NL8000033A - Verbeteringen in en met betrekking tot een beta- -galactosidase-produkt met een grote thermostabiliteit, een micro-organisme, dat een dergelijk beta-galac- tosidase-produkt produceert, een werkwijze ter bereiding van een dergelijk beta-galactosidase-produkt en de toepassing van een dergelijk beta-galactosidase- produkt. - Google Patents

Description

4.

N.O. 28.578 >

Verbeteringen in en met betrekking tot een β-galactosidase-produkt met een grote thermostabiliteit, een raicroorganisme, dat een dergelijk β-galactosidase-produkt produceert, een werkwijze ter bereiding van een dergelijk β-galactosidase-produkt en de toepassing van een dergelijk β-galactosidase-produkt ♦_

Behalve ondergeschikte hoeveelheden proteïnen, vitaminen en zouten is het hoofdbestanddeel van de vaste stoffen van wei het disaccharide lactose.

Pogingen zijn gedaan wei om te zetten tot meer waardevolle 5 produkten door hydrolyse van de lactose tot glucose en galactose door middel van microbieel geproduceerde β-galactosidasen. Hoewel verschillende pogingen tot oplossing van dit probleem zijn gedaan, weerspiegelt in een omvangrijke hoeveelheid gepubliceerde literatuur, is geen succesvol commercieel proces nog ontwikkeld. Een van 10 de hoofdredenen, waarom de enzymatische omzetting van lactose tot glucose en galactose niet gerijpt is tot een commercieel succesvol proces is het feit, dat geen β-galactosidase met bevredigende eigenschappen bekend is. Wanneer de omzetting van lactose op bevredigende wijze moet worden uitgevoerd, is het noodzakelijk, dat het 15 β-galactosidase tegelijkertijd de beide volgende eigenschappen vertoont: 1) het β-galactosidase dient stabiel te zijn bij een temperatuur, die voldoende hoog is om een microbiële verontreiniging te voorkomen en 2) de remming van het β-galactosidase door lactose of de produkten afkomstig van de lactose-hydrolyse, dat wil zeggen 20 galactose en glucose, dient minimaal te zijn, teneinde de hydrolyse tot voltooiing te brengen zonder al te grote hoeveelheden van het enzym te gebruiken.

Beschreven is, dat zure β-galactosidasen bereid kunnen worden uit fungi, bijvoorbeeld Aspergillus, in het bijzonder 25 Aspergillus oryzae en Aspergillus niger. waarvoor verwezen wordt naar het Amerikaanse octrooischrift 3*029.073 en Journal of Food Science, 37 (1972), 619 - 623* Deze enzymen vertonen een redelijk goede thermostabiliteit, maar worden sterk geremd door de hydrolyse-produk-ten van lactose. Anderzijds worden β-galactosidasen uit bepaalde 30 bacteriën zoals Lactobacilli en Enterobacteria slechts weinig geremd door de hydrolyse-produkten van lactose, maar hun thermostabiliteit is zeer gering; dit is reeds vele jaren bekend. Ook zijn β-galactosi-dasen vroeger aangetroffen in thermofiele bacillen, zie Ε.Ξ. Goodman en D.M. Pederson in Canadian J.of Microbiology, 22 80 0 0 0 33 * 2 (1976), 817 - 825 die een β-galactosidase uit B. Stearothermophilus beschrijven met een relatief goede thermische stabiliteit, maar dit wordt sterk geremd door de hydrolyse-produkten van lactose. Ook een β-galactosidase uit B. coagulans is beschreven (Brits octrooischrift 5 1Λ93Λ52) en dit enzym heeft eigenschappen soortgelijk aan de ei genschappen van het enzym afkomstig van 3. stearothermophilus.

Het oogmerk van de uitvinding is een β-galactosidase te verschaffen, dat tegelijkertijd een goede thermische stabiliteit en een geringe remming door de produkten afkomstig van de lactose-hydrolyse 10 en lactose zelf heeft.

Volgens het eerste aspect van de uitvinding wordt een micro-bieel enzym-produkt verschaft, dat een β-galactosidase bevat, dat met betrekking tot de enzym chemische en immunologische eigenschappen (later in de onderhavige uitvinding meer gedetailleerd te defi-15 nieren) het β-galactosidase is of identiek is aan het β-galactosidase, dat voortgebracht wordt door kweking van het microorganisme NRRL B-11, 229.

Het is verrassend, dat het nieuwe β-galactosidase tegelijkertijd een goede thermische stabiliteit en een lage remming door de 20 produkten afkomstig van de lactose-hydrolyse en lactose zelf vertoont.

De eigenschappen van het microorganisme NRRL B-11, 229 zijn de volgende.

Morfology: staven 2 - 5^/Um x 0,7 - l^-um. Sporen 1,6 - 1,8^um x 0,8 - 1yUm gevormd op Schaeffer’s agar, sub-eindstandig tot eind-25 standig geplaatst. Enigszins gezwollen sporehouder, die slechts even uit de vegetatieve cel steekt. Fysiologie: catalase positief, geen anaerobe groei, zuur evenwel geen gas gevormd uit glucose, xylose, trehalose, lactose, arabinose of mannitol. Groei tussen *f0 en ?0°C en een pH tussen 6,0 en 8,5· Geen groei in 3 % NaCl, evenwel groei 30 in 1 ^ NaCl. De proteinase-proeven, die eidooier en caseïne als substraten bevatten, waren negatief en de zetmeelafbraak was gering.

NO^ wordt gereduceerd tot NC^ · Geen dihydroxyaceton wordt uit glycerol gevormd. Het microorganisme schijnt verwant te zijn met B. stearothermophilus.

35 De uitvinding is niet beperkt tot de stam NRRL B-11, 229» maar omvat de taxonome groep, die wordt voorgesteld door het type cultuur NRRL B-11, 229 en waarvan de leden in hoofdzaak de ^kono-mische eigenschappen van deze stam hebben, zoals hiervoor beschreven, en in staat zijn een β-galactosidase te produceren, dat met betrek-40 king tot enzym-chemische en immunologische eigenschappen het 80 0 0 0 33 β-galactosidase is of identiek is aan het β-galactosidase, dat wordt voortgebracht door kweking van het raicroorganisme NRRL B-11, 229*

Een voorkeursuitvoeringsvorm van het microbiële enzym-pro-dukt volgens de uitvinding omvat een microbieel enzym, dat ver-5 schijnt als een bestanddeel van een raicroorganisme celprodukt, welk microorganisme behoort tot de hiervoor gedefinieerde taxonoraische groep voorgesteld door het type cultuur NRRL B-11, 229#

Volgens het tweede aspect van de uitvinding wordt een micro-organisme verschaft, dat behoort tot de hiervoor gedefinieerde taxo-10 nomische groep voorgesteld door het type cultuur NRRL B-11, 229* Dit aspect van de.uitvinding omvat tevens fracties van een dergelijk microorganisme.

De immunoligische eigenschappen van het enzym worden bepaald zoals hierna beschreven. Oplosbaar, gezuiverd enzym (waarvan de be-15 reiding later zal worden beschreven) werd gebruikt voor antiserum-produktie in konijnen op een op zichzelf bekende wijze.

De twee-dimensionele imraünoelektroforetische bepaling werd in duplo op de volgende wijze uitgevoerd.

Eerste dimensie: 10^,ul van een monster, dat 100^ug gezuiverd 20 enzym/ml bevat, wordt aangebracht op een agarose-gel van 1,5 mm bij 20°C en een elektroforese werd gedurende 90 minuten uitgevoerd met een elektrisch veld-gradiënt van 7 volt/cm en in een buffersysteem, dat bestaat uit 11 g barbituurzuur, 65 g natrium-barbital, 28 g glycine, 23 g TKIS (TRIS is een afkorting van tris-(hydroxymethyl)-25 aminomethaan) en water aangevuld tot 25 liter. Tweede dimensie, loodrecht op de eerste dimensie: 1,0 ml antiserum bereid zoals hiervoor beschreven, wordt opgelost in 10,8 ml agarose-gel en de agarose-gel-strip afkomstig van de eerste dimensie elektroforese wordt verenigd met de antiserum agarose-gel. De tweede dimensie immunoelektroforese 30 wordt gedurende 16 uren uitgevoerd met een elektrisch veld-gradiënt van 1 volt/cra. De gel van een van de twee proeven wordt samengeperst, gewassen en gedroogd en het proteïne wordt ontwikkeld met Coomasie briljant blauw en de gel van de andere proef wordt direkt omgezet met 0,1 % ONPG (ortho-nitrofenylgalactoside) in 1/15 molaire KNaHPO^ 55 (pH 6,5)· Wanneer lactose aanwezig is, zal het ONPG ontleed worden tot galactose en o-nitrofenol, wat een krachtige gele kleur vertoont.

Een gele kleur van o-nitrofenol was zichtbaar op de gel na 30 minuten. In dit systeem bewoog het lactase 51 mm in de richting van de anode en een precipitaat van de lactase en het antiserum werd gevormd 40 in de tweede dimensionele proef. Na precipitatie was de lactase nog 800 0 0 33 * * c actief, zoals bewezen door de reactie met ONPG. Verwezen wordt naar fig. 1.

Fig. 1a laat de verschijningsvorm van de gel bij de eerste proef zien, waarvan het proteïne ontwikkeld is. Het blijkt, dat ten 5 minste drie verschillende proteïnen aanwezig zijn, overeenkomend met de precipitatèn 1, 2 en 3· Fig. 1b laat de verschijningsvorm van de gel zien bij de tweede proef, waarin de reactie met ONPG werd uitgevoerd. Het gearceerde gebied van fig. 1b was donkergeel gekleurd, erop wijzend, dat het precipitaat 2 van fig. 1a overeenkomt met 10 β-galactosidase, terwijl de precipitaten 1 en 3 bij fig· 1a overeenkomen met proteïnen, die geen β-galactosidase zijn.

Door toepassing van gekruiste tandem immunoelektroforese (bijvoorbeeld volgens N.H. Axelsen c.s., A manual of quantitative Immunoelectrophoresis, 1977) is het mogelijk vast te stellen, of een 15 authentiek β-galactosidase volgens de uitvinding identiek is aan of verschilt van een of ander onbekend β-galactosidase-monster. Soortgelijke kwalitatieve proeven kunnen worden uitgevoerd door middel van andere immunoligische methoden, bijvoorbeeld immuno-diffusie of di-rekte immunoprecipitatie gevolgd door natrium-dodecylsulfaatgel-20 chromatografie.

Onder de chemische eigenschappen van het enzym zijn de thermische stabiliteit en de remming door de produkten afkomstig van lactose-hydrolyse de meest belangrijke.

De β-galactosidase-activiteit wordt op de volgende wijze 25 bepaald. Een ongezuiverd lysaat van cellen wordt bereid door bij 37°C gedurende 15 minuten te behandelen met lysozyme bij een concentratie van 2 mg/ml in melkbuffer (pH 6,5» zoutsamenstelling als in melk) gevolgd door twee cycli van vriezen en ontdooien. Het lysaat, dat 2-10 lactase-activiteitseenheden (hierna te definiëren) bevat 30 per liter, wordt 1 uur gemcubeerd in melkbuffer met 2,0 % lactose, waarna de reactie wordt onderbroken door koken, precipitatie in ijswater en centrifugeren. De bovenstaande vloeistoffen worden geanalyseerd op glucose volgens de glucose-oxidase-peroxidase-methode (Tech. Bull. no. 510, Sigma Chemical Co.). 1 lactase-activiteits-35 eenheid wordt gedefinieerd als de hoeveelheid enzym, dat onder genormaliseerde omstandigheden van een pH van 6,5 en 60°C 1^-umol glucose per minuut vrij maakt.

De thermische stabiliteit wordt op de volgende wijze gemeten. De activiteit wordt bepaald zoals hiervoor aangegeven, behalve voor hO het feit, dat verschillende incubatietemperaturen worden gebruikt.

800 0 0 33 4 5

Monsters worden elke 30 minuten gedurende 2 uren voor glucose-analyse onttrokken.

De remming door galactose wordt op de volgende wijze gemeten. Bij de genormaliseerde proef voor galactose-remming bevat het incu-5 batie-mengsel 2,0 % lactose en 2,0 % galactose; overigens zijn de omstandigheden zoals hiervoor aangegeven in verband met de bepaling van de activiteit. Andere combinaties van glucose en galactose zijn echter onderzocht, bijvoorbeeld 2 % lactose en 10 % galactose, overeenkomend met 90 % hydrolyse van 5 maal geconcentreerde melk.

10 De pH-activiteitskromme is een andere enzym chemische eigen schap, die belangrijk is, tengevolge van het feit, dat het pH-opti-mum van het β-galactosidase niet te ver dient te zijn van de pH van de te behandelen wei, aangezien anders een te grote hoeveelheid β-galactosidase gebruikt zou moeten worden. Het pH optimum van het 15 β-galactosidase volgens de uitvinding is ongeveer 6,5 - 7,0 bij 60°C, wanneer de activiteitsmetingen worden uitgevoerd volgens de hiervoor gegeven methode voor de bepaling van de β-galactosidase-activiteit. Eveneens is de β-galactosidase-activiteit meer dan 75 % van de maximum activiteit in het pH-traject van 6,1 - 8,0.

20 Het molecuulgewicht van het β-galactosidase wordt op de vol gende wijze bepaald. Eerst wordt het enzym sterk gezuiverd door middel van gel-elektroforese op polyacrylamide. Vervolgens wordt het molecuulgewicht van het β-galactosidase bepaald door middel van gel-elektroforese, waarbij het β-galactosidase parallel met andere pro-25 teïnen wordt doorgevoerd, waarvan het molecuulgewicht bekend is, dat wil zeggen fosforylase A met het molecuulgewicht 94.000 en de sub-eenheid van E. Coli β-galactosidase (inactief) met molecuulgewicht 116.000. Het molecuulgewicht van het β-galactosidase volgens de uitvinding, dat nog actief is, was in dit systeem ongeveer 116.000.

30 Het was verrassend, dat een β-galactosidase bestond, dat tegelijkertijd een grote thermische stabiliteit vertoonde overeenkomend met een halfwaarde van meer dan 500 minuten bij 65°C en een geringe galactose-remming van ongeveer 10 % volgens de hiervoor vermelde genormaliseerde proef. Met 10 % galactose in het incubatie-35 mengsel is de galactose-remming minder dan 50 %· Eveneens was zeer laag (ongeveer 5 mM) en geen lactose-remming kon worden vastgesteld bij zelfs zeer hoge concentraties lactose.

Volgens het derde aspect van de uitvinding wordt een werkwijze verschaft voor de bereiding van een microbieel β-galactosidase-40 produkt, waarbij een microorganisme behorende tot de hiervoor gede- 80 0 0 0 33

D

C

p fineerde taxonoraische groep, voorgesteld door het type cultuur NRHL B-11, 229 gekweekt wordt op een fermentatie-milieu met assimi-liseerbare stikstof-, koolstof- en zuurstofbronnen, waarna de cellen worden gewonnen en het intracellulaire β-galactosidase-produkt wordt 5 geïsoleerd.

De enzymvorming wordt opgewekt door lactose en galactose en volgt de groei. Echter kan de stam constitutief worden gemaakt door toepassing van een gebruikelijke mutatie-techniek. Het organisme toont geen enkele groei-vraag naar speciale C- of N-bronnen, maar de 10 groei en enzym-vorming worden verbeterd, wanneer het minimale substraat verrijkt wordt met organische stikstofbronnen zoals pepton of trypton, gistextract of mais-weekvloeistof. Het organisme is eveneens zeer veelzijdig met betrekking tot het gebruik van koolstofbron-nen, aangezien het bijvoorbeeld glucose, galactose, lactose, fructose, 15 glycerol, glutaminaten, succinaten, lactaten en acetaten verbruikt.

De groei op de mono- en disacchariden wordt gevolgd door een zeer sterke zuurproduktie, dis de groei onderbreekt, wanneer de pH beneden ongeveer 6,0 daalt.

Het β-galactosidase wordt intracellulair voortgebracht, maar 20 kan gemakkelijk uit de cellen worden vrijgemaakt volgens gebruikelijke technieken, bijvoorbeeld behandeling met tolueen, butanol of lysozyme, ultrasone behandeling of mechanische desintegratie, waarna de celoverblijfselen worden verwijderd en het enzym wordt gezuiverd volgens gebruikelijke technieken, bijvoorbeeld precipitatie met zout 25 of precipitatie met een organisch oplosmiddel.

Wei, melk en andere lactose bevattende vloeistoffen, kortheidshalve hierna aangeduid als wei, kunnen op bevredigende wijze worden omgezet tot een siroop, die glucose en galactose en nagenoeg geen lactose bevat, door middel van het β-galactosidase volgens de 30 uitvinding. Deze omzetting kan doelmatig ladingsgewijze worden uitgevoerd door middel van het oplosbare β-galactosidase. Om deze omzetting echter op een meer economisch aantrekkelijke wijze en op industriële schaal uit te voeren, verdient het sterk aanbeveling een geïmmobiliseerd β-galactosidase-produkt te gebruiken.

35 Immobilisatie-methoden voor enzymen zijn bijvoorbeeld in de volgende in de tabel vermelde publicaties beschreven.

800 0 0 33 7 t g» ____Immobilisatie van cellen, inclusief geïsoleerd enzym,

Octrooi gehele cellen inclusief zuiver ______________enzym_

Brits octrooischrift 1ΛΗ.539 χ x

Amerikaans octrooischrift ^.001.095 x " if .025.391 x " if.033.822 x '» if.038.1if0 x

Het blijkt eveneens uit de voorafgaande lijst, dat immobilisatie van gehele cellen en zuiver enzym beschreven zijn. Het β-galactosidase-produkt volgens de uitvinding kan ook geïmmobiliseerd worden zowel in de vorm van gehele cellen als als een zuiver 5 enzym. Elk van de hiervoor vermelde immobilisatie-methoden kan gebruikt worden voor het β-galactosidase-produkt volgens de uitvinding.

Volgens het vierde aspect van de uitvinding wordt een β-galactosidase-produkt volgens de uitvinding verschaft, dat geimrao-10 biliseerd is. Dit geïmmobiliseerde β-galactosidase-produkt volgens de uitvinding toont het uitstekende voordeel in staat te zijn op een commerciële schaal en op een economisch aantrekkelijke wijze een fluidum met een zeer grote lactose-concentratie volledig om te zetten tot galactose en glucose, tengevolge van het ontbreken van rem-13 ming van substraat en lactose-hydrolyse-produkten.

Volgens het vijfde aspect van de uitvinding wordt een werkwijze verschaft voor de ladingsgewijze omzetting van een lactose bevattend fluidum, bij voorkeur wei, tot een siroop, die glucose en galactose en een ondergeschikte hoeveelheid lactose bevat, waarbij 20 een oplosbaar microbieél β-galactosidase-produkt volgens de uitvinding in het lactose bevattende fluidum wordt gebracht bij een pH tussen ongeveer 5,5 en 8,5 en bij een temperatuur tussen 55 en 75°C.

De initiële β-galactosidase-activiteit in het lactose bevattende fluidum, uitgedrukt in lactase-activiteitseenheden/liter, va-25 rieert aanzienlijk, in hoofdzaak tengevolge van variaties in pH, temperatuur, omzettingstijd en initiële lactose-concentratie.

Volgens het zesde aspect van de uitvinding wordt een werkwijze verschaft voor de continue omzetting van een lactose bevattend fluidum, bij voorkeur wei, dat een siroop, die glucose en galactose 30 en een ondergeschikte hoeveelheid lactose bevat, waarbij het lactose bevattende fluidum in een kolom wordt gevoerd, die gevuld is met het 80 0 0 0 33 r δ geïmmobiliseerde microbiële β-galactosidase-produkt volgens de uitvinding bij een pH tussen ongeveer 5,5 en 8,5, bij een temperatuur tussen 55 en 75°C en bij een snelheid, die een stijging geeft tot een lactose-concentratie in de kolom-afvoer, die minder is dan 10 73, 5 bij voorkeur minder dan 1 % van de lactose-concentratie in de wei-toevoer.

De uitvinding zal in de volgende voorbeelden worden toegelicht.

De voorbeelden I en II lichten de bereiding toe van het 10 β-galactosidase, voorbeeld III licht het ladingsgewijze gebruik van het oplosbare β-galactosidase toe, de voorbeelden IV en V lichten de immobilisatie van het β-galactosidase toe en voorbeeld VI licht het continue gebruik van het geïmmobiliseerde β-galactosidase toe. Voorbeeld I

15 Het enzym werd bereid door ondergedompelde ladingsgewijze fermentatie in een conventionele fermentatie-inrichting van 400 liter met roerder, temperatuurregeling (uitwendige watermantel) en luchttoevoerbuis, waarbij de verhouding hoogte/diameter 2 : 1 was.

De fermentatie werd onder de volgende omstandigheden uit- 20 gevoerd:

Temperatuur: 50°C

Luchtstromingssnelheid: 120 Nl/min.

Hoerdersnelheid: 200 omwentelingen/minuut.

Het substraat bestond uit de volgende bestanddelen: 25 weipoeder 2,0 kg mais weekvloeistof 8,0 kg (NH^)2S0^ 0,½ kg

MgS0^-7H20 0,2 kg Κ2ΗΡ0^ 0,1 kg 30 Pluronic ® 0,2 kg

Pluronic ^ is een vloeibaar niet-ionogeen oppervlakactief middel.

De pH werd vóór de sterilisatie op 7,2 ingesteld.

Leidingwater werd toegevoegd tot een totaal volume van 400 liter.

35 De vloeistof werd met een een avond te voren (50°C) hellend opgestelde voedingsagar van NRRL B—11, 229 geinoculeerd en 24 uren later werd de fermentatie voltooid en werd de cultuur snel afgekoeld tot 10°C, waarna het enzym werd gewonnen. De cellen werden op een centrifuge afgescheiden en geopend door een passage door een 40 Manton-Gaulin homogeniseerinrichting van het type SP 15 M 8 TA met 80 0 0 0 33 5 9 een eentraps homogeniseringsklepsamenstel, waarbij de drukval ongeveer 30.000 - 35.ΟΟΟ kPa bedroeg. Het enzym werd uit de gebroken cellen geëxtraheerd met een fosfaatbufferoplossing (pH 6,5» 0,1 mo-lair) en de celoverblijfselen werden op de centrifuge verwijderd.

5 De oplosbare enzymfractie werd verder geconcentreerd door ultrafiltratie (DDS membraan GE 6p, waarbij DDS een afkorting is van De Danske Sukkerfabrikker).

Opbrengsten: cultuurvloeistof 1,0 eenheid/ml *f10 1 slib 11,3 eenheden/ml 30,5 1 10 concentraat 121 eenheden/ml 1,7 1

Voorbeeld II

Het microorganisms NEEL B 11,229 wordt gekweekt op een chemostaat op werkbankschaal bij een verdunningssnelheid van -1 0,15 h .

15 Volume: 350 ml

Luchtstromingssnelheid: 0,5 Nl/min.

Temperatuur: 50°C

roerdersnelheid: 5Ö0 omwentelingen/minuut pH: 7-8 ingesteld met verdund azijnzuur

20 substraat: zoals beschreven in voorbeeld I

opbrengst: 2,1 eenheden/ml

Voorbeeld III

Ladingsgewijze hydrolyse met het oplosbare lactase-produkt zoals beschreven in voorbeeld I werd uitgevoerd in een pH-staat on-25 der stikstof bij 60°C en een pH van 6,5 onder toepassing als substraat van gedeioniseerd wei-permeaat, waaraan 0,5 g KC1/1 als activator was toegevoegd.

Het wei-permeaat was gedeioniseerd, dat wil zeggen zowel kationen als anionen waren ui thet wei-permeaat verwijderd.

30 Met een enzym-dosering van 100 eenheden/liter werd een 100 % omzetting bereikt in k5 uren en met een enzym-dosering van 50 eenheden/liter werd een omzetting van 96,5 % bereikt in 71 uren.

Voorbeeld IV

Immobilisatie van β-galactosidase, Een fermentatie-vloeistof 35 met β-galactosidase bevattende cellen, bereid zoals beschreven in voorbeeld I, wordt op een pH van 7»5 ingesteld en de cellen worden uit de fermentatie-vloeistof doof centrifugeren gewonnen. Bepaald wordt dat het concentraat ongeveer 10 % droge stof en ongeveer 50 % intacte cellen bevat.

*fö De suspensie werd vervolgens gepompt door een Manton-Gaulin 80 0 0 0 33 ΊΟ homogeniseerinrichting type SP 15 Μ - 8 ΤΑ met een enkel traps-homo-geniseringsklepsamenstel, waarbij de drukval ongeveer 30.000 tot 35*000 kPa bedroeg.

Aan 1 liter van het gehomogeniseerde concentraat werd bij 5 een pH van 7*5 en 25°C 50 % glutaaraldehyde-oplossing toegevoegd om een concentratie van 0,5 % glutaaraldehyde in de oplossing te ontwikkelen. Na een reactietijd van 30 minuten werd de gel mechanisch gebroken en met 1 volumedeel water verdund. 100 ml van een 20-pro-cents uitvlokkingsmiddel Superfloc C 521 werden toegevoegd, waarbij 10 een doorzichtige waterfase in de oplossing werd gevormd. Het mengsel werd gefiltreerd en de filterkoek werd gegranuleerd en aan de lucht gedroogd.

Opbrengst: 15 %

Specifieke activiteit: 100 eenheden/g

15 Voorbeeld V

Aan 20 ml van het concentraat van voorbeeld I worden 16 g zuur geprecipiteerd caseïne en 4 g eiwit toegevoegd. Het mengsel wordt geroerd tot een homogene pasta is gevormd. Een 50-procents glutaaraldehydeoplossing wordt toegevoegd om een concentratie te ont-20 wikkelen van 1,5 % glutaaraldehyde in de pasta. Het vochtige produkt wordt 30 minuten met rust gelaten om het verknopingsproces te voltooien. Het produkt werd gegranuleerd en aan de lucht gedroogd. Opbrengst: 10 %

Specifieke activiteit: 25 eenheden/g

25 Voorbeeld VI

Continue hydrolyse van lactose door middel van geïmmobiliseerd β-galactosidase. In een laboratoryumkolom met vast bed werd de hydrolyse van een lactose-siroop uitgevoerd door middel van het geïmmobiliseerde β-galactosidase, bereid volgens voorbeeld IV. De vol-30 gende proefomstandigheden werden gebruikt:

Toevoer: 5}5 gew.fi lactose, 50°C, pH 6,7

Conserveermiddelen: 50 mg NaN^ en 150 mg chlooramfenicol per liter lactose-siroop

Kolomgrootte: diameter 2,5 cm; hoogte 40 cm 35 Hoeveelheid geïmmobiliseerd β-galactosidase: 15 g 80 0 0 0 33 11

Proefresultaten:

Tijd Stromingssnelheid Contacttijd % omzetting tot (dagen)_(mg/h)_(minuten)_monosacchariden 0 300 10 98,5 1 300 10 94,3 2 300 10 89,2 3 120 26 98,8 6 120 26 93,0 7 75 42 98,3 8 75 42 92,1

Voorbeeld VII

Het microorganisme DSM 1687 werd geinoculeerd op een Petrischaal, waarin het substraat TY agar was, beschreven in R.E. Goodman en D.M. Pederson, Canadian Journal of Microbiology, 22 (1976), 817-3 De Petri-schaal werd 2 dagen bij 50°C geïncubeerd. De bacteriën uit de Petri-schaal werden vervolgens gebruikt voor de bereiding van een onzuiver extract op de volgende wijze: 1 vol.dl van de bacteriën afgeschrapt van het oppervlak van het substraat werd gesuspendeerd in 1,3 vol.dln van een 0,1 molaire fosfaatbuffer bij een pH van 6,3 bij 10 4°C en de bacteriën werden sonisch vernietigd (frequentie 20 KHz, 4x1 minuut). De suspensie met vernietigde bacteriën werd gecentrifugeerd bij 16.000 x g gedurende 20 minuten bij 4°C in een centrifuge MSE 21, waarbij het aldus gevormde centrifuge-produkt het onzuivere extract was.

13 Boor middel van gekruisde tandem immunoelektroforese, zoals hiervoor toegelicht, werd vastgesteld, dat het β-galactosidase gevormd door middel van DSM I687 immunologisch indentiek was aan het β-galactosidase gevormd door middel van NRRL B-11, 229. Verwezen wordt naar fig. 2, waar de holte aan de linkerzijde overeenkomt met 20 NRRL B-11, 229 en de holte aan de rechterzijde overeenkomt met DSM 1687.

Soortgelijke experimenten werden uitgevoerd met DSM 1688 en DSM 1689. Door middel van gekruisde tandem immunoelektroforese, uitgevoerd zoals hiervoor beschreven, werd gevonden, dat de β-galacto-25 sidasen overeenkomen met DSM 1688 en DSM 1689 immunoligisch identiek zijn aan het β-galactosidase overeenkomend met NRRL B-11, 229.

80 0 0 0 33

Claims (6)

1. Microbieel enzym-produkt, dat een β-galactosidase bevat, dat met betrekking tot de chemische en immunologische eigen- van het enzym schappen/het β-galactosidase is of identiek is aan het β-galactosi-5 dase, dat wordt voortgebracht door kweking van het microorganisme NREL B-11, 229.

2. Microbieel enzymprodukt volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het produkt een microbieel enzym bevat, dat verschijnt als een bestanddeel van een microorganisme celprodukt, 10 welk microorganisme behoort tot de taxonomische groep voorgesteld door het type cultuur NEEL B—11, 229, waarvan de leden van de taxonomische groep in hoofdzaak de taxonomische eigenschappen van dit type cultuur hebben.

3. Microorganisme behorende tot de taxonomische groep voor- 15 gesteld door het type cultuur NREL B-11, 229, waarvan de leden van 2 0 de taxonomische groep in hoofdzaak de taxonomische eigenschappen hebben van dit type cultuur en het enzymprodukt volgens conclusie 1 bevatten. k. Werkwijze ter bereiding van een microbieel β-galactosi-20 dase-produkt volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men een microorganisme volgens conclusie 3 kweekt op een fermen-tatiemilieu met assimileerbare stikstof-, koolstof- en zuurstofbron-nen, waarna men de cellen wint en het intracellulaire β-galactosi-dase-produkt isoleert. 25 5» Microbieel β-galactosidase-produkt volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het produkt geïmmobiliseerd is.

6. Werkwijze voor de ladingsgewijze omzetting van een lactose bevattend fluidum, bij voorkeur wei, tot een siroop, die glucose en galactose en een ondergeschikte hoeveelheid lactose bevat, 30 met het kenmerk, dat men een oplosbaar microbieel β-galactosidase-produkt volgens conclusie 1 toevoert aan het lactose bevattende fluidum bij een pH tussen ongeveer 5,5 an 8,5 en bij een temperatuur tussen 55 en 75°C.

7. Werkwijze voor de continue omzetting van een lactose be-35 vattend fluidum, bij voorkeur wei, tot een siroop, die glucose en galactose en een ondergeschikte hoeveelheid lactose bevat, met het kenmerk, dat men het lactose bevattende fluidum toevoert aan een kolom gevuld met het geïmmobiliseerde microbiële β-galactosidase-produkt volgens conclusie 5 bij een pH tussen onge-ifO veer 5,5 en 8,5, bij een temperatuur tussen 55 en 75°C en bij een 80 0 0 0 33 % snelheid, die een stijging geeft tot een lactose-concentratie in de kolom-afvoer, die kleiner is dan 10 %, bij voorkeur kleiner dan 1 % van de lactose-concentratie in de toevoer. ********

8 Q 0 0 0 33