DK146325B - Beta-galactosidase, fremgangsmaade til fremstilling deraf og anvendelse deraf - Google Patents

Beta-galactosidase, fremgangsmaade til fremstilling deraf og anvendelse deraf Download PDF

Info

Publication number
DK146325B
DK146325B DK519079AA DK519079A DK146325B DK 146325 B DK146325 B DK 146325B DK 519079A A DK519079A A DK 519079AA DK 519079 A DK519079 A DK 519079A DK 146325 B DK146325 B DK 146325B
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
beta
galactosidase
lactose
enzyme
galactose
Prior art date
Application number
DK519079AA
Other languages
English (en)
Other versions
DK146325C (da
DK519079A (da
Inventor
Helle Fabricius Woeldike
Original Assignee
Novo Industri As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DK10379A external-priority patent/DK10379A/da
Application filed by Novo Industri As filed Critical Novo Industri As
Priority to DK519079A priority Critical patent/DK146325C/da
Priority to NL8000033A priority patent/NL8000033A/nl
Priority to AU54384/80A priority patent/AU5438480A/en
Priority to NZ192552A priority patent/NZ192552A/xx
Priority to ES487503A priority patent/ES487503A0/es
Priority to IT8047556A priority patent/IT8047556A0/it
Priority to FR8000424A priority patent/FR2453214A1/fr
Priority to GB8000722A priority patent/GB2038837A/en
Priority to DE19803000598 priority patent/DE3000598A1/de
Publication of DK519079A publication Critical patent/DK519079A/da
Publication of DK146325B publication Critical patent/DK146325B/da
Publication of DK146325C publication Critical patent/DK146325C/da
Application granted granted Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING OR TREATMENT THEREOF
    • A23C21/00—Whey; Whey preparations
    • A23C21/02—Whey; Whey preparations containing, or treated with, microorganisms or enzymes
    • A23C21/023—Lactose hydrolysing enzymes, e.g. lactase, B-galactosidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
    • C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

148325
Valletørstof indeholder som hovedbestanddel disaccharidet lactose, samt desuden mindre mængder af proteiner, vitaminer og salte.
5 Man har gjort forsøg på at omdanne valle til vær difuldere produkter ved hydrolyse af lactosen til glucose og galactose ved hjælp af ad mikrobiel vej fremstillede beta-galactosidaser, men man har hidtil ikke udviklet nogen tilfredsstillende, kommerciel proces. En af de væsentligste 10 årsager til, at den enzymatiske konvertering af lactose til glucose og galactose ikke har ført til nogen i kommerciel henseende tilfredsstillende proces, er den kendsgerning, at man ikke kender nogen beta-galactosidase med tilfredsstillende egenskaber. Hvis konverteringen af lactose skal gen-15 nemføres tilfredsstillende, er det nødvendigt, at beta-galactosidasen samtidigt skal udvise begge de to følgende egenskabers 1) beta-galactosidasen bør være stabil ved en temperatur, der er tilstrækkelig høj til at forhindre mikrobiel kontaminering, og 2) beta-galactosidasens inhibering af 20 lactose eller af de produkter, der hidrører fra lactose- hydrolysen, altså galactose og glucose, bør være minimal for at få hydrolysen til at løbe til ende uden at anvende urimeligt høje mængder af enzymet.
25 Det er beskrevet, at sure beta-galactosidaser kan fremstilles ved hjælp af svampe, f.eks. af Aspergillus-slægten, især Aspergillus oryzae og Aspergillus niger, idet der henvises til USA-patentskrift nr. 3.629.073 og Journal of Food Science, bind 37 (1972), side 619 - 623. Disse en-30 zymer udviser rimeligt god termostabilitet, men de inhiberes kraftigt af lactosens hydrolyseprodukter. På den anden side bliver beta-galactosidaser fra visse bakterier, såsom Lactobacilli og Enterobakterier kun lidt inhiberet af lactosens hydrolyseprodukter, men deres termostabilitet er meget rin-35 ge; dette har været kendt i mange år. Man har også tidligere fundet beta-galactosidaser i termophile Bacilli, jfr. R.E.
Goodman og D.M. Pederson, som i Canadian Journal of Microbiology, bind 22 (1976), side 817 - 825 beskriver en beta- 2 146326 galactosidase hidrørende fra B. stearothermophilus med relativt god termostabilitet, som dog inhiberes stærkt af lacto-sens hydrolyseprodukter. I engelsk patentskrift nr.
1.493.452 er der beskrevet en beta-galactosidase hidrørende 5 fra B. coagulans, og dette enzym har egenskaber af lignende art som det enzym, der hidrører fra B. stearothermophilus.
Det er opfindelsens formål at tilvejebringe en beta-galactosidase, der samtidigt har god termostabilitet og 10 en lav inhibering af de produkter, der hidrører fra lactose-hydrolysen, og lactosen selv.
Beta-galactosidasen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 1 angivne. Det ér overraskende, at 15 den nye beta-galactosidase samtidigt udviser en god termisk stabilitet og lav inhibering af de produkter, der hidrører fra lactose-hydrolysen, og lactosen selv.
Egenskaberne af mikroorganismen Bacillus NRRL B-20 11, 229 er følgende. Morfologi: Stave 2-5μχ0,7-1μ.
Sporer 1,6-1,8 μ x 0,8 - 1 μ fremkommet på Schaeffer's agar, lokaliseret subterminalt til terminalt. Let opsvulmet sporangium, der kun netop forlænger den vegetative celle.
Fysiologi: Positiv for katalase; ingen anaerob vækst; syre, 25 men ingen gas, dannes på basis af glucose, xylose, trehalose, lactose, arabinose eller mannitol. Vækst mellem 40 og 70° C og pH 6,0 og 8,5. Ingen vækst i 3% NaCl, men vækst i 1% NaCl. Proteinaseprøverne med æggeblomme og casein som substrater var negative, og stivelsesnedbrydningen var svag.
30 NOg reduceres til NC^ . Der dannes ingen dihydroxyacetone ud fra glycerol. Mikroorganismen synes at være beslægtet med B. stearothermophilus.
En foretrukken udførelsesform for enzymet ifølge 35 opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav .2 angivne.
De immunologiske egenskaber af enzymet bestemmes 3 146325 som beskrevet i det følgende. Opløseligt, renset enzym (hvis fremstilling vil blive beskrevet senere i denne beskrivelse) blev anvendt til fremstilling af antiserum i kaniner på kendt måde.
5
Den todimensionale immunoelektroforetiske bestemmelse blev gennemført i form af dobbeltforsøg på følgende måde.
10 Første dimension: 10 μΐ af prøven indeholdende 100 pg renset enzym/1 påføres på en 1,5 mm agarosegel ved 20° C, og der gennemføres en elektroforese i 90 minutter med en gradient i det elektriske felt på 7 Volt/cm og i et stødpudesystem bestående af 11 g bartitursyre, 65 g Na-bartital, 15 28 g glycin, 23 g TRIS (TRIS er en forkortelse for tris-(hydroxy-methyl)-aminomethan) og vand ad 25 liter. Anden dimension, vinkelret på første dimension: 1,0 ml antiserum fremstillet som beskrevet i det foregående opløses i 10,8 ml agarosegel, og den agarosegelstrimmel, der fremkommer som 20 resultat af elektroforesen i den første dimension, forenes med agarosegelen med antiserum. Immunelektroforesen i den anden dimension gennemføres i 16 timer med en gradient i det elektriske felt på 1 Volt/cm. Gelen fra et af de to forsøg presses, vaskes og tørres, og proteiner fremkaldes med 25 Coomasie brilliantblåt, og gelen fra det andet forsøg omsættes direkte med 0,1% ONPG (o-nitro-phenylgalactosid) i 1/15 molær KNaHPC>4 (pH 6,5). Hvis der er lactase tilstede, vil ONPG blive spaltet til galactose og o-nitro-phenol, som udviser en kraftig gul farve. En gul farve af o-nitro-phenol 30 blev synlig på gelen efter 30 minutters forløb. I dette system bevægede lactasen sig 51 mm i retning af anoden, og der dannede sig en bue hidrørende fra det af lactase og antiserum dannede bundfald i det todimensionale forsøg.
Efter bundfældningen var lactasen stadig aktiv, hvilket 35 fremgik af, at den kunne reagere med ONPG. Der henvises til fig. 1.
Fig. 1 a viser udseendet af gelen i det første . 146325 4 forsøg, som er proteinfremkaldt. Man ser, at der mindst foreligger tre forskellige proteiner, svarende til buerne 1, 2 og 3. Fig. 1 b viser udseendet af gelen i det andet forsøg, hvor man udførte en reaktion med ONPG. Det skraverede 5 areal på fig. 1 b var farvet dybt gult, hvilket viser, at det bundfald, der ligger indenfor buen 2 på fig. 1 a, svarer til beta-galactosidase, hvorimod det bundfald på fig. 1 a, der ligger indenfor buerne 1 og 3, svarer til proteiner, der ikke er beta-galactosidase.
10
Ved anvendelse af tandem-krydset immunoelektrofo-rese (f.eks. i henhold til N.H. Axelsen et al., A manual of quantitative Immunoelectrophoresis, 1977) er det muligt at afgøre, om beta-galactosidasen ifølge opfindelsen er iden- 15 tisk med eller forskellig fra en prøve af en vilkårlig, ukendt beta-galactosidase. Man kan udføre lignende, kvantitative prøver ved hjælp af andre immunologiske metoder, f.eks. immunodiffusion eller direkte immunoprecipitation efterfulgt af gelchromatografi med natriumdodecylsulfat.
20
Blandt de enzymkemiske egenskaber er den termiske stabilitet og inhiberingen af de produkter, der hidrører fra lactosehydrolysen, de vigtigste.
25 Beta-galactosidasens aktivitet bestemmes på føl gende måde. Man fremstiller et råt celle-lysat ved behandling i 15 minutter ved 37° C med lysozym med en koncentration af 2 mg/ml i mælkestødpude (pH 6,5, saltsammensætning som i mælk) efterfulgt af to cycler af frysning og optøning.
30 Lysatet, der indeholder 2-10 lactaseaktivitetsenheder (som senere vil blive defineret) per liter, inkuberes i en time i mælkestødpude med 2% lactose, hvorpå reaktionen afbrydes ved kogning, bundfældning i isvand og centrifugering. Superna-tanterne analyseres for glucose under anvendelse af glucose- 35 oxidase-peroxidase metoden (Tech. Bull. No. 510, Sigma
Chemical Co.). 1 lactaseaktivitetsenhed er defineret som den enzymmængde, der under standardbetingelser omfattende pH 6,5 og 60° C frigør 1 μπιοί glucose per minut.
B 146325 5
Den termiske stabilitet måles på følgende måde. Aktiviteten bestemmes som ovenfor angivet, med undtagelse af, at der anvendes forskellige inkubationstemperaturer. Der udtages prøver til glucoseanalyse hvert 30. minut i 2 timer.
5
Inhiberingen hidrørende fra galactose måles på følgende måde. Ved standardbestemmelsen for galactoseinhibe-ring indeholder inkubationsblandingen 2,0% lactose og 2,0% 10 galactose; i øvrigt er betingelserne som angivet i det foregående i forbindelse med bestemmelse af aktiviteten. Imidlertid har man undersøgt andre kombinationer af glucose og galactose, f.eks. 2% lactose og 10% galactose, svarende til 90% hydrolyse af 5 gange koncentreret mælk.
15 pH-aktivitets-kurven er en anden enzymkemisk egenskab, der er vigtig på grund af, at pH-optimet af beta-galactosidasen ikke bør ligge for langt fra pH af den valle, som skal behandles, idet man ellers må anvende en urimeligt 20 stor mængde beta-galactosidase. pH-optimet af beta-^galacto-sidasen ifølge opfindelsen er ca. 6,5 - 7,0 ved 60° C, når aktivitetsmålingerne gennemføres i henhold til den ovenfor angivne metode til bestemmelse af beta-galactosidaseaktivi-tet. Ligeledes er aktiviteten af beta-galactosidasen over 25 75% af den maksimale aktivitet i pH-intervallet 6,1 - 8,0.
Molekylvægten af beta-galactosidasen bestemmes på følgende måde. Først bliver enzymet i høj grad renset ved hjælp af gelelektroforese på polyacrylamid. Derpå bestemmes 30 molekylvægten af beta-galactosidasen ved hjælp af gelelektroforese, hvorved beta-galactosidasen bringes til at løbe parallelt med andre proteiner, hvis molekylvægt er kendt, nemlig phosphorylase A med molekylvægt 94.000 og underenheder af E. coli beta-galactosidase (inaktiv) med molekylvægt 35 116.000. Molekylvægten af beta-galactosidasen ifølge opfindelsen, som stadig er aktiv, var ca. 116.000 i dette system.
Det var overraskende, at der eksisterede en beta- 6 146325 galactosidase, som samtidigt udviste en høj termisk stabilitet svarende til en halveringstid på over 500 minutter ved 65° C og en lav galactose-inhibering på ca. 10% i henhold til den ovenfor angivne standardbestemmelse. Med 10% galac-5 tose i inkuberingsblandingen er galactoseinhiberingen under 50%. Km var også meget lav ( Si 5 mM), og man kunne ikke konstatere nogen lactoseinhibering selv ved meget høje lac-tosekoncentrationer.
10 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af det mikrobielle beta-galactosidaseprodukt er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 4 angivne.
Enzymdannelsen induceres af lactose og galactose 15 og følger væksten. Stammen kan dog gøres konstitutiv under anvendelse af konventionel mutationsteknik. Organismen udviser ikke nogen vækstkrav hvad angår specielle C- eller N-kilder, men væksten og enzymdannelsen forbedres, hvis det minimale substrat beriges ved organiske N-kilder som pepton 20 eller trypton, gærekstrakt eller majsstøbevand. Organismen er også meget versatil hvad angår udnyttelsen af carbonkil-de, idet den udnytter f.eks. glucose, galactose, lactose, fructose, glycerol, glutaminater, succinater, lactater og acetater. Ved vækst på mono- og disaccharider fremkommer der 25 en meget stærk syreproduktion, som afbryder væksten, hvis pH synker under ca. 6,0.
Beta-galactosidasen produceres intracellulært, mens den let frigøres fra cellerne under anvendelse af kon-30 ventionelle metoder, som f.eks. ved behandling med toluen, butanol eller lysozym, ultrasonisk behandling eller mekanisk disintegrering, hvorefter celleaffaldet fjernes og enzymet renses under anvendelse af konventionel teknik, f.eks. salt-fældning eller fældning med organiske opløsningsmidler.
35
Valle, mælk og andre lactoseholdige væsker, for kortheds skyld i det følgende kaldet valle, kan på tilfredsstillende måde konverteres til en sirup, der indeholder 7 146325 glucose og galactose og praktisk talt ingen lactose, ved hjælp af beta-galactosidasen ifølge opfindelsen. Denne konvertering kan på effektiv måde gennemføres diskontinuerligt ved hjælp af den opløselige beta-galactosidase. For at gen-5 nemføre denne konvertering på en i økonomisk henseende mere attraktiv måde og i industriel skala, er det imidlertid i høj grad anbefalelsesværdigt at anvende et immobiliseret beta-galactosidaseprodukt.
10 Immobiliseringsmetoder for enzymer er f.eks. be skrevet i de nedenfor angivne publikationer:
Patent Immobilisering af celler, isoleret 15 herunder enzym, hele celler herunder rent enzym 20 Engelsk patent nr.
1.444.539 x x US pat. nr.
4.001.085 x 25_________ US pat. nr.
4.025.391 x US pat. nr.
30 4.033.822 x US pat. nr.
4.038.140 x 35
Det fremgår også af den ovenfor angivne liste, at immobilisering af både hele celler og rent enzym er beskrevet. Beta-galactosidaseproduktet ifølge opfindel- 3 146325 sen kan også immobiliseres både i form af hele celler og som rent enzym. Enhver af de ovenfor angivne immobiliseringsmetoder kan anvendes til beta-galactosidaseproduk-tet ifølge opfindelsen.
5
Ifølge en udførelsesform for opfindelsen er beta-galactosidasen således immobiliseret. Dette immobi-liserede beta-galactosidaseprodukt ifølge opfindelsen udviser den fremragende fordel, at det er i stand til i 10 kommerciel målestok og på en i økonomisk henseende attraktiv måde at konvertere en væske med en meget høj lactosekoncentration fuldstændigt til galactose og glucose, på grund af den manglende substratinhibering og den manglende inhibering fra lactosens hydrolyseproduk-15 ter.
Anvendelsen af beta-galactosidasen ifølge opfindelsen foretages i form af en fremgangsmåde til konvertering af en lactoseholdig væske, fortrinsvis 20 valle, til en sirup, der indeholder glucose, galactose og en mindre mængde lactose, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man bringer den lactoseholdige væske i forbindelse med beta-galactosidasen ifølge opfindelsen.
25
Denne anvendelse kan foretages diskontinuerligt, og i så tilfælde er en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ejendommelig ved, at man indfører beta-galactosidasen ifølge opfindelsen i opløselig form 30 i den lactoseholdige væske ved pH mellem ca. 5,5 og 8,5 og ved en temperatur mellem 55 og 75° C.
Anvendelsen kan også foretages kontinuerligt, og i så fald er en foretrukken udførelsesform for frem-35 gangsmåden ejendommelig ved, at den lactoseholdige væske indføres i en søjle, der er pakket med beta-galactosidasen ifølge opfindelsen i immobiliseret form ved en pH-værdi mellem ca. 5,5 og 8,5, ved en temperatur mellem 55 0 U6325 9 og 75° C og med en hastighed, som giver anledning til fremkomsten af en lactosekoncentration i det fra søjlen udgående materiale, som er mindre end 10%, fortrinsvis mindre end 1% af lactosekoncentrationen i det materiale, 5 der går ind i søjlen.
Den initiale beta-galactosidaseaktivitet i den lactoseholdige væske, udtrykt i lactaseaktivitetsen-heder/1, varierer betydeligt, hovedsageligt på grund af 10 variationer i pH, temperatur, konverterinstid og initial lactosekoncentration.
Opfindelsen skal illustreres ved de følgende eksempler.
15
Eksempel 1 og 2 illustrerer fremstilling af beta-galactosidasen, eksempel 3 illustrerer den diskontinuerlige anvendelse af den opløselige beta-galactosi-dase, eksempel 4 og 5 illustrerer immobilisering af 20 beta-galactosidasen og eksempel 6 illustrerer den kontinuerlige anvendelse af den immobiliserede beta-galacto-sidase.
25 Eksempel 1
Enzymet blev fremstillet ved submers batch-fermentation i en 400 1 konventionel gæringstank med omrører, temperaturkontrol (ekstern vandkappe) og luft-30 indledningsrør, hvorved forholdet højde/diameter var 2:1.
Gæringen blev gennemført under følgende betingelser:
35 Temperatur: 50° C
Hastighed af luftstrøm: 120 Nl/minut
Omrøringshastighed: 200 omdrejninger pr.
minut.
146325 ίο
Substratet bestod af følgende bestanddele:
Vallepulver 2,0 kg
Majsstøbevand 8,0 - (nh4)2so4 0,4 - 5 MgS04 ·7Η20 0,2 - k2hpo4 0,1 -
Pluronic® 0,2 - ®
Pluronic er et flydende, non-ionogent over-10 fladeaktivt middel.
pH blev indstillet til 7,2 før steriliseringen .
15 Der tilsattes vandværksvand til et totalt volumen på 400 1.
Gæringsvæsken blev podet med et skråglas af næringsmiddelagar, hvorpå der den foregående nat ved 50° 20 C havde været vækst af NRRL B-ll, 229, og 24 timer senere fuldførtes gæringen, og kulturen blev hurtigt afkølet til 10° C, hvorpå enzymet blev udvundet. Cellerne blev separeret på en centrifuge og åbnet ved en passage gennem en Manton-Gaulin homogenisator af typen SP 15 M 8 TA 25 med et enkelttrinshomogeniseringsventilanlæg, med et trykfald på 300 - 350 kg/cm2. Enzymet blev ekstraheret fra de sønderbrudte celler med en opløsning af en phos-phatstødpude (pH 6,5, 0,1 M) og celleaffaldet blev fjernet ved centrifugering. Den opløselige enzymfraktion 30 blev yderligere koncentreret ved ultrafiltrering (DDS membran GR 6p, hvor DDS er en forkortelse af De Danske Sukkerfabrikker).
Udbytte: Gæringsvæske 1,0 enhed/ml 410 1 35 Slam 11/3 enheder/ml 30,5 1
Koncentrat 121 enheder/ml 1,7 1 λ1 Η632Β
Eksempel 2
Mikroorganismen NRRL B-11,229 blev bragt til at vokse i en chemostat af laboratorietypen ved en for-5 tyndingshastighed på 0,15 timer
Volumen: 350 ml
Hastighed af luftstrøm: 0,5 Nl/min.
Temperatur: 50° C
10 Omrørerhastighed: 500 rpm pH: 7-8, indstillet med fortyndet eddikesyre
Substrat: Som beskrevet i eksempel 1
Udbytte: 2,1 enheder/ml 15
Eksempel 3
Diskontinuerlig hydrolyse med det opløselige 20 lactaseprodukt, hvis fremstilling er beskrevet i eksempel 1, blev gennemført i en pH-stat under nitrogen ved 60° C og pH 6,5, idet man som substrat anvender et deio-niseret vallepermeat, hvortil der var tilsat 0,5 g KC1/1 som aktivator.
25
Vallepermeatet blev deioniseret, d.v.s. både kationer og anioner blev fjernet fra vallepermeatet. Med en enzymdosering på 100 enheder pr. liter opnåede man 100% konvertering i løbet af 45 timer, og med en enzym-30 dosering på 50 enheder pr. liter opnåede man en konvertering på 96,5% i løbet af 71 timer.
Eksempel 4 35
Immobilisering af beta-galactosidase. pH-værdien af gæringsvæske med beta-galactosidaseholdige celler fremstillet som beskrevet i eksempel 1 indstilles 12 145326 på 7,5, og cellerne udvindes fra gæringsvæsken ved centrifugering. En bedømmelse viser, at koncentratet indeholder ca. 10% tørstof og ca. 50% intakte celler.
5 Slammet blev derpå pumpet igennem en Manton-
Goulin homogenisator af type SP 15 M - 8 TA med et enkelttrinshomogeniseringsventilanlæg, hvor trykfaldet var 300 - 350 kg/cm2.
10 Til 1 liter af det homogeniserede koncentrat ved en pH-værdi på 7,5 og 25° C tilsatte man 50% glutar-aldehydopløsning, og man frembragte en koncentration på 0,5% glutaraldehyd i opløsningen. Efter 30 minutters reaktionstid blev gelen sønderbrudt ad mekanisk vej og 15 fortyndet med 1 volumen vand. Man tilsatte 100 ml af et 20% flokkuleringsmiddel Superfloc C 521, hvorved der dannedes en klar vandfase i opløsningen. Blandingen blev filtreret, og filterkagen blev granuleret og lufttørret.
20 Udbytte: 15%
Specifik aktivitet: 100 enheder/g
Eksempel 5 25
Til 20 ml af koncentratet fra eksempel 1 tilsætter man 16 g syrefældet casein og 4 g ægalbumen.
Blandingen holdes i omrøring, indtil der er dannet en homogen pasta. Der tilsættes 50% glutaraldehyd for at 30 frembringe en koncentration af 1,5% glutaraldehyd i pastaen. Det fugtige produkt overlades til sig selv i 30 minutter for at tværbindingsprocessen kan fuldføres.
Produktet blev granuleret og lufttørret.
35 Udbytte: 10%
Specifik aktivitet: 25 enheder/g
Eksempel 6 13 146325
Kontinuerlig hydrolyse af lactose ved hjælp af immobiliseret beta-galactosidase. I en laboratoriesøjle 5 med fikseret masse gennemførte man en hydrolyse af en lactosesirup ved hjælp af den immobiliserede beta-galactosidase, der var fremstillet i henhold til eksempel 4.
Man gjorde brug af følgende forsøgsbetingelser: 10 Indført materiale: 5,5% w/w lactose, 60° C, pH 6,7.
Konserveringsmidler: 50 mg NaN^ og 150 mg chloramphenicol pr. liter lactosesirup Søjledimension: Diameter 2,5 cm; højde 40 cm 15 Mængde af immobiliseret beta-galactosidase: 15 g
Tid Væskehas- Kontakt- % Konverte-(dage) tighed tid ring til 20 (ml/time) (minutter) monosaccha- rider 0 300 TO 9875 25 I 300 TO 9471 2 300 10 8172 3 120“ “26 9878 30 6 120 26 93,0 7 75 42 9871 35 8 75 42 9271

Claims (6)

14 146325 5
1. Beta-galactosidase, kendetegnet ved, at deri er identisk med den beta-galactosidase, der dannes ved dyrkning af stammen Bacillus NRRL B-11,229 10 under aerobe betingelser og under anvendelse af et dyrkningsmedium omfattende en nitrogenkilde og små mængder uorganiske salte.
2. Beta-galactosidase ifølge krav 1, kende-15 t e g n e t ved, at den foreligger i opløselig form.
3. Beta-galactosidase ifølge krav 1, kende tegnet ved, at den foreligger i immobiliseret form. 20
4. Fremgangsmåde til fremstilling af beta- galactosidasen ifølge krav 1, kendetegnet ved, at stammen Bacillus NRRL B-11,229 under aerobe betingelser dyrkes på et vækstmedium indeholdende 25 assimilerbare nitrogen-, carbon- og oxygen-kilder og små mængder uorganiske salte, hvorefter cellerne høstes og den intracellulære beta-galactosidase isoleres.
5. Fremgangsmåde til konvertering af en lac- 30 toseholdig væske, fortrinsvis valle, til en sirup, der indeholder glucose, galactose og en mindre mængde lactose, kendetegnet ved, at man bringer den lactoseholdige væske i forbindelse med beta-galactosidasen ifølge krav 1. 35
6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, hvor konverteringen er diskontinuerlig, kendetegnet ved, at man indfører beta-galactosidasen ifølge krav 2 i den
DK519079A 1979-01-10 1979-12-06 Beta-galactosidase, fremgangsmaade til fremstilling deraf og anvendelse deraf DK146325C (da)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK519079A DK146325C (da) 1979-01-10 1979-12-06 Beta-galactosidase, fremgangsmaade til fremstilling deraf og anvendelse deraf
NL8000033A NL8000033A (nl) 1979-01-10 1980-01-03 Verbeteringen in en met betrekking tot een beta- -galactosidase-produkt met een grote thermostabiliteit, een micro-organisme, dat een dergelijk beta-galac- tosidase-produkt produceert, een werkwijze ter bereiding van een dergelijk beta-galactosidase-produkt en de toepassing van een dergelijk beta-galactosidase- produkt.
ES487503A ES487503A0 (es) 1979-01-10 1980-01-07 Un metodo para la manufactura de un producto enzimatico mi- crobiano de b-galacto sidasa.
NZ192552A NZ192552A (en) 1979-01-10 1980-01-07 -galactosidase produced by microorganism eg nrrl b-11 229 conversion of lactose to glucose and galactose
AU54384/80A AU5438480A (en) 1979-01-10 1980-01-07 Microbiological production of a thermo-stable beta- galactosidase
IT8047556A IT8047556A0 (it) 1979-01-10 1980-01-09 Prodotto contenente beta-galattossi dasi di origine microbica microorganismo e procedimento per la sua produzione e sua applicazione nel trattamento di liquidi contenenti lattosio
FR8000424A FR2453214A1 (fr) 1979-01-10 1980-01-09 Produit enzymatique contenant de la beta-galactosidase, micro-organisme et procede pour sa preparation et utilisation de ce produit.
GB8000722A GB2038837A (en) 1979-01-10 1980-01-09 Microorganisms for the production of microbial beta- galactosidase, microbial beta- galactosidase, method for production thereof and application thereof
DE19803000598 DE3000598A1 (de) 1979-01-10 1980-01-09 Mikrobiologisches enzymprodukt enthaltend eine beta -galactosidase

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK10379 1979-01-10
DK10379A DK10379A (da) 1979-01-10 1979-01-10 Mikrobiel beta-galactosidase mikroorganisme til fremstilling deraf fremgangsmaade til fremstilling deraf og anvendelse deraf
DK519079 1979-12-06
DK519079A DK146325C (da) 1979-01-10 1979-12-06 Beta-galactosidase, fremgangsmaade til fremstilling deraf og anvendelse deraf

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK519079A DK519079A (da) 1980-07-11
DK146325B true DK146325B (da) 1983-09-05
DK146325C DK146325C (da) 1984-02-20

Family

ID=26063306

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK519079A DK146325C (da) 1979-01-10 1979-12-06 Beta-galactosidase, fremgangsmaade til fremstilling deraf og anvendelse deraf

Country Status (9)

Country Link
AU (1) AU5438480A (da)
DE (1) DE3000598A1 (da)
DK (1) DK146325C (da)
ES (1) ES487503A0 (da)
FR (1) FR2453214A1 (da)
GB (1) GB2038837A (da)
IT (1) IT8047556A0 (da)
NL (1) NL8000033A (da)
NZ (1) NZ192552A (da)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3811964A1 (de) * 1988-04-11 1989-10-19 Biodyn Ag Getraenk fuer menschliche ernaehrung
FR2749307B1 (fr) * 1996-05-29 1998-09-04 Roquette Freres Procede de preparation de d-arabitol

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1493542A (en) * 1974-12-04 1977-11-30 Reynolds Tobacco Co R Production of thermostable lactose
NZ190603A (en) * 1978-06-07 1982-03-23 Nat Res Dev Heat-stable -galactosidase derived from bacillus stearothermophilus hydrolysis of lactose

Also Published As

Publication number Publication date
DK146325C (da) 1984-02-20
DE3000598A1 (de) 1980-07-31
ES8101618A1 (es) 1980-12-16
NL8000033A (nl) 1980-07-14
FR2453214A1 (fr) 1980-10-31
IT8047556A0 (it) 1980-01-09
NZ192552A (en) 1982-03-30
AU5438480A (en) 1980-07-17
DK519079A (da) 1980-07-11
GB2038837A (en) 1980-07-30
ES487503A0 (es) 1980-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lotscher et al. Interconversion of high and low ATPase activity forms of ECF1 by the detergent lauryldimethylamine oxide
US3806416A (en) Creatine amidohydrolase and process for its preparation
Fernandes et al. β-Galactosidase from a cold-adapted bacterium: purification, characterization and application for lactose hydrolysis
Fenton Solvent treatment for β-d-galactosidase release from yeast cells
Dobrynina et al. Disruption of bacterial biofilms using recombinant dispersin B
DK145503B (da) Glucoseisomerase
Skorko et al. Glycogen-bound polyphosphate kinase from the archaebacterium Sulfolobus acidocaldarius
DK146325B (da) Beta-galactosidase, fremgangsmaade til fremstilling deraf og anvendelse deraf
Decleire et al. Hydrolysis of lactose solutions and wheys by whole cells of Kluyveromyces bulgaricus
GB2291058A (en) Acid alpha-amylases derived from sulfolobus species
Simon et al. Allosteric and non-allosteric phosphofructokinases from lactobacilli purification and properties of phosphofructokinases from L. Plantarum and L. Acidophilus
Schaffel et al. Alkaline phosphatase from Bacillus licheniformis. Solubility dependent on magnesium, purification and characterization
Atlan et al. Purification of extracellular alkaline phosphatase released by Escherichia coli excretory mutants
Cerny et al. Comparative polyacrylamide electrophoresis of periplasmic proteins released from gram-negative bacteria by polymyxin B
Ghatak et al. Immobilization of β-galactosidase from Enterobacter cloacae: characterization and its use in the continuous production of low lactose milk
Avery et al. Studies on the Enzymes of Pneumococcus: Iii. Carbohydrate-Splitting Enzymes: Invertase, Amylase, and Inulase
HOSHINO et al. Formation and characterization of three types of yeast invertase
Balasubramaniam et al. Sucrose phosphorylase and invertase activities in bacteria
Griffiths et al. Hydrolysis of lactose by a thermostable β‐galactosidase immobilised on DEAE‐cellulose
Yakimova et al. Alpha-galactosidase and invertase from Penicillium chrysogenum sp. 23: purification, characteristics and hydrolysis of raffinose
Williams et al. Studies on the alginase of Agarbacterium alginicum
DK143714B (da) Fremgangsmaade til hydrolyse af lactose under dannelse af glucose og galactose
Bhatti Purification and properties of the alkaline phosphatase of Serratia marcescens
Konings et al. Specificity of the transhydrogenase factor for chromatophores of Rhodopseudomonas spheroides and Rhodospirillum rubrum
JPS61135584A (ja) プロテア−ゼの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
PBP Patent lapsed