DK152643B

DK152643B - Fremgangsmaade til fremstilling af et oxygen- og carbondioxid-overfoeringsmiddel

Info

Publication number: DK152643B
Application number: DK099174AA
Authority: DK
Inventors: Jr Leland C Clark
Original assignee: Childrens Hosp Medical Center
Priority date: 1973-02-26
Filing date: 1974-02-25
Publication date: 1988-04-05
Also published as: US3911138A; FR2218903B1; DK152643C; US3911138B1; JPS5058215A; DE2409598A1; GB1467172A; CA1042799A; FR2218903A1

Description

1 DK 152643B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et oxygen- og carbondioxid-overføringsmiddel, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 1 anførte.

For adskillige år siden opdagede man, at dyr kunne overleve indånding af dampe fra oxygenmættede, perfluorerede væsker, såsom de isomere af perfluortetrahydrofuran og perfluortri-butylamin. Dyr overlevede ikke blot åndingsperioden, men vendte derefter tilbage til et tilsyneladende normalt helbred, jævnfør Clark, L.C., et. al., "Survival of Mammals Breathing Organic Liquids Equilibrated with Oxygen at Atmospheric Pressure", Science 152: 1755 - 1756 (1966) og Golian, F. og L.C. Clark, Jr., "Rapid Decompression of Mice Breathing Fluorocarbon Liquid at 500 PSI", Alabama Journal of Medical Sciences, 4:336-337 (1967). Dette viser, at de nævnte forbindelser både har oxygenbærende evne og ikke var akut giftige. Fluortetrahydrofuran er også foreslået som perfusionsmedium til et isoleret hjerte, som beskrevet i Golian, F. og L. C. Clark, Jr., The Physiologist 9:191 (1966). Sloviter, et al. beskrev, at dispersionerne af perfluortetrahydrofuran var lige så gode, om ikke bedre end suspensioner af erythro-cytter i pufrede elektrolytter hvad angår opretholdelsen af funktionen og metabolismen af isoleret, perfunderet rottehjerne, se Nature 216:458 (1967). Overlevelsen af en kanin efter infusion af en perfluortributylamin, hvor ca. 1/3 af blodet blev erstattet, er beskrevet af L. C. Clark, Jr., i Edmond Hall Lecture, University of Louisville Sigma-Xi, den 19. maj 1967, Welch, Louisville Times, den 20. maj 1967. Geyer, et. al. har beskrevet, at emulsioner af flydende carbon-fluorider kan anvendes til næsten fuldstændigt at erstatte blodet af intakte rotter, og at disse dyr reagerer godt, når de holdes i en oxygenatmosfære. Federation Proc. 27:384, 1968 og Organ Perfusion and Preservation, udgivet af J.

C. Norman, New York: Appleton-Century-Crofts, 1968, side 85 - 96. Clark, et. al. har beskrevet perfusionen af hele dyr med perfluorerede blodemulsioner under anvendelse af Clark-hjerte-lunge-maskinen af boble-skumdæmpningstypen Federation Proc., 29:1764 (1970) og fysiologien af syntetisk

DK 152643 B

2 blod fremstillet ud fra carbonfluoridemulsioner i Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery, 60:757 - 773 (1970).

Der er således udført et omfattende arbejde i forbindelse med anvendelsen af carbonfluorider og fluor-carbon-emulsioner som oxygen-overføringsmidler og som kunstigt blod. Den kommer-celle anvendelighed af kunstigt blod, der har alle det naturlige blods fordele eller nogle af disse, og som mangler nogle af disses ulemper, er betydelig. Kunstigt blod kunne erstatte naturligt blod til transfusioner, igangsætning af hjerte-lunge-maskiner og andre anvendelser. Yderligere kan naturligt blod medføre sygdomme, kræver typebestemmelse og krydsafpasning, har en meget kort opbevaringstid og er meget dyr at opsamle, opbevare og administrere. I mange dele af verden er der ingen faciliteter til opsamling og administration af blod. Der er tilfælde, hvor indgift af naturligt blod ville være livreddende for dyr, men hvor det ikke er muligt, enten fordi dyret ikke tidligere er blevet typebestemt, fordi blodet ikke er rekvirerbart, eller fordi blodet ikke kan fremskaffes hurtigt nok. Der eksisterer således et stort behov for kunstigt blod til dyr, herunder forsøgsdyr, dyr i zoologiske haver og kæledyr.

I tysk offentliggørelsesskrift nr. 2 144 094 er der rapporteret forsøg med anvendelsen af emulsioner af perfluor-tributylamin, perfluorbutyltetrahydrofuran og perfluoroctan som oxygen-overføringsmiddel. Disse midler har dog ikke fået nogen praktisk betydning, idet det har vist sig, at de nævnte forbindelser har tilbøjelighed til at ophobes i leveren og til dels i milten, dvs. i det såkaldte reticulo-endotheliale system, forkortet RES-systemet. Forbindelserne kan ophobes og forblive i de nævnte organer i lang tid og måske i hele individets levetid.

Den foreliggende opfindelse er baseret på den overraskende opdagelse, at ikke alle perfluorerede organiske forbindelser har den nævnte ulempe. Medens perfluortributylamin, perfluor- 3

DK 152643B

butyltetrahydrofuran og perfluoroctan alle har en udpræget tilbøjelighed til at akkumulere i leveren, dvs. de er "RES-file", så findes der visse perfluorerede cycliske carbonhy-drider, som ikke udviser denne ulempe. Disse forbindelser er således "RES-fobe". Eksempler herpå er perfluordecalin, perfluormethyldecalin og perfluordecahydrodimethylnaphthalen.

Det fremgår ikke af det ovennævnte tyske offentliggørelsesskrift, at forbindelser med RES-fobe egenskaber eksisterer.

De RES-fobe forbindelser forlader organerne, såsom leveren, og vil i løbet af få dage udskilles gennem lungerne eller huden.

Eksempler på "RES-file" fluorholdige organiske forbindelser er perfluoralkethere, perfluorcycloethere, perfluortetrahydro-furan og perfluortributylamin, der sekvestreres og tilbageholdes temmeligt permanent af leveren eller milten af RES. Disse RES-file forbindelser er karakteriseret ved tilstedeværelsen af et heteroatom, såsom oxygen eller nitrogen, i deres molekylstruktur, eller ved deres heterocycliske natur.

I den efterfølgende tabel I er anført specifikke eksempler på perfluorerede carbonhydrider, der er velegnet til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, samt empiriske formler deraf, og andre egenskaber, herunder rekvirerbarhed i forbindelse med varemærker.

4

DK 152643B

Tabel I

Varemærke Kemisk navn Empirisk Molekyl- Kogepunkt Damptryk ved Masse- _ _ formel vægt 0 C 37«5° C fylde

Imperial* perfluor- C....F 512 160 torr 1,972 PP9 methyl decal in 11 5,2

Imperial perfluor- C7F,Æ 550 76 180 1,788 PP2 thyleyelo- ' hexan

Imperial perfluor- C F 400 102 62 1,828 PP3 lf3-dime- 8 16 thylcyclo-hexan

Imperial perfluor- C F 462 142 13,6 1,946 PP5 . decalin 10 18 perfluor- C-,,,*' 562 dimethyl- ±d ^ decalin

De ovenfor angivne perfluorerede carbonhydrider kan syntetiseres ved kendte kemiske eller elektrokemiske processer. De kemiske processer er særlig egnede hertil, idet man derved kan fremstille rene stoffer af kendt struktur og med veldefinerede kogepunkter. De ovenfor angivne perfluorerede carbonhydrider har alle den fælles egenskab, at de har en høj opløselighed for oxygen og carbondioxid, og de er velegnede som bærevæsker for oxygen til understøttelse af respirationen af et dyr, dvs. et varmblodet dyr eller et pattedyr.

Der anvendes fortrinsvis et perfluoreret cyclisk carbonhydrid, eller en blanding af sådanne, som har et damptryk mellem 1 og 50 torr ved ca. 37,5 °C. Sådanne forbindelser eller blandinger er RES-fobe og udskilles hurtigt fra organismen uden at frembringe uønsket gasopsamling i vævet af det animalske legeme. Dette er påvist ved forsøg, hvorved der anvendtes en blanding af lige dele perfluor(1,3-dimethylcyclohexan) med et damptryk på 62 torr ved 37,8 °C og perfluordecalin 5

DK 152643B

med et damptryk på 13,6 torr ved 37,5 °C i form af en emulsion. Damptrykket af den emulgerede blanding viste sig at være ca. 38 torr ved 37,5 °C. Ved intravenøs infusion af den resulterende emulsion i mus, anvendt som kunstigt blod, blev mængderne af fluoreret forbindelse, som akkumuleredes i leveren, reduceret fra så meget som ca. 40% af den totalt infunderede mængde til 0 i et tidsrum af ca. 3 uger. Det foretrukne damptryk er 20 - 40 torr. Hvis man anvender perfluorerede forbindelser med et damptryk over 50 torr, vil indånding af dampen af det samme eller et lignende fluoreret carbonhydrid, som injiceres, afbalancere gastrykkene i lungerne, således at der ikke opstår gasemboli. Uden denne dampånding er partialtrykket af det fluorerede carbonhydrid i lungerne - i modsætning til de fleste andre gasser og dampe - yderst lav, tilsyneladende primært på grund af den ringe opløselighed af den fluorerede forbindelse i blod. Som følge deraf overskrider det totale gastryk i blodet det totale alveolare tryk, og der opstår gasemboli. Indånding af dampen kan forhindre dette i timevis. Hvis dyret fjernes fra dampen og anbringes i den atmosfæriske luft, før en potential lethal mængde af et gasformigt fluoreret carbonhydrid med højt damptryk (for eksempel ca. 100 - 200 torr ved 37,5 °C) har forladt blodbanen, indtræder døden i løbet af kort tid. Imidlertid kan den kritiske nødvendighed af at indånde damp ved intravenøs infusion af emulsioner elimineres ved at anvende forbindelser med et damptryk under 40 - 50 torr ved ca. 37,5 °C.

Det omhandlede oxygen- og carbondioxid-overføringsmiddel til anvendelse som kunstigt blod fremstilles på emulsionsform. Vand, ioner, glucose, aminosyrer, proteiner og de fleste organiske stoffer er praktisk talt uopløselige i de flydende fluorerede carbonhydrider. Fremstillingen sker ved at emulgere det fluorerede carbonhydrid i en vandig fase indeholdende de ønskede salte, glucose og lignende, sammen med et overfladeaktivt middel, der er nødvendigt som emulgeringsmiddel.

Det er teoretisk muligt at anvende en vand-i-olie-emulsion, 6

DK 152643B

men det foretrækkes at anvende olie-i-vand-emulsioner. Som emulgeringsmiddel kan for eksempel anvendes en polyoxyethylen-polyoxypropylen-copolymer med en molekylvægt på ca. 8200 (Pluronic F68), sammen med natriumchlorid i en koncentration på 0,6 vægt-procent (som Ringer-opløsning fortyndet til sin halve styrke med vand). Blandingen af vand, fluoreret carbon-hydrid, natriumchlorid og emulgeringsmiddel hældes i en Waring-blander, og blanderen sættes i gang i et meget kort tidsrum, fortrinsvis under 1 minut. Der benyttes hensigtsmæssigt en modificeret Waring-blander, hvori hvirvlen i centret er elimineret; herved undgås for meget skum. Formålet med denne blanding er at frembringe en meget grov emulsion, således at det fluorerede carbonhydrid mere eller mindre suspenderes i den vandige fase. Denne grove emulsion bliver derpå yderligere emulgeret på en af to foretrukne måder. Ved en af måderne benyttes en homogenisator, for eksempel en Gaulin model 15M homogenisator, der har maksimal kapacitet 15 gph, 2 og som kontinuert arbejder under et driftstryk på 562 kg/cm .

Ved den anden måde benyttes en ultralydgenerator, for eksempel en Branson model LS-75. I begge tilfælde pumpes emulsionen fra en med vandkappe forsynet beholder af rustfrit stål med en Sigma motorpumpe model T6S med en hastighed på 100 cm /minut, under anvendelse af et polyurethanrør med en indre diameter på 0,95 cm, til en med vandkappe forsynet gennemstrømnings-celle, der er tilknyttet homogenisatoren eller ultralydgeneratoren, og derpå gennem en varmeveksler, Travenol model 5M0331, og tilbage til beholderen. Der anvendes en magnetisk omrøringsstang i beholderen for at holde emulsionen godt blandet. På grund af den store energimængde, der kontinuerligt anvendes af homogenisatoren eller sonicatoren i lange tidsrum (ca. 3 timer), er det meget vanskeligt at forhindre, at emulsionerne overopvarmes. Man anvender et afkølet, recir-kulerende bad til at pumpe kølevæske ved -20 °C til gennemstrømningscellen, beholderen og varmeveksleren. Denne afkøling holder emuisionstemperaturen under 10 °C. Carbonfluorid-emul-sionen cirkuleres i Gaulin-homogenisatoren eller ultralydgene- 7

DK 152643B

ratoren, indtil den optiske tæthed når en stabil lav værdi.

Den optiske tæthed kan registreres kontinuerligt i gennemstrømningsceller med forskellige optiske baner, efterhånden som emulgeringen skrider frem. Det vil forstås, at der foreligger en bred variation hvad angår det punkt, hvor den optiske tæthed af det perfluorerede carbonhydrid jævner sig ud, men at den i næsten ethvert tilfælde jævner sig ud. Det gælder i almindelighed, at den optiske tæthed er desto lavere eller emulsionen er desto mere transparent, jo finere partiklerne er. Efter homogenisering eller ultralydbehandlingen bliver 3 emulsionerne centrifugeret i 350 cm flasker i 60 minutter for at fjerne populationen af store partikler, for at bestemme, om der ville forekomme separation, og for at fjerne det metalstøv, der afgives fra ultralydgeneratoren. Når man benytter en ultralydbehandling, anvender man også en OH-anionbyt-ter for at fjerne F-ioner fra emulsionen i et sådant omfang, at koncentrationen deraf bringes ned under 1 ppm. Den dannede emulsion overføres derpå til rene flasker og anvendes enten øjeblikkeligt eller opbevares i køleskab, indtil den skal bruges. Emulsionerne er mere stabile, når de holdes afkølede, og bakterievækst derved hæmmes.

Ved ionbytning kan fluoridioner fjernes fra de ultralydbehandlede emulsioner. Mængden heraf er sædvanligvis meget lille, dvs. svarende til en ppm-værdi på normalt 2 til 100 ppm.

Derpå centrifugeres emulsionerne i 20 minutter med 3000 g for at fjerne metalpartikler og lignende faste stoffer. Emulsionen føres derpå gennem en ionbytterharpiks, for eksempel en kvaternær polystyrenalkylamin (på hydrolyseret form), der forhandles under varebetegnelsen REXYN 1201, i en søjle på 10 x 190 mm, ved en hastighed på 20 - 30 dråber pr. minut. Gentagen analyse for F-ion bekræfter fjernelse.

De således fremstillede emulsioner kan have følgende egenskaber: 8

DK 152643B

Partikelst'ørrelse ITdseende Absorptionsevne 1 - 10 pm Mælkehvid 100 0,1 - 1 pm Blåhvid 10 0,01 - 0,1 pm Semi-transparent 1 0,001 - 0,01 pm Transparent 0,1

De mælkehvide emulsioner bundfældes til dannelse af et klart lag; transparente emulsioner bundfælder ikke. Semi-transparen-te emulsioner tørrer til dannelse af en blank film. Hvert carbonfluorid har sin egen optiske tæthedskurve efter homogenisering, og der foreligger et reproducerbart plateau for hvert af dem. Dette er meget vigtigt, fordi det på reproducerbar måde er muligt at fremstille emulsioner fra dag til dag. Hvis man varierer mængden af F68 overfladeaktivt middel, for eksempel fra 1 til 20 volumenprocent, medens carbonfluoridet holdes konstant, vil absorptionsevnen af emulsionen aftage, og som følge deraf vil partikelstørrelsen aftage. Hvis man holder koncentrationen af det overfladeaktive middel konstant, men ændrer mængden af carbonfluorid, for eksempel fra 1 til 30 volumenprocent, vil absorptionsevnen forøges. Det foretrækkes at fremstille emulsioner, der er transparente eller semi-trans-parente, dvs. har en partikelstørrelse mellem 0,001 og 0,lyum, fordi de normalt er særlig stabile, og fordi det har vist sig, at de kan indgives sikkert. Partikelstørrelser op til 5yum kan anvendes, såfremt det viser sig, at midlet på sikker måde kan passere de animalske vener, arterier og kapillærer.

For eksempel har 10 volumenprocent emulsioner af de per-fluorerede forbindelser, PP9 og PP5 med 5 volumenprocent F68 optiske tæthedsplateauer på ca. 0,25 og 0,4 ved 550^um, de har et transparent udseende, og de har vist sig tilfredsstillende til intravenøs infusion. Koncentrationen af disse og andre perfluorerede forbindelser kan forøges fra ca. 5 til ca. 30 volumenprocent, således at de ret nøjagtigt approximerer den oxygenbærende egenskab af naturligt blod. Man kan variere mængden af emulgeringsmiddel og fluore- 9

DK 152643B

ret carbonhydrid i en emulsion inden for vide grænser, således at der tilvejebringes stabile emulsioner til intravenøs infusion, og således at der opnås tilfredsstillende resultater, jvf. efterfølgende udførelseseksempler.

Særlig egnede emulgeringsmidler er de blokpolymere polyoler, der forhandles under Wyandottes' varemærke "Pluronics". En fordel ved de ifølge opfindelsen anvendte perfluorerede forbindelser er deres lette emulgerbarhed, der muliggør anvendelsen af meget ringe mængder emulgeringsmiddel. Det mest almindeligt anvendte emulgeringsmiddel er Pluronic F68, der har en molekylvægt på ca. 8.000, og som er let tilgængeligt. Dette overfladeaktive,, middel er et effektivt emulgeringsmiddel, og det har været anvendt ved fremstilling af fedtemulsioner.

F68 er ikke-hæmolytisk, og det er non-ionogent. Det har været anvendt til at stabilisere erythrocytterne mod mekanisk hæmo-lyse. I små mængder er F68 tilfredsstillende, og det foretrækkes at anvende det i koncentrationer på ca. 5 til ca.

10 vægtprocent i Ringer's lactatopløsning. Med henblik på toxicitetsstudier i forbindelse med F68 skal der henvises til den ovenfor angivne litteraturhenvisning, Clark, "Physiology of Synthetic Blood". Derfor foretrækkes det at anvende Pluronic F68. Andre typer af overfladeaktive midler kan anven des. Et af de vigtigste kriterier ved udvælgelse af overfladeaktive midler til infusion i naturligt blod er naturligvis, at det ikke må skade blodet. Der er meget få, hvis overhovedet nogen, kationiske eller anioniske overfladeaktive midler, der ikke frembringer hæmolyse, når de blandes med blodet. De non-ionogene, overfladeaktive stoffer, der ikke frembringer hæmolyse, er således de foretrukne, og de omfatter naturligt forekommende overfladeaktive midler, såsom albumin, phospholipid, glycerol, dextraner og gelatine.

Ud over det perfluorerede cyclocarbon og det overfladeaktive r middel i emulsionen foretrækkes det, at emulsionen omfatter en ionisk bestanddel, men dette er ikke afgørende. Det er 10

DK 152643 B

ikke til infusion nødvendigt, at en ionisk bestanddel tilsættes til emulsionen før indgivelsen, fordi emulsionen blander sig med det ioniske, naturlige blod. Da de fleste af de overfladeaktive midler udviser et betydelig osmotisk tryk, har man gjort forsøg på at ændre ionsammensætningen på en sådan måde, at der ikke opstår en hypertonisk opløsning.

Ved fremstillingen af emulsioner tilsættes almindeligvis ca. 0,6 vægtprocent natriumchlorid, fordi dette er en koncentration, der kan infunderes ret hurtigt uden at frembringe hæmolyse. Det er hensigtsmæssigt at anvende Ringer-opløsning, der er fortyndet til halv styrke med vand.

Det gennemsnitlige oxygentryk (spændingen), der sædvanligvis skrives pC^, venøst blod af et dyr, der indånder luft, er ca. 70 torr. Det gennemsnitlige arterielle pC^, er ca.

90 torr. Under oxygen-indånding vil det venøse pC>2 måske forøges til ca. 80 torr, og det arterielle pC>2 til ca. 600 torr. Der er naturligvis variationer blandt dyr, i afhængighed af deres alder, sygdomsangreb, respirationsdybde, bedøvelsesniveau, hjerteydelse og mange faktorer, men når man ser bort fra hyperbarisk oxygenbehandling, overskrider pC^ af blandet venøst blod næsten aldrig 100 torr. Når man infunderer emulsioner af carbonfluorider, forøges pC^ sædvanligvis til 300, og det kan ikke skelnes fra arterielt blod ved udseendet alene; det må måles. Den almindeligste måde at måle blodets p°2 er at benytte en membran-dækket, polarografisk elektrode (Clark-oxygenelektroden). Forøgelsen af venøst oxygenspænding er en funktion af mængden af den emulsion af carbonfluorid, der tilsættes til blodstrømmen. Jo større værdien af carbon-fluoridet er, desto højere er generelt taget pC^, og værdierne når normalt 300 torr i en hund. Som følge af denne dramatiske forøgelse falder pC^ gradvist, og det vender tilbage til normalt niveau i løbet af 2 timer. Denne reduktion har vist sig at være en naturlig reaktion på den forøgede oxygenering af legemsvævet. Det kan for eksempel vises ved målinger med en til hjernen bestemt, polarografisk oxygenkatode. Det ved

DK 152643 B

11 fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede middel kan således undersøges for dets evne til at overføre oxygen under anvendelse af de to ovenfor angivne metoder, nemlig forøgelsen af blandet venøst p02 og forøgelsen af den kationiske oxygenstrøm.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres nærmere i den efterfølgende detaljerede beskrivelse af praktiske eksempler, idet der som forsøgsdyr er anvendt mus.

I. Forsøg med indgift af en ifølge opfindelsen fremstillet emulsion på mus_

Hunmus af typen schweizisk albino, fra Laboratory Supply Co. blev vejet til det nærmeste halve gram og anbragt i en plastbeholder, fyldt med befugtet 100 % C>2, idet halen ragede uden for. Halevener blev ekspanderet ved at indhylle halen med et vådt, 40 °C varmt trådnet i 10 sekunder. Kun de laterale vener anvendtes. Efter infusion bliver halen penslet med 70 % ethanol og markeret med henblik på identifikation. Dyrene anbragtes i et rent bur i grupper på ti, og de fodredes ad libitum i observationsperioden, hvorefter de blev slagtet.

Emulsioner indførtes med en sprøjtepumpe af typen Sage Instru- 3 ment model 355 med en hastighed af 2 cm /minut, og en af 3 glas fremstillet 10 cm multifit sprøjte tilsluttet via 30,5 cm af Kel-F-rør af type 18 til en 1,27 cm tyndvægget nål af type 26. Trykket kontrolleredes med en Statham P23Gb spændingsmåler og en Med-Science Electronics A-V trykkontrollør, der via en T-forbindelse var tilsluttet til røret for at sikre, at nålen forblev i venen, og at emulsionen ikke blev infiltreret. Pumpen kontrolleredes af et tidsindstillingsorgan af typen Kraft Rapid Reset. Den afgivne dosis måltes i sekunder af infusion til det nærmeste halve sekund.

II. Analytisk bestemmelse med natriumbiphenyl Fremgangsmåde til analyse af carbonfluorid i væv (lever og 12

DK 152643 B

milt) og i blod er baseret på dekomposition af de organiske fluorforbindelser med natriumbiphenylreagens efterfulgt af fortynding og potentiometrisk måling af fluor med en Orion fluoridelektrode.

A. Apparat. Elektroderne til bestemmelse af aktive fluoridioner (Model 94-01A og model 90-01 med den enkelte tilslutningsreferenceelektrode; kombinationsmodel nr. 96-09-00) blev leveret af Orion Research,. Inc. Elektroderne blev opbevaret i vand, der indeholdt ca. 1 ppm F~. Model nr. 90-00-01 (Orion, Inc.) fyldeopløsning blev anvendt til reference-elektroden. Radiometer model 22 pH-meter med ekspanderet skala blev anvendt til at aflæse millivolt. Supplerende apparatur består af følgende: 10 ,ul kasserbare pipetter (Clay Adams, ' + 3 total kapacitet 10 ^,ul, nøjagtighed - 1/2 %); 15 cm koniske centrifugerør af polypropylen (Nalgene); hule hætter af poly- 3 3 ethylen (størrelse 0); 50 cm Tipet Head med 1000 cm Erlen- 3 + meyer-kolbe (Thomas Scientific Co., Td 50 cm , nøjagtighed - 3 2 %); 100 cm polypropylenbægre (kasserbare bægre af typen Tri-pour, Sherwood Medical Industries, Inc.); 12 ml kasserbare sprøjter, mellemstykkespidser til sprøjter (mindst 6,5 cm i længden); vævshomogenisator med motor med variabel hastighed og patrondrev (Thomas Scientific); støder af teflon og malebeholder af glas, som ledsager vævshomogenisatoren, en blander af typen Vortex Genie, der er indstillet på hastigheden 5 (Scientific Industries).

B. Reagenser. Natriumbiphenyl-reagens (Southwestern Analytical Chemicals, Inc.) leveret i 15 ml beholdere. Hver beholder indeholder 15 - 18 mæk. natriumbiphenyl opløst i 1,2-di-methoxyethan. Ved opbevaring i kulden taber reagenset ca.

5 % styrke pr. måned.

Alle reagenser var af analytisk kvalitet. Den pH-puffer, der blev anvendt ved analysen af F efter dekompositionen af den organiske F-forbindelse, blev fremstillet på følgen- 13

DK 152643B

de måde: iseddike, 57 ml natriumnitrat, 58 g CDTA (trans-1,2-diaminocyclohexan-Ν,Ν,Ν',N'-tetraeddikesyre-monohydrat, Aldrich Chemical Company), 4 g natriumhydroxid-tabletter, ca.

35 g destilleret vand op til 1 liter, pH justeres til 5,8 med natriumhydroxid. Pufferen fremstilledes i 12 liter portioner og opbevaredes i en glasbeholder. Neefus, et. al. (American Industrial Hygiene Association Journal 31, 96-99 (1970)) diskuterede betydningen af at anvende den ovenfor angivne TISAB piffer (puffer til indstilling af den totale puffer) ved et pH, der var større end 5,14 og mindre end 6,0 for at forhindre tilstedeværelsen af udissocieret HF ved et surt pH, hvilket medfører falske, lave millivolt-aflæsninger, og af OH ved basisk pH, hvilket giver falske, høje millivoltaflæsninger. CDTA anvendes som komplekseringsmiddel for calcium og magnesium.

C. Analysemetode. Den følgende metode kan anvendes ved analyse af carbonfluorid, der er til stede i blod, animalske væv og emulsioner (anvendt som kunstigt blod).. Animalske væv bliver først fremstillet ved at veje organet i luft og i vand for at beregne tætheden af organet.

Tæthed = _vægt af det tørre organ_ vægt af det tørre organ - vægt af organ i vand Vægten af vævsprøven konverteres derpå til volumenaf prøven: „ , vægt at prøven volumen af prøven = Tæth|d af granet

Under anvendelse af dette volumen fortyndes vævet 1:3 (eller 1:5 i tilfælde af meget små organer, såsom musemilt) med 1 % Pluronic F 68 opløsning i vand. Man fremstiller homogenisa-ter under anvendelse af en glasbeholder og en støder af teflon med vævshomogenisatoren.

14

DK 152643B

Analysen kan gennemføres i serie og i stort antal (ca. 10 3 analyser pr. time). De 15 cm koniske centrifugerør er anord-net i et reagensglasstativ (in duplo for hver prøve, som skal analyseres), og 2 dråber 1,2-dimethoxyethan indføres i hvert glas. 1,2-dimethoxyethanet (opløsningsmiddel anvendt til biphenylreagenset) tjener som opløsningsmiddel til optagelse af blod- eller vævsprøverne, der tørrer hurtigt i de små mængder, der anvendes. Genvinding af carbonfluorid reduceres i høj grad uden anvendelse af dette opløsningsmiddel. Reagensglassene forsynes med etiket, og de forsynes med en hul hætte nummer 0. Anvendelsen af hætter hjælper med til at reducere tilstedeværelsen af luftholdigt vand i reagensglassene, hvilket vand reagerer med natriumbiphenylreagenset. Under anvendelse af de 10 ^,uliter kasserbare pipetter for hver prøve indføres 10 ^,ul af prøven (blod, vævshomogenisat eller emulsion) i reagensglassene. Den 12 ml sprøjte fyldes med natriumbiphenyl-reagenset. Plastspidsen anvendes for at neddykke sprøjten i beholderen for natriumbiphenyl. Hele luftmængden skulle fjernes fra sprøjten, før man fortsatte. Natriumbiphenyl (1,8 ml) indførtes i hvert centrifugerør, og indholdet blandes i 15 sekunder under anvendelse af Vortex-blanderen. Reaktionen mellem natrium og carbonfluoridet var fuldstændig i løbet 3 af få sekunder. De 100 cm polypropylenbægre blev forsynet 3 med etikette for hver prøve. Under anvendelse af den 50 cm 3 automatiske pipette hældtes 50 cm TISAB puffer i bægrene. Natriumbiphenylet i centrifugerørene blandedes i ca. 10 sekun- 3 der. Ca. 5 cm af pufferen hældtes fra bægeret i reagensglasset, og indholdet blandedes, indtil hele mængden af biphenyl reagerede. Indholdet af reagensglasset hældtes i bægeret, og proceduren gentoges to gange for at sikre, at reagensglasset blev skyllet godt med pufferen, og at det omsatte biphenyl blandedes med pufferen. En hvid forbindelse (biphenyl) dannedes i bægrene på dette stadium. De angivne volumina af prøver, natriumbiphenyl og puffer, som er angivet ved denne fremgagnsmåde, blev valgt sådan, at en fuldstændig forbrænding af carbonfluorid af natriumbiphenylet muliggjor-

DK 152643B

15 des, mens man stadig anvendte den minimale mængde af natrium-biphenyl. Større mængder af natriumbiphenyl frembringer en basisk pH-værdi, når reaktionsprodukterne blandes med pH = 5,8 pufferen.

Hele bægeret placeredes under den selektive fluoridionelektro-de for at måle indholdet af frit fluorid. Et vækkeur indstilledes på 5 minutter, og laboranten gik videre med fortynding af den næste prøve, mens fluoridelektroden stabiliseredes.

Frit fluorid aflæstes som millivolt på pH-meteret, og den procentvise mængde af carbonfluorid i prøven beregnedes under anvendelse af en kalibreringskurve for det særlige carbon-fluorid, som analyseredes.

D. Kalibreringskurver. En emulsion af carbonfluorid med en kendt mængde af carbonfluorid (beregnet i henhold til tæthed) udvalgtes. Emulsionen fortyndedes 1:10 og 1:100 for at tilvejebringe tre standardpunkter på kalibreringskurven.

For eksempel vil carbonfluoridet X have millivolt-aflæsninger ved 10 % (den procentdel af carbonfluorid, som anvendes i de fleste af de emulsioner, der fremstilles i de følgende eksempler), og ved 1% (ved fortynding 1:10). I henhold til Nernst-formlen bør der forekomme en 59 millivolt ændring mellem 1:10 fortyndinger ved stuetemperatur. I praksis varierer dog millivolt-inkrementerne mellem 57 og 60 millivolt. Denne forskel kan tilskrives den procentvise fejl, som metoden 3 er behæftet med (dvs. den 50 cm automatiske pipette har en nøjagtighed på - 2 %). Typiske analytiske resultater med forskellige prøver er som følger: 16

DK 152643B

Prøve io fluor Fundet _ teoretisk _

Perfluortributylamin, . væske 78,0 ^80,4

Perfluorbutyltetra- hydrofuran-emulsion 74,0 70,6

Perfluor-1,4-dii sopr opoxybutan, væske 73,0 71,4 2H-tetradecafluor-5-trifluormethyl- 3,6-dioxanonan-emulsion 71,4 73,2 4-F-benzoesyre 13,56 13,4 III. Måling af udskillelsen af dampformiqt carbonfluorid

Der anvendtes en gaskromatograf af serie 2700 Vatian med en detektor for indfangede elektroner, en søjle på 366,1 cm, 10 % SE-30 Chromosorb 60/80, ved en temperatur på 80 °C, til at måle dampformigt carbonfluorid. En mus anbragtes 3 inden i en 225 cm glasflaske, og åbningen blev forseglet med svær aluminiumfolie. 10 til 100 ^ul prøver af luft fra det indvendige af flasken blev udtaget 1 minut og 3 minutter efter og blev analyseret af gaskromatografen. Kalibrering af gaskromatografen blev udført ved at indsprøjte 0,5, 1, 2 eller 5 ^,ul af carbonf luor idet fortyndet med hexan under anvendelse af en Hamilton-sprøjte.

De følgende eksempler illustrerer fremstillingen af emulsioner og infusion af mus (alle procenter af carbonfluorider er på volumenbasis og andre procentdele er på vægtbasis).

Eksempel 1

En 9,4 % emulsion af perfluordecalin, dvs. PP5, der indeholder 5 % P68, blev fremstillet ved ultralydbehandling som ovenfor angivet med en koncentration af natriumchlorid på 17

DK 152643B

0,6 %. Emulsionen blev ført gennem en OH anionbytterharpiks for at befri den for F . Emulsionen havde næsten et transparent udseende. To hundrede mus blev hver infunderet intravenøst med denne émulsion på kendt måde med en dosis på 100 cm /kg legemsvægt.

Eksempel 2

En 10,1 % emulsion af perfluordecalin (PP5), der indeholdt 5 % F68, blev fremstillet ved Gaulin-homogeniseringsteknikken med en tilsat koncentration af natriumchlorid på.0,6 %. Emulsionen havde næsten et transparent udseende. To hundrede mus blev hver infunderet intravenøst med denne emulsion i 3 henhold til den generelle teknik med en dosis på 100 cm /kg legemsvægt.

Eksempel 3

Fremgangsmåden som anført i eksempel 2 blev gentaget med den ændring, at man fremstillede en 8,2 % perfluordecahydrol-l-methylnaphthalen (dvs. PP9 emulsion), som blev infunderet i to hundrede mus.

Eksempel 4

Fremgangsmåden i eksempel 1 blev gentaget med den ændring, at man fremstillede en 9,4 % PP9 emulsion, der blev infunderet i to hundrede mus.

Eksempel 5

Fremgangsmåden ifølge eksempel 2 blev gentaget med den ændring, at en 10 % PP9 emulsion blev fremstillet og infunderet i to hundrede mus.

DK 152643 B

18

Eksempel 6 (sammenligningseksempel)

Fremgangsmåden ifølge eksempel 1 blev gentaget med den ændring, at man fremstillede en 9,3 % emulsion af perfluor(l,8-diiso-propoxyoctan), dvs. PIID, der blev infunderet i to hundrede mus.

Eksempel 7 (sammenligningseksempel)

Fremgangsmåden ifølge eksempel 1 blev gentaget med den ændring, at man fremstillede en 10 % emulsion af en blanding af 2,5 % af hver af PP9, PHD, 2H-eicosafluor-5,8,ll-tris-(trifluor-methyl)-3,6,9,12-tetraoxapentadecan, nemlig (E-4 fra duPont), og FC47 (perfluortributylamin), og at den blev infunderet i to hundrede mus.

Eksempel 8

Fremgangsmåden ifølge eksempel 1 blev gentaget med den ændring, at man fremstillede en 9,4 % perfluordimethyldecalin (herefter kaldet PFDMD), som blev infunderet i to hundrede mus.

Eksempel 9

Fremgangsmåden ifølge eksempel 1 blev gentaget med den ændring, at man fremstillede en 10 % emulsion af en blanding af 5 % af hver af materialerne PP5 og perfluor-(l,3-dimethylcyclo- 3 hexan), nemlig PP3 og 50 cm /kg legemsvægt blev infunderet i to hundrede mus.

For at vise det omhandlede middels virkning i legemet, især RES, og for at vise de RES-fobe egenskaber af de perfluorerede forbindelser slagtedes grupper af mus fra eksempel 1-9 med tidsbestemte intervaller. Med henblik på dette studium blev musene fra hvert af eksemplerne sædvanligvis aflivet i grupper på seks, deres levere og milte blev underkastet 19

DK 152643B

biopsi, og procentdelen af infunderet carbonfluorid-dosis, der var efterladt i vævet, blev bestemt under anvendelse af den ovenfor angivne teknik, hvorved der anvendtes natrium-biphenyl. De gennemsnitlige procentdele af infunderet carbon-fluorid-dosis, der blev efterladt i leverne og miltene for alle mus i den gruppe, der blev slagtet (efter ca. 1 time, 1 dag, osv., igennem 5 måneder), er registreret i de følgende tabeller II og III. I de tilfælde, hvor to procentdele er registreret i en tidsblok, aflivede man to grupper mus, og den gennemsnitlige procentdel for hver gruppe er registreret. Hvor tiden ikke er angivet, blev der ikke gjort nogen bestemmelse.

Eksemplerne 6 og 7 er sammenligningseksempler.

20 DK 152643 B

• Μ 'β tn tn m m Β - - - CM τ- [Λ [Λ

in tn CM

å a - tn • Η »di- in i- νο S · » · ·> χ- tn vo tn cm τ- mm • »d tn σ» μ· in «a- cm 9 * ^ » » n tn *- co vo vo c--

Si τ- cm cm tn CM CM

<1)___ > .

©Si Η ο * tn 60 t-O χφ 00 •h d -- - - cm τ- tn «φ o . p m χ- cm tn »d__ d H Si H ®

©60 com 00 in incM

43 d » ·> — * ·> k «Η tntn in c- vo © cm cm tn xd- to •h <0 a 60 τ- 0 a (HI o d - - 0 mi «cj t— τ- ©

I «- cm tn H

I P--|>

Ml © *H

Wl St ® >

PQI © 60 -P

<ji*d dm cm 0 tnc- 0 ^

eh! d <d « — — * » — i* S

3 t- ootn tn 0 Om 0 tn tn tntn **t· ««j* ro a S3__:_ •h -— ω 60 © «Η d CM CM x- CM VO in vc p

Hi — — » ·> » » ^ no

in xj-x- com cm fM cS

Ητ-Ιί'· tn cm τ-·»- tn Si ©__p © p © fii

d S

0 H 60 x- P (¾ P

•Η P dx“ C St

» d MPW .5 tJ> O

HO 'ΟΟΩΗηΡί dfj Pd-gn°ft BSi m in m m m x- SmM· P S n d (¾ d P P Pppx-Hplpr^ft Si 0 p p P P P P BPH p m ft -- ti © M >d d 0

Sj ft pa x- cm tn x^- in vo 00 σ» * © a a fid

21 DK 152643 B

Η *d a *4- tA Ο ^ • Λ ev et ΙΑ Ο Ο ΙΑ 1Λ

U

fd S ω

«V

tA Ο •ύ

a ^ ο τ- tA

λ « a « CM ο Κ\ \0 ΚΩ >d +a a C— Οτ- O 00 T- * » Λ fa «ι #1 •η τ-τ- in c~- vo vo rj- a__

•H

Φ

43 60 * tA

rd 3 C— C\l_ OD O

<tf *· * * *> H tA 030 VO CD 0 H__—-- © •p Φ 60 3 COO Ο 'Φ CM ^ GQ λ ^ « fa ·» •H CM AI Al C— t— VO ro 03___ HI ° HI «d © HI 60 I -p 3 tA c*-

Pi Ο) * » PI U *- C- t- P3I a> ________ •ajl Ό-- HI 3 3 μ a

Vl Λ _ *A O

£j *d 00 r- in OJr- VO LO ID

•rj ^ ® ® Λ *1 S

in t~ vo vo 00 vo vd <H «Η d-- > H 60 ** <d «a a •d *d W AJ tA Al Al VD CM 0

49 » ·»·> ft ·> ft >. Q

β T-VO VO rh Al AJ rj* LD

Φ -P

O m Φ O © +3 H a 60 P4 *H t— VO at -p ^ C— ^ in σι 0 n ·» ·> ·>««>. 43 r-r- 0 Or- O CN Φ

----r- P

•d -η •H c~- *d s y ·? ή st

§ op Λ £ I

C ” j? * +>

2 ^ 0 0 >o ο H

P P d ·* S c φ

Sun in σι σι σι -r- 3ο3-φ p 3. en 43

η! n! n* n* S* Γ Η Η I & 2 -(k U

« P4 p| ft ft ft PM ft ftp ft pq ft O

Λ ---- ft H 05 (β Φ Cj HP* ·

Via r- W 1Λ ·«· ΙΛ VO f- 00 cn * Φ n m 3*1 22

DK 152643B

Af de i tabel II og III angivne data fremgår det, at indholdet af perfluoreret forbindelse i leveren og milten kan påvises indenfor 1 time, og mængden forøges i løbet af de næste fem dage. Ved slutningen af fem dage er næsten 50 % af den infunde-rede dosis for alle forbindelserne blevet sekvestreret af leveren og milten. Sekvestreringen af perfluorcyclocarbonhy-driderne som gruppe (PP5, PP9 og PFDMD) er temporær i sammenligning med de ikke-carbocycliske forbindelser som gruppe (eksempel 6 og 7). Især fjernes PP5 med en meget større hastighed end de andre perfluorerede forbindelser individuelt (når man sammenligner eksempel 2 med eksempel 3, 4, 5 og 8). Imidlertid fjernes blandingen af PP3 og PP5 fuldstændigt indenfor 3 uger i sammenligning med enhver af de undersøgte emulsioner. Disse data viser, at perfluorerede cycliske carbonhydrider af den omhandlede art som bloderstatninger er RES-fobe i den henseende, at de kun midlertidigt sekvestreres af leveren og milten, og det viser sig, at de udskilles fra RES. Derimod findes de andre undersøgte carbonfluorider i leveren og milten og forbliver der i ret ubegrænsede tidsrum, som vist i eksempel 7 og 8.

Andre data har vist, at perfluor-(1,4-diisopropoxybutan),

Allied PlD, som har et damptryk på ca. 13 torr ved 37,5 °C, meget nær ved damptrykket af PP5, forbliver i musens lever og milt i ret ubegrænsede perioder i tidsrum af op til mindst 1 år uden, at mængden deraf aftager væsentligt.

De foreliggende data i forbindelse med mus viser ved analyse, at der efter ca. 5 dages forløb findes ca. 42 % af den injicerede dosis af perfluoreret forbindelse (PP5) i leveren, nogle få procent i milten, og meget små mængder i de andre organer af legemet og i det organfrie legeme, der kaldes kadaveret. Nøjagtige data for disse andre organer og kadaveret er ikke tilgængelige for tiden. Ikke desto mindre synes det, som om nyrer, lunger og indvolde, herunder kadaveret, sandsynligvis indeholder fluoreret forbindelse i en mængde, der er en størrelsesorden lavere end i leveren eller milten. Museprøver, der er gennemført for PP5 efter 5 dage (når niveauet 23

DK 152643B

af carbonfluorid i blodet i det væsentlige er lig nul), viser, at der kan gøres regnskab for ca. 67 % af den totalt infundere-de mængde i det totale muselegeme. Den nøjagtige histologiske lokalisering af dette carbonfluorid er ikke kendt; den kan endog forekomme i lungerne, for eksempel på grund af den lille mængde af RES aktivitet i dette organ. Yderligere kan andre faktorer end RES aktivitet bidrage til tilstedeværelsen af carbonfluorid i andre organer eller det organfrie legeme.

I efterfølgende eksempler er vist, at dampene af den perfluore-rede forbindelse udskilles gennem vævet af forsøgsmusen til de externe omgivelser, hovedsageligt gennem lungerne og huden.

Eksempel 10

Man fremstillede en emulsion af 10 % PP5 på samme måde som beskrevet i eksempel 1. Med denne emulsion foretoges en infu-sion af mus i en dosis af 100 cm /kg på sædvanlig måde. Den totalt injicerede mængde af carbonfluorid var 200^um pr. mus. To mus, mus A og mus B, blev undersøgt for udskillelse af dampe af carbonfluorider i henhold til den ovenfor beskrevne GC-teknik. Daglige dampprøver blev taget efter 3 minutters ophold i flasken for hver mus, og mængderne af cis- og trans-iso-mere af PP5 i nanoliter pr. liter luft bestemt ved GC-analyser er sammenstillet i tabel IV.

Eksempel 11

En emulsion af 10 % PP9 blev fremstillet på samme måde som beskrevet i eksempel 1. Med denne emulsion foretoges infusion af mus som beskrevet i eksempel 10, og der gennemførtes GC-ana-lyser på lignende måde med henblik på sammenligning med PP5. Resultaterne er sammenstillet i tabel IV. Det bemærkes, at det anvendte PP9 indeholdt noget PP5, bestemt med GC-apparatet.

Der undersøgtes tre mus, A, B og C.

Eksempel 12

Man fremstillede en 10 % FC-47 emulsion på samme måde som 24

DK 152643B

beskrevet i eksempel 1. Man infunderede mus som i eksempel 10 - 11, og man udførte på lignende måde GC-analyser med henblik på sammenligning med PP5 og PP9. Resultaterne er sammenstillet i tabel IV. Man undersøgte tre mus, A, B og C.

25 DK 152643B

I tø t- ¾fi | 4S g oo oo ooo ooo ooo ooo o fh ra l*l 08

WH

FH FH 0) Φ +s 43

<T\ <H *H ^J-VO t-VO I CTvCM I CO f- I CM m I CM CM

Pi HH T- |τ-| I r- T- | -r- T-

00 Ph O

8 Jfi .H aft___________ cd •ti -»tf- in VO vhVD VO O CM 00 —| A fli * « * Λ ^ * ti μι cm o- co cm i m vo i *- σι ινοσ» i cnco o P4 V- |rr |r |r-r |rr β

H

<H -—-— O I Cto L -° ‘Η β h! cd +*fl t°i vo in ^j-o lo fh com ·»·*··»

Pi 0 SBPh moo Oxd- 10m l*-0 |τ-ιη I mm pq I <h WHP< t-·^ cm cm | cm tn I cm cm i tntn l mm 3! e EH I Φ-------------;- § fi! Rh

•ti ©CD

43 43 <H in -Hri vocn cm σ> σ\ I I c·- I I cm ι i mil

Cd PM Η H f- CM mCM II II r I I r- I I

H

•H CQ

«Μ 2

OQ

rcj c3 τ-σν t'-vo mil in i i in i i oil |d eh inc*- coc*-cMii t- i I cm i i mil

I U0 «Η β cd *H +» β Fh 00 CO

offiH T- vo cncn mil mil <· i I oil who τ-m mm **— i i ·«— I I cm i i mil

<ή pq *aj p <5 pq 0 <JWo <i ffi O

ti m m coco 03 00 00 OQGQOO CQ CO 00 03 OQ 00 * ii n ill in in §ii φ φ CD CD CD fli

(10 ¾)¾) W) do tiD

DK 152643B

Af tabel IV fremgår for det første, at de perfluorerede cy-cliske carbonhydrider PP5 og PP9 udskilles af musen gennem dennes væv, hovedsageligt lungerne og huden, som damp. Som en bekræftelse af, at PP5 undslipper fra leveren og milten hurtigere end PP9, ses det for det andet, at PP5 damp udskilles hurtigere end PP9 (anvendt PP9 indeholdt faktisk noget PP5, som angivet under søjlen "PP9"). I forbindelse med den ikke-cycliske forbindelse, FC-47, blev der heller ikke konstateret nogen udskilt damp af GC-apparatet. Dette supplerer de angivne data, der viser en større lever- og miltretention af sådanne andre carbonfluorider. Af de to isomere af PP5 undslipper den transisomere initialt med en større hastighed end cis-formen. De i tabel IV angivne data understøtter de netop angivne kvalitative observationer. Selv om de angivne data også tilvej ebringer kvantitativ information i forbindelse med udskillelsen af de undersøgte forbindelser, tager de angiver kvantitative værdier ikke relative forsøgsunøjagtigheder ved de anvendte teknikker i betragtning.

I forbindelse med retentionen af FC-47 blev leveren af en mus, der blev aflivet ca. 1 år efter infusion af FC-47, indført i en flaske inden i en beholder, der indeholder en vis mængde silicagel, indtil den er tør. Prøver af luften i flasken viste intet spor af FC-47, når den injiceres i gaskromatografen.

Den tørrede lever blev derpå findelt til et pulverformet støv og blandet med hexan. En prøve af denne blanding af lever og hexan frembragte et kromatogram, hvis toppe var identiske med et kromatogram af en prøve af originalt FC-47 fra det chargenummer, der blev anvendt til at infundere musen.

Vægten af den tørrede lever var større end den, der ville være normal for levervæv alene, og den mængde, der blev bestemt under anvendelse af biphenylmetoden, var betydelig. Det kan i denne forbindelse ikke fastslås, om det fluorholdige kemikalium er blevet løst komplex-bundet med stoffer i leveren, og båndet var sønderbrudt ved at findele og blande med hexan, eller om hele mængden af tilstedeværende fluorholdigt kemikalium var ekstraheret med hexan, eller om noget kan have dannet

DK 152643 B

27 nye forbindelser med proteiner af en eller anden årsag. Man kan imidlertid lægge mærke til, at flydende FC-47 ville fordampe i løbet af sekunder, hvis den blev gnedet på en bordflade under normale atmosfæriske betingelser. Alligevel bliver FC-47 i leveren af en mus i mindst 1 år; i en tørrende atmosfære kan den ikke konstateres ved gaskromatografisk analyse, og den kan kun konstateres i leveren ved findeling og ekstraktion med hexan.

Eksempel 13

En ung hankat blev bedøvet med Nembutal, og en kanyle blev indført i den højre haIsvene. Man lod dyret komme sig efter denne behandling indtil kl. 15:30 den næste dag. En 250^ul prøve af åndedræt blev derpå undersøgt for fluoreret carbonhy-drid, og aflæsningen på Varian gaskromatografen var 0. Man fremstillede en emulsion af PP5 (10 %) i 5 % Pluronic F68 som i eksempel 1, og det var hensigten, at denne skulle ind- 3 gives i en dosis af 30 cm pr. kg legemsvægt.

3

Kl. 15:35 injicerede man 1 cm emulsion intravenøst, og PP5 kom øjeblikkeligt tilsyne i kattens ånde, som vist på en 250 ,ul analyseprøve, som før angivet. Derpå administrere-de man en 75 cm dosis, hvorunder dyret var vågent, forblev agtpågivent og spandt og legede med et legetøj. Kl. 17 postoperativt blev en blodprøve taget. Man tog også kl. 17:15 den første dag derefter, og kl. 13:15 den anden dag derefter blodprøver og analyserede disse for fluoreret carbon-hydrid under anvendelse af den ovenfor angivne biphenylme-tode. Disse analyser er gengivet i tabel V sammen med en analyse af en urinprøve, der er taget ved direkte punktur af en kats blære, og andre observationer.

På den anden dag derefter blev katten bedøvet igen, og en 3 lille plastkop med et volumen på 10 cm blev blot holdt tæt imod pelsen af det højre bagben i 2 minutter. Gaskromatografisk analyse af en 250 ml prøve af gas taget indenfor få sekunder

DK 152643 B

28 fra koppen viste tilstedeværelsen af PP5. Når denne kop snart derefter blev placeret over et frisk barberet hudareal af katten, konstaterede man endog en større mængde PP5 i en udtaget, lignende 250^ul gasprøve. Adskillige minutter senere blev koppen derpå limet på plads over det barberede areal, således at man lod huden hele, og man udtog en yderligere

Q

250^ul gasprøve. En 1 cm prøve af katteblod ved 20 °C blev derpå anbragt i bunden af en glasbeholder med et volumen 3 på 20 cm , og dampen foroven og blodet blev analyseret ved GC, og der konstateredes betydelige mængder PP5. Når blodet blev opvarmet til 40 °C, fandt man endog mere PP5 i dampen.

Gasprøverne fra åndedrag, pels, barberet hud, limet kop, blod ved 20 °C og blod ved 40 °C blev alle analyseret for PP5 under anvendelse af en gaskromatograf og angivet i tabel 3 VI i nanoliter PP5 pr. liter prøve. Dampen over 1 cm urinprøve taget som. angivet ovenfor blev også analyseret og på lignende måde rapporteret i tabel VI.

29 DK 152643B

~~Γϊ I

δ φ §00 ν -tf· ιο c*» τ- ο φ ·· » « ·> Ο to Ο Ο ο

ίο · -tf-O

Ρ4 ρ 00 00 τ- τ- ^ί·ίΟ Ρ4 Ρ V0 Ο ^C— τ-τ- οο 0 » ft Λ ·» *» Λ ^ ^ ^ Ρ (Ο to οο οο οο φ d Η s,

<Η tO CM

Φ τ- Ο τ- CQ c— ΙΟ ΙΟ φ ο Ο Ο 0} · · · jg τ- τ α •Η ΙΟ p Ο CM CM ^ 3 g ,- > > % s t - _______ o = *a o -p

O -g -H

>1 H CM _ g ^

IP EH LO O "tf- δ O

Si -rt S > ?

&l g * S

§ ® s φ 1- LO LO H ^

j> W ·. » H

•Η O τ- C- "tf- ® fj

Cj tEj CM CM tO O Φ

w »d H

to o ^

SJ P -P

W P

0} Φ Cd l>fcj *d >d C 'd ft _ SO O O Ή ®*ΰβ PH H H Ρ Μ Η Φ ft P ffl P P g g

dl 3 H

---- H O

fi *H >

Φ Φ i «Ρ H

3 Cd H

Η Φ

LO LO O O fi O

ip τ— τ— O P · Φ •ι-i ·· ·· ** φ s ^ É+ r-ι f" m vo Hd'd

i—I iH iH H H *H

Φ o i> ______________ O |> p +3+3+3 +3+3+3 φ Φ Φ

*> > > X Μ M

Η -Η -Η X Μ Λ

+3+3+3 0j Φ CSJ

cd cd cd ft ft ft P P P , , .

Φ φ Φ P P P

bo ft bOft bD ft Φ Φ Φ cd o td o cd o «p+3(p+3lpp T” CM to bo ro to ω eh en ffl ca ·ο·ο·ο oop

Ρ r” ft CM ft tO ft iUpsiJS

Tabel VI

DK 152643B

30

Perfluordecalinindhold af prøver

Nr. Prøve Nanoliter pr. liter 1 åndedræt 48 2 pels 1/5 3 nybarberet hud 2,3 4 fra plastkop limet til huden 12 5 blod ved 20 °C 93 6 blod ved 40 °C 240 7 urin 0,3

Tabel V og VI udviser et antal bemærkelsesværdige kendsgerninger. Blodanalyser fra tabel V viser et relativt højt niveau (ca. 3,3 %) af PP5 kort tid efter intravenøs administration. Efter den første fulde dag falder niveauet for PP5 ned til ca. 0,78 %, og derpå, efter 1 5/6 dage, til et niveau på ca. 0,11 %. Man fandt en meget lille mængde PP5 i urinprøven, nemlig 0,04 %. Tabel VI viser de relative mængder af PP5 dampe, som udskilles fra katten. Der udskilles mere damp gennem lungerne af katten (hvilket kan konstateres i åndedrættet) end gennem huden (hudhætteforseglet prøve). Pels- og hudprøverne viste en mindre mængde konstateret PP5 damp ved den blotte anbringelse af koppen over pelsen og huden, hvilket er ventet. Dampanalyse af blodprøver ved 20 og 40 °C viste næsten en trefoldig forøgelse af fordampningen af PP5 med den forøgede temperatur. Slutteligt udviste gasprøven fra urinen en meget ringe mængde PP5, og det er ikke klart, om en sådan mængde var et resultat af vævsdiffusion eller om den førtes ind i blæren med affaldsvæsker. I hvert tilfælde bekræftedes dampudskillelsesfænomenet af det perfluorerede cycliske carbonhydrid PP5 fra det animalske legeme gennem vævet, især lungerne og huden, af de ovenfor angivne data.

Claims

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et oxygen- og carbondioxid-overføringsmiddel ved emulgering af en perfluoreret organisk forbindelse i et vandigt medium, kendetegnet ved, at et perfluoreret cyclisk carbonhydrid med RES-fobe egenskaber emulgeres i det vandige medium i nærværelse af en emulgator, hvorpå emulsionen homogeniseres under sådanne betingelser, at partikelstørrelsen bliver under 5 ^um, fortrinsvis 0,01 - 0,001 ^um.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det perfluorerede cycliske carbonhydrid med RES-fobe egenskaber er perfluordecalin eller perfluormethyldecalin.