpapereita, joihin oli imeytetty ketoneille herkkä sys- 13 68469 teemi, joka antoi vaaleanpunaisen värin, kun asetoasetaattia oli läsnä, mutta hydrolysoitumaton esteri ei aiheuttanut vä-rinmuutosta. Tällainen systeemi on kuvattu täysin US-patent-tijulkaisussa nro 4 147 514.

5 Värinmuodostusta seurattiin käyttämällä spektrofoto- metriä, jonka heijastuneen valon alue oli 580 ja 720 mm. Reagenssiliuskat oli ensin kalibroitu mittaamalla väkevyydeltään tunnettujen asetoasetaattiliuosten prosentuaalinen heijastumissuhde. Tulokset on esitetty taulukossa.

10 Kuviossa 1 on esitetty neljän liuoksen heijastumissuhde (%) ajan (min) funktiona.

14 68469

Taulukko

Puskurin Aika %-heijastumissuhde Asetoasetaatti pH_(min)_(mg-%) 8.8 0 77,8 0 5 20 73,5 1 50 72,0 1,2 180 57,3 9,0 9.8 0 75,9 0,5 20 59,4 8,0 10 30 53,4 12,5 45 46,0 21,0 60 40,4 23,5 90 35,1 37,5 120 30,2 49,0 15 180 27,6 59,0 10,9 0 74,1 1,0 20 53,7 12,0

30 28,8X 54,0X

45 39,9 30,0 20 60 36,7 35,0 90 34,4 38,0 120 33,6 40,0 180 31,6 45,0 12,7 0 68,5 2,0 25 20 31,6 45,0 30 25,7 65,0 45 21,4 93,0 60 21,4 93,0 90 19,5 115,0 30 120 19,0 120 180 18,6 125

X

anomaliakohta 35 Kuvion käyrä 1 esittää edellä annettuja pH-arvon 8,8 tietoja. Kuten voidaan havaita, jopa kolmessa tunnissa ei tapahtunut kuin vähän hydrolysoitumista ( < 8 % teoreettisesta 68469 15 saannosta). Sen sijaan käyristä 2, 3 ja 4 ilmenee esterin huomattava hydrolysoituminen, so. asetoasetaatin muodostuminen, vain 20 minuutin kuluessa. Kun pH kasvoi arvosta 9,8 arvoon 12,7 (käyrät 2, 3 ja 4) esteri hydrolysoitui nopeam-5 min ja suuremmassa määrin.

Esimerkki II

Edullisen välineen valmistus Tässä kokeessa valmistettiin erilaisia välineitä, joita voidaan käyttää ketonivertailuliuoksen valmistuksessa.

10 Jokainen väline muodostui suodatinpaperineliöstä, joka oli asennettu polystyreeniliuskan toiseen päähän. Paperi imeytettiin kaliumkarbonaatilla ja metyyliasetoasetaatilla.

Kaista Eaton and Dikeman nro 222 suodatinpaperia (noin 5 x 25 cm) kasteltiin 2,54 M (35 g/dl) ^CC^rn vesiliuokseen 15 (tislattu), otettiin ylös, kun se oli täysin kyllästetty, ja kuivattiin 15-25 minuuttia ilmauunissa noin 70°C:ssa. Sitten kuivattu paperi kastettiin toiseen liuokseen, joka sisälsi 20 g metyyliasetoasetaattia per 100 ml etanolia (23A), otettiin ylös ja kuivattiin 15-25 min ilmauunissa 70°C:ssa.

20 Tämän jälkeen aineosilla kyllästetty paperi kiinni tettiin kaksipuolisen teipin (Double Stick 415, 3M Company) toiseen puoleen. Sitten paperi-teippiyhdistelmä kiinnitettiin aksiaalisesti orientoidun polystyreenilevyn (Plastic Suppliers, Inc.) toiseen reunaan. Saatu laminaattilevy lei- 25 kattiin paperiliuskaa vasten kohtisuorassa suunnassa niin, että saatiin liuskoja (noin 9x1 cm), joiden toisessa päässä 011 imeytetty paperineliö (lxl cm).

Esimerkki III

Ketonivertailuliuoksen valmistus 30 Tässä kokeessa tutkittiin ketonivertailuliuosten val mistusta käyttämällä esimerkissä II valmistettuja liuskoja. Liuska kastettiin paperipuoli edellä kyvettiin, jossa oli 12 ml tislattua vettä, ja samalla huolehdittiin siitä, että esiintyi mahdollisimman vähän sekoitusta. 30 minuutin kulut- 35 tua liuskaa ja liuosta sekoitettiin perusteellisesti ja liuska poistettiin. Näin saadun ketonivertailuliuoksen asetoetik-kahappopitoisuus (asetoasetaattipitoisuus) oli 15 mg-%.

Claims (9)

68469

1. Väline, jota voidaan käyttää ketonien määritys-liuosten valmistukseen, tunnettu siitä, että se muo- 5 dostuu kantimesta, johon on sisällytetty tietty määrä seosta, jossa on (a) /3-ketoalkaanihapposteriä, jolla on kaava O O

10 R'-C-CH2~C-OR jossa R on alempi alkyyliryhmä ja R' on noin 1-7 hiiliatomia sisältävä alifaattinen tai syklinen ryhmä, ja (b) hydrolysointiainetta, joka kykenee muuntamaan es-15 terin vastaavaksi ^J-ketoalkaanihapoksi, kun esteri ja hydro- lysointiaine sijoitetaan sopivaan liuottimeen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunnet-t u siitä, että esteri on metyyliasetoasetaatti, etyyliaseto-asetaatti tai etyyli-3-keto-4-fenyylibutyraatti.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen väline, tun nettu siitä, että se muodostuu kantajamatriisista, johon on sisällytetty (a) tietty määrä (alempi alkyyli)asetoasetaat-tia ja (b) emäksistä ainetta, joka kykenee hydrolysoimaan (alempi alkyyli)asetoasetaatin niin, että muodostuu asetoetik-25 kahappoa, ja tukialustasta, joka on pitkänomainen muovilius-ka, johon kantajamatriisi on kiinnitetty.

4. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-3 mukainen väline, tunnettu siitä, että hydrolysointiaine on emäs.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunnet-30 t u siitä, että se muodostuu kantimesta, johon on sisällytetty yhdistettä, jolla on kaava OM O R'-C=CH-C-OR 35 68469 jossa R on alempi alkyyliryhmä, R* on noin 1-7 hiiliatomia sisältävä alifaattinen tai syklinen ryhmä ja M on alkalime-talli-ioni.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen väline, tunnet-5 t u siitä, että R ja R' ovat kumpikin metyyliryhmiä ja M on Na+ .

7. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-6 mukainen väline, tunnettu siitä, että kännin on paperi.

8. Menetelmä, jolla voidaan valmistaa ketonien mää-10 ritysliuos, tunnettu siitä, että tietty määrä liuotinta saatetaan kosketukseen minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-7 mukaisen välineen kanssa.

9. Menetelmä, jolla voidaan kalibroida ketonien tes-tauslaite, tunnettu siitä, että tietty määrä liuotin- 15 ta saatetaan kosketukseen minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-7 mukaisen välineen kanssa niin, että syntyy määritys-liuos, joka normaalisti kykenee tuottamaan tietyn vasteen testauslaitteessa, kun liuos saatetaan kosketukseen sen kanssa, määritysliuos saatetaan kosketukseen laitteen kanssa, ha-20 valtaan todellinen vaste laitteessa, verrataan todellista vastetta ennalta tiedettyyn vasteeseen ja säädetään laite niin, että se näyttää ennalta tiedettyä vastetta. D , 68469