DK145965B - Fremgangsmaade og apparat til dybfrysning af flydende biologiske substanser - Google Patents

Description

i 145965

Opfindelsen vedrører en fremgangsmåde og et apparat til dybfrysning af flydende biologiske substanser, især blod, blodbestanddele eller cellesuspensioner, ved hvilken substanserne før nedkølingen 5 blandes med beskyttelsesadditiver til undgåelse af cellebeskadigelse af de biologiske substanser under dybfrysningen.

Konservering af biologiske substanser til forhindring af irreversible cellebeskadigelser udgør et 10 vanskeligt problem, navnlig ved konservering af blod.

Gennem nogen tid er blod foruden ved konventionelle opbevaringsmetoder også gjort holdbar ved dybfrysning og oplagring i flydende nitrogen, hvorved først en langtidskonservering er blevet muliggjort. En nødven-15 dig forudsætning ved dybfrysemetoden er at blande blodet med et beskyttelsesadditiv, da integriteten af de røde blodlegemers cellemembran ellers beskadiges, og cellerne kan blive hæmolyserede under dybfryseprocessen, når blodet føres gennem temperatur-20 området for indfrysning. Por at undgå udvaskning af beskyttelsesadditiverne fra blodet efter optøningen før en transfusion, som det hidtil har været nødvendigt på grund af beskyttelsesadditivernes uforenelighed med organismen, undersøges nu til dags sådanne be-25 skyttelsesadditiver som f.eks. HES (hydroxyethyl- stivelse), med hensyn til deres biologiske forenelighed.

Et af problemerne i forbindelse med forberedelsen af blodet til fryseprocessen består i at blande 30 blodet og beskyttelsesadditivet så fuldstændigt og hurtigt som muligt, da det har vist sig, at cellernes overlevelsesprocent bliver desto større, jo større tilførselshastigheden for beskyttelsesadditiverne i blodet er. Tilførselshastigheden står i relation 35 til indtrængnings- eller anlægshastigheden for beskyttelsesadditiverne i eller på cellemembranerne. Af væ- 2 1459$5 sentlig betydning; er det endvidere så vidt muligt for hver celle i suspensionen at opnå samme koncentrationsbetingelser for beskyttelsesadditiverne. Hidtidige fremgangsmåder, der frembringer blandingen af 5 blod og beskyttelsesadditiv ved hjælp af rystning, tillader forekomsten af inhomogeniteter i blandingen og bevirker derfor en højere beskadigelsesandel for de røde blodlegemer ved nedfrysningen.

Med opfindelsen tilsigtes der tilvejebragt en 10 fremgangsmåde til blanding af biologiske substanser og beskyttelsesadditiver med en tilsluttet emballering til dybfrysning af den fremkomne blanding, ved hvilken fremgangsmåde der opnås en forbedring af blandingsgraden med tilførsel af beskyttelsesadditivet med 15 meget stor hastighed og i så vidt mulig ensartet koncentration.

Dette opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen ved, at beskytteisesadditiverne forstøves, at de biologiske substanser inddryppes i forstøvnings-20 strålen, og at den således opnåede blanding fyldes på beholdere og dybfryses.

Opfindelsen beror på den erkendelse, at blandingshastigheden er proportional med mediernes kontaktoverflade ved blanding af to flydende medier.

25 Dette betyder, at en volumenenhed må opdeles i mange små delvolumener for at opnå den størst mulige overflade. Forstøves derfor beskyttelsesadditivet, før den biologiske substans indføres i dråbeform, har beskyttelsesadditivet en større kontaktoverflade, 30 hvortil kommer, at de enkelte dråber af beskyttelsesadditivet også i forhold til det ikke forstøvede volumen har en højere overfladeenergi. Disse dråber vil derfor bestræbe sig på at-forbinde sig med andre fluidumpartikler for at formindske deres overflade-35 energi. Endvidere kan forstøvningsstrålens kinetiske energi anvendes til blanding af de to medier.

145965 3

Beskytteisesadditivet kan fortrinsvis ved hjælp af en pumpe bringes op på et højt tryk på f.eks. 160 bar, og derefter forstøves fint i en dyse, hvorefter de biologiske substanser kan ind-5 dryppes midt i forstøvningsstrålen. Ved hjælp af pumpen opnås der nemlig en god doseringsmulighed for beskyttelsesadditivet, da der ved hver arbejdstakt af pumpen med ensartet arbejdshastighed stadig vil blive transporteret en nøje defineret mængde 10 beskyttelsesadditiv. Endvidere muliggør det med pumpen frembragte høje tryk også en forstøvning af mere seje fluider. Dette er vigtigt, da beskyttelsesadditivet må tilføres den biologiske substans så vidt mulig i høj koncentration for at undgå en 15 for høj volumenandel af beskyttelsesadditivet i forhold til den biologiske substans. Endvidere betinger en højere koncentration en lavere overfladespænding og dermed en bedre blandbarhed af medierne.

Beskyttelsesadditiverne kan ifølge endnu 20 en udføreisesform for opfindelsen forstøves ved hjælp af ultralyd, idet inddrypningen af de biologiske substanser sker i midten af forstøvningsstrålen. Med dette formål kan der i området for beskyttelsesadditivets tilgang være en lydsender, der med sin lyd-25 udstrålingsflade vender mod den tilførte strøm af beskyttelsesadditiv. Den store energitæthed af det af lydsenderen fremkaldte lydfelt bevirker en fin forstøvning af beskyttelsesadditivet.

En yderligere fordelagtig udførelsesform for 30 opfindelsen består i, at forstøvningen af beskyttelsesadditiverne gennemføres ved hjælp af en under tryk stående bæregas på en sådan måde, at allerede en gasstrøm med et relativt lavt gastryk på 0,5-1 bar også medriver sejtflydende fluider. En regulering af 35 den kinetiske energi af forstøvningsstrålen ved en gi- 4 145965 vet forstøvningsdyse er mulig på enkel måde ved hjælp af en tilgangsventil. En inddrypning af den biologiske substans i siden af forstøvningsstrålen giver da en god blanding af de to medier.

5 Som bæregas kan der fortrinsvis anvendes nitrogen, da denne gas hverken ændrer den kemiske sammensætning af beskyttelsesadditivet eller indvirker uheldigt på bestanddelene i den biologiske substans. Føres bæregassen endvidere før forstøv-10 ning gennem et filter, f.eks. et membranfilter, kan en inficering af den biologiske substans af kim i gassen undgås.

Apparatet til gennemførelse af fremgangsmåden er ejendommeligt ved en forrådsbeholder for beskyt-15 telsesadditiver, en forrådsbeholder for de biologi ske substanser og en forstøvningsenhed, hvilke to forrådsbeholdere gennem adskilte ledninger og reguleringsorganer står i forbindelse med forstøvningsenheden, og at der i ledningen fra forrådsbeholderen 20 for beskyttelsesadditiver til forstøvningsenheden i givet fald er en pumpe.

Såfremt der i ledningen fra forrådsbeholderen for beskyttelsesadditivet til forstøvningsenheden er en pumpe, kan der før forstøvningen fremkaldes 25 et højt tryk i beskyttelsesadditivet, der ved udnyttelse af dette tryk kan ledes til forstøvnings-enheden og forstøves i denne. I stedet for at anvende en pumpe kan de to forrådsbeholdere anbringes på et højere niveau end forstøvningsenheden, så at til-30 ledningen af beskyttelsesadditiv og de biologiske substanser til forstøvningsenheden kan ske automatisk. I begge tilfælde er forrådsbeholderne fortrinsvis udskiftelige, så at såvel beskyttelsesadditiverne som de biologiske substanser kan leveres 35 som sterile enheder. Endvidere kan det samlede apparat være anbragt i et sterilt lukket kammer, så at faren for inficering af de biologiske substanser 145965 5 herved undgås.

Til indføring af den biologiske substans i midten af forstøvningsstrålen har forstøvningsenheden fortrinsvis en dyse, i hvis hus der centralt er ind-5 skruet en forneden kegleformet indsats, der har en langs midteraksen forløbende, til forrådsbeholderen for de biologiske substanser sluttet ledning, og som har sådanne dimensioner, at der mellem den konisk tilspidsede side af dysens hus og den kegle-10 stubformede del af indsatsen er en ringspalte, der er forbundet med forrådsbeholderen for beskyttelsesadditiver gennem en sidekanal i huset.

Til gennemførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen under anvendelse af en bæregas har appa-15 ratet en forrådsbeholder for beskyttelsesadditiver, en forrådsbeholder for biologiske substanser, en forrådsbeholder for bæregas og en forstøvningsenhed, hvorhos forrådsbeholderne er forbundet med forstøvningsenheden gennem hver sin ledning.

20 I dette tilfælde omfatter forstøvningsenheden fortrinsvis en konisk tilspidset dyse med en tilslutningsstuds for bæregassen, i hvilken dyse der centralt, kort før den mindste diameter i dysen ender et rør med tilslutning til forrådsbeholderen for 25 beskyttelsesadditiver, hvorhos der på siden af dysen er en tilledning for de biologiske substanser, hvilken ledning fører til siden af forstøvningsstrålen.

Ifølge en foretrukket udførelsesform for opfindelsen er der i ledningen fra forrådsbeholderen 30 for bæregassen til forstøvningsenheden et trykmåle-organ og et filter. Trykmåleorganet muliggør indstilling af en bestemt ønsket hastigheds- og gennemstrømningsværdi for bæregassen i forstøvningsenheden, så at der kan sikres en høj, ensartet strømningshas-35 tighed for bæregassen.

Ved en yderligere udførelsesform for apparatet 6 165965 kan der være klembøjler til fastgørelse af foroven åbne plastposer, så at disse hænger sækagtigt ned fra forstøvningsenheden og kan optage blodblandingen.

Efter fyldeoperationen tilsvejses plastposen og til-5 føres en dybfryseindretning.

Opfindelsen forklares nærmere i det følgende under henvisning til tegningen, hvor fig. 1 viser et apparat til blanding af biologiske substanser og beskyttelsesadditiver 10 ved hjælp af en pumpe, fig. 2 en forstøvningsenhed for et beskyttelsesadditiv, der har fået et højt tryk ved hjælp af en pumpe, fig. 3 et apparat til blanding af biologiske 15 substanser og beskyttelsesadditiver ved hjælp af en bæregas, og fig. 4' en tilsvarende forstøvningsenhed for beskyttelsesadditivet.

I fig. 1 er der vist en forstøvningsenhed 4 20 til blanding af biologiske substanser med beskyttelsesadditiver i et ikke vist sterilt, lukket rum, hvilken forstøvningsenhed gennem adskilte ledninger er forbundet med en forrådsbeholder 1 for beskyttelsesadditiver og en forrådsbeholder 2 for bio-25 logiske substanser. Begge forrådsbeholdere 1 og 2 er udskiftelige og kan leveres som sterile enheder.

I ledningen fra forrådsbeholderen 1 for beskyttelsesadditivet til forstøvningsenheden 4 er der en pumpe 5 til fremkaldelse af et højt tryk i beskyt-30 telsesadditivet, idet der med pumpen 5 kan transporteres en nøjagtig defineret mængde af beskyttelsesadditiv til forstøvningsenheden 4.

I fig. 2 er der vist en til dette apparat passende forstøvningsenhed, som har en dyse 6, i hvis 35 hus der er indskruet en indsats 7, der er keglestub- 145965 7 formet i sin nederste ende. Langs midteraksen af indsatsen 7 forløber der en ledning 8, der er tilsluttet forrådsbeholderen for den biologiske substans, hvilken ledning ender i den fra dysen 6 5 fremtrædende forstøvningsstråle. Indsatsen 7 har sådanne dimensioner, at der mellem dens keglestub-formede del og væggen i dysen opstår en ringspalte 9, og at den ender lige før den mindste diameter af dysen. Gennem en sidekanal 10 i huset er ring-10 spalten 9 forbundet med forrådsbeholderen for beskyttelsesadditiver.

Blandingsindretningen ifølge fig. 3 har til forskel fra blandingsindretningen ifølge fig. 1 yderligere en til forstøvningsenheden 11 sluttet 15 gasflaske 3 for en bæregas, idet en pumpe for beskyttelsesadditivet herved kan undværes. I ledningen fra gasflasken 3 til forstøvningsenheden 11 er der et filter 17, der hindrer inficering af den biologiske substans af kim i bæregassen. Gennem ikke 20 viste reguleringsorganer kan tilførslen af den biologiske substans og beskyttelsesadditiverne i forstøvningsenheden 11 reguleres, idet man ved aflæsning af trykket i ledningen fra gasflasken 3 til forstøvningsenheden 11 ved hjælp af en tryk-25 måler 16 kan bestemme strømningshastigheden for bæregassen i forstøvningsenheden 11. Indstilles der bestemte værdier på reguleringsorganerne og på trykmåleren, opnås der en hurtig og ensartet blanding af de to medier.

30 I fig. 4 er der vist en til dette apparat svarende forstøvningsenhed, der i hovedsagen består af en konisk tilspidset dyse 12 med et centralt anbragt, ved enden ligeledes konisk tilspidset rør 14, der ender kort før den mindste diameter 35 af dysen 12. I dysen 12 indføres bæregassen gennem 145965 8 en tilslutningsstuds 13, medens røret 14 er forbundet med beholderen for beskyttelsesadditivet. En tilførselsledning 15, der fører til siden af den fra dysen fremtrædende forstøvningsstråle muliggør ind-5 drypning af biologiske substanser i forstøvningsstrålen.

Som beskyttelsesadditiver, der kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kommer f.eks. følgende stoffer på tale: vandige opløsninger af 10 hydroxyethylstivelse, højmolekylært dextran, gelatine, glycerol og polyvinylpyrrolidon.

Taleksempler.

Kendt teknik.

Ved en kendt teknik, der er beskrevet i en ar-15 tikel af H. W. Krijnen et al. i Cryobiology 5, nr. 2, 1968, centrifugeres 500-600 ml blod, hvorefter det overliggende plasma fjernes, og der sker oplagring ved -30°C. Plasmaet erstattes af et kølebeskyttelsesmiddel, der består af 380 g glycerol, 29 g sorbitol 20 og 6,3 g NaCl pr. liter vand. En aluminiumbeholder med en højde på 250 mm og en diameter på 59 mm fyldes med denne erythrocytsuspension, der er beriget med glycerol. Dybfrysningen sker ved neddykning i flydende nitrogen med en temperatur på -196°C i 10 25 minutter. Optøningen sker i et vandbad på 40°C under samtidig omrystning med en frekvens på 1 s-1 i 10 minutter. Vaskning sker med en vaskeopløsning, der i første trin pr. liter vand indeholder 175 g sorbitol og 8 g Nacl. I to yderligere trin vaskes der 30 med fysiologisk kogesaltopløsning. Ved denne kendte fremgangsmåde opnås der i gennemsnit 92% overlevende, røde blodlegemer.

9 U59S5

Fremgangsmåde ifølge opfindelsen.

Til dybfrysning af normalt menneskeblod blev der anvendt en 87% vandig glycerolopløsning med 2 en viskositet på 145 cP, svarende til 0,145 Ns/m .

5 Den maksimale tilførselshastighed for beskyttelsesmidlet androg 216 cm^/s,som ved en dysediameter på 0,07 cm svarer til en volumenstrøm på 0,83 cm /s.

Denne tilførselshastighed blev enten opnået ved hjælp af en i tilledningen fra forrådsbeholderen for 10 beskyttelsesadditiv til forstøvningsenheden anbragt pumpe eller ved anvendelse af en bæregas. Bæregassens tryk blev indstillet på mellem 0,5 og 1 ato (ca. 1 bar), idet bæregassen til opnåelse af kimfrihed blev ført gennem et membranfilter.

15 Partikelstørrelsen i den forstøvede stråle efter forstøvningsenheden androg i begge tilfælde mindre end 0,1 mm, og forstøvningsstrålens spidsvinkel ved afgangen fra forstøvningsenheden var ca.

60°. I forstøvningsstrålen blev der inddryppet men-20 neskeblod med en dråbestørrelse på stort set 2 mm. Koncentrationen af beskyttelsesadditivet i det samlede materiale androg under de forannævnte betingelser 15%.

Derefter blev den opnåede blanding af beskyt-25 telsesadditiv og menneskeblod dybfrosset med en frysehastighed på 595°C/min. Indfrysningstiden fra 0°C til -196°C androg 2 min. Den sluttelige temperatur blev holdt på -196°C.

Under disse betingelser kunne andelen af over-30 levende, røde blodlegemer holdes på mindst 98%.

Claims (9)

145965

1. Fremgangsmåde til dybfrysning af flydende biologiske substanser, især blod, blodbestanddele eller cellesuspensioner, ved hvilken substanserne 5 før nedkøling blandes med beskyttelsesadditiver til undgåelse af cellebeskadigelse af de biologiske substanser under dybfrysningen, kendetegnet ved, at beskyttelsesadditiverne forstøves, at de biologiske substanser inddryppes i forstøv- 10 ningsstrålen, og at den således opnåede blanding påfyldes beholdere og. dybfryses.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at beskyttelsesadditiverne ved hjælp af en pumpe bringes op på et højt tryk og 15 derefter forstøves fint i en dyse, og at inddryp-ningen af de biologiske substanser sker i midten af forstøvningsstrålen.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, k e n de-tegnet ved, at beskyttelsesadditiverne for- 20 støves ved hjælp af ultralyd, og at inddrypningen af de biologiske substanser sker i midten af forstøvningsstrålen.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at forstøvningen af beskyttelses- 25 additiverne gennemføres ved hjælp af en under tryk stående bæregas i en forstøvningsenhed.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at der som bæregas anvendes nitrogen, der før anvendelse ledes gennem et filter.

6. Apparat til gennemførelse af fremgangsmåden ifølge ethvert af kravene 1-3, kendetegnet ved en forrådsbeholder (1) for beskyttelsesadditiver, en forrådsbeholder (2) for de biologiske substanser og en forstøvningsenhed (4), hvilke to forrådsbehol- 145965 dere (1, 2) gennem adskilte ledninger og reguleringsorganer står i forbindelse med forstøvningsenheden (4), og at der i ledningen fra forrådsbeholderen (1) for beskyttelsesadditiver til forstøvningsen-5 heden (4) i givet fald er en pumpe (5).

7. Apparat ifølge krav 6, kendetegnet ved, at forstøvningsenheden (4) har en dyse (6), i hvis hus der centralt er indskruet en forneden keglestubformet indsats (7), der har en 10 langs midteraksen forløbende, til forrådsbeholderen (2) for de biologiske substanser sluttet ledning (8), og som har sådanne dimensioner, at der mellem den konisk tilspidsede side af dysens (6) hus og den keglestubformede del af indsatsen (7) er en ringspal-15 te (9), der er forbundet med forrådsbeholderen (1) for beskyttelsesadditiver gennem en sidekanal (10) i huset.

8. Apparat til gennemførelse af fremgangsmåden ifølge krav 4 eller 5, kendetegnet ved 20 en forrådsbeholder (1) for beskyttelsesadditiver, en forrådsbeholder (2) for biologiske substanser, en forrådsbeholder (3) for bæregas og en forstøvningsenhed (11), og at forrådsbeholderne (1, 2, 3) er forbundet med forstøvningsenheden (11) gennem hver 25 sin ledning.

9. Apparat ifølge krav 8, kendetegnet ved, at forstøvningsenheden (11) omfatter en konisk tilspidset dyse (12) med en tilslutningsstuds (13) for bæregassen, i hvilken dyse der centralt, 30 kort før den mindste diameter i dysen ender et rør (14) med tilslutning til forrådsbeholderen (1) for