DK153491B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af et 4'-0-tetrahydropyranyl- eller 4',14-bis(0-tetrahydropyranyl)-anthracyclinglycosid eller et ugiftigt syreadditionssalt deraf - Google Patents

Description

DK 153491B

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt 4'-O-tetrahydropyranyl-eller 4 1,14-bis (0-*tetrahydropyranyl) -anthracyclinglycosid med den almene formel o OH f 1

OCH, 0 OH

5 3 0 (I) o - hvori R3- betyder et hydrogenatom eller en tetrahydropyranyl-oxygruppe, eller et ugiftigt syreadditionssalt deraf. Disse forbindelser har antibiotisk virkning.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man 10 omsætter et anthracyclinglycosid med formlen O 9H »i 2 R·4·

OCH O OH I

O (II) r<^ H° Æh^ hvori r3· betyder et hydrogenatom eller en tetrahydropyranyl-oxygruppe, eller et syreadditionssalt deraf med 3,4-dihydro-2H-pyran i et inert organisk opløsningsmiddel og under til-15 stedeværelse af en sur katalysator og, om Ønsket, omdanner

H

2

DK 153491 B

den dannede forbindelse med formlen I til et ugiftigt syreadditionssalt deraf eller, om nødvendigt, omdanner et dannet syreadditionssalt af forbindelsen med formlen I til den fri forbindelse eller til et andet ugiftigt syreadditionssalt 5 deraf.

Et antal anthracyclinglycosider er beskrevet i litteraturen. Blandt disse har daunomycin (US-patentskrift nr. 3.616.242 og GB-patentskrift nr. 1.003.383) og adriamycin (US-patentskrift nr. 3.590.028 og nr. 3.803.124), som er de kendte 10 forbindelser, der er nærmest beslægtede med forbindelserne med formlen I, og som udvindes fra dyrkningsvæsken fra dyrkningen af visse streptomyces-arter, et bredt antitumorspek-trum mod forskellige eksperimentelle tumorer og anvendes klinisk som stærke kemoterapeutiske midler. Til trods for 15 adriamycins og daunomycins nytte som kliniske antitumormidler er det kendt, at de har alvorlige bivirkninger, såsom alopecia, leukopenia og kardiotoksicitet.

Det har vist sig, at forbindelserne med formlen I har en kraftigere anticanceraktivitet og lavere toksicitet end 20 de ovennævnte kendte analoge forbindelser.

Udtrykket "ugiftige syreadditionssalte" omfatter syreadditionssalte af forbindelser med formlen I med alle de organiske og uorganiske syrer, der er almindeligt anvendt til fremstilling af i det væsentlige ugiftige salte af lægemid-25 ler, som indeholder aminfunktioner. Sådanne salte kan eksempelvis dannes af syrer som svovlsyre, phosphorsyre, saltsyre, hyirogenbromid, salpetersyre, phosphorsyrling, eddikesyre, propionsyre, maleinsyre, voleinsyre, palmitinsyre, citronsyre, ravsyre, vinsyre, fumarsyre, glutaminsyre, pantothensyre, 30 laurylsulfonsyre, methansulfonsyre og naphthalensulfonsyre.

Forbindelserne med formlen I eksisterer som de individuelle : diastereomere (heri arbitrært betegnet som isomer a og isomer b) , som har forskellig konfiguration i C-2-positionen i tetrahydropyranyloxygruppen, eller som blandinger af sådanne lp 3

DK 153491B

isomere. Den foreliggende opfindelse omfatter fremstillingen af såvel de enkelte diastereomere som diastereomerblandingerne.

På tegningen viser fig. 1 det infrarøde absorptionsspektrum (KBr) af 5 4'-O-tetrahydropyranyldaunomycin (isomer a), fig. 2 det infrarøde absorptionsspektrum (KBr) af 4'-O-tetrahydropyranyldaunomycin (isomer b), fig. 3 det infrarøde absorptionsspektrura (KBr) af 4·,14-bis(O-tetrahydropyranyl)adriamycin (isomer a), 10 fig. 4 det infrarøde absorptionsspektrum (KBr) af 414-bis(O-tetrahydropyranyl)adriamycin (isomer b) og fig. 5 til 8 proton-NMR-spektreme (100 MHz, CDCl^) af forbindelserne i samme rækkefølge som de ovennævnte infrarøde absorptionsspektrer.

15 14-O-Tetrahydropyranyl-adriamycin og daunomycin, som er udgangsmaterialer til fremstilling af de omhandlede forbindelser, har formlerne 0 Od 20 0 i li i: Ul2 All JH 13" 1 2ΛΛΛΛκμ3

Il g0H

4T 5 Π 6 [ (7

OCHj 0 OH

0 Daunomycin " ' Ίτ\ "Ab Nla..

HO^—f I 2« 11¾ og .

|| 4

DK 153491 B

«·· · Ί O OH i o O » li n 1 J}2 111 3? 15 g CH.Q-/ 2 ΑΛ/Υν % v_>

J |l π I J °H

^ οΓ^^Ιγ

OCH^ O OH

O

14-O-Tetrahydropyranyl- " -o adriamycin h , /CK, \ K ^ z1'

Hov-f 1 2' .«% .

Daunomycin har to reaktive hyiroxylgrupper (eksklusive de to phenoliske hydroxylgrupper) på C-9 og C-4', og 14-O-tetrahydro-pyranyl-adriamycin har to reaktive hydroxylgrupper (igen eks-5 klusive de tb phenoliske grupper) på C-9 og C-4'.

Udgangsanthracyclinglycosidet kan være en fri base eller et syreadditionssalt. Da syreadditionssaltene af tetrahydro-pyranylether-reaktionsprodukterne ved kendte metoder kan omdannes til de tilsvarende frie baser eller til ugiftige syre-! 10 additionssalte, er det ikke nødvendigt, at et udgangsmateri- ale er ugiftigt.

Ethvert ikke-reaktivt organisk opløsningsmiddel kan anvendes til tetrahydropyranyleringsreaktionen. Egnede opløsningsmidler er eksempelvis benzen, toluen, xylen, dimethylformamid, 15 acetonitril og tetrahydrofuran. Reaktionsopløsningsmidlet kan være et enkelt opløsningsmiddel eller en blanding af opløsningsmidler. Et foretrukket opløsningsmiddel er vandfrit • dimethylformamid.

*/, y , *

Den sure katalysator kan være enhver organisk syre (f.eks.

20 myresyre eller trifluoreddikesyre) eller en uorganisk syre lif 13 ________ v'

DK 153491 B

5 (f.eks. saltsyre eller phosphorsyre). En foretrukket klasse af sure katalysatorer omfatter de organiske sulfonsyrer. Særligt foretrukne katalysatorer er aromatiske sulfonsyrer, såsom p-toluensulfonsyre og benzensulfonsyre. En især foretruk-5 ket katalysator er p-toluensulfonsyre.

Reaktionstemperaturen er ikke kritisk. Gode resultater ved forethringsreaktionen er opnået ved stuetemperatur, skønt højere og lavere temperaturer også kan anvendes.

Reaktionstiden varierer efter de valgte reaktionsbetingelser, 10 f.eks. temperatur, katalysator og opløsningsmiddel. Udvælgelse af den optimale reaktionstid kan ske ved rutineforsøg under anvendelse af den nedenfor beskrevne tyndtlagsprøv-ning. I almindelighed har reaktionstider på ca. 20 til ca. 50 timer vist sig at give fordelagtige resultater.

*

Mens reaktionsprodukter og reaktionsudbyttet afhænger af fak-15 torer som koncentrationen af udgangsmaterialerne, forholdet mellem reaktanterne m.m., er hovedprodukterne ved anvendelse af daunomycin som udgangsmateriale 4'-O-tetrahydropyranyl-daunomycin (forkortet som 4'-0-PD) og 9-0-tetrahydropyranyl-daunomycin (forkortet som 9-0-PD). Disse produkter kan påvi-20 ses i reaktionsblandingen ved tyndtlagskromatografi på sili-cagel (Merck Co.<,60F2^^) under anvendelse af en chloroform-methanol-eddikesyre-blanding (80:20:4 v/v) som elueringsmid-del. Produkterne fremkommer ved Rf 0,74 (4'-0-PD) og Rf 0,15 (9-O-PD).

25 Produktet 4'-0-PD adskilles i to komponenter med Rf-værdier på 0,46 og 0,65 ved tyndtlagskromatografi på silicagel under anvendelse af en chloroform-methanol-blanding (10:1 v/v).

Disse komponenter viste sig at være diastereomeren af 4'-0-PD. Komponenterne med Rf 0,46 og Rf 0,65 betegnedes arbitrært 30 som henholdsvis 4'-0-PDa (isomer a) og 4’-o-PDb (isomer b).

iri

DK 153491B

6

Ved anvendelse af 14-0-tetrahydropyranyl-adriamycin som udgangsmateriale var hovedprodukterne, der påvistes under anvendelse af den ovennævnte tyndtlagskromatografi på silicagel, to komponenter, som er diastereomere af 4',14-di(O-tetrahydropyranyl)adriamycin, dvs. 4',14-di(O-tetra-5 hydropyranyl)adriamycin (isomer a), forkortet som 4',14-di-O-PAa ved Rf 0,55 og 4',14-di(O-tetrahydropyranyl)adriamycin (isomer b), forkortet som 4',14-di-O-PAb ved Rf 0,73. Forbindelsen 41,14-di(O-tetrahydropyranyl)-adriamycin kan også kaldes 4',14-bis(O-tetrahydropyranyl)-adriamycin.

10 Den diastereomere blanding af 4',14-di-O-PAa og 4',14-di-O-PAb fremstilles i højt udbytte ved forethring af 14-0-tetrahydropyranyladriamycin eller et syreadditionssalt deraf med 3,4-dihydro-2H-pyran i et inert organisk opløsningsmiddel og under tilstedeværelse af en sur katalysator.

15 Produkterne med formlen I kan isoleres fra reaktionsblandingen ved konventionelle fremgangsmåder. Således kan produkterne fra tetrahydropyranyleringsreaktionen udvindes ved neutralisation af reaktionsblandingen med et basisk stof (f.eks. et alkalimetalcarbonat eller -hydrogencarbonat), 20 ekstraktion af den neutraliserede reaktionsblanding med et med vand ikke-blandbart organisk opløsningsmiddel (f.eks. ethylacetat, chloroform, methylenchlorid eller methyliso-butylketon), ekstraktion af den organiske ekstrakt med en fortyndet vandig syreopløsning (organisk eller uorganisk), 25 neutralisation af det vandige sure lag med et basisk stof, ekstraktion af det neutraliserede vandige lag med et med vand ikke-blandbart organisk opløsningsmiddel og koncentration af den organiske ekstrakt til tørhed. Det således opnåede mørkerøde tørrede pulver kan renses ved silicagel-30 søjlekromatografi eller, i tilfælde af en mindre mængde, ved præparativ tyndtlagskromatografi.

Produkter, der opnås i form af en blanding af diastereo- . λ ' mere (a og b isomere) , kan adskilles som beskrevet ovenfor i1·1 C 1 ‘•j?·1®,: ved silicagel-tyndtlagskromatograf i i de individuelle a og b -Y^V i _________ . — . -·. il

DK 153491 B

7 isomere i det væsentlige i ren form.

Produkterne, der opnås ved de ovenstående reaktioner, kan udvindes i form af den frie base eller et ugiftigt syreadditionssalt. De fri baser kan let omdannes til ugiftige 5 syreadditionssalte, hvis terapeutiske aktivitet i det væsentlige er ækvivalent med den af de tilsvarende frie baser. Saltene dannes, isoleres, renses og formuleres ved de metoder, der generelt anvendes til saltdannelse af antibiotika, f.eks. anthracyclinglycosidantibiotika. Således kan den 10 frie base omsættes med en ugiftig syre i et egnet opløsningsmiddel, og saltet udvindes ved lyofilisering eller ved fældning med et fældningsmiddel, dvs. et opløsningsmiddel, hvori det ønskede salt kun er svagt opløseligt.

Produkter i form af et syreadditionssalt kan omdannes til 15 den tilsvarende frie base ved neutralisation med et basisk stof. Endelig kan giftige syreadditionssalte omdannes til ugiftige syreadditionssalte ved neutralisation og behandling med en ugiftig syre som beskrevet ovenfor.

Fysisk-kemiske egenskaber 20 De omhandlede forbindelser eksisterer i fast form som et amorft eller krystallinsk rødt pulver. Som frie baser er de opløselige i ethylacetat, chloroform og ethanol og tungt-opløselige i bl.a. vand, n-hexan og petroleumsether. Ethano-liske opløsninger og sure opløsninger af forbindelserne er ! 25 røde, giver positiv ninhydrinreaktion og reducerer ikke

' A

Fehling's væske. Fig. 1-8 og tabel 1 viser elementaranalyse, smeltepunkt (sønderdeling), specifik drejning (c = 0,2 i CHCl^), absorptionsspektrum for UV-lys og synligt lys (methanol), infrarødt absorptionsspektrum (KBr-tablet) og NMR-spektrum 30 (100 MHZ, CDClj).

/ i.-i li m, 8 ~

DK 153491 B

--:------- ία O c,w VO — o

_ _ _ VO

ZZZZ —-mino O O CM m o >-H -4- * <* OO ΙΛ CA ^r—f ^ o iX. r o « O ^ H ' "p. (ΛΟ CTWD >, O Ό O. m oj ΟΛλγ r— ·*

I 0J a CM m -CM -S\ <J

CO 03 o fH c- P

X) IT\ <~t J- *" fH V , ·“ o —Ό —- ω

I CM CO CO H *5 + O HO^IA X

-=» _T ' -Γ il y. ΛΙΛΗΟ w

Η H VO rH f** w ^ v^rf\s_^H

*> Ό H CVI Q tn —^ o—.

ΤΓ O m O CM υ -m· " ” " ° cm tnco m · *—1 cm cm in vo

________CM

O > —' ^ ·—' CO > cj 03 O w

< CO ΙΛ C3 —Ό lA O

^ _Γ ,,Γ T ^ iahh^t , I O VO pi · O ** O VO ^ g· «Λ -=r —CO -— " I ----—---- m VO S CM m O CO t-- s >ri CO O O in C\J OX^J- c— ri Ό CM lA VO ri ^ . m -ru -ir\ -

I ri S O ri 7 <U + ^ 1 B

-4 ·"*·* ri o O O o —'LA'·"'' „

»H ri VO ri C“- CO -=t- CM O O S

I VO ”· CM Q K30 ri f—I CL

. ’u’ ^—Άs '"ri ·Λ* -=* · ·' " O n —- o -— r~ U X 55 <—> O K\ O CM ..

cm inco m _:_____cm cm in ^ ' —' o

ιη^—· X

.—, .— ^ CO CTv^^^ o

^ -M- CM ^-ϋί O O

O CM CM o uyTV=J· CM

- - — --- in v^Vj v , O ri VO CM ~ ~ O.---

P Q VO P. CM ίη'-'ΐΟνΟ O

® x O tn £ VO m o}™ ca£- ^

*i I t- C\ O· <-l VO Ln H

S O (O N N _r cl ^ , - —0-1 · .2 I 4 A H lej T O o ^ . *· "“·“*" Η O Ό ιλ *c\ if\ ir\ ® © ^ £?voh ^ S) m'—mco “ •o vo H CUQ tArri ° IH ... TT VI ^ li > , , Z Z v3 CM CM O CM .

c o W X ’— cm in co k\ Zj g CM CM -3- m ^ fe . ; ^ * V-J —' —O * <e ^ -M- CM tnCM'---- u . ° cm cj HHOin ® « ri VO CM P. o CJ-OvTri ^ -5 o, vo o vo ε in ^-co >---- ic · t~_ C\ o cm mcMiovo i/i O rri -X i—i VO CM — CT\ l^— C · Cil N 41 ri 1 o Lp.

© - CO CM CM ri m Ό + - -0-1 ti ’ ¢11-=1- vo c\ — o toiin^—^ 5* ® .¾ mo cm ri cm mm o o ^ VO CM O fO. —·—- CO ic 5 ... -ΆΗ ^ ·»«··· O (Π *? ω Ο X Z ·—* CM CM O CM § e cm m co rn 5 ©-----——----pi cm m s +-> t en i p ω ε

-¾ +-> * -τ’ m w O-n O

ni P. >*. JM H * P VHrri <n

m Oc3 C CJ*OC

vi ^5+J ο ϋ Uis *H ri Es, +J

<U®r*®<D -P P. -rriCcj T) +J pw © ^ VI Jji 3 'Λ C bl, <D .— -Iri C a, p _ c

ι-H Π c: >s tu fe +j 0 <-* C w U +-> bi ' 2 bD

I ® ·Γ-Ι Q) i—I ® > ri „ U‘,_5CM ^ OPi Ο-l, “ © ^ -0 -1-1 ^1 cap i—i © s__^ ®Φν^. i w® Etc 0 ^ , c >, Π c © ο e vhxi O-w c·-! tr* © 'p -H,-iwiij_o S.: CO 0-0° cc; <c in cq

Xj r C-* ^ ^ Π I in ^ O << ri r . cm^ m =c ^ in vo g >,, *: .: . -J ' sl I'fv'j iv'j ' 1 " , * • V-l>- 1 i 9

DK 153491B

Med hensyn til strukturen af forbindelserne 4'-0-PDa, 41-O-PDb, 4',14-di-O-PAa og 4'f14-di-O-PAb, kan antallet af tetrahydropyranylgrupper, som er bundet til forbindelserne, analyseres til at være enten en eller to ud 5 fra signalintensiteten fra methinprotonen i C-2- og methylen-protonen i C-3-, C-4-, C-5- og C-6-stillingerne i tetrahydro-pyranylgruppen. Bindingspositionen af tetrahydropyranylgrup-pen kan analyseres ved kemisk forskydning af C-4'-protonen i daunosamindelen mod et lavere felt (sammenlignet med det 10 af daunomycin) på grund af dannelse af en glycosidisk binding på C-4' .

Forskellen i konfigurationen mellem 4'-P-PDa og 4'-O-PDb og 4',14-di-O-PAa og 414-di-O-PAb formodes at være en forskel i absolut konfiguration R og S på C-2 i tetrahydro-15 pyranylgruppen, idet kemisk forskydning og koblingskonstanter (J-værdi) af C-2- og C-3-protonerne er forskellige fra hinanden. Den absolutte konfiguration af a og b isomererne er imidlertid stadig ukendt. Tabel 2 viser kemisk forskydning (fra fig. 5-8) af C-2-protonen i tetra-20 hydropyranylgruppen og af C-4'-protonen i daunosamindelen.

:> - '1 ·. " ·> • v · iå

•fM

7Xp.

10

DK 153491 B

Tabel 2

Proton V-THP* 14-THP* DS4'** __ (ppm)_(ppm)_(ppm)_

Forbindelse V-O-PDa 4-,38 - 3,62 5 4'-0-PDb 4,72 - 3,64 4',14-di-O-PAa 4,38 4,70 3,60 4',14-di-O-PAb 4,72 4,72 3,66 *THP: Kemisk forskydning i C-2-methingruppen i en substitueret tetrahydropyranylgruppe **DS4': Kemisk forskydning i C-4'-methingruppen i daunosamin 10 Af det ovenstående bestemtes strukturen af de omhandlede forbindelser at være som angivet ovenfor.

Antibiotisk aktivitet

Forbindelserne med formlen I har vist sig at have antimikro-biel aktivitet mod mange forskellige patogene mikroorganismer.

15 De minimale inhibitoriske koncentrationer (bestemt ved bouillonfortyndingsmetoden) af repræsentative forbindelser fremstillet ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er vist i tabel 3.

Ow-vi

Sti

DK 153491B

u

Tabel 5 Minimal inhibitorisk koncentration (ΜΓΚ, ug/ml)

Testet forbindelse

Test-organisme_4'-0-PDa 41 -O-PDb

Staph, aureus 6,25 6,25

PDA 209P

5 Staph.. aureus 12,5 5»12

Smith

Bacillus subtilis 3>12 1,56 NBBLB-558

Bacillus cereus 6,25 6,25 ATCC 10702

Bacillus megaterium 6,25 3,12

APP

Sarcina lutea 0,39 0,39 PCI 1001 10 Micrococcus flavus 0,78 1,56 PDA 16

Corynebacterium bovis 0,78 0,78 1810

Pseudomonas aeruginosa >100 >50 A3

Escherichia coli >100 >100

NIHJ

Mycobacterium smegmatis 6,25 6,25 ATCC 607 15 Candida albicans >50 25 (1 -

Som vist i tabel 3 er de omhandlede forbindelser nyttige som antibiotiske midler, især mod gram-positive bakterier.

Antitumoraktivitet

Forbindelser med formlen I viser udpræget antitumoraktivitet 20 med lav toksicitet i standardtest.

. A. De omhandlede forbindelser viste sig at have en stærk J inhibitorisk virkning på væksten og nucleinsyresyntesen af '< L1210-leukæmiceller i kultur.

-4’ K

H

i

DK 153491 B

12 F.eks. inkluderes Ll210-celler (5xl04 celler/ml) i RPMI-1640-medium (Roswell Park Memorial Institute 1640) , som indeholdt 20% kalveserum, og dyrkedes ved 37°C under tilstedeværelse af 0,1 og 0,5 yg/ml af de omhandlede forbindelser i en 5 CC^-inkubator. Antallet af celler tælles periodisk,og vækstinhibitionen (%) af kontrol bestemtes som vist i tabel 4.

Tabel 4 Vækstinhibitorisk virkning af tetrahydropyranylderivater på Ll210-celler i kultur._ 10 Koncentration Inhibition (%)

Forbindelse _0,1_0,5 yq/ml_ 41-O-PDa 79,2 95,0 4'-0-PDb 74,6 88,8

Daunomycin 68,8 72,7 15 4',14-di-O-PAa 37,5 80,8 4',14-di-O-PAb 25,5 72,1

Adriamycin 70,7 84,2

Virkningen af de omhandlede forbindelser på nucleinsyresyn-tese undersøgtes som følger: 20 1x10^ celler/ml af Ll210-celler suspenderedes i RPMl-medium, som indeholdt 10% kalveserum, og dyrkedes først ved 37°c i 1 til 2 timer i en CC^-inkubator, hvorefter de omhandlede forbindelser sattes til mediet i forskellige koncentrationer.

14

Efter 15 minutters inkubation tilsattes C-uridin (0,05 yCi/ml) 14 o

25 eller C-thymidin (0,05 yCi/ml), og der inkuberedes ved 37 C

i 60 minutter. Der sattes 10%'s trichloreddikesyre (TCA) til inkubationsmediet for at stoppe reaktionen og fælde de syre- uopløselige materialer,og derefter vaskedes bundfaldet tre gange med 5 til 10%'s TCA opløst i myresyre. Radioaktiviteten 30 måltes og udtryktes som 50%'s inhibitionskoncentration for inkorporering.

k l.^rv.n

DK 153491B

13

Tabel 5 14 14 50%'s inhibitionskoncentration af C-thymidin- og C-uridin-inkorporerinq i Ll2lQ-celler i kultur._ 50's inhibitionskoncentration ug/ml

Forbindelse_ Uridin_Thymldin 5 4'-0-PDa 0,13 0,28 4'-O-PDb 0,20 0,32

Daunomycin 0,40 0,70 4',14-di-O-PAa 0,23 0,55 4',14-di-O-PAb 0,24 0,97 10 Adriamycin 0,50 2,1 B. Ved prøvning mod forskellige eksperimentelle tumorer hos dyr viser de omhandlede forbindelser en udpræget anti-tumoraktivitet med reduceret toksicitet i forhold til adriamycin og daunomycin. Følgelig er forbindelserne tera-15 peutisk nyttige til inhibition af væksten af pattedyrstumorer.

Eksempelvis inokuleredes BDF.-mus intraperitonealt med 6 1x10 celler/mus af Ll210-leukæmiceller. Efter 24 timers forløb fra inokulationen administreredes de omhandlede for-·. 20 bindeiser intraperitonealt til musene én gang dagligt i ti på hinanden følgende dage, og musene holdtes under observa- F-, tion i 45 dage. Antitumoraktiviteten vistes ved levetidsforlængelsen (T/C, %) i forhold til levetiden af kontrolmus, hvori der injiceredes fysiologisk saltopløsning. Resultater-25 ne er vist i tabel 6.

’ .j t Ό s 3*

Tabel 6

DK 153491 B

Antitumoraktivitet af tetrahydropyranylderivater (T/C, %).

_Dosis (mg/kq/dag)_

Forbindelse_5_2,5_1,25_0,6_0,3_0,15 5 4'-O-PDa >320 >320 122 115 96 90 41-O-PDb >320 256 122 115 103 90 4',14-di-O-PAa 154 115 109 96 103 96 4',14-di-O-PAb 161 109 103 103 96 115

Adriamycin toksisk 231 218 230 165 128 død 10 Ud fra resultaterne med hensyn til toksiske dødsfald og vægttab hos musene i dette forsøg er det vist, at toksiciteten af de omhandlede forbindelser er 1/3 til 1/2 lavere end den af adriamycin og daunomycin, som er udgangsmaterialer ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse.

15 C. De udprægede antitumorvirkninger, som ses af A og B ovenfor, bekræftedes af stabiliteten af de omhandlede forbindelser mod inaktivering med hepatisk NADPH-cytochrom-P450-reduktase. Specifikt inkuberedes NADPH-cytochrom-P450-reduktase, som var isoleret fra rotteleverhomogenat og 20 renset, med de omhandlede forbindelser ved 25°C i 25 minut-ter i nitrogengasfase, og det dannede inkubationsprodukt, ..· ·; ! 7-deoxyaglycon, bestemtes som vist i tabel 7.

Tabel 7

Stabilitet af tetrahydropyranylderivater overfor rotte-NADPH-cytochrom-P4 50-reduktase._

Produkt (nmol/rør) 25 Forbindelse_(7-deoxyaglycon)_ _ 4’-O-PDa 37,3 ?r' : 4'-O-PDb 46,6 ϊ % > V: Daunomyc in 65,8 m

DK 153491 B

i5 , . p

Tabel 7 fortsat 4·,14-di-O-PAa 13,1 4',14-di-O-PAb 15,8

Adriamycin 47,2

Sammensætning af reaktionsblandingen:

5 NADPH 0,2 mM

Tris-HCl (pH 8,0) 0,1 M

Substrat 0,1 mM

Enzym 4,6 yg/ml (Tris-HCl=tris-(hydroxymethyl)-aminomethan).

10 Terapeutisk anvendelse

Som nævnt ovenfor er forbindelserne 4'-0-PDa, 4'-0-PDb, 4',14-di-O-PAa og 414-di-O-PAb og deres ikke-toksiske syreadditionssalte nye antibiotika, som er nyttige i både human- og veterinærmedicinen, og som også har udpræget 15 inhibitorisk virkning mod maligne pattedyrstumorer, herunder både faste og ascitiske typer.

De omhandlede forbindelser kan formuleres som et farmaceutisk præparat, der indeholder en terapeutisk effektiv anti-mikrobiel eller tumor-inhiberende mængde af 4'-0-PDa, 4'-0-20 PDb, 414-di-O-PAa eller 414-di-O-PAb eller en blanding deraf eller et ugiftigt syreadditionssalt deraf, i kombina--cj> tion med en farmaceutisk bærer eller et fortyndingsmiddel.

Sådanne præparater kan tilberedes i enhver farmaceutisk form, som er egnet til parenteral administrering.

25 Præparater til parenteral administrering omfatter sterile vandige eller ikke-vandige opløsninger, suspensioner eller emulsioner. De kan også fremstilles i form af sterile faste præparater, som kan opløses i sterilt vand, fysiologisk saltopløsning eller et andet sterilt injicerbart medium 30 umiddelbart før brug.

J|i 16

DK 153491B

Den foretrukne dosisstørrelse afhænger af arten af den anvendte forbindelse, af præparatets formulering og af applikationsmåden, af situs og vært og af sygdommens art. I almindelighed injiceres forbindelserne intraperitonealt, intravenøst, subku-5 tant eller lokalt i andre pattedyr end mennesket og intravenøst eller lokalt i mennesket. Mange faktorer, som modificerer virkningen af lægemidlet, må tages i betragtning af fagfolk, f.eks. alder, legemsvægt, køn, kost, administreringstidspunkt, administreringsvej, ekskretionshastighed, patientens kondi-10 tion, lægemiddelkombinationer, reaktionsfølsomheder og sygdommens sværhedsgrad. Administrering kan udføres kontinuert eller periodisk indenfor den maksimale tolererede dosis. Optimale applikationshastigheder for et givet sæt betingelser kan fastslås af fagfolk ved anvendelse af konventionelle 15 doseringsbestemmelsestests ifølge de ovenstående retningslinier .

Til anvendelse som antimikrobielle midler administreres forbindelserne i almindelighed således, at koncentrationen af den aktive bestanddel er større end den minimale inhibito-20 riske koncentration for den pågældende behandlede organisme.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nærmere i de efterfølgende eksempler.

Eksempel 1

Fremstilling af 41-o-tetrahydropyranyldaunomycin (4'-0-PDa 25 og 4'-O-PDb)_

Til en opløsning af 60 mg daunomycin-hydrochlorid i 5 ml vandfrit dimethylformamid sattes 1 ml 3,4-dihydro-2H-pyran og en katalytisk mængde af p-toluensulfonsyre. Efter henstand i 16 timer ved stuetemperatur i mørke sattes reaktions-30 blandingen til 20 ml 0,1 N vandig natriumhydrogencarbonat-opløsning og ekstraheredes med 4 x 10 ml chloroform. Efter ekstraktion af chloroformekstrakten med 10 x 10 ml 1%'s 'v eddikesyre neutraliseredes det resulterende sure vandige lag med natriumhydrogencarbonat og reekstraheredes derefter med tr-Vpt 17

DK 153491 B

10 x 20 ml chloroform. Chloroformlaget tørredes over vandfrit natriumsulfat og koncentreredes til tørhed. De således opnåede 44 mg remanens underkastedes præparativ tyndtlags-kromatografi på silicagel (Merck Co. ) og elueredes 5 med en chloroform-methanolblanding (10:1) (v/v).

Silicagelbånd, som svarede til Rf 0,46 og 0,65, skrabedes af tyndtlagspladen, elueredes med chloroform-methanol-blan-dingen (10:1) (v/v) og koncentreredes til tørhed. Remanen serne opløstes hver for sig i methylenchlorid, blev frosset 10 ved tilsætning af t-butanol under afkøling og tørredes under reduceret tryk. Der opnåedes 10,1 mg af et rødligbrunt fast stof af 4'-0-PDa og 10,3 mg af et rødt fast stof af 4'-O-PDb fra Rf 0,46 henholdsvis 0,65 fraktionen.

4'-O-PDa og 4'-O-PDb er diastereomere af 4'-O-tetrahydro-15 pyranyldaunomycin, og deres fysisk-kemiske egenskaber er som vist i tabel 1.

Eksempel 2

Fremstilling af 4',14-bis(O-tetrahydropyranyl)adriamycin ud - fra 14-O-tetrahydropyranyladriamycin._ 20 Til en opløsning af 35 mg 14-O-PA i 2 ml vandfrit dimethyl-formamid sattes 0,5 ml 3,4-dihydro-2H-pyran og en katalytisk mængde af p-toluensulfonsyre. Efter henstand i 40 timer ved stuetemperatur i mørke sattes reaktionsblandingen til -! 10 ml 0,02 N vandig natriumhydrogencarbonatopløsning og 25 ekstraheredes med 4 x 5 ml ethylacetat. Efter ekstraktion af ethylacetatlaget med 3 x 10 ml 1%'s eddikesyre neutraliseredes det sure vandige lag med natriumhydrogencarbonat og ekstraheredes med 5 x 10 ml chloroform. Chloroformlaget tørredes over vandfrit natriumsulfat og koncentreredes til tør-30 hed.

Den resulterende remanens kromatograferedes under anvendelse • / af præparativ tyndtlagskromatografi på en silicageltyndt- / lagsplade som beskrevet nedenfor, og der opnåedes 8,4 mg af i i m 18

DK 153491B

et rødt fast stof af 4',14-di-O-PAa og 8,1 mg af et rødt fast stof af 4',14-di-O-PAb fra Rf 0,55 henholdsvis 0,73 fraktionen. Deres fysisk-kemiske egenskaber er som anført i tabel 1.

5 Fremstilling af udgangsmaterialet 14-o-tetrahydropyranyl-adriamycin (14-O-PA) ud fra adriamycin._

Til en opløsning af 130 mg adriamycinhydrochlorid i 10 ml vandfrit dimethylformamid sattes 2 ml 3,4-dihydro-2H-pyran og en katalytisk mængde p-toluensulfonsyre. Efter henstand 10 i 48 timer ved stuetemperatur i mørke sattes reaktionsblandingen til 20 ml 0,1 N vandig natriumhydrogencarbonatopløs-ning og ekstraheredes med 5 x 20 ml ethylacetat. Efter ekstraktion af ethylacetatlaget med 4 x 40 ml 1%'s eddikesyre neutraliseredes det sure vandige lag med natriumhydrogen-15 carbonat og ekstraheredes med 10 x 20 ml chloroform. Chloro-formlaget tørredes over vandfrit natriumsulfat og koncentreredes til tørhed. De resulterende 160 mg fast stof eluere-des og rensedes ved præparativ tyndtlagskromatografi på silicagel under anvendelse af en chloroform-methanol-blanding 20 (10:1) (v/v). Båndet med Rf 0,12 skrabedes af tyndt- lagspladen og rensedes ved metoden ifølge eksempel 1.

1 Der opnåedes 35 mg af et rødt fast stof af 14-O-PA

Rf 0,12 fraktionen.

4',14-di-O-PAa og 4',14-di-O-PAb er diastereomere af 4',14— 25 bis(O-tetrahydropyranyl)adriamycin, og deres fysisk-kemiske egenskaber er som vist i tabel 1.

·/*

Claims (1)

1. DK 153491 B Analogifremgangsmåde til fremstilling af et 4'-O-tetrahydro-pyranyl- eller 41,14-bis(O-tetrahydropyranyl)-anthracyclin-glycosid med den almene formel i? °\H ° 1 , OCH-, 0 0H 5 3 0 (I) Cf* hvori betyder et hydrogenatom eller en tetrahydropyranyl-oxygruppe, eller et ugiftigt syreadditionssalt deraf, kendetegnet ved, at man omsætter et anthracyclinglycosid med formlen ° °H « ! OCH O OH I 10 o (in H0 nh2 hvori R^ betyder et hydrogenatom eller en tetrahydropyranyl-oxygruppe, eller et syreadditionssalt deraf med 3,4-dihydro-2H-pyran i et inert organisk opløsningsmiddel og under tilstedeværelse af en sur katalysator og, om ønsket, omdanner 15 den dannede forbindelse med formlen I til et ugiftigt syreadditionssalt deraf, eller, om nødvendigt, omdanner et dannet syreadditionssalt af forbindelsen med formlen I til den fri forbindelse éller til et andet ugiftigt syreadditionssalt deraf. - K v!