DE2905254C2 - Verfahren zum Zumischen von Zufuhrmedien zu Zellsuspensionen sowie Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Zumischen von Zufuhrmedien zu Zellsuspensionen, nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1 sowie eine Vorrichtung zur ^b0 Durchführung des Verfahrens, nach dem Oberbegriff des Anspruchs 6.

Für die Gefrierkonservierung biologischen Materials, Insbesondere lebender Zellen, ist die Verwendung von Gefrierschutzmitteln üblich, mit deren Hilfe die Zahl ^h5 lebender Zellen nach Wiederauliauen erhöht wird. Für einige Zellarten ist eine schonende Verdünnung des Schutzmittels mich erfolgtem Frier-Tauprozeß durch entsprechende Zusatzlösungen (Nährmedien) als Revitallsierungsmethode eingeführt.

Bei der Zumischung derartiger Gefrierschutzmittel müssen folgende Phänomene berücksichtigt werden:

Ein Teil der Schutzadditive wie beispielsweise DMSO oder Glyzerin ist osmotisch aktiv und in der applizierten Form relativ dünnflüssig, wobei die Viskosität etwa bei 0,01 Pas liegt.

Der andere Teil der Schutzadditive wie beispielsweise Dextran oder Hydroxyäthylstärke ist osmotisch inaktiv und in der benutzten Konzentration sehr zähflüssig, wobei die Viskosität etwa bis 0,4 Pas reicht.

Die Zellen sind nach dem Auftauen besonders empfindlich hinsichtlich mechanischer Beanspruchung und insbesondere hinsichtlich osmotischen Ungleichgewichtes.

Die osmotisch aktiven Additive, die aufgrund ihres Einbringens in die Zellen als intrazelluläre Schutzmittel bezeichnet werden, können eine Hämolyse erzeugen, wenn sie sehr konzentriert sind bzw. die Expositionsdauer Zelle-Additiv zu lang ist, was durch entsprechende Untersuchungen belegt ist. Es ist deshalb eine möglichst kurze Zumischzeit zu fordern. Einzelne Zellen werden immer dann mit unverdünntem, reinem Schutzadditiv In Kontakt kommen, wenn der Zufluß des Additivs einsetzt. Die schädliche Wirkung örtlicher hoher AdditivkonzentH.tion stellt sich auch dann ein, wenn die Konzentration insgesamt gering ist, d. h. bezogen auf die gesamte Menge der Zellsuspension nach der Additivzuführ.

Diese Zusammenhänge gelten auch sinngemäß für das Problem der Entfernung der Schutzmittel aus den Zellen, nachdem die Zellsuspension aufgetaut wurde.

Die zweite Gruppe der Schutzadditive, die nicht in die Zelle eindringen können und deshalb als extrazelluläre Schutzmittel bezeichnet werden, kann nur zur vollen Wirkung gebracht werden, wenn möglichst alle Zellen damit kontaktiert werden. Das erfordert aber bei dem sehr hohen Zähigkeitsunterschied zwischen Schutzaddltlv und Zeilsuspension (bis lOOfach) besondere Maßnahmen zum Intensiven Vermischen. Diese Forderung ergibt sich auch gerade aus dem für diese Schutzadditivgruppe geförderten höchstmöglichen Anteil überlebender Zellen, da an eine Verwendung solcher Art präparierter Zellen im Einschritt-System gedacht ist.

Alle Zellen, die mit osmotisch aktiven Schutzadditiven präpariert werden, müssen wieder von diesen Medien befreit werden. Beispielswelse bei Erythrozyten erfolgt dies In einem mehrstufigen Zentrifugalwaschprozeß, den die Zellen zum überwiegenden Teil gut überstehen, wobei dieser Prozeß In Blutbanken mit automatisierter Technik durchgeführt wird.

Bei einem bekannten Verfahren zur Zufuhr der Schutzmittel vor dem Frieren wird in möglichst kurzer Zelt das Schutzmittel durch entsprechende Schlauchleitungen, z. B. durch ein Transfusionsbesteck, eingeleitet. Das Transfusionsbesteck besteht hierbei im wesentlichen aus einer Schlauchleitung mit Abklemmvorrichtung und Kanülen oder Einstichdornen an den Enden.

Bei einem bekannten Verfahren zum Entfernen der Additive von echten Zellen mit Kern, wie sie z. B. in Leukozyten vorliegen, wird das Additiv sehr schonend mittels eines mehrstufigen Verdünnungsprozesses abgetrennt, wozu beispielsweise 1/50 der Ausgangsmenge zugeführt wird, dann nach etwa 7 Minuten 1/25 usw.. bis eine mehrlache Verdünnung der ursprünglichen Suspension erreicht Ist. Dann wäscht man. wie bei Erythrozyten, das Schutzmittel weiter aus. Hierbei besteht jedoch der

Nachteil, daß die beschriebene stufenweise Verdünnung langwierig, bei Leukozyten beispielsweise 1 Stund« Dauer, und die Sicherheit hinsichtlich der Sterilität unbefriedigend ist, da im offenen System auf einer Sterilbank mit Pipetten etc. gearbeitet wird.

Außerdem ist die zuvor beschriebene schonende Methode nicht für Erythrozyten geeignet, weil es sich hierbei stets um Makrosysteme mit mindestens 250 ml Inhalt handelt, die mit der beschriebenen Methode nur sehr umständlich zu behandeln sind. in

Aus diesen Gründen ist eine Verbesserung der Vor- und Nachbehandlungsmethodik indiziert, um

1. eine Verbesserung der Lebensfähigkeit von Erythrozyten, die im Einschritt-Verfahren konserviert werden, zu erreichen;

2. eine schonendere vor das eigentliche Auswaschen gestellte Entfernung von intrazellulären Schutzmitteln als bisher bei Erythrozyten zu erhalten;

3. die Revitalisierung von Leukozyten nach dem Auf- ,₍₎ tauen (auf Entfernung des Schutzadditivs) hinsichtlich der Sterilität sicherer und weniger personalintensiv zu gestalten;

4. die Revitalisierung von Zellsuspensionen in größeren, therapeutisch wirksamen Mengen (z. B. 10 ZeI-len in 100 ml) ohne Aufteilung in viele Miniaturproben zu ermöglichen.

Das aus der DE-OS 25 57 871 bekannte gattungsgemäße Verfahren und die ebenfals aus dieser Druckschrift bekannte gattungsgemäße Vorrichtung, Ausführungs- J'¹ form gemäß dortiger Fig. 3, versucht, wenigstens die unter Punkt 1 genannte Verbesserungsmöglichkeit zu realisieren. Hierzu wird bei dem gattungsgemäßen Verfahren zum Zumischen von Zufuhrmedien zu Zellsuspensionen das Zufuhrmedium zu einem Flüssigkeitsne- « bei zerstäubt, in den die Zellsuspension eingetropft wird. Die so erhaltene Mischung aus Zellsuspension und Zufuhrmedium wird in Behälter abgefüllt und kann danach tiefgefroren werden.

Die gattungsgemäße Vorrichtung zum Durchführen des Verfahrens weist dementsprechend einen Behälter für das Zufuhrmedium, einen Bebälter für die Zellsuspension und einen die Mischung von Zufuhrmedium und Zellsuspension aufnehmenden Mischbehälter auf. Weiterhin ist eine Verdüsungseinheit vorgesehen, die an einen Inertgasspeicher angeschlossen ist, wobei das aus diesem Speicher entnommene Inertgas zur Zerstäubung des Zufuhrmediums benutzt wird.

Da jedoch beim gatiungsgemäßen Verfahren und der gattungsgemäßen Vorrichtung das Zerstäuben des Zufuhrmediums unter hohem Druck erfolgt und außerdem die Zellsuspension in die Mitte des Zerstäubungsstrahles eingetropft, d. h. in Tropfenform eingeleitet wird, ergeben sich eine Reihe von Nachteilen. Zunächst wird durch das Eintropfen der Zellsuspension in den ^⁵ Strahl des unter hohem Druck zerstäubten Schutzadditives eine hohe kinetische Belastung und damit eine unmittelbare Schädigung des Zellmaterials bewirkt. Weiterhin hat die Expansionsarbeit des unter hohem Druck stehenden Zuluhrmediums eine schädigende Konvektion ^b0 zur Folge. Des weiteren lsi die Mischzeit für die einzelnen Zellen sehr kurz, da die Mischung der Zellsuspension mit dem Zufuhrmedium stets Troplen tür Tropfen crlolgt. was einen hohen Konzentrationssprung in jedem Troplen zur Folge hat. Ein weiterer Nachteil besteht "'' darin, daß die sehr hohe Zuführgeschwindigkeit eine tür den osmoiischen Ausgleich zu kurze Equilibrierungszeit und damit eine erhebliche Schädigung osmoUscher Natur zur Folge hat, wobei unter osmotischem Ausgleich das Eindringen des Zufuhrmediums in die Zellen zu verstehen ist. Ein weiterer Nachteil 1st darin zu sehen, daß die notwendige Sterilität nicht gewährleistet und das Verfahren für die Anwendung am Menschen nicht geeignet ist, da das Zerstäuben in einen zunächst oben offenen Beutel erfolgt. Schließlich ist die Verdüsungseinheit nicht auswechselbar, so daß bei weiterer Verwendung eine Kontaktierung mit einer anderen Zellsuspension nicht sicher auszuschließen ist.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung ein Verfahren der im Oberbegriff des Anspruchs 1 umrissenen Gattung sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens, nach dem Oberbegriff des Anspruchs 6, zu schaffen, mit denen es möglich ist, ein Zufuhrmedium einer Zeflsuspension ohne Schädigung der in dieser enthaltenen Zellen zuzumischen, wobei unter Berücksichtigung der erforderlichen Sterilität eine schonende, jedoch gleichmäßige und intensive Vermischung von Zufuhrmedium und Zellsuspension erreichbar ist.

Diese Aufgabe wird durch die kennzeichnenden Merkmale des Anspruchs 1 bzw. des Anspruchs 6 gelöst.

Dadurch, daß die Zellsuspension beim Zumischen des Zufuhrmediums bereits in dem Behälter vorliegt, in dem der Mischprozeß abläuft, wird durch den Zerstäubungsstrahl keine zerstörende kinetische Energie unmittelbar auf die Zellen aufgebracht. Vielmehr erfolgt die Kontaktierung mit der zusammenhängenden flüssigen Oberfläche der Zellsuspension.

Weiterhin wird durch die Vergrößerung der spezifischen Oberfläche erreicht, daß sich die Stoffaustauschvorgänge, wie sie im vorliegenden Fall durch das Vermischungsproblem zweier Flüssigkeiten vorliegen, erheblich beschleunigen lassen. Die Geschwindigkeit der Auflösung von Tropfen, die auf die Zellsuspensionsoberlläche aufgebracht werden. Ist dann dem Quadrat der Teilchenabmessung umgekehrt proportional, wenn der Tropfendurchmesser etwa 0,1 bis 0,01 mm beträgt. Für dieses Maß liegt nämlich der Teilchendurchmesser in der Größenordnung der Dicke der laminaren Unterschicht, in der ein Stofftransport nur durch Diffusion erfolgen kann. Für die absolute Geschwindigkeit der Tropfenauflösung durch Diffusion ist der Diffusionskoeffizient des Tropfenmediums maßgebend, wenn der Vorgang nicht durch den Übergangswiderstand Medium-Suspensionslösung bestimmt wird. Wird der Austauschvorgang durch den Übergangswiderstand bestimmt, sind die Stoffkonstanten der Suspensionslösung maßgebend.

Zusammenfassend folgt hieraus, daß die Mischung durch Zerstäubung besonders intensiv ist, wenn der Tropfendurchmesser bei 0,1 mm liegt. Bei Einhaltung dieser Forderung ist diese Mischform bezüglich der Geschwindigkeit des Stoffaustausches unübertroffen. Es stellt sich der gewünschte Effekt ein, daß örtliche Konzentrationsgradienten einmal durch die räumlich verteilte Form der zuzumlschenden Substanz, und zum anderen durch die kurze Mischzeit zwischen Tropfen und Suspension vermieden werden. Damit die mit Lösung angereicherte Oberflächenzone mit tieferliegenden Flüssigkeitsschichten gemischt wird, wird eine zusätzliche Makrokonvektion durch Umwälzen der Suspension erzeugt.

Weiterhin ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren eine schonendere Revitalisierung der Zellen in großen Mengen wie sie für therapeutische Zwecke benötigt werden. Außerdem wird die Vitalität der gelrierkonservierten Zellen durch die Emiöglichung einer allmählichen Verdünnung der Zufuhrmedien ohne osmotischen Schock verbessert, wobei die Sterilitätssicherheit ebenso

groß Ist wie bei üblichen Verfahren der Blutbanken und der Transfuslonsmedizln, da Im geschlossenen System gearbeitet wird.

Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß das Verfahren und die Vorrichtung an vorhandene Ausrüstungen wie Transferbestecke, Beute! und Zentrifugen angepaßt ist, wobei auch eine Einsparung von Kosten durch den Wegfall zusätzlicher Behälter und zusätzlicher Transfuslonsbestecke erzielt werden kann, da die Zeilsuspension für die Dauer der Revitallsierung im Mischbehälter bleiben kann.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Mischprinzip mit einer Oberflächenvergrößerung des Zufuhrmediums Im Mittel um den Faktor 1000 verwendet, wobei bevorzugte Werte für die Tropfengröße des Zufuhrmediums zwischen 0,01 und 0,1 mm (Mittelung nach Sauter) liegen. Die Auftreffgeschwindigkeit der Tropfen liegt im Bereich von 4 bis 11 m/s, während die Viskosität des zuzuführenden Mediums im Bereich von 1 bis 5 cP bei 25° C (Nährlösung für gefrlerkonservierte Zellen) bzw. bei 460 cP bei 25° C (HES, Hydroxyäthylstärke), 1,542 cP bei 25° C (20% Glyzerin), 5,041 cP bei 25° C (50% Glyzerin), 2,14 cP bei 25° C (20% DMSO, Dlmethyl-Sulfoxid), (Gefrierschutzadditive als Zufuhrlösung für Zellen, die gefrierkonserviert werden sollen) liegt.

Zur gleichzeitigen Umwälzung der Zellsuspenslon während des Aufsprühens des Zufuhrmediums wird der Inhalt des Mischbehälters mit einer Frequenz von 0,5 bis 3 Hz hin- und hergeschwenkt.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die Erfolgschance für Therapien durch die größere Zellenausbeute nach dem Gefrierkonservierungsprozeß erhöht werden kann. Die Zeltdauer der Sammlung der Zellen mit der ZeI!zentrifuge zum Gewinn der Mindestzellzahl für eine Regeneration der blutbildenden Systeme kann herabgesetzt werden. Andererseits wird dadurch die natürlich vorhandene Restzellzahl im Organismus größer belassen; dadurch sind die Therapiechancen wesentlich zu verbessern. In Fällen einer Teilremission der Blutzellen zum Abnahmezeitpunkt liegt die gesammelte Zellzahl oft nur knapp über der erforderlichen Mindestmenge. Die Therapie hat in solchen Fällen nur dann Aussicht auf längerfristigen Erfolg, wenn ein hoher Prozentsatz lebender 21ellen (> 85%) nach dem Gefrierkonservieren erhalten werden kann.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in der Verbesserung der Zumischung auch schwer mischbarer Gefrierschutzadditive zu Blutzellen zu sehen. Dies trifft insbesondere auf Hydroxyäthylstärke (HES) zu, bei der bei Verwendung anderer Verfahren sonst eine schlechte Vermischung bei Erythrozyten zu beobachten 1st, wenn nicht besondere zusätzliche Maßnahmen getroffen werden. Es muß jedoch jede Möglichkeit genutzt werden, die Recovery der Erythrozyten möglichst hoch zu halten, damit Kryokonserven von Erythrozyten mit HES z. B. für Katastrophenfälle etc. bereitgestellt werden können.

Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß eine erheblich schnellere und ohne osmotischen Schock erfolgende Zufuhr von bei zu langer Einwirkzeit hämolysierend oder toxisch wirkenden Schutzadditiven (z. B. Glyzerin oder DMSO) erreicht werden kann. Damit wird die Schädigung der Zellen vor dem eigentlichen Frier-Tau-Zykius verringert; der Vorteil ist neben der geringen Zahl morphologisch defekter Zellen In der verminderten osmotischen Belastung nach Betrag und Dauer zu sehen, die die Ausgangssituation der einzufrierenden Zellen verbessert.

Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß ein schonender, ohne Verdünnungsschock arbeitender erster Waschschritt für Auswaschprogramme von kryokonservlerten Erythrozyten möglich Ist. Verluste, wie sie beispielsweise bei bekannten Aufbereitungsverfahren für die Transfusion von Erythrozyten auftreten, können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren reduziert werden.

Ein Ausführungsbeispiel der Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird nachfolgend anhand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigt

Flg. 1 eine schematisch vereinfachte Darstellung einer Ausführungsform der Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens für das Zumischen von Zufuhrmedien zu Zellsuspensionen, und

!5 Flg. 2 eine der Fig. 1 entsprechende vergrößerte Darstellung einer Verdüsungseinhelt der Vorrichtung gemäß Fig. 1.

Gemäß Fig. 1 wird das zuzumischende Zufuhrmedium (1) aus einem Behälter für das Zufuhrmedium über eine Doslerpumpe (2) ζ. B. in einer Wlrbedüse (5) mit Hilfe eines sterilen Inertgases (4) (z. B. Stickstoff) zerstäubt. Die Düse (5), die In Fig. 2 vergrößert dargestellt Ist, wird wie ein Anschlußdorn in ein entsprechendes Gegenstück (6) eines Plastikbeutels (7) eingeführt und dichtet die Aufnahmestelle ohne weitere Hilfsmittel ab. Ein Entlüftungsstutzen (8) des Plastikbeutels (7) wird geöffnet, und der Gasausstrom in diesem Entlüftungsstutzen (8) wird so eingestellt, daß etwa 3000 Pascal Überdruck Im Beutelinnern gegenüber dem Umgebungsdruck vorliegt. Dadurch wird der Plastikbeutel (7) aufgebläht und die In diesem enthaltene Zellsuspenslon (9) bietet einem herabfallenden Zufuhrmediumnebel (10) eine große Oberfläche.
Die Entfernung Düsenende - Oberfläche der Zellsuspension (9) wird so eingestellt, daß gerade noch keine »Eindellung« des Flüssigkeitsspiegels durch den austretenden Gasstrom erfolgt, um eine mechanische Belastung der Zellen zu vermeiden. Die Auftreffgeschwindigkeit der Tropfen auf die Suspensionsoberfläche liegt dann in der Größenordnung der freien Fallgeschwindigkeit gegenüber der sehr viel höheren Austrittsgeschwindigkeit aus der Düse (5).

Die weitere Durchmischung des mit Nährlösung angereicherten Obertlächenfilms mit dem übrigen Probevolumen erfolgt durch Hin- und Herschwenken des Plastikbeutels (7) mittels einer Schwenkeinrichtung (11) mit einer Frequenz von etwa 0,3 Hz, um die Zellensuspension (9) kontinuierlich umzuwälzen. Das Aufsprühen des Zufuhrmediums (1) und die Umwälzung erfolgen gleichzeitig.

Zur Erfüllung der Förderung nach Sterilität ist eine möglichst einfache Methode der Keimfreimachung der Zerstäuber wichtig. So kann z.B. ein Glassystem mit Gummiabdichtungen und Gummistopfen verwendet

werden. Dieses ist autoklavlerbar und wird so wie alle Gebrauchsgeräte des Labors, wie Pipetten, Gläser etc. sterilisiert.

Die Zellen bleiben während des Prozesses in einem standardisierten Transfer-, Transfusions- oder Frierbeutel. Damit wird die gleiche Sicherheit im praktisch geschlossenen System erreicht wie bei der Verwendung üblicher Blutkonserven. Da die Anschlußteüe des Systems vorteilhafterweise mit den üblichen Transferoder Transfusionsbestecken kompatibel sind, ergibt sich

eine weitere zusätzliche Sicherheit für die vereinfachte Handhabung.

Für weiße Zellen ist es von Bedeutung, die Möglichkeit zur Thermostatisierung vorzusehen. Diese Zellen

werden nur knapp oberhalb des Gefrierpunktes der Lösung nachbehandelt, da bei dieser Temperatur die Membraneigenschaften für den Prozeß der Schutzadditiventfernung besonders günstig zu sein scheinen. Die Vorrichtung gestattet die Thermostatisierung entweder mit einer Kryostat-Thermostatkomblnation mit Wasserbad und Umwälzpumpe oder aber die Temperaturkonstanthaltung z. B. durch ein Eiswürfelbad.

Die Dosierung hochzäher Medien muß durch die Pumpe (2) vorgenommen werden, falls eine hohe Zufuhrgeschwindigkeit gefordert ist. Hierzu können übliche Rollerpumpen (Perlstaltikpumpen) verwendet werden. Diese kommen nicht in Kontakt zum Zufuhrmedium (1), und die für diese Pumpen verwendeten Schlauchleitungen sind ebenfalls mit dem Zerstäubungsmischer kompatibel.

Für niedrigviskose Zufuhrmedien (1) mit wasser- oder blutähnlicher Viskosität genügt die Verwendung einer Infusionsflasche in Verbindung mit einem Transfusionsbesteck. Diese werden wie eine Tropfeninfusion an die Düse (5) angeschlossen. Besonders vorteilhaft ist eine gute Dosierungsmöglichkell über die Tropfenzählung pro Zelt Im Bereich kleinster Durchflüsse, wie beispielsweise Im Bereich zwischen 0 und 10 ml pro Minute. Dieser Bereich 1st besonders für die Nachbehandlung weißer Zellen wichtig. Mit der Methode der Verwendung der Tropfeninfusionstechnik lassen sich Durchflüsse von etwa 0 bis 24 ml pro Minute reproduzierbar einstellen.

Im Rahmen eines Krebstherapieprogrammes mit autologer Zellretransfusion konnten bereits Erfahrungen mit der beschriebenen Vorrichtung gesammelt werden, mit

ίο der bisher 10 Einzelpersonen mi« im Durchschnitt 3 χ ΙΟ⁹ lymphoiden Zellen in knapp 100 ml Lösung, die mit einer Zentrifuge aus dem perlpheren Blutkreislauf von Patienten gewonnen wurden, nach dem Frler-Tau-Zyklus revltallsiert wurden. Die Zellen wurden anschließend mittels eines Zentrifugalwaschprozesses zweimal gewaschen und retransfundiert. Es traten keine Sterilitätsprobleme auf und die erstmalig im Makrosystem gefrierkonservierten Humanzellen wiesen befriedigende Vitalitätsmerkmale auf.

Zur weiteren Erläuterung werden nachstehend Beispiele von In der Praxis erprobten Zerstäubungsmischungen für verschiedene Zellsuspensionen angegeben:

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (9)

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Zumischen von Zufuhrmedien zu Zellsuspensionen, bei welchem das Zufuhrmedium zu einem Flüssigkeitsnebel zerstäubt wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellsuspension in einen Behälter eingefüllt wird und anschließend das Zufuhrmedium mittels eines Inertgasstromes im Behälter zerstäubt und auf die Oberfläche der Zellsuspension aufgesprüht wird, wobei die Zellsuspension während des Aufsprühens des Zufuhrmediums gleichzeitig umgewälzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Behälter einen Beutel einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Beutel im Zuge des Zerstäubcns mittels des Inertgasstromes autbläht.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Au/treffgeschwindigkeit der Tropfen auf die Zellsuspensionsoberfläche durch Einstellung des Düsenabstandes zur Zellsuspenslonsoberlläche in der Größenordnung der freien Fallgeschwindigkeit gehalten wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der mittlere Tropfendurchmessser des zerstäubten Zufuhrmediums 0,1 bis 0,01 mm beträgt.

6. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, mit einem Behälter für das Zufuhrmedium und einem Behälter für die Zellsuspension, mit einem die Mischung von Zufuhrmedium und Zellsuspension aufnehmenden Mischbehälter und mit einer Verdüsungseinhelt, an die ein Inertgasspeicher angeschlossen Ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Mischungsbehälter (7) gleichzeitig den Behälter für die ungemischte Zellsuspension (9) bildet,

daß das Düsenende der VerdOsungselnhelt (5) direkt bei Bildung einer sterilen Verbindung in dem Mischungsbehälter (7) angeordnet ist, und daß eine Schwenkvorrichtung (11) zum Hin- und Herschwenken des Mischungsbehälters (7) vorgesehen ist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß in die Verbindung zwischen dem Behälter für das Zufuhrmedium (1) und der Verdüsungseinheil (5) eine Pumpe (2) eingeschaltet Ist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine Temperiervorrichtung für die Im Mischungsbehälter (7) enthaltene Zellsuspension vorgesehen 1st.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Anschlußteile der Vorrichtung mit Transfer- oder Transfusionsbestecken kompatibel sind.

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