DK148180B - Fremgangsmaade til fremstilling af maytansinol - Google Patents

Description

148180

Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af maytansinol med formlen

01 GH 0 °H

I ?H3 " ov oh5°vVh - c\A/x

Tif T v·^ V ** X> (i) ^3 00H3 ved hvilken en maytansinolester underkastes reduktiv hydro-5 lyse ved behandling med et komplekst metalhydrid i et tørt organisk opløsningsmiddel.

Det er kendt at fremstille maytansinol ved at behandle may-tanbutin med formlen

R

Cl ' \ CHjr 0 0 CH,0 1 ' · 3 π .i n 5Vy-" °\ A /\ y x^y«» ch5 och5 10 hvori R er -CO-CHCH^-NCH^-COCH (CH^) 2' met^ lithiumaluminium-hydrid i tørt tetrahydrofuran ved en temperatur på -23°C i 3 timer. Udbyttet af maytansinol er 40%, jf. J.Am.Chem.Soc.

(1975) 97, side 5294, højre spalte linie 8-7 f.n. Det anvendte udgangsmateriale, maytanbutin, er udvundet fra plan-15 ten Putterlickia verrucosa i ringe udbytte ved en række besværlige og omstændelige fremgangsmådetrin. Endvidere er det i ovennævnte litteratursted anført, at maytanacin med formlen I, hvori R er -CO-CH3, ved reducerende spaltning på 2 148180 tilsvarende måde kan omdannes til maytansinol.

Det har vist sig, at maytansinol kan fremstilles i overraskende godt udbytte ved at behandle antibiotikumet C-15003 med et komplekst metalhydrid ved en temperatur på -20 til 5 0°C.

I overensstemmelse hermed er fremgangsmåde ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at man behandler antibiotikumet C-15003 med den almene formel

R

Cl ' I CHZ 0 0 ^Jv-i 3- S. 1 ?v ur X, (II) —‘ "ho 2^0 oh3 0CH5 /ch3 10 hvori R betyder -CO-CH , -C0-CH9-CEL-CH, eller ^ch3 ^ ch3

-CO-CH--CH , med det ^komplekse metalhydrid ved en tempe-z ^»CH

ratur på -20 ^ til 0°C.

Det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendte udgangsmateriale med formlen (II) kan fremstilles industrielt ved 15 dyrkning af en antibiotikum-C-15003-producerende stamme af slægten Nocardia og isolering af antibiotikum C-15003 fra dyrkningsmediet.

C-15003-producerende stammer af slægten Nocardia samt fremstillingen af antibiotikum C-15003 er beskrevet i beskri-20 velsen til dansk patentansøgning nr. 4588/77.

3 U8180 I det foregående og i det efterfølgende skal der ved udtrykket "antibiotikum C-15003" generelt forstås forbindelser med den ovenstående almene formel II, enten som de tre forbindelser hver for sig eller i form af en blanding 5 af to eller tre af disse forbindelser. Den forbindelse, hvori R er

-CO-CH

^CH3 betegnes "antibiotikum C-15003 P-3" eller mere kortfattet "C-15003 P-3", den forbindelse, hvori R er -CO-CH2-C^-CH^, 10 betegnes "antibiotikum C-15003 P-3'" eller mere kortfattet "C-15003 P-3'",og den forbindelse, hvori R er ^CH3 -CO-CHL-CH , betegnes "antibiotikum c-15003 p-4" eller ^CH3 eller mere kortfattet "C-15003 P-4".

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen forklares nærmere i de 15 følgende eksempler. Dele er vægtdele, såfremt andet ikke er angivet. Forholdet mellem dele og volumendele svarer til forholdet mellem g og ml, og procent er baseret på vægt/vo-lumen, medmindre andet er angivet.

Eksempel 1.

20 I en volumendel tetrahydrofuran opløses 0,015 dele af krystallerne af antibiotikumet C-15003, og efter afkøling af opløsningen til -5°C tilsættes 0,012 dele lithiumaluminium-hydrid. Blandingen henstår i 2 timer. Efter tilsætning af 0,5 volumendele af en 1%'s vandig opløsning af I^SO^ ekstra-25 heres reaktionsblandingen med 2 volumendele ethylacetat. Ethylacetatlaget vaskes med vand, tørres ved tilsætning af vandfrit natriumsulfat og koncentreres under reduceret tryk. Præparativ TLC med silicagel udføres på koncentratet, og Rf-området 0,25 til 0,3 skrabes af og ekstraheres med 30 ethylacetat indeholdende en mindre mængde vand. Ekstrakten vaskes med vand, tørres over vandfrit natriumsulfat og koncentreres under reduceret tryk, hvorved der udskilles kry- 148180 4 staller. Krystallerne isoleres ved filtrering og tørres.

Ved ovenstående fremgangsmåde opnås 0,010 dele maytansinol med smp. 174°C.

Elementæranalyse for C28H37C1N2°8: 5 Fundet: C 59,65 H 6,58 N 5,02 Cl 6,51

Beregnet: C 59,52 H 6,60 N 4,96 Cl 6,27 IR: 1715, 1670, 1580 (cm"1) UV (nm) : 232 (32750), 244 sh. (30850), 252 (31650), 281 (5750) , 288 (5700).

10 Eksempel 2.

I 1 ml tetrahydrofuran opløses 15 mg af en blanding af antibiotikum C-15003 P-3, P-3' og P-4, og efter afkøling af . opløsningen til -5°C tilsættes 12 mg lithiumaluminium-hydrid. Blandingen henstår i 2 timer. Efter tilsætning af 15 0,5 ml 1%'s vandig opløsning af H2SC>4 ekstraheres reaktions blandingen med 2 ml ethylacetat. Ethylacetatlaget vaskes med vand, tørres ved tilsætning af vandfrit natriumsulfat og koncentreres under formindsket tryk. Præparativ TLC med sili-cagel udføres på koncentratet under anvendelse af ethylacetat 20 indeholdende vand som fremkalderopløs.ningsmiddel, og zonen med Rf-værdierne fra 0,25 til 0,3 skrabes af og ekstraheres med ethylacetat indeholdende en mindre mængde vand. Ekstrakten vaskes med vand, tørres over vandfrit natriumsulfat og koncentreres under formindsket tryk, hvorved der udskilles 25 krystaller. Krystallerne frafiltreres og tørres. På denne . måde opnås 10 mg maytansinol svarende til et udbytte på 75,1%. Smp.: 174°C.

Eksempel 3.

I 1,5 ml tetrahydrofuran opløses 20 mg af en blanding af 30 antibiotikum C-15003 P-3, P-3' og P-4, og efter afkøling af opløsningen til -20°C tilsættes 16 mg lithiuraaluminiumhydrid.

148180 5

Blandingen henstår i 3 timer. Efter tilsætning af 1 ml 1%'s vandig opløsning af H2S04 ekstraheres reaktionsblandingen med 3 ml ethylacetat. Ethylacetatlaget vaskes med vand, tørres ved tilsætning af vandfrit natriumsulfat og 5 koncentreres under formindsket tryk. Præparativt TLC med silicagel udføres på koncentratet under anvendelse af ethylacetat indeholdende vand som fremkalderopløsningsmiddel, og zonen ved Rf-værdierne fra 0,25 til 0,3 skrabes af og ekstraheres med ethylacetat indeholdende en mindre mæng-10 de vand. Ekstrakten vaskes med vand, tørres over vandfrit natriumsulfat og koncentreret under formindsket tryk, hvorved der udkrystalliseres krystaller. Krystallerne frafil-treres og tørres. På denne måde opnås 9,2 mg maytansinol svarende til et udbytte på 51,7%. Smp.: 174°C.

15 Sammenligningseksempel.

I 1,5 ml tetrahydrofuran opløses 24 mg maytanacin, og efter afkøling af opløsningen til -23°C tilsættes 20 mg lithium-aluminiumhydrid. Blandingen henstår i 3 timer. Til blandingen sættes 6 ml 1%'s vandig opløsning af H2SC>4, hvorefter 20 blandingen ekstraheres med 2 gange 4 ml ethylacetat. Ethylacetatlaget vaskes med vand og koncentreres under formindsket tryk. Præparativ TLC med silicagel udføres på koncentratet under anvendelse af ethylacetat mættet med vand som fremkalderopløsningsmiddel, og zonen med Rf-værdierne 0,25 25 til 0,27 skrabes af og ekstraheres med ethylacetat indeholdende en mindre mængde vand. Ekstrakten vaskes med vand, tørres over vandfrit natriumåulfat og koncentreres under formindsket tryk, hvorved der udkrystalliseres krystaller. Krystallerne frafiltreres, hvorved man får 8,8 mg maytansi-30 nol svarende til et udbytte på 39,4%. Smp.: 178°C.

Fremstilling af udgangsmateriale.

A. Nocardia nr. C-15003 (IFO 13726, FERM 3992, ATCC 31281), som blev dyrket på et medium (gærekstrakt-maltekstrakt-agar), anvendes til inokulering af en 200 volumendeles 148180 β fermentor indeholdende 40 volumendele af et podningskulturmedium (2% glucose, 3% opløselig stivelse, 1% råt sojabønnemel, 1% majsstøbevand, 0,5% polypepton, 0,3% NaCl, 0,5% CaCO-j, pH 7,0) . Det inokulerede medium 5 inkuberes ved 28°C i 48 timer til opnåelse af et inoku-lum. 0,5 volumendele af det således opnåede inokulum overføres til en 200 volumendeles fermentor indeholdende 40 volumendele af et fermentationsmedium sammensat af 5% dextrin, 3% majsstøbevand, 0,1% polypepton og 10 0,5% CaCOg (pH 7,0) og dyrkes ved 28°C i 90 timer, hvorved der opnås et inokulum (podningskultur). Bestemt ved seriefortyndingsmetoden under anvendelse af Tetrahy-mena pyriformis W som prøveorganisme og antibotikumet 015003 P-3 som standardprøve findes den ovenstående 15 kultur at have en titer på 25 yg/ml.

B. 10 volumendele af det under A opnåede inokulum (podningskultur) overføres til en 2000 volumendeles fermentor indeholdende 500 volumendele af et podningskulturmedium (samme som ovenfor) og inkuberes ved 28°C i 48 timer.

20 500 volumendele af den resulterende kultur overføres til en 50000 volumendeles rustfri ståltank, indeholdende

30000 volumendele podningskulturmedium og dyrkes ved 28°C

under gennemluftning (30000 volumendele/min.), omrøring 2 (280 omdr./min. (1/2 DT)) og indvendigt tryk (1 kg/cm )

25 til opnåelse af en podningskultur. Denne kultur anvendes til podning af en 200000 volumendeles rustfri ståltank, indeholdende 100000 volumendele af et lignende fermentationsmedium som det, der anvendtes under A, med et inokulum på 10%. Det inokulerede medium inkuberes ved 28°C

30 under gennemluftning (100000 volumendele/min.), omrøring 2 (200 omdr./min. 1/2 DT)) og indvendigt tryk (1 kg/cm ) i 90 timer. Bestemt ved den under A beskrevne metode findes den ovenfor opnåede kultur at have en titer på 25 yg/ml.

C. Til 95000 volumendele af den under B opnåede kultur sæt-35 tes 2000 dele "Hyflo-supercel"®, og efter grundig blanding 7 140180 filtreres blandingen på et trykfilter, hvorved der opnås 85000 volumendele filtrat og 32000 dele fugtige celler. Filtratet på 85000 volumendele omrøres og ekstraheres med 30000 volumendele ethylacetat. Denne fremgangsmåde 5 blev gentaget endnu en gang. Ethylacetatlaget samles, vaskes to gange med 30000 volumendele vand, tørres ved tilsætning af 500 dele vandfrit natriumsulfat og koncentreres under reduceret tryk til 200 volumendele. Petro-leumsether sættes til koncentratet, og det resulterende 10 bundfald isoleres ved filtrering (53 dele). Dette råprodukt I omrøres med 100 volumendele ethylacetat, og de uopløselige bestanddele filtreres fra. Filtratet omrøres med 10 dele silicagel (0,05-0,2 mm), og ethyl-acetatet fjernes under reduceret tryk. Remanensen hældes 15 på en silicagelsøjle (400 volumendele). Eluering udføres med 500 volumendele hexan, 500 volumendele hexan-ethyl-acetat (3:1), 500 volumendele hexan-ethylacetat (1:1), 500 volumendele hexan-ethylacetat (1:3), 500 volumendele ethylacetat og 1000 volumendele ethylacetat-methanol (50:1), 20 idet eluatet opsamles i 100 volumendeles fraktioner.

1 volumendel af hver fraktion koncentreres til tørhed, og 0,1 volumendel ethylacetat sættes til koncentratet, hvorved der opnås en blanding. Blandingen anbringes i en plet 2,5 cm fra den nederste kant af en silicagelglaspla-25 de (60 F254, 0,25 mm, 20 x 20) og elueres ca. 17 cm med et opløsningsmiddelsystem af ethylacetat-methanol (19:1).

Efter eluering gennemføres påvirkningen med ultraviolet lys (2537 Å).

De aktive fraktioner nr. 23 til nr. 28 med Rf 0,6-0,65 30 opsamles og koncentreres under reduceret tryk til ca. 20 volumendele. Til dette koncentrat sættes 150 volumendele petroleumsether, hvorved der opnås 15 dele af et råprodukt II.

148180 8 D. I 10 volumendele ethylacetat opløses 1,5 dele af råproduktet II, som blev opnået under C, og opløsningen omrøres godt med 4 dele silicagel (0,05-0,2 mm). Ethyl-acetatet fjernes under reduceret tryk. Remanensen hældes 5 på en søjle af 300 volumendele silicagel, som først vaskes med 500 volumendele chloroform og derefter elueres med 500 volumendele chloroform-methanol (50:1), 500 volumendele chloroform-methanol (20:1) og 500 volumendele chloroform-methanol (10:1). Eluatet opsamles i 25 volu-10 mendeles fraktioner.

0,5 volumendel af hver fraktion koncentreres under reduceret tryk. Til koncentratet sættes 0,05 volumendel ethylacetat, og blandingen underkastes silicageltyndtlagskroma-tografi (elueringssystem: chloroform-methanol 9:1), hvor-15 ved der opnås en prøveopløsning.

Fraktionerne nr. 39 og 40, der absorberes ved 2537 Å i Rf-området 0,50-0,60 opsamles og koncentreres til tørhed under reduceret tryk. Til remanensen sættes 2 volumendele ethylacetat, og blandingen henstår, hvorved der opnås 20 0,150 dele krystaller af antibiotikumet 015003.

Disse krystaller af antibiotikumet 015003 (0,150 dele) opløses i 15 volumendele methanol, hvorefter der tilsættes 0,300 dele natriumchlorid og 15 volumendele vand. En søjle pakkes med 200 volumendele "Diaion HP-10" og kali-25 breres med 600 volumendele 50%'s methanol-vand indeholdende 5% NaCl. Den ovenfor fremstillede prøveopløsning sendes gennem søjlen, og der gennemføres gradienteluering under anvendelse af 1500 volumendele 60%'s methanol-vand indeholdende 5% NaCl og 1500 volumendele 95%'s methanol-30 vand. Eluatet opsamles i 15 volumendeles fraktioner, og hver fraktion undersøges ved silicageltyndtlagskromato-grafi. Fraktionerne 145 til 153 indeholder C-15003 P-3, fraktionerne 167-180 indeholder C-15003 P-3' og P-4, og fraktionerne 185-190 indeholder C-15003 P-4.

148180 9

Hver gruppe af fraktionerne koncentreres og opløses ved tilsætning af 50 volumendele vand og 100 volumendele ethylacetat. Opløsningen omrystes i en skilletragt, og det vandige lag skilles fra, og efter vaskning med to 5 50 volumendeles portioner vand tørres ethylacetatlaget over vandfrit natriumsulfat, koncentreres og henstår derefter På denne måde opnås krystaller fra hver gruppe af fraktioner. Krystallerne opsamles ved filtrering og tørres.

10 C-15003 P-3 0,070 dele C-15003 P-3', P-4 0,018 dele C-15003 P-4 0,015 dele

De blandede krystaller af C-15003 P-3' og P-4 (0,018 dele) opløses i 0,3 volumendele ethylacetat og anbringes plet-15 vis på en linie i en afstand fra 2,5 cm fra den nederste kan af en silicagel-glasplade (kiselgel 60 F254f ^,25 mm, 20 x 20), hvorefter der elueres med ethylacetat-methanol (19:1). Efter eluering til ca. 18 cm skrabes absorptionsbåndet ved Rf 0,68 (P-4) og det ved Rf 0,65 (P-31) af, 20 og de ekstraheres hver uafhængigt af hinanden to gange med · ethylacetat indeholdende en mindre mængde vand. Den resul terende ethylacetatekstrakt vaskes med vand, tørres over vandfrit natriumsulfat, koncentreres under reduceret tryk og henstår derefter.

25 0,010 dele krystaller af C-15003 P-4 og 0,003 dele kry staller af C-15003 P-3* opnås fra fraktionen med Rf 0,68 henholdsvis den med Rf 0,65.