DK152218B

DK152218B - Poroest, kugleformigt gelmateriale til separationsformaal og fremgangsmaade til fremstilling af samme samt anvendelse heraf til fremstilling af et modificeret, poroest gelmateriale

Info

Publication number: DK152218B
Application number: DK237679AA
Authority: DK
Inventors: Hiroo Sasaki; Katsuo Komiya; Yoshio Kato
Original assignee: Toyo Soda Mfg Co Ltd
Priority date: 1978-06-08
Filing date: 1979-06-07
Publication date: 1988-02-08
Also published as: US4246362A; JPS54160300A; US4256842A; US4256843A; CA1116584A; EP0006199A1; EP0006199B1; JPS6136177B2; AU527554B2; DE2964346D1; DK152218C; DK237679A; AU4757679A

Description

DK 152218 B

Opfindelsen angår et porøst, kugleformigt gelmateriale, hvilket gelmateriale er fremstillet ved en vandig suspensionspolymerisation af et methacrylat af en polyol og eventuelt efterfølgende er blevet underkastet hydrolyse i en vandig opløsning af en base.

5 Gelfiltreringsmetoder er vigtige metoder til separation og rens ning af vandopløselige stoffer. Dextrangel og polyacrylamidgel har således fundet udstrakt anvendelse inden for det biokemiske område som f.eks. separationsbærere. Disse geler har imidlertid lav mekanisk styrke, hvorfor de kun med betydelige ulemper har kunnet 10 anvendes som bærere ved højhastighedsvæskechromatografi.

Der er i den senere tid blevet gjort forsøg på at fremstille hydrofile geler med stor mekanisk styrke ved tværbindingspolymerisation af en acrylatmonomer eller en methacrylatmonomer. Det er imidlertid ikke lykkedes at opnå en gel med egenskaber, der tilfreds-15 stiller følgende vigtige krav: 1) stor mekanisk styrke, 2) ingen adsorption af de undersøgte materialer, og 3) stor separationsfaktor (adskillelse).

Disse krav kan kun opfyldes, når de forskellige ønskede fysis-20 ke og kemiske egenskaber, der stilles til en ideel gel, forefindes.

Blandt de kendte geler har polyethylenglycoldimethacrylatgeler, der er beskrevet i japansk patentpublikation nr. 24512/1973, den fordel, at de kun har lille adsorptionsevne men samtidig den ulempe, at de har ringe mekanisk styrke og en lille separationsfaktor.

25 Geler fremstillet ved at copolymerisere hydroxyethylmethacrylat og ethylenglycoldimethacrylat er omtalt i japansk patentpublikation nr. 64187/1973; disse geler har stor adsorptionsevne og ringe mekanisk styrke.

Fra beskrivelsen til US patent nr 3.657.117 kendes endvidere 30 porøse, kugleformige gelmaterialer til chromatografibrug, hvilke gelmaterialer består af tværbundne polymerer fremstillet ved copolyme-risering af en hovedmængde af en monomer med formlen: H2C = C-COOR1

35 I

R

i hvor R betegner hydrogen eller methyl, og R ifølge eksemplerne i beskrivelsen kan være 2,3-diacetoxypropyl, 2-hydroxy-3-acetoxy- 2

DK 152218 B

propyl, 2-formyloxyethyl og 2-acetoxyethyl, og en mindre mængde af en α,ω-alkylendiol-bis-methacrylat, såsom butan-1,4-dioldimetha-crylat, ethylenglycol-bis-methacrylat og hexan-1,6-diol-bis-metha-crylat. Polymererne kan eventuelt forsæbes ved behandling i en 5 vandig og/eller methanol isk opløsning af en base, og det angives, at i udover monomerer, hvori R har den ovenfor angivne betydning, kan også: pentaerythritotoltriacetatmethacrylat og -acrylat, 2-(2'-ace-toxyethoxy)-ethylmethacrylat og -acrylat, 2-acetoxy-3-hydroxy-propylacrylat, 4-acetoxy-2,3-dihydroxybutylacrylat, 4-acetoxy-2,3-10 dihydroxybutylmethacrylat, 2,3-diacetoxybutylacrylat, 2,3-diacetoxy-butylmethacrylat, 2,3-diformyloxypropylacrylat, 2,3-dipropionyl-oxypropylacrylat, 2,3-dibutyryloxypropylacrylat, 2-hydroxy-3-buty-ryloxypropylacrylat og 3-hydroxy-2-butyryloxypropylacry!at anvendes som hovedmonomerkomponent i den tværbundne polymer.

15 Det har imidlertid vist sig, at disse kendte polymergeler, hvor af ingen fremstilles ud fra monomerer med frie hydroxylgrupper, har for ringe hydrofile og for stærke hydrofobe egenskaber, hvilket bevirker en stærk adsorption af stoffer med hydrofobe karakteristika, såsom proteiner. Når polymergelerne anvendes til separation 20 af sådanne stoffer bliver elueringsvoluminet eller -tiden ikke blot en funktion af stoffernes molekylestørrelse men også af deres adsorption til gelen. Elueringstiden bliver forlænget (eventuelt uendelig ved totaladsorption) og elueringsvoluminet forøget, hvilket dels bevirker brug af unødvendig tid og elueringsvæske, dels bevirker en mindre 25 skarp adskillelse af ellers fraktionerbare stoffer, da selve det volumen eluringsvæske, hvori de enkelte stoffer elueres (som ved al anden chromatografering) bliver større jo længere tid, der går, inden elueringen finder sted.

Opfinderne til nærværende opfindelse har derfor undersøgt mu-30 ligheden for at fremstille en til anvendelse ved gelpermeabilitets-væskechromatografi velegnet separationsgel med ikke blot god mekanisk styrke men også med stor hydrofilicitet, ringe adsorptionsevne (hydrofobicitet) og stor separationsevne.

Dette formål er det nu lykkedes at opnå med det indledningsvis 35 angivne porøse, kugleformige gelmateriale, som ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det ved den vandige suspensionspolymerisation fremstillede porøse, kugleformige gelmateriale er blevet opnået ved homopolymerisation af pentaerythritoldimethacrylat eller ved copoly-merisation af fra 100 til 5 vægtdele pentaerythritoldimethacrylat og 3

DK 152218B

fra O tit 95 vægtdele af en anden methacrylatmonomer, der har en hydrofil gruppe eller en til en hydrofil gruppe konverterbar gruppe.

Opfindelsen er siledes baseret på den opdagelse, at pentaerythritoldimethacrylat som tværbindingsmonomer tilvejebringer stor me-5 kanisk styrke og en til overvindelse af et tværbundet produkts hydrofobicitet tilfredsstillende hydrofilicitet, hvilken hydrofilidtet eventuelt kan øges ved en hydrofil behandling af de steder p§ overfladen af gelen, hvor de primære hydroxylgrupper befinder sig.

Det porøse gelmateriale ifølge opfindelsen er særligt velegnet til 10 adskillelse af vigtige vandopløselige stoffer, såsom proteiner og enzymer i vandigt medium.

Hovedgrundene til, at pentaerythritoldimethacrylat er udmærket som tværbindingsmonomer er: (1) at kæden mellem to vinylgrupper er kort, hvorved der kan 15 opnås en gel med en stor mekanisk styrke, (2) at en hydrofil oxiranforbindelse under relativt milde betingelser kan omsættes med to hydroxylgrupper med en bemærkelsesværdig stor reaktivitet som primære hydroxylgrupper, hvorved hovedkæden og esterbindingerne i 20 polymeren som dennes hydrofobe del kan dækkes af den hydrofile bindingskæde. Som følge heraf elimineres de hydrofobe adsorptionssteder, og selv stærkt adsorberbare materialer, såsom proteiner, adsorberes ikke og kan fraskilles på basis af molekyistørrelser ved en gelpermeabili-25 tetseffekt, og (3) at en vandig suspensionspolymerisation relativt let kan udføres, selv når der er to hydroxylgrupper til stede, hvilke grupper giver stærkt hydrofile egenskaber.

Opfindernes undersøgelser har vist, at stabiliteten af den 30 vandige suspensionspolymerisation forringes i takt med monomerens eller tværbindingsmidlets stigende hydrofilicitet, og pentaerythritoldimethacrylat har en næsten kritisk hydrofilicitet.

Pentaerythritoldimethacrylat kan fremstilles på simpel måde ved at omsætte pentaerythritol med methacrylsyre eller dennes estere.

35 Den porøse, kugleformige gel ifølge opfindelsen indeholder primære hydroxylgrupper, og af fysiske egenskaber har den en gennemsnitlig partikeldiameter på 1-500 μ, en gennemsnitlig porediameter på 20-1500Å og en vandtilbageholdelsesevne på 1-5 g/g.

DK 152218B

4

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af det porøse, kugleformige gelmateriale ifølge opfindelsen, hvilken frem-gangsmåde er ejendommelig ved, at pentaerythritoldimethacrylat homopoly seres, eller at fra 100 til 5 vægtdele pentaerythritoldi-5 methacryiat copolymeriseres med fra 0 til 95 vægtdele af en anden methacrylatmonomer, der har en hydrofil eller en til en hydrofil gruppe konverterbar gruppe, ved en vandig suspensionspolymerisation, og at det dannede gelmateriale eventuelt underkastes hydrolyse i en vandig opløsning af en base.

10 Den vandige suspensionshomopoiymerisation eller copolymerisa- tion til frembringelse af bæreren kan udføres pi kendt måde. F.eks. opløses et tværbindingsmiddel, en monomer og en polymerisationsini-tiator i et organisk opløsningsmiddel, og blandingen opvarmes til 40-90°C, fortrinvis 50-80°C, og udhældes i en vandig opløsning af 15 suspensionsmidlet under omrøring til frembringelse af tværbindingspolymerisation i et nærmere angivet tidsrum.

Forholdet mellem pentaerythritoldimethacrylat som tværbindings-middel og en comonomer ligger i området fra 100:0 til 5:95, fortrinsvis fra 100:0 til 10:90.

20 Når forholdet mellem pentaerythritoldimethacrylat og comonomer- en forøges, opnås der en gel med større hårdhed og større mekanisk styrke. Når kun pentaerythritoldimethacrylat polymeriseres, opnås der en gel med bemærkelsesværdig stor hårdhed og mekanisk styrke.

Methacrylatmonomerer, som benyttes ved den foreliggende 25 opfindelse, er methacrylatmonomerer med en hydrofil gruppe og/eller en til en hydrofil gruppe konverterbar gruppe og er copolymeriser-bare med pentaerythritoldimethacrylat ved en vandig suspensionspolymerisation.

Egnede methacrylatmonomerer med en hydrofil gruppe omfatter 30 2-hydroxyethylmethacrylat og polyethylenglycoldimethacrylat med formlen: CH- ro ,3 CH3 35 ch2«c-coo —f ch2-ch2-o -fc— OC-OCH2 (3^ni 15) (trimer eller højere) såsom tetraethylenglycoldimethacrylat og nonaethylenglycoldimeth-

DK 152218B

5 acrylat. Det foretrækkes navnlig at anvende 2-hydroxyethylmeth-acrylat.

Egnede methacrylatmonomerer med en hydrofilgruppe omfatter halohydrinmethacrylater og methacrylatmonomerer indeholdende en 5 oxirangruppe. Det foretrækkes navnlig at anvende glycidylmeth- acrylat.

Som methacrylatmonomerer, der har en hydrofil gruppe eller en til en hydrofil gruppe konverterbar gruppe, har monomethacrylater af en lavere polyvalent alkohol med 3*6 carbonatomer, sisom 10 glycerin, pentaerythritol, trimethylolethan og trimethylolpropan, overskud af hydrofile egenskaber, hvorved en vandig suspensionspolymerisation ikke kan udføres. Det er imidlertid muligt at anvende C^-C^, mættede alifatiske estere heraf, sisom estere med eddikesyre, propionsyre eller butansyre, og monomethacrylater af polyethylen-15 glycol eller polypropylenglycol, hvis hydroxylgruppe er esterificeret med en lavere, mættet alifatisk syre, og som har formlen: CH_ I 3 CH2-C-COO -f CH-CH2-0 OCH2-R2 (l<m<15) 20 R1 (hvor R1 betegner H eller CHg, og Rg betegner en C^-Cg, mættet, alifatisk carbonhydridgruppe). Det foretrækkes navnlig at anvende mono-eller dipropionat eller -butyrat af pentaerytritolmonometh-acrylat.

25 Det organiske opløsningmiddel til opløsning af tværbindings- midlet og monomeren bør danne mindst to faser med vandet og bør være et inert opløsningsmiddel.

Egnede organiske opløsningsmidler omfatter aromatiske carbon-hydrider, halogencarbonhydrider, alkoholer med 4 eller flere carbon-30 atomer, ketoner med 4 eller flere carbonatomer, alifatiske syre-estere og ethere med 5 eller flere carbonatomer.

Det foretrækkes navnlig at anvende toluen, chlorbenzen, dichlorbutan, n-butanol, cyclohexanol, diisobutylketon, cyclohexa-non, n-butylacetat og diisopropylether.

35 Mængden af organisk opløsningsmiddel udgør volumenmæssigt fortrinsvis fra 1 til 4 gange, og navnlig fra 1,2 til 3 gange totalmængden af tværbindingsmiddel og vinylmonomer.

Polymerisationsinitiatorerne kan være sædvanlige radikal-polymerisationsinitiatorer. Det foretrækkes navnlig at anvende ben- 6

DK 152218 B

zoy I peroxid, azobis-isobutyronitril, t-butylperpivalat, etc.

Mængden af polymerisationsinitiator udgør fortrinsvis fra 0,2 til 10 vægtprocent, navnlig 0,5-5 vægtprocent, af den totale mængde af tværbindingsmiddei og methacrylatmonomer.

5 Oer kan anvendes sædvanlige suspensionsstabilisatorer. Det foretrækkes navnlig at benytte poly vinylal kohol (poval) og poly-vinylpyrrolidon.

Mængden af suspensionsstabilisator er sædvanligvis på fra 1 til 10 vægtprocent af vandet.

10 Det porøse, kugleformige gelmateriale ifølge den foreliggende opfindelse, der har en til en hydrofil gruppe konverterbar gruppe kan hydrolyseres i en vandig opløsning af en base til omdannelse af denne gruppe, eksempelvis en epoxygruppe, et halogenatom eller en mættet alifatisk syre-estergruppe, til en hydroxylgruppe.

15 Bortset fra eliminering af epoxygrupper, halogenatomer og mættede alifatiske syre-estergrupper er de fysiske egenskaber, hvad angår gennemsnitlig partikeldiameter, gennemsnitlig porediameter og tilbageholdt vand for det hydrolyserede gelmateriale, i det væsentlige de samme som dem for ikke-hydrolyseret gelmateriale.

20 Ved hydrolysen af den porøse, kugleformige gel i den vandige opløsning af en base til fremstilling af det hydrofile gelmateriale suspenderes den ikke-hydrolyserede gel i en vandig opløsning af en base, og blandingen opvarmes til en forud fastlagt temperatur under omrøring i passende omfang og i en forud fastlagt tid.

25 Den vandige opløsning af en base kan være en vandig opløsning af en alkalimetalforbindelse, navnlig en vandig opløsning af natriumhydroxid eller kaliumhydroxid.

Opfindelsen angår også en anvendelse af det porøse, kugleformige gelmateriale ifølge opfindelsen til fremstilling af et modifi- 30 ceret, porøst, kugleformigt gelmateriale, hvilken anvendelse er ejendommelig ved, at primære hydroxylgrupper på det porøse, kugleformige gelmateriale ifølge krav 1 additionsomsættes med en hydrofil oxiranforbindelse eller dennes oligomer.

Det modificerede kugleformige gelmateriale har bedre fysiske 35 egenskaber, navnlig en forbedret hydrofilicitet på sin overflade, en bedre mekanisk styrke, et forøget oxygenindhold, som bestemt ved elementaranalyse, og en forøget absorption frembragt af ether-bindinger og bekræftet ved IR-spektrum i forhold til dem for udgangsmaterialet og dets eventuelt hydrolyserede udførselsform. De

DK 152218 B

7 fysiske egenskaber, hvad anglr middelpartikeldiameter, middelpore-diameter og tilbageholdt vand, er for det modificerede gelmateriale imidlertid i det væsentlige de samme som dem for udgangsmaterialet og dets eventuelt hydrolyserede udførselsform.

5 Virkningerne af den hydrofile, modificerede behandling ifølge den foreliggende opfindelse er som følger: (1) En forbedring ved formindskelse af adsorptionsegenskaberne frembragt ved eliminering af hydrofobe adsorptionssteder, 10 (2) En forøgelse af mekanisk styrke frembragt ved tvær binding.

Ved den hydrofile behandling til fremstilling af den modificerede kugleformige gel blandes en oxiranforbindelse, en katalysator og et opløsningsmiddel med det porøse, kugleformige gelmateriale ifølge 15 opfindelsen, som eventuelt kan være hydrolyseret, og blandingen omrøres ved en reaktionstemperatur på fra 0 til 200°C, fortrinsvis fra stuetemperatur til 120°C, i et ønsket tidsrum til omsætning af den hydrofile oxiranforbindelse eller dennes oligomer med en primær hydroxylgruppe i gelen ved en additionsreaktion.

20 Om nødvendigt tilsættes vand i overskud på det afsluttende stadium af reaktionen, og blandingen opvarmes til mere end 50°C i adskillige timer til hydrolysering af tilbageværende oxiranringe eller andre hydrolyserbare grupper.

Når epichlorhydrin benyttes som oxiranforbindelse er det vigtigt 25 at behandle den med en vandig opløsning af en base til erstatning af chloratomet med en hydroxylgruppe.

Forskellige metoder kan anvendes ved den hydrofile behandling.

I det følgende anføres tre typiske metoder.

Den første metode består i en omsætning i en vandig opløsning 30 af en base. Basen kan være et alkalimetalhydroxid eller -carbonat eller et alkalisk jordartsmetalhydroxid eller -carbonat.

Den anden metode består i en omsætning i et polært organisk opløsningsmiddel i nærværelse af en katalysator, såsom et alkalimetalhydroxid, -carbonat og metalal koholat. Det polære organiske 35 opløsningsmiddel kan være (1) et opløsningsmiddel af amidtypen / såsom dimethyiformamid og N-methylpyrrolidon, (2) dimethylsufoxid og (3) et opløsningsmiddel af ethertypen, såsom dioxan, diethylen-glycoldimethylether.

Den tredie metode består i en omsætning i nærværelse af en

DK 152218B

s

Lewis-syre som katalysator.

Typiske katalysatorer er borfluorid, dettes etherkomplex og stannitetrachlorid. Egnede opløsningsmidler omfatter opløsningsmidler af ethertypen, såsom dioxan og diethylenglycoldimethylether.

5 De hydrofile oxiranforbindelser, som benyttes ved den fore liggende opfindelse, omfatter epichlorhydrin, glycidon, butadien-diepoxid og forskellige glycidylethere af polyvalente alkoholer.

Egnede glycidylethere af polyvalente alkoholer omfatter (1) mono- eller di-glycidylethere af ethylenglycol, propylenglycol, 10 butandiol eller hexandiol, (2) mono-, di- eller tri-glycidylethere af glycerol, erythritol, pentaerythritol, sorbitol, trimethylolethan eller trimethylolpropan, (3) mono- eller di-glycidylethere af diethylen-glycol og triethylenglycol, (4) mono- eller di-glycidylethere af propylenglycol, og (5) mono- eller di-polyglycidylethere af et 15 monosaccharid eller oligosaccharid.

Disse glycidylethere kan fremstilles på kendt måde under anvendelse af en polyvalent alkohol og epichlorhydrin. Typiske glycidylethere er kommercielt opnåelige.

Oxiranforbindelsen kan være en blanding af to eller flere 20 forbindelser. Hvis molekylvægten af oxiranforbindelsen er for stor, formindskes det indre porevolumen af gelen mærkbart, hvilket nedsætter separationsfaktoren (resolutionen) for separationsmaterialet. Molekylvægten for oxiranforbindelsen er almindeligvis mindre end 1000 og fortrinsvis mindre end 500.

25 Når der ifølge den foreliggende opfindelse benyttes en mono- oxiranforbindelse, opnås kun virkningen (1), d.v.s. en sænkning af adsorptionsevnen, af virkningerne ved den hydrofile behandling. Når der benyttes di- eller tri-oxiranforbindelser, kan der opnås både en nedsættelse af adsorptionsevnen og en forøgelse af den mekaniske 30 styrke ved en tværbindingsreaktion.

Det hydrofile, porøse, kugleformige gelmateriale ifølge opfindelsen, dets hydrolyserede udførselsform og det herudfra med en hydrofil oxiranforbindelse eller dennes oligomer ved en additionsreaktion fremstillede, modificerede gelmateriale har fortrinsvis en 35 partikeldiameter på fra 1 til 500 μ, navnlig fra 5 til 200 μ, for at være særligt effektiv ved forskellige anvendelser.

Den gennemsnitlige porediameterstørreise i den porøse, kugleformige gel kan reguleres inden for et område på fra 10 til 2000 Å.

Som væskechromatografimateriale er det særligt vigtigt, at den po- 9

DK 152218 B

pøse, kugleformige gel har en gennemsnitlig porediameterstørrelse på fra 20 til 1500 Å.

Som separationsmateriale har de hydrofile geler ifølge den foreliggende opfindelse, der er opnået ved hydrofil behandling, lav 5 adsorptionsevne, høj mekanisk styrke og er bemærkelsesværdigt udmærkede som permeable gelmaterialer. De kan anvendes inden for de sædvanlige dextrangel- og agarosegelområder, navnlig til separation og analyse af biokemisk materiale, såsom proteiner og enzymer.

De porøse, kugleformige geler, som har undergået eller ikke 10 undergået den hydrofile behandling, har udmærkede egenskaber som fordelingschromatografimaterialer. Sådanne geler har stærkt reaktive hydroxylgrupper, hvorved der kan opnås forskellige geler med særlige funktioner, såsom svarende til dextrangel og agarosegel, ved at modificere de reaktive hydroxylgrupper. Gelerne ifølge opfindelsen 15 har imidlertid fordele i form af høj mekanisk styrke, som ikke kan tilvejebringes ved dextrangel og agarosegel.

Den foreliggende opfindelse vil blive yderligere belyst ved nogle eksempler og efterfølgende beskrivelse, som kun har til formål at belyse og ikke begrænse den foreliggende opfindelse.

20

Fremstilling af pentaerythritoldimethacrylat.

I en glaskolbe forsynet med en omrører og en termostat blev der fyldt 200 vægtdele pentaerythritol, 1000 vægtdele dimethylform-amid og 2 vægtdele kaliumhydroxid. Blandingen blev omrørt ved 25 65°C, og 400 vægtdele glycidylmethacrylat blev dråbevis tilsat i løbet af 1 time. Blandingen blev yderligere omrørt ved denne temperatur i 40 minutter, og derpå blev der tilsat 1,5 vægtdele iseddikesyre, og blandingen blev afkølet til under 60°C. Dimethylformamid og ikke-omsat glycidylmethacrylat blev afdestilleret under reduceret tryk i en 30 rotationsfordamper. Det tilbageværende materiale blev tilblandet 3000 vægtdele ethylacetat, og ved filtrering blev der fraskilt et uopløseligt materiale.

Ethylacetatopløsningen blev ekstraheret og vasket med 1000 vægtdele af en 15% vandig opløsning af natriumchlorid til fjernelse af 35 vandopløselige komponenter. Ethylacetatopløsningen blev tørret over vandfrit natriumsulfat, og ethylacetatet blev derpå afdestilleret under reduceret tryk. Det resulterende pentaerythritoldimethacrylat blev analyseret ved væskechromatografi under høj hastighed og nedenstående betingelser. Resultatet er vist i fig. 1.

10

DK 152218 B

Apparatur: HLC 802 UR (fremstillet af Toya

Soda Ind. Co.) Søjle: TSK GEL G-2000H, to søjler med indvendig diameter pi 7,5 mm og 5 længde på 600 mm.

Eiueringsmiddel: tetrahyd rof uran.

Strømningshastighed: 1 ml/minut.

Temperatur under bestemmelsen: Stuetemperatur.

Detektor: Differential refra ktometer.

10

Ifølge analysen indholdt produktet ca. 10% pentaerythritoltri-methacrylat og små mængder glycidylmethacrylat som urenheder. Af produktet blev der optaget IR-spektrum, som er vist i fig. 2.

Det resulterende pentaerythritoldimethacrylat blev anvendt i 15 eksemplerne.

EKSEMPEL 1 I en reaktor, der var udstyret med en omrører og en termostat, blev der fyldt 4000 vægtdele vand og 2000 vægtdele poly vinylal kohol 20 (poval), og blandingen blev omrørt ved 70°C til opløsning af poly-vinylalkoholen. Den vandige opløsning af polyvinylal kohol blev iblandet en blanding af 400 vægtdele pentaerythritoldimethacrylat, 800 vægtdele n-butanol og 8 vægtdele benzoylperoxid til frembringelse af en tværbindingspolymerisation i løbet af 16 timer. Efter 25 reaktionen blev den resulterende suspension filtreret gennem et glasfilter og vasket med varmt vand og yderligere vasket med acetone til opnåelse af en fin kugleformig gel. IR-spektrum af den tørrede gel er vist i fig. 3.

Den resulterende gel blev sigtet, og partikler med en diameter 30 p| 8-12 μ blev opsamlet. Gelen blev under tryk pakket i en rustfri stålsøjle med en indre diameter på 7,5 mm og en længde på 60 cm.

Under anvendelse af en dextran-standardprøve (fremstillet af Pharmacia Co.) blev grænsen for separabel molekylvægt bestemt til 5 at være ca. 10 . Betingelserne ved bestemmelsen var som følger:

Apparatur: HLC 802 UR (fremstillet af Toya Soda Ind.

Co.)

Medium: Destilleret vand.

35

DK 152218B

11

Strømningshastighed: 1/0 ml/minut.

Injiceret prøvemængde: 100 μΙ af en ca. 0,4% vandig opløs ning.

Detektor: IR-detektor.

5 Temperatur: Stuetemperatur.

Forholdet mellem tryktab og strømningshastighed blev undersøgt ved varierende strømningshastighed. Resultatet heraf var, at tryktabet forøgedes proportionalt med strømningshastigheden indtil 300 10 kg/cm . Gelens mekaniske styrke var bemærkelsesværdig høj.

En polyethylenglycol-standardprøve blev elueret med vand.

Ifølge resultatet forløb elueringen af polyethylenclycolen ikke altid i molekylvægtsrækkefølge p§ grund af adsorption. Resultatet var imidlertid bedre end dem for kendte hydrofile separatiosbærere.

15 En protein-standardprøve blev elueret med en phosphorsyre- pufferopiøsning. Resultatet var som følger:

Protein Eluering % y-globulin 15 20 albumin (blodserum) 55 β-lactoglobulin 30 myoglobin 35 cytochrome C 3 25 Betingelserne ved bestemmelsen var som følger:

Betingelserne ved måling pi polyethylengiycol-standardprøven Apparatur: HLC 802 UR

Søjle: Invendig diameter 7,5 mm og længde 600 30 mm.

Elueringsmiddel: Vand.

Strømingshastighed: 1,0 ml/minut.

Temperatur: Stuetemperatur.

Detektor: Differential refra ktometer.

35

Betingelserne ved måling på protein-standardprøven Apparatur: HLC 802 UR

Søjle: To søjler, indvendig diameter 7,5 mm og længde 600 mm.

DK 152218B

12

Elueringsmiddel: phosphorsyrepufferopløsning (pH 6,8)

Strømningshastighed: 1,0 ml/m?nut.

Temperatur: Stuetemperatur.

Detektor: UV 280 nm.

5 I de følgende eksempler er betingelserne ved måling pi dextran-, polyethylenglycol- og protein-standardprøver de samme som anført ovenfor.

EKSEMPEL 2 10 En vandig suspensionscopolymerisation blev udført i overens stemmelse med fremgangsmåden i eksempel 1 med undtagelse af, at der blev anvendt 200 vægtdele pentaerythritoldimethacrylat som tværbindingsmiddel og 200 vægtdele 2-hydroxyethylmethacrylat som comonomer efterfulgt af en efterbehandling.

15 Produktet blev sigtet, og gel med en diameter på 20-30 μ blev opsamlet.

I overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge eksempel 1 blev gelen pakket i en søjle, og grænsen for separabel molekylvægt blev bestemt under anvendelse af en dextran-standardprøve. Den var ca.

20 104.

Når en protein-standardprøve blev elueret under anvendelse af en phosphorsyrepufferopløsning, var adsorptionen lidt lavere end den for gelen i eksempel 1.

25 Protein Eluering % γ-globulin q 30 albumin (blodserum) 63 β-lactoglobulin 38 myoglobin 45 30 cytochrom C 12 EKSEMPEL 3

En vandig suspensionscopolymerisation og efterbehandling blev udført i overensstemmelse med fremgangsmåden i eksempel 1 med 35 undtagelse af, at der blev anvendt 60 vægtdele pentaerythritoldimethacrylat som tværbindingsmiddel, 340 vægtdele glycidylmethacrylat som comonomer og 600 vægtdele monochlorbenzen som opløsningsmiddel i stedet for n-butanol.

Residualepoxygruppen blev bestemt til at udgøre 63% af det teo-

DK 152218B

13 retisk beregnede.

Produktet blev sigtet, og gel med en diameter på 20-30 μ blev opsamlet.

I overensstemmelse med fremgangsmåden i eksempel 1 blev gelen 5 pakket i en søjle, og grænsen for separabel molekylvægt blev bestemt under anvendelse af en dextran-standardprøve. Den var ca.

106..

100 vægtdele gel med en diameter på 20-30 μ, der var opnået ved sigtning, blev suspenderet i 500 vægtdele 1N NaOH i vandig 10 opløsning, og blandingen blev omrørt ved 30°C i 20 timer. Gelen blev vasket med varmt vand. Der blev ikke detekteret residual-epoxygrupper.

Gelen blev pakket i en søjle, og en protein-standardopløsning blev elueret under anvendelse af en phosphorsyrepufferopløsning.

15 Resultaterne var som følger:

Protein Eluering % y-globulin 35 albumin (blodserum) 62 20 β-lactoglobulin 45 myoglobin 48 cytochrome C 28 EKSEMPEL 4 25 En vandig suspensionscopolymerisation og efterbehandling blev udført i overensstemmelse med fremgangsmåden i eksempel 1 med undtagelse af, at der blev anvendt 150 vægtdele pentaerythritoldi-methacrylat som tværbindingsmiddel og 250 vægtdele nonaethylengly-coldimethacrylat (gennemsnitlig molekylvægt på 400 blandet med 30 polyethylenglycoldimethacrylat) som comonomer.

Produktet blev sigtet, og gel med diameter på 20-30 μ blev opsamlet.

I overensstemmelse med fremgangsmåden i eksempel 1 blev gelen pakket i en søjle, og grænsen for separabel molekylvægt blev 35 bestemt under anvendelse af dextran-standardprøven. Den var ca.

104.

Gelen blev pakket i en søjle, og en protein-standardprøve blev elueret under anvendelse af phosphorsyrepufferopløsningen. Resultatet var som følger: 14

DK 152218 B

Protein Eluering % γ-globulin 55 albumin (blodserum) 84 β-lactoglobulin 60 5 myoglobin 68 cytochrom C 45 EKSEMPEL 5

En vandig suspensionscopolymerisation og efterbehandling blev 10 udført i overensstemmelse med fremgangsmåden i eksempel 1 med undtagelse af, at der blev anvendt 50 vægtdele pentaerythritoldi-methacrylat som tværbindingsmiddel, 350 vægtdele glycerolmono- methacrylatmonopropionat som comonomer og 600 vægtdeie isoamyl-alkohol som opløsningsmiddel.

15 Produktet blev sigtet/ og gel med diameter pi 30-50 μ blev opsamlet. I 500 vægtdele af en 3N vandig opløsning af NaOH blev 100 vægtdele af gelen suspenderet og omrørt ved 40°C i 16 timer. Gelen blev filtreret og vasket med varmt vand. I overensstemmelse med fremgangsmåden i eksempel 1 blev gelen pakket i en søjle, og 20 grænsen for separabel molekylvægt blev bestemt ved anvendelse af 4 en dextran-standardprøve. Den var ca. 5 x 10 .

En polyethylenglycol-standardprøve blev elueret med vand.

Ifølge resultatet forløb elueringen af polyethylenglycolen altid efter molekylvægt. Dette resultat viser lav adsorptionsevne.

25 En protein-standardprøve blev elueret med en phosphorsyre- pufferopiøsning. Resultatet var som følger:

Protein Eluering % y-globulin 76 30 albumin (blodserum) 92 β-lactoglobulin 75 myoglobin 80 cytochrome C 55 35 EKSEMPEL 6

En vandig opslæmning af gel med en diameter på 8-12 μ, der var opnået ifølge eksempel 1, blev filtreret gennem et glasfilter til opnåelse af en våd kage. I en giasreaktor blev der fyldt 100 vægtdele af den våde kage af gelen, 50 vægtdele glyceroldiglycidylether

1S

DK 152218B

(Denacol EX-314, fremstillet af Nagase Sangyo K.K.) og 200 vægtdele af en 1N vandig NaOH-opløsning og omrørt ved 30°C i 16 timer. Suspensionen blev filtreret gennem et glasfilter, og gelen blev vasket med varmt vand. IR-spektrum af den resulterende gel er vist 5 i fig. 4. Den forøgede absorption nær 1100 cm skyldes det resulterende etherbind.

f overensstemmelse med fremgangsmåden i eksempel 1 blev gelen pakket i en søjle, og der blev udført separationsbestemmelser på dextran-standardprøven, polyethylenglycol-standardprøven og 10 protein-standardprøven.

Ifølge separationen af dextran-standardprøven med vand var grænsen for separabel molekylvægt stort set den samme.

Polyethylenglycol-standardprøven blev elueret med vand. Ifølge resultatet forløb elueringen af polyethylenglycolen efter molekylvægt.

15 I sammenligning med gel, som ikke var undergået hydrofil behandling, blev der fundet en bemærkelsesværdig formindskelse af ad-sorptionsevnen.

Protein-standardprøven blev elueret med en phosphorsyrepuffer-opløsning. Ifølge resultatet forløb elueringen af proteinerne efter 20 molekylvægt uden nogen adsorption. Hele prøven blev elueret. Resultatet af elueringen af polyethylenglycol-standardprøven er vist i fig. 5.

Resultatet af elueringen af protein-standardprøven er vist i fig.

6.

25 EKSEMPEL 7

Gel med en diameter pi 8-12 μ opnået ifølge eksempel 1 blev vasket med dioxan.

I en glasreaktor blev der fyldt 100 vægtdele dioxanbefugtet 30 kage af gelen, 600 vægtdele dioxan, 50 vægtdele ethylenglycol-monoglycidylether og 1 vægtdel borfluorid-etherat, og blandingen blev omrørt ved 70°C i 16 timer.

Efter reaktionen blev reaktionsproduktet filtreret gennem et glasfilter og vasket med varmt vand.

35 Den resulterende gel blev fyldt i en søjle, og der blev foretaget en separation af en dextran-standardprøve. Grænsen for separabel molekylvægt var stort set den samme som den i eksempel 6. Gelens adsorptionsegenskaber over for polyethylenglycol-standardprøven og protein-standardprøven var mærkbart forbedret.

16

DK 152218 B

EKSEMPEL 8

Gel med en diameter på 8-12 μ opnået ifølge eksempel 1 blev vasket med dimethylformamid.

I en glasreaktor blev der fyldt 100 vægtdele af den dimethyl-5 formamidvåde kage af gelen, 300 vægtdele dimethylformamid, 30 vasgtdele glyceroldiglycidylether (Danacol EX-314) og 2 vægtdele kaliumcarbonat, og blandingen blev omrørt ved 60°C i 16 timer.

Derpå blev der til reaktionsblandingen tilsat 100 vægtdele af en 1N vandig NaOH-opløsning, og yderligere reaktion blev udført i 10 10 timer. Efter reaktionen blev gelen filtreret gennem et glasfilter, vasket med varmt vand og fyldt i en søjle.

En protein-standardprøve blev elueret med phosphorsyrepuffer-opløsning. Ifølge resultatet blev alle proteiner elueret efter molekylvægt.

15 EKSEMPEL 9 I en glasreaktor blev der fyldt 100 vægtdele vandvædet kage af en gel med diameter på 20-30 μ opnået ifølge eksempel 2, 200 vægtdele 1N vandig NaOH-opløsning og 40 vægtdele butadiendi-20 epoxid, og blandingen blev omrørt ved 25°C i 10 timer og yderligere omrørt ved 50°C i 2 timer. Efter reaktionen blev gelen behandlet på sædvanlig måde.

Gelen blev pakket i en søjle, og en protein-standardprøve blev elueret med phosphorsyrepufferopløsning. Ifølge resultatet blev alle 25 proteiner elueret uden nogen adsorption.

I sammenligning med resultatet i eksempel 2 blev der konstateret en bemærkelsesværdig reduktion af adsorptionsevnen. Dette resultat viser virkningen af den hydrofile behandling.

30 EKSEMPEL 10 i en glasreaktor blev der fyldt 100 vægtdele vandvædet kage af en gel med epoxygrupper, og som havde en diameter på 15-20 μ opnået ifølge eksempel 3, 200 vægtdele 1N vandig NaOH-opløsning og 50 vægtdele ethylenglycoldiglycidylether (Denacol EX-811), og 35 blandingen blev opvarmet til 30°C i 20 timer og yderligere opvarmet til 50°C i 5 timer til omsætning heraf.

Den resulterende gel blev vasket og pakket i en søjle.

En prøve af polyethylenglycol-standarden og protein-standarden blev elueret hver for sig. Både polyethylenglycolen og alle proteiner 17

DK 152218 B

blev elueret i molekylvægtsorden.

I sammenligning med resultatet i eksempel 3 havde gelen, der var opnået ved hydrofil behandling, forbedret mekanisk styrke og lavere adsorptionsegenskaber. Den hydrofile behandling frembragte 5 således forøget mekanisk styrke og formindskelse af adsorptions- egenskaberne.

EKSEMPEL 11 . I overensstemmelse med fremgangsmåden i eksempel 7 blev der 10 udført en hydrofil behandling og en efterbehandling med undtagelse af, at den benyttede gel havde en diameter på 20-30 μ og var opnået ifølge eksempel 4. Den resulterende gel blev pakket i en søjle. En prøve af protein-standarden blev elueret med phosphorsyrepuffer-opløsning. Ifølge resultatet blev alle proteiner elueret uden nogen 15 adsorption.

I sammenligning med resultatet i eksempel 4 var virkningen af den hydrofile behandling bemærkelsesværdig.

EKSEMPEL 12 20 En omsætning blev udført i overensstemmelse med fremgangs måden i eksempel 7 med undtagelse af, at der blev benyttet en gel med en diameter på 8-12 μ opnået ifølge eksempel 1 og 50 vægtdele epichlorhydrin som oxiranforbindelse. Den resulterende gel blev vasket med varmt vand. En del af gelen blev tørret, og indholdet af 25 chloratomer blev bestemt ved en elementaranalyse; der blev fundet et chlorindhold på 8%.

Den resterende gel blev suspenderet i 300 vægtdele 1N vandig NaOH-opløsning, og blandingen blev omrørt ved 60°C i 10 timer til hydrolysering af gelen. Gelen blev vasket med varmt vand, og en 30 del af gelen blev tørret, og indholdet af chloratomer blev bestemt ved en elementaranalyse; der blev fundet et chlorindhold på 0,5%.

Den resulterende gel blev pakket i en søjle. En prøve en protein-standarden blev elueret med phosphorsyrepufferopløsning.

Alle proteiner blev elueret i molekylvægtsorden uden nogen ad-35 sorption.

I sammenligning med resultatet i eksempel 1 var virkningen af den hydrofile behandling bemærkelsesværdig god.

18

DK 152218 B

EKSEMPEL 13

Den 1 eksempel 5 opnåede gel blev sigtet, og gel med en diameter på 15-20 μ blev opsamlet.

I 500 vægtdele 3N vandig NaOH-opløsning blev 100 vægtdele 5 vandvædet kage af gelen suspenderet, og gelen blev hydrolyseret ved 40°C i 16 timer.

Den resulterende gel blev vasket med varmt vand, og derpå blev 50 vægtdele glyceroldiglycidylether (Denacol EX-314) og 200 vægtdele 1N vandig NaOH-opløsning tilsat, og blandingen blev omrørt 10 ved 30°C i 16 timer til gennemførelse af den hydrofile behandling.

Den resulterende gel blev vasket med varmt vand og pakket i en søjle under højt tryk. Gelen havde tilstrækkelig høj mekanisk styrke til at pakningen forløb let.

Som vist i eksempel 5 var gelen, der ikke var undergået den 15 hydrofile behandling, blød, hvorfor den var vanskelig at pakke i en søjle. Den hydrofile behandlingsforøgelse af den mekaniske styrke var således bemærkelsesværdig.

En prøve af protein-standarden blev elueret med phosphor-syrepufferopløsningen. Alle proteiner blev elueret uden nogen 20 adsorption. Adsorptionsevnen var således formindsket i sammen ligning med den gel, som ikke var undergået den hydrofile behandling.

EKSEMPEL 14 (sammenligningseksempel) 25

Fremstilling af gel

Ifølge fremgangsmåden i eksempel 2 blev der fremstillet en gel med en partikeldiameter på 20-30 pm (i det følgende omtalt som AQ).

Gelen blev omsat med butadien-diepoxid ifølge fremgangsmåden i 30 eksempel 9 i nærværende beskrivelse. Den resulterende gel omtales som A|.

Der blev endvidere fremstillet en gel med en partikeldiameter pi 20-30 pm ved suspensionspolymerisation og forsæbning udført ifølge fremgangsmåden i eksempel 5 i beskrivelsen til US patent nr.

35 3.657.117. Den resulterende gel omtales som B .

o

Gelen blev omsat med butadien-diepoxid ved fremgangsmåden ifølge eksempel 9 i nærværende beskrivelse. Den resulterende gel omtales som B^.

Hovedforskellen mellem AQ og Bq henholdsvis mellem og 19

DK 152218 B

er betinget af tværbindingsmidiet.

Bedømmelse

De fire slags geler blev respektivt i form af opslæmninger fyldt pi søjler af rustfrit stil (indre diameter 7,5 mm og længde 600 mm), og der blev udført sammenlignende eluering af iysozym. Lysozym har, som proteiner, hydrofobe egenskaber. Hydrofobiciteten af geler kan bedømmes ved forløbet af elueringsafprøvningen. (Reference: E. Pfannkoch et al, J. Chromatogr. Sci. 18 430 (1980)). Når gelen er hydrofob, findes elueringen af lysozym at være stærkt forsinket i forhold til det ud fra molekylstørrelse forventede elueringsvolumen og/elier at blive fuldstændigt adsorberet af gelen.

Elueringsbetingelser

Apparat: HLC 802 UR (Toyo Soda)

Elueringsmiddel: Phosphatpuffer (pH 6,8)

Strømningshastighed: 1,0 ml/min

Temperatur: Stuetemperatur

Detektor: UV 280 nm

Resultater

For hver af de fire søjler er elueringsmønsteret for lysozym vist pi tegningens figur 7. Lysozymet blev elueret i løbet af ca. 55 min pi gelen betegnet Aq og i løbet af ca. 120 min på gelen betegnet Bo· I betragtning af molekylstørrelsen af lysozym skulle det blive elueret i løbet af 27 min, såfremt der ikke forekommer nogen gensidig hydrofob påvirkning. Både B - og B^-gelen er bemærkelsesværdigt hydrofobe. Lysozymet blev elueret i løbet af ca. 22 min på A^-gelen, og der forekom siledes ingen hydrofob påvirkning. I sammenligning med gelen AQ er virkningen af omsætning med butadien-diepoxid bemærkelsesværdig. Den tværbundne gel har primære hydroxylgrupper, som reagerer med butadien-diepoxidet, hvorved hydrofobe steder afskærmes.

På den anden side elueres lysozym i løbet af ca. 110 min på gelen B^. Virkningen af omsætning med butadien-diepoxid er således ikke særlig betydelig.

I det følgende skal der gives en kort omtale af tegningens figurer, hvor:

DK 152218B

20 fig. 1 viser resultatet af en væskechromatografianalyse ved høj hastighed af pentaerythritoldimethacryiat opnået ved den tidligere i beskrivelsen beskrevne fremgangsmåde.

fig. 2 viser et IR-spektrum af pentaerythritoldimethacryiat opnået ved den tidligere beskrevne fremgangsmåde, fig. 3 viser et IR-spektrum af den ifølge eksempel 1 op nåede porøse, kugleformige gel, fig. 4 viser et IR-spektrum af den ifølge eksempel 6 opnåede porøse, kugleformige gel, fig. 5 viser eiueringsresultatet for en prøve af polyethylen-glycol-standarden under anvendelse af den porøse, kugleformige gel opnået ifølge eksempel 6 og pakket i en søjle, og fig. 6 viser eiueringsresultatet for en prøve af protein standarden under anvendelse af den porøse, kugleformige gel opnået ifølge eksempel 6 og pakket i en søjle. Komponenterne blev elueret uden nogen adsorption efter deres molekylvægt, fig. 7 viser sammenlignende afprøvning af eluering af lysozym på geler ifølge opfindelsen Aq og A1 henholdsvis geler ifølge US patentskrift nr.

3.657.117, Bq og Br I figurerne 1, 5 og 6 betegner de med tallene 1-14 identificerede toppe følgende stoffer: I. pentaerythritoltrimethacrylat, 2 pentaerythritoldimethacryiat, 3. glycidylmethacrylat, 4. polyethylenglycol 20.000, 5. polyethylenglycol 6.000, 6. polyethylenglycol 4.000, 7. polyethylenglycol 1.000, 8. polyethylenglycol 600, 9. polyethylenglycol 200, 10. γ-giobulin, II. albumin (blodserum), 12. β-lactoglobulin, 13. myoglobin, ΛΑ Γ

Claims

1- Porøst, kugleformigt gelmateriale til separationsformål, hvilket gelmateriaie er fremstillet ved en vandig suspensions-5 polymerisation af et methacrylat af en polyol og eventuelt efterfølgende er blevet underkastet hydrolyse i en vandig opløsning af en base, kendetegnet ved, at det ved den vandige suspensionspolymerisation fremstillede porøse, kugleformige gelmateriaie er blevet opnået ved homopolymerisation af pentaerythritoldimeth-10 acrylat eller ved copolymerisation af fra 100 til 5 vægtdele penta-erythritoldimethacrylatet og fra 0 til 95 vægtdeie af en anden methacrylatmonomer, der har en hydrofil gruppe eller en til en hydrofil gruppe konverterbar gruppe.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af et porøst, kugleformigt 15 gelmateriale ifølge krav 1, kendetegnet ved, at pentaery- thritoldimethacrylat homopoiyseres, eller at fra 100 til 5 vægtdele pentaerythritoldimethacrylat copolymeriseres med fra 0 til 95 vægtdele af en anden methacrylatmonomer, der har en hydrofil gruppe eller en til en hydrofil gruppe konverterbar gruppe, ved en vandig suspen-20 sionspolymerisation, og at det dannede gelmateriale eventuelt underkastes hydrolyse i en vandig opløsning af en base.

3. Anvendelse af det porøse, kugleformige gelmateriaie ifølge krav 1 til fremstilling af et modificeret porøst, kugleformigt gelmateriale, kendetegnet ved, at primære hydroxylgrupper 25 på det porøse, kugleformige gelmateriaie ifølge krav 1 additionsomsættes med en hydrofil oxiranforbindelse eller dennes oligomer. 30 35