DK145543B - Fremgangsmaade til fremstilling af hydrolyserbareestere af clavulansyre - Google Patents
Fremgangsmaade til fremstilling af hydrolyserbareestere af clavulansyre Download PDFInfo
- Publication number
- DK145543B DK145543B DK287078A DK287078A DK145543B DK 145543 B DK145543 B DK 145543B DK 287078 A DK287078 A DK 287078A DK 287078 A DK287078 A DK 287078A DK 145543 B DK145543 B DK 145543B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- clavulanic acid
- ester
- solution
- ethyl acetate
- water
- Prior art date
Links
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
1 U5543
Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte hydrolyserbare estere af clavulansyre med den almene formel
CH«OH
j,__N^y 0 ^
COOR
hvor R betegner en sådan gruppe, at esteren er hydrolyserbar, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at clavulansyre med formlen I
-r>*a Pe20e λ'Ύ \
COOH
eller et salt deraf esterificeres på i og for sig kendt måde til indføring af gruppen R. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er der tilvejebragt hidtil ukendte forbindelser af en helt ny forbindelsesklasse, og disse hidtil ukendte forbindelser udviser nyttig biologisk virkning, som skyldes deres evne til at hydrolyseres til clavulansyre.
Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er af en art, som ikke kan betegnes en "analogifremgangsmåde", idet de omhandlede forbindelser fremstilles ved at esterificere en hidtil ukendt forbindelse, som tilhører en ny forbindelsesklasse. Selv om de ønskede slutprodukters struktur havde været givet, kunne forbindelserne ikke have været fremstillet af en fagmand ved nogen kendt metode.
2 145543
Med hensyn til clavulansyres fremstilling ved dyrkning af Strep-tomyces clavuligerus og denne forbindelses egenskaber henvises til dansk fremlæggelsesskrift nr. 141.254 (dansk patentansøgning nr. 1672/75).
Stereokemien ved carbonatomerne 5 og 2 i clavulansyren er den samme, som findes hos naturligt forekommende penicilliner og cephalosporiner, således at clavulansyre kan illustreres med strukturformlen I
CH-OH
\
COOH
Således er et mere fyldestgørende kemisk navn for clavulansyre Z--(2R,5R)-3-(S-hydroxyethyliden)-7-oxo-4-oxa-l-azabicyclo[3,2,0]hep-tan-2-carboxylsyre.
Clavulansyres virkning illustreres af, at visse stammer af Klebsiella aerogenes A, hvis vækst ikke inhiberes ved tilstedeværelse af 125 yug/ml ampicillin, amoxycillin, carbe-nicillin eller benzylpenicillin eller ved tilstedeværelse af 10yug/ ml clavulansyre, inhiberes ved tilstedeværelse af mindre end 12,5yUg/ ml af de ovenfor anførte penicilliner, når der også forekommer 5^ug/ ml clavulansyre. Lignende resultater er iagttaget for kombinationer indeholdende forskellige estere af clavulansyre. F.eks. inhiberes stammer af Klebsiella aerogenes A, hvis vækst ikke inhiberes af 125yug/ml ampicillin eller af lO^ug/ml clavulansyre-methylester, af mindre end 12,5yug/ml ampicillin i nærværelse af S^ug/ml clavulansyre-methylester. Det har også vist sig, at stammer af Staphylococcus aureus Russell, hvis vækst ikke inhiberes ved tilstedeværelse af 100yug/ml ampicillin eller af 5yug/ml clavulansyre, inhiberes ved tilstedeværelse af mindre end 10yUg/ml ampicillin i nærværelse af lyug/ml clavulansyre. Ved forsøg på hunmus· har det vist sig, at blod- og vævsniveauer af clavulansyre på betydelig mere end 5yug/ml let kan nås ved subcutan administration af 100 mg/ kg af natriumsaltet af clavulansyre, og at værdifulde niveauer af clavulansyre kan nås efter oral administration af 100 mg/kg af natriumsaltet af clavulansyre.
3 145543
Egnede estere af clavulansyre er sådanne, som rent teoretisk er afledt af alkoholer såsom methanol, ethanol, propanol, butanol, 2,2,2-trichlorethanol, 2,2,2-trifluorethanol, benzylalkohol, p-nitro-benzylalkohol, phenol, acetoxymethanol, pivaloyloxymethanol og 2-di-methylaminoethanol.
Forskellige estere af clavulansyre er værdifulde mellemprodukter ved visse fremgangsmåder til rensning af clavulansyre. Mange cla-vulansyreestere er værdifulde synergistiske forbindelser. Sådanne esteres aktivitet kan skyldes hydrolysen af esteren til dannelse af den oprindelige syre.
I nærværende beskrivelse betegner udtrykket "ester" estere, som rent teoretisk er afledt af en alkohol eller thiol med den almene formel ROH eller RSH, hvor R har den ovenfor anførte betydning. Egnede grupper R er f.eks. alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, arylalkyl eller andre lignende grupper, som, om ønsket, kan være substituerede. For ikke at forøge molekylvægten til et urimeligt omfang, omfatter grupperne R normalt ikke mere end 16 carbonatomer, især ikke mere end 12 carbonatomer og navnlig ikke mere end 8 carbonatomer.
Gruppen R er fortrinsvis, rent teoretisk, afledt af en alkohol ROH eller (mindre fordelagtigt) en thiol RSH, som er farmaceutisk tolerabel.
Egnede substituenter, som kan omfattes af gruppen R, er f.eks. halogenatomer, og lavere alkoxy-, hydroxy-, lavere acyloxy-, lavere alkylamino- og lavere dialkylaminogrupper. Udtrykket "lavere" betyder, at gruppen indeholder højst 6 carbonatomer, fortrinsvis højst 4 carbonatomer. Således kan R f.eks. være methyl, ethyl, n-pro-pyl, isopropyl, ligekædet eller forgrenet butyl, pentyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, vinyl, allyl, butenyl, cyclo-propyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclo-hexenyl, cyclohexadienyl, methylcyclopentyl, methylcyclohexyl, benzyl, benzhydryl, phenylethyl, naphthylmethyl, phenyl, naphthyl, propynyl, tolyl, 2-chlorethyl, 2,2,2-trichlorethyl, 2,2,2-trifluorethyl, acetylmethyl, benzoylmethyl, 2-methoxyethyl, 2-dimethylaminoethyl, 2-diethylaminoethyl, 2-piperidinoethyl, 2-morpholinoethyl, 3-dime-thylaminopropyl, p-chlorbenzyl-/ p-methoxybenzy1, p-nitrobenzyl, p-brom- 4 145543 benzyl, m-chlorbenzyl, 6-inethoxynaphthy1-2-methyl, p-chlorphenyl eller p-methoxypheny1, ligesom de kan være sådanne andre grupper, som er kendt fra penicillin- eller cephalosporinteknikken til dannelse af.estere, som vides let at kunne hydrolyseres in vivo til dannelse af det oprindelige antibiotikum.
Let hydrolyserbare estere omfatter, men er ikke begrænset til» estere med de almene formler V og VI
/CHOH 0 /H2OH
Γ )=7
CiWx-CO-A3 C®^o-CH-Z
2 II
AZ X C = Y
V VI
1 2 hvor A betegner hydrogen, alkyl, aryl eller aralkyl, A betegner hydro- 3 gen eller methyl, A betegner alkyl, aryl eller aralkyl, X betegner oxygen eller svovl, Y betegner oxygen eller svovl, og Z betegner en divalent organisk gruppe. Estere med de almene formler V og VI, som ret let frigør clavulansyren i blodstrømmen efter administra- 1 2 tion, omfatter sådanne, hvor A er hydrogen, A er hydrogen eller 3 methyl, og A er methyl, ethyl, propyl, butyl, benzyl eller phenyl, og sådanne, hvor X er oxygen, Y er oxygen, og Z er -CH2CH2-, —CH.CH—, now X) -xu I forbindelse med disse formler betegner udtrykket ."alkyl" alkyl-grupper med op til 6 carbonatomer; udtrykket "aryl" betegner phenyl, naphthyl eller phenyl, som er substitueret med en inert substituent, f.eks. fluor, chlor, methyl eller methoxy, og udtrykket "aralkyl" betegner en alkylgruppe-substitueret med en arylgruppe.
Særlig velegnede estere med formlerne V og VI er sådanne, som har de almene formler VII og VIII
5 145543
CHo0H
ΓΤ^ν/0”2™ ri^V^ CO-O-CH-O-CO-A5 VI1 o
VIII
4 5 hvor A betegner hydrogen eller methyl, A betegner methyl, tert;bu- tyl eller phenyl, og A 6 betegner hydrogen eller methoxy.
Mange estere af clavulansyre adskiller sig fra analoge estere af penicilliner eller cephalosporiner, idet de viser forøget tendens til at hydrolyseres til clavulansyre under milde betingelser. F.eks. hydrolyseres enkle alkylestere såsom methylesteren langsomt til clavulansyre i vand, som er pufret til pH-værdi 7. Estere, som undergår nogen hydrolyse under milde betingelser, er omfattet ^f den almene formel IX
CH-OH
__^ox_/ i / 0 xCOOR1 hvor R·*· betegner en carbonhydridgruppe med 1-9 car bonatomer, som eventuelt er substitueret med halogen, lavere alkoxy, hydroxy eller eventuelt til salte omdannede basiske grupper med den almene formel NR2R^.
2 ...... 3 hvor R betegner hydrogen eller lavere alkyl, R betegner hydrogen 2 2 3 eller lavere alkyl eller er knyttet til R , således at NR R er en 5- eller 6-leddet ring.
I forbindelse med den almene formel IX betegner udtrykket "lavere”, at gruppen indeholder 1-4 carbonatomer.
Egnede grupper R^ er alkyl og aralkyl, som eventuelt er substitueret 2 3 med,halogen, methoxy, hydroxy eller til salt omdannede NR R -grup- 2 3 per, hvor R betegner methyl eller ethyl, og R betegner methyl el- 2 2 3 ler ethyl eller et knyttet til R , således at NR R er en pyrrolidin-, piperidin- eller morpholingruppe.
6 165543 Særlig velegnede alkylgrupper er ligekædede grupper med højst 6 carbonatomer, som eventuelt er substitueret med en methoxy-, hydroxy- 2 3 eller til et salt omdannet NR R -gruppe eller med et chlor-, brom- eller iodatom eller med en CCl-j- eller CF3-gruppe.
De estere af clavulansyre, som er særlig værdifulde som synergister, er sådanne, som i pattedyrvæv, især i humant blod, hydrolyseres til dannelse af clavulansyre eller et salt deraf, idet det antages, at clavulansyre og salte deraf synes at være noget nyttigere synergistiske midler end esterne i sig selv. Mange af esterne med de almene formler V - IX er værdifulde til dette formål.
En yderligere gruppe af særlig velegnede estere fremstillet ifølge opfindelsen er sådanne værdifulde mellemprodukter, som let omdannes til clavulansyre eller et salt deraf ved kemiske eller biologiske teknikker, som fra penicillin- eller cephalosporinteknikken vides at være tilstrækkelig milde til ikke at nedbryde reaktive syre-labile β-lactamringe.
Særlig velegnet er en ester, som kan spaltes ved hydrogenolyse.
Sædvanlige estere til en sådan proces er f.eks. benzyl-, substituerede benzyl-, benzhydryl-, substituerede benzhydryl- og trityleste-re. Benzylesteren har vist sig at være særlig værdifuld til dette formål.
I det store hele er karakteren af en hvilken som helst substituent i estergruppen uden betydning, så længe den ikke øver indflydelse på hydrogenolysereaktionen.
Som tidligere anført har clavulansyreestere værdifulde terapeutiske egenskaber. Der kan derfor fremstilles et farmaceutisk præparat, som indeholder en clavulansyreester sammen med et farmaceutisk tolerabelt bærestof.
Sådanne præparater foreligger i en form, som er egnet til oral, topisk eller parenteral anvendelse, og de kan anvendes til behandlingen af infektioner hos pattedyr, herunder mennesker.
7 145543
Under visse betingelser kan effektiviteten af orale præparater af clavulansyreestere forbedres, hvis sådanne præparater indeholder et pufferstof eller et enterisk overtræksmiddel, således at de omhandlede forbindelser ikke har forlænget kontakt med stærkt sur mavesaft. Sådanne pufrede eller enterisk overtrukne præparater kan fremstilles i overensstemmelse med sædvanlig farmaceutisk praksis.
Clavulansyreestere kan forekomme i præparatet som eneste terapeutiske middel eller kan forekomme sammen med andre terapeutiske midler såsom et β-lactam-antibiotikum. Egnede β-lactam-antibiotika til anvendelse i sådanne synergistiske præparater omfatter ikke kun sådanne, som vides at være stærkt modtagelige for β-lactamaser, men også sådanne, som vides at have god grad af modstandsdygtighed i sig selv over for β-lactamaser. Sådanne egnede β-lactam-antibiotika til anvendelse i disse præparater omr, fatter benzylpenicillin, phenoxymethylpenicillin, carbenicillin, methi-cillin, propicillin, ampicillin, amoxycillin, epicillin, ticarcillin, cyclacillin, 6-aminopenicillansyre, 7-aminocephalosporansyre, 7-amino-desacetoxycephalosporansyre, cephaloridin, cephalothin, cefazplin, cephalexin, cefoxitin, cephacetril, cephamandol, cephapirin, cephradin, cephaloglycin og andre velkendte penicilliner og cephalosporiner eller "pro-drugs" dertil, f.eks. hetacillin, metampicillin, acetoxymethyl’-, pivaloyloxymethyl- eller phthalidylesterne af benzylpenicillin, ampicillin, amoxycillin eller cephaloglycin eller phenyl-, tolyl- eller indanyl-a-estere af carbenicillin eller ticarcillin.
Det er klart, at hvis den i præparatet værende penicillin eller cephalosporin ikke er egnet til oral administration, skal præparatet tilpasses parenteral administration.
Når clavulansyreesteren forekommer i et farmaceutisk præparat sammen med et β-lactam-antibiotikum, kan forholdet mellem clavulansyreesteren og β-lactam-antibiotiket være f.eks. 20:1 - 1:12, især 10:1 - 1:10 og navnlig 3:1 - 1:3.
8 145563
Den totale mængde antibakterielle midler i en hvilken som helst enhedsdosisform vil normalt være mellem 50 og 1500 mg og vil sædvanligvis være mellem 100 og 1000 mg.
De omhandlede præparater kan anvendes til behandling af infektioner i bl.a. luftvejene, urinvejene og bløde væv hos mennesker.
Præparaterne kan også anvendes til behandling af infektioner hos husdyr, f.eks. til behandling af mastitis hos kvæg.
Særlig foretrukne præparater indeholder 150 - 1000 mg amoxycillin, ampicillin eller et "pro-drug" dertil og 50 - 500 mg in vivo hydrolyserbar ester af clavulansyre, især 200 - 500 mg amoxycillin, ampicillin, eller et "pro-drug" dertil og 50 - 250 mg in vivo hydrolyserbar ester af clavulansyre.
Clavulansyren fremstilles ved, at en stamme af Streptomyces clavu-ligerus dyrkes, og clavulansyre eller et salt deraf isoleres fra kulturmediet. Dyrkningen er nærmere beskrevet i dansk fremlæggelsesskrift nr. 141.254.
Ved en fremgangsmåde til fremstilling af en ren form af clavulansyre eller salte deraf isoleres en uren form af clavulansyre eller et salt deraf, omdannes til en ester af clavulansyre på sædvanlig måde, hvorefter esteren renses, og clavulansyre eller et salt deraf gendannes fra esteren.
Den urene clavulansyre eller et salt deraf, som anvendes ved denne fremgangsmåde, vil normalt indeholde mindst 1 vægtprocent antibiotikum.
Egnede estere til anvendelse ved denne fremgangsmåde omfatter sådanne, som kan spaltes ved hydrogenolyse, enzymatiske metoder eller ved 9 145543 hydrolyse under meget milde betingelser.
En velegnet gruppe estere til anvendelse ved denne fremgangsmåde er en sådan, som har den almene formel X ;
Ao _ Pa2°a o CO-O-CH-A7 A8
7 A
hvor A betegner et hydrogenatom eller en eventuelt substitueret
O
phenylgruppe, og A betegner en eventuelt substitueret phenylgruppe.
7 Særlig hensigtsmæssigt er A et hydrogenatom eller phenyl, tolyl,
O
chlorphenyl eller methoxyphenyl, og A er phenyl, tolyl, chlorphe-; nyl eller methoxyphenyl.
7 8 A er fortrinsvis et hydrogenatom, og A er fortrinsvis en phenyl-r gruppe.
Esterne med formlen X kan spaltes ved hydrogenolyse, hvorved der fås clavulansyre eller et salt deraf.
Andre grupper af estere, som kan anvendes ved denne fremgangsmåde,, er sådanne, som har de almene formler V og VI som ovenfor beskrevet. Sådanne estere kan omdannes til salte af clavulansyre ved mild basisk hydrolyse, f.eks. ved pH-værdi 7,5.
Den urene form af clavulansyre eller et salt deraf, som skal renses ved denne fremgangsmåde, kan være i form af et fast stof eller en opløsning, som sædvanligvis også vil indeholde betydelige mængder organiske eller uorganiske urenheder.
Clavulansyren eller et salt deraf kan omdannes til en ester ved i og for sig kendte esterificeringsreaktioner, som nedenfor beskrives. Den foretrukne metode til fremstilling af den ønskede ester af clavulansyre er omsætning af et salt af clavulansyre med et 1C 145543 esterificeringsmiddel, f.eks. et reaktivt halogenid eller en sulfonates ter. Sådanne reaktioner udføres hyppigt i et organisk opløsningsmiddel med høj dielektricitetskonstant, f.eks. dimethyl-formamid, dimethylformamid/acetone, dimethylsulfoxid, N-methyl-acetamid eller hexamethylphosphoramid.
Om ønsket kan saltet af clavulansyre opløses i opløsningsmidler på sædvanlig måde, eller det kan bindes til et polymerbærestof.
Egnede bærestoffer til anvendelse ved denne fremgangsmåde er stærke baseanionbytterharpikser, især sådanne, som har en makroretikulær natur, som tillader anvendelsen af ikke-vandige opløsningsmiddelsystemer. Det har vist sig, at "Amerblyst A26" er anvendelig til dette formål. Clavulansyresaltet kan adsorberes på harpiksen fra kulturfiltratet, og harpiksen kan derefter suspenderes i dimethyl-formamid indeholdende natriumiodid, eller det kan elueres som en søjle med en opløsning af natriumiodid i dimethylformamid eller i en blanding af dimethylformamid og acetone.
Når den urene ester er dannet, renses den normalt chromatografisk.
Ved sådanne fremgangsmåder opløses esteren normalt i et organisk opløsningsmiddel såsom ethylacetat, methylenchlorid, chloroform eller cyclohexan. Den faste fase, som anvendes ved den chromatografiske proces, er normalt et inert materiale såsom silicagel eller chromatografisk lignende materialer.
De;fraktioner, som forlader søjlen, kan undersøges for tilstedeværelse af clavulansyre ved at gøre brug af dens synergistiske egénskaber. Aktive fraktioner sammenhældes normalt, og det organiske opløsningsmiddel afdampes under reduceret tryk.
Den ester, som fås ved denne fremgangsmåde, er sædvanligvis af acceptabel renhed, men materialet kan, om ønsket, genchromatogra-feres.
Den rensede ester af clavulansyre kan anvendes til fremstilling af clavulansyre eller et salt deraf på de ovenfor beskrevne metoder.
En særlig velegnet metode til fremstilling af clavulansyre eller et salt deraf er hydrogenering af en forbindelse med den almene formel 11 145543 X som ovenfor beskrevet. Sådanne reaktioner finder normalt sted i nærværelse af en overgangsmetalkatalysator under anvendelse af lave eller middelhøje hydrogentryk. Reaktionen kan udføres ved høj temperatur, stuetemperatur eller lav temperatur, f.eks. ved 0 -100°C. Særlig velegnede reaktionsbetingelser til sådanne hydrogeneringer er at anvende hydrogentryk lidt over atmosfæretryk og en omtrentlig stuetemperatur (12 - 20°C). Reaktionen kan udføres i sædvanlige opløsningsmidler såsom lavere alkanoler, f.eks. ethanol·
Det har vist sig, at en særlig velegnet katalysator er palladium på kul.
Hvis hydrogeneringen udføres i nærværelse af en base, fås et salt af clavulansyre, f.eks. fås natrium- eller kaliumsaltet, hvis reaktionen udføres i nærværelse af natrium- eller kaliumhydrogenearbonat.
Clavulansyren eller saltet deraf, som fås ved sådanne reaktioner, er sædvanligvis af god renhed.
f. 4 Særlig foretrukne udførelsesformer for fremgangsmåden ifølge opfindelsen går ud på, at forbindelsen med formlen I eller et salt deraf omsættes med en til den ønskede ester svarende diazoalkan eller med en til den ønskede ester svarende alkohol eller thipl i nærværelse af et kondensationsfremmende middel. Det er ifølge opfindelsen særlig hensigtsmæssigt, at et salt af forbindelsen med formlen I omsættes med en forbindelse R-Q, hvor R har den i krav 1 angivne betydning, og Q betegner en let udskiftelig gruppe.
Som kondensationsfremmende middel kan nævnes carbodiimid.
Egnede salte af clavulansyre, som kan omsættes med forbindelser R r- Q, er f.eks. alkalimetalsalte såsom natrium- eller kaliumsalte eller andre sædvanlige salte, f.eks. sølvsaltet.
Egnede grupper Q omfatter sådanne atomer eller grupper, som vides at være udskiftelige med carboxylatanioner, og omfatter chlor-, brom- og iodatomer, sulfonsyreestere såsom OSC^CH-j- eller OSc^CgH^CHg--grupper, aktive estergrupper såsom OCOH- eller OCOCF3~grupper og andre sædvanlige grupper, som kan udskiftes med nucleofile grupper.
12 145543
Den ovenfor anførte reaktion udføres normalt i et organisk opløsnings^ middel med relativt høj dielektricitetskonstant såsom dimethylfor-mamid, acetone, dioxan eller tetrahydrofuran og ved ikke-ekstreme temperaturer, f.eks. mellem -5 og +100°C, sædvanligvis mellem +5 og +30°C, f.eks. ved stuetemperatur.
Omsætningen af clavulansyre med en diazoforbindelse er en mild fremgangsmåde til fremstilling af alkyl- eller aralkylestere eller lignende estere. Diazoteringsreaktionen kan udføres under sædvanlige reaktionsbetingelser, f.eks. ved ikke-ekstreme temperaturer og i et sædvanligt opløsningsmiddel. Sådanne reaktioner udføres normalt ved en temperatur mellem -5 og +100°C, især mellem +5 og +30°C, f.eks. ved stuetemperatur. Egnede opløsningsmidler til denne reaktion omfatter lavere alkanoler såsom methanol og ethanol og opløsningsmidler såsom tetrahydrofuran eller dioxan. Ethanol har vist sig at være et særligt anvendeligt opløsningsmiddel ved denne omsætning.
Omsætningen mellem clavulansyre og en alkohol eller thiol i nærværelse af et kondensationsfremmende middel finder normalt sted i et inert organisk opløsningsmiddel med relativt høj dielektricitetskonstant, f.eks. acetonitril. Reaktionen udføres sædvanligvis ved stuetemperatur eller sænket temperatur, f.eks. ved en temperatur mellem -10 og +22°C, især mellem -5 og +18°C, f.eks. i starten ved 0°C og derefter under gradvis opvarmning til ca. 15°C. Det anvendte kondensationsfremmende middel er normalt ét middel, som .fjerner vand fra reaktionsblandingen. Egnede midler er f.eks. carbodiimider, carbodiimidazoler eller ækvivalente reagenser. Dicyclo-hexylcarbodiimid har vist sig at være et særlig velegnet kondensationsfremmende middel til anvendelse ved denne fremgangsmåde. For at undertrykke clavulansyrens indre kondensation udføres denne omsætning normalt i nærværelse af et betydeligt overskud af alkoholen eller thiolen.
13 145543
Beskrivelse 1.
Prøver, som kan anvendes til påvisning af clavulansyre. Undersøgelsesprincip.
Opløsninger- indeholdende clavulansyre inkuberes i 15 minutter med et lactamase-præparat i 0,05M phosphatpuffer ved pH-værdi 7 og ved 37°C. I løbet af denne tid optræder enzyminhibering eller inaktivering. Substrat (benzylpenicillin) tilsættes derefter, og inkuberingen fortsættes i 30 minutter ved 37°C. Omfanget af enzymatisk nedbrydning i substratet til penicilloinsyre (penicillpic acid) bestemmes ved hydroxylaminprøven for penicillin. Den anvendte mæng- de β-lactamase er sådan, at den giver 75%'s hydrolyse af benzvl-penicillinet på 30 minutter ved 37°C.
Hydrolysegraden er en afspejling af den mængde af enzym, som forbliver uinhiberet. Resultaterne udtrykkes som procent inhibering af enzymaktiviteten ved en given fortynding af den clavulansyreholdige opløsning (f.eks. kulturfiltrat) eller den koncentration af clavulansyre (yug/ml), som giver 50%'s inhibering af enzymet under de ovenfor anførte betingelser (I5q)· β-Lactamase-enzym.
Som enzym anvendes β-lactamase, som er produceret af Escherichia coli JT4: Denne kultur er en ampicillinresistent stamme, og dens resistens skyldes produktionen af en R-faktor-bestemt β-lactamase. Andre lignende R-faktor-bestemte β-lactamaser kan anvendes, om ønsket.
Kulturen holdes på næringsagarskråkultur og podes i 400 ml sterilt trypton-medium i en 2-liters konisk kolbe. Dette medium har nedenstående sammensætning: Η 145543
Trypton (oxoid) 32 g/liter gærekstrakt (oxoid) 20 g/liter
NaCl 5 g/liter.
CaCl26H20 2,2 g/liter.
Den endelige pH-værdi indstilles på 7,4 ved hjælp af fortyndet na-triumhydroxid. Kolben rystes ved 25°C i 20 timer på et roterende rysteapparat ved 240 omdrejninger pr. minut.
Bakteriecellerne indhøstes ved centrifugering, vaskes med 0,05M phos-phatpuffer med pH-værdi 7 (resuspenderes og centrifugeres) og re-suspenderes i vand, hvorved der fås en cellekoncentration, som er 25 gange så stor som i dyrkningsmediet. Denne cellesuspension udrives derefter i en MSE-ultrasonic desintegrator ved 4°C. Celleresterne fjernes ved centrifugering, og alikvoter af den overstående væske oplagres i dybfrost. Til anvendelse i undersøgelsesteknikken fortyndes den overstående væske i 0,005M phosphat-puffer, indtil der fås ca. 75% hydrolyse af en 1 mg/ml opløsning af benzylpenicillin på 30 minutter ved 37°C.
Forsøgsteknik.
Egnede fortyndinger af inhibitorpræparater og β-lactamase-opløsning blandes og inkuberes ved 37°C i 15 minutter (test). En konstrolprøve med puffer i stedet for inhibitorpræparat inkuberes også. Benzyl-penicillinopløsningen (substrat) sættes derefter til test- og kontrolblandingerne, og inkuberingen fortsættes i yderligere 30 minutter ved 37°C. Den resterende benzylpenicillin i hver blanding bestemmes derefter under anvendelse af hydroxylaminforsøget som beskrevet af Batchelor et al., Proc. Roy. Soc., B 154, 498 (1961).
6 ml hydroxylaminreagens sættes til alle forsøgsprøverne, kontrolprøver og blindprøver, og de lades reagere i 10 minutter ved stuetemperatur før tilsætning af 2 ml ferriammoniumsulfatreagens. Absorptionen af den endelige opløsning måles i et EEL-colorimeter eller spektrofotometer ved 490 nanometer mod reagensblindprøven. Sammensætningen af reaktionsblandingerne, testblandinger og blindprøver 15 148543 før hydroxylaminforsøget er anført i nedenstående tabel:
Komponenter Test Benzylpeni- Kontrol, Reagens, (alle opløst i eller for- cillin, ml. blind, ml tyndet med 0,005M phos- blind, ml phatpuffer, pH-værdi 7)_ ._;_^
Escherichia coli β-lactamaseopløsning 1,9 0,0 1,9 1,9
Inhibitoropløsning 0,1 0,0 0,0 0,0 .Benzylpenicillin 5 mg/ml 0,5 0,5 0,5 0,0 0,Q05M phosphatpuffer, pH-værdi 7 0,0 2,0 0,1 0,6.
Beregning af resultater. '
Den procentvise inhibering af β-lactamase beregnes på følgende mådes
Absorption af benzylpenicillin blind minus absorption af kontrolprøven (ikke-inhiberet reaktion) = X
absorption af test (inhiberet reaktion) minus absorption af kontrol-prøven (ikke inhiberet reaktion) = Y
Y
procent inhibering = - 100
X
For at få I50-værdien fortyndes inhibitorpræparatet, indtil der er opnået 50%'s inhibering af β-lactamase-inaktiveringen af benzylpenicillin ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde.
Beskrivelse 2.
Papirchromatqgrafisk påvisning af clavulansyre.
Kulturfiltrat og en referenceopløsning af clavulansyre (250^ug/ml delvis renset præparat) sættes som prøver (20^ug/oprindelse) på Whatman nr. 1 papirstrimler, 1 cm. brede. Chromatogrammerne laves ved nedadgående chromatografi i 16 timer ved 5°C under anvendelse af n-butanol/isopropanol/vand i v/v-forholdet 7:7:6 som opløsnings-r middel. Strimlerne tørres ved 40°C og lægges på agarplader indeholdende 6^ug/ml benzylpenicillin og podes med en β-lactamase-produ-cerende stamme af Klebsiella aerogenes (synergismesystem). Pladerne inkuberes natten over ved 30 C, og clavulansyre viser sig som en 16 1455A3 zone med inhiberet vækst. Rf-Værdien for zonen er 0,46. 6^ug/ml benzylpenicillin alene er under den koncentration, som er. nødvendig for at dræbe Klebsiella aerogenes, men ved tilstedeværelse af en β-lactamase-inhibitor bliver denne koncentration toxisk, hvilket vil sige, at der er synergisme.
Anvendelse af det ovenfor anførte synergismesystem gør det muligt at bestemme clavulansyre ved koncentrationer, som er under de koncentrationer, hvor den viser antibakteriel virkning.
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler 1-32, fremstillingen af clavulansyre ved dyrkning og isolering af syren eller et salt deraf belyses i eksempel 33 - 41, og anvendelse af esterne belyses i eksempel 42 - 50. De fremstillede esteres antibakterielle/synergistiske virkning er beskrevet i eksempel 51 - 54.
Eksempel 1.
Fremstilling af methylesteren af clavulansyre.
^ >CH„0H ^ CH20H
\ 0 \ C00Na COOCH3 19,8 mg af natriumsaltet af clavulansyre opløses i 0,5 ml tørt di-methylformamid og behandles med 0,25 ml methyliodid. Efter henstand ved stuetemperatur i 1 1/2 time under vandfrie betingelser fjernes opløsningsmidlerne i vakuum. Remanensen renses ved P.L.C. på sili-cagel (Kieselgel 60F254, markedsført af E. Merck, Darmstadt, Vesttyskland) og eluering med ethylacetat, hvorved der fås clavulansyre--methylester i form af en farveløs olie (R^-værdi 0,38; rød farve med triphenyltetrazoliumchloridspray), og olien har nedenstående egenskaber: 17 145543
Analyse:
Beregnet far CgH-^NOg.· C 50,70 Η 5,20 N 6,57 Fundet: C 50,49 H 5,43 N 6,29.
UV-spektrum (methanol: λ : ingen absorption >215 nm; max IR-spektrum: vm (film): 3300 - 3600 (bredt), 1800, 1750, 1695 cnT1. max "Tilnærmet første ordens NMR-spektrum (CDCl^): 2,49 (bred S, 1, udskiftet med D20), 3,05 (d, 1, J = 17,5 Hz), 3,54 (dd, 1, J = 17,5 Hz, J7 = 2,5 Hz), 3,84 (S,3) 4,24 (d, 2, J = 7 Hz), 4,93 (dt, 1, J = 7 Hz, J2 = 1,5 Hz), 5,07 (d, 1,. J = 1,5 Hz), 5,72 (d, 1, J = 2,5 Hz).
Molekylvægt (massespektrum): 213,0635.
Beregnet for CgH^NOg: 213,0637.
Tynd tlagschrojna tograf i på methylesteren viser en enkelt zone i hver af de nedenstående opløsningsmiddelsystemer: butanol/ethariol/ vand i volumen/volumen-forholdet 4:1:5, topfase R^-værdi 0,75; iso-propanol/vand i volumen/volumen-forholdet 7:3, R^-værdi 0,95; ethyl-acetat/ethylalkohol i volumen/volumen-forholdet 8:2, Rf-værdi 0,87'. Disse zoner bestemmes ved bioautografi under anvendelse af Klebsiella aerogenes med tilsat benzylpenicillin (synergismesystem).
Eksempel 2 .
Fremstilling af p-nitrobenzylesteren af clavulansyre.
^ ΓΗ nu ,CH„OH
rfx=y rT\=S
Λν —*· J-γ C00Na ^COOCH —^ \~ϋΙ02 18 145543
Behandling åf natriumsaltet af clavulansyre med p-nitrobenzylbro-mid i tørt dimethylformamid giver, efter P.L.C., en farveløs olie, som krystalliserer af chloroform-ether, hvorved der fås p-nitro-benzylesteren af clavulansyre i form af hvide fjeragtige nåle med smeltepunkt 111 - 112°C, som efter omkrystallisation har smeltepunkt 117,5 - 118°C.
Eksempel 3.
Fremstilling af benzylesteren af clavulansyre.
CHo0H
I 1 ch2oh ^-/όγ**\Η _ COONa x H '^''COOCH.-Ph u o 1
Urent 3-(β-hydroxyethylidenj-7-oxo-4-oxa-l-azabicyclo[3,2,0]heptan--2-carboxylsyre-natriumsalt (antages at være ca. 55 mg rent støf) i 0,64 ml tørt dimethylformamid behandles med 0,18 ml benzylbromicl. Opløsningen holdes ved stuetemperatur (ca. 17 - 18°C) i 3 timer under vandfrie betingelser. Reaktionsblandingen fraktioneres på silicagel og elueres med ethylacetat, hvorved der fås 63 mg af en i det væsentlige ren form af benzylesteren af 3-(β-hydroxyethyliden)--7-oxo-4-6xa-l-azabicyclo[3,2,0]heptan-2-carboxylsyre i form af en farveløs olie.
IR-spektrum (film): 1800, 1745 og 1695 cm NMR-spektrum (CDCl^): 2,25 (s, 1, udskiftelig med D20), 3,05 (d, 1, J = 17 Hz), 3,51 (dd, 1, J = 17 Hz, J2 = 2,5 Hz), 4,24 (d, 2, J = 7,5 Hz), 4,92 (dt, 1, J = 7,5 Hz, J2 = 1,5 Hz), 5,15 (d, 1, J - 1,5 Hz), 5,24 (s, 2), 5,71 (d, 1, J = 2,5 Hz), 7,456 (s, 5).
Eksempel 4.
19 145543
Fremstilling af benzylesteren af clavulansyre ud fra råekstrakter af kulturfiltratet fra Streptomyces clavuligerus.
20 liter kulturfiltrat fremstillet som beskrevet i eksempel 34 inddampes under vakuum til 5 liter under anvendelse af en "opstigende film"-inddamper. Koncentratet frysetørres under anvendelse af en "Edwards E.F.6" skalfrysetørrer fremstillet af Edwards High Vacuum Ltd.. 300 g af det således fremstillede faste stof indeholder 3 g natrium-clavulansyre som bestemt ved enzyminhiberingsforsøget.
Det faste stof suspenderes i 900 ml tørt dimethylformamid, og der tilsættes 150 ml benzylbromid. Blandingen omrøres i 2 timer ved stuetemperatur og fortyndes derefter med 1 liter ethylacetat. Reaktionsblandingen filtreres, og filtratet inddampes til mindst muligt rumfang. Den olieagtige remanens ekstraheres med yderligere 1 liter ethylacetat, og ekstrakten filtreres. Filtratet koncentreres igen, og den resulterende olieagtige remanens hældes på en 7,62 cm x 35,56 cm silicagelsøjle ("Biogel Biosil A" 100 mesh) i cyclohexan. Søjlen elueres med cyclohexan til fjernelse af benzylbromid, og opløsningsmidlet ændres derefter til ethylacetat, og der opsamles fraktioner på 20 ml. Fraktionerne undersøges for tilstedeværelse af benzylesteren af clavulansyre ved at sætte dem pletvis på glas-bårne silicageltyndtlagschromatografiplader (Merck precoated sili-cagel 60 F 254) og påsprøjtning af 2,3,5-triphenyltetrazoliumchlo-rid (TTC) sprayreagens. Fraktioner, som viser intense røde pletter med dette reagens, undersøges yderligere ved tyndtlagschromatografi på silicagelplader under anvendelse af chloroform-ethylacetat i forholdet 8:2 som opløsningsmiddel og ved at sprøjte de fremkaldte plader med TTC-spray. Benzylesteren af clavulansyre løber med en R^-værdi på 0,31 ved 22°C. Fraktioner indeholdende denne ester sammenhældes og koncentreres til 15 ml, og denne opløsning chromatograf eres yderligere på en 3,81 cm x 40,64 cm silicagelsøjle (Merck silicagel H, type 60) med chloroform/ethylacetat 8:2 som opløsningsmiddel. Der opsamles fraktioner på 15 ml, og de undersøges for benzylester på den ovenfor beskrevne måde. De fraktioner, som indeholder esteren, koncentreres til 8 ml og renses endelig ved søjle-chromatografi på en 2,54 cm x 40,64 cm silicagelsøjle (Merck sili- 20 145543 cagel H, type 60) med ethylacetat/cyclohexan i forholdet 8:2 som opløsningsmiddel. Udvalgte fraktioner sammenhældes og inddampes under vakuum, hvorved der fås 160 mg af den rene benzylester i form af en olie.
Eksempel 5.
Fremstilling af clavulansyre-benzylester.
3,3 kg forstøvningstørret faststof indeholdende 69,4 g clavulansyre opslæmmes i 5,5 liter dimethylformamid, og der tilsættes 500 ml benzylbromid. Efter omrøring ved stuetemperatur i 2 timer tilsættes 12 liter ethylacetat, og de faste stoffer fjernes ved filtrering. Filtratet inddampes under vakuum,hvorved der fås 212 g af en olieagtig remanens. Remanensen hældes på en søjle med et leje af 10,16 cm x 33,02 cm silicagel (Hopkins & Williams MFC) i cyclohexan. Søjlen elueres med 12 liter cyclohexan til fjernelse af overskydende benzylbromid. Eluenten ændres derefter til ethylacetat, og der opsamles fraktioner på 500 ml. Disse undersøges for benzylclavulanatindhold ved at sættes i pletter på silicageltyndtlagschromatografiplader (Merck precoated silicagel 60 F 254) og påsprøjtes 2,3,5-triphenyltetrazolium-chlorid (TTC) sprayreagens. Fraktioner, som giver intense røde pletter, undersøges yderligere ved tyndtlagschromatografi på silicagel med chloroform/ethylacetat i forholdet 8:2 som opløsningsmiddel og sprøjtning af de fremkaldte plader med TTC-spray. Fraktionerne 5-13 indeholder størstedelen af esteren, og disse sammenhældes og inddampes i vakuum, hvorved der fås 79,3 g olie. Dette præparat chromatograferes derefter på en 10,16 cm x 45,72 cm søjle af silicagel (Merck silicagel H type 60) med chloroform/ethylacetat i forholdet 8:2 som opløsningsmiddel. Fraktioner udvælges som ovenfor beskrevet, og ved inddampning fås 45,9 g af en olie, som er af 62%1 s renhed bestemt ved NMR-spektroskopi.
Dette produkt chromatograferes til slut på en 6,99 cm x 45,72 cm søjle af "Sephadex LH 20" i cyclohexan/chloroform i forholdet 1:1. Efter udvælgelse af fraktioner og inddampning fås 27,6 g af en farveløs olie, som viser sig at være 95% ren benzylester af clavulansyre 21 145543 bestemt ved NMR-spektroskopisk undersøgelse. ("Sephadex LH 20" ér et hydroxypropylderivat af "Sephadex Q 25", markedsført af Pharmacia Great Britain, 75 Uxbridge Road, London W5, Storbritannien),
Eksempel 6.
Fremstilling af clavulansyre-benzylester.
150 liter kulturfiltrat med pH-værdi 7,0 indeholder 16,2 g clavularj-syre (natriumsalt) ifølge enzyminhiberingsforsøg. Dette filtrat omrøres med 5 kg "Amberlyst A.26"-anionbytterharpiks i Cl -form (Rohm & Hass Company, Philadelphia, U.S.A) il time ved stuetemperatur. Harpiksen filtreres derefter, og filtratet undersøges igen, hvorved det ses, at 6,4 g clavulansyre er fjernet. Harpiksen vaskes med 20 liter deioniseret vand efterfulgt af 20 liter acetone og 10 liter dimethylformamid. Efter genfiltrering suspenderes harpiksen i 2,3 liter dimethylformamld/0,2M natriumiodid. Til dette sættes 200 ml benzylbromid, og suspensionen omrøres grundigt. Efter henstand ved stuetemperatur i 16 timer tilsættes 2 liter ethyl-acetat, hvorefter harpiksen filtreres, og yderligere ethylacetat-vaskevæsker fra harpiksen sammenhældes med filtratet. Ekstrakten inddampes til et lille rumfang og chromatograferes på en 7,62 cm x 45,72 cm silicagelsøjle (Merck silicagel H type 60) med ethylacetat/ cyclohexan i forholdet 8:2 som opløsningsmiddel. Fraktioner indeholdende benzylclavulanat udvælges ved pletprøver på silicageltyndtlags-chromatografiplader og påsprøjtning med TTC-reagens som beskrevet i eksempel 4. De udvalgte fraktioner inddampes til 20 ml og chromatograferes derefter på en 3,81 cm x 45,72 cm silicagelsøjle (Merck silicagel H type 60) med chloroform/ethylacetat i forholdet 8:2 som opløsningsmiddel. Udvalgte fraktioner sammenhældes og inddampes, hvorved der fås 440 mg af en farveløs olie, som ifølge NMR--spektroskopi er 90% benzylclavulanat.
Eksempel 7.
Fremstilling af benzylesteren af clavulansyre ud fra råekstrakter af kulturfiltratet af Streptomyces clavuligerus.
22 U5543
En alikvot af et vandigt reekstrakt af butanolekstrakten fra et kulturfiltrat frysetørres under anvendelse af et "Edwards" kammertørreapparat. En portion på 24 g af det vundne faste stof indeholder 0/96 g natrium-clavulansyre ifølge enzyminhiberingsforsøget. Dette faste stof suspenderes i 75 ml tørt dimethylformamid, og der tilsættes 75 ml benzylbromid. Blandingen omrøres i 2 timer ved stuetemperatur. Suspensionen fortyndes derefter med 500 ml ethylacetat, og blandingen filtreres. Filtratet inddampes på en roterende vakuuminddamper, hvorved der fås en olieagtig remanens. Denne remanens hældes på en 5,08 cm x 35,56 cm silicagelsøjle ("Biogel Biosil A" 100 mesh) i cyclohexan. Benzylbromid elueres fra søjlen/ og derefter ændres opløsningsmidlet til ethylacetat, og der opsamles fraktioner på 1-0 ml. Fraktioner indeholdende benzylesteren af clavulan-syre udvælges som beskrevet i eksempel 4. Yderligere rensning udføres som beskrevet i eksempel 4 ved hjælp af søjlechromatografi.
Ved denne fremgangsmåde fås 220 mg ren benzylester.
Eksempel 8.
Fremstilling af pivaloyloxymethylclavulanat.
Til en omrørt opløsning af 0,37 g brommethylpivalat i 5 ml tørt di-τ methylformamid sættes 0,49 g natriumclavulanat. Efter 2 timers henstand ved stuetemperatur behandles reaktionsblandingen med 20 ml ethylacetat, 10 ml cyclohexan og 20 ml vand. Blandingen adskilles i to faser, og den ikke-vandige fase fraskilles, vaskes med 20 ml vand og tørres over natriumsulfat. Den tørrede opløsning inddampes, hvorved det ønskede produkt fås i form af 500 mg af en lysegul olie.
NMR-spektrum (CDClg): 1,26 (s, 9), 3,13 (d, 1, J = 17 Hz), 3,62 (dd, 1, J - 17 Hz, J1 = 2,5 Hz), 4,3 (d,2, J = 7,5 Hz), 5,0 (dt, 1, J = 7,5 Hz, J2 = 1,5 Hz), 5,16 (d, 1, J = 1,5 Hz), 5,79 (d, 1, J = 2,5 Hz), 5,926 (s, 2).
IR-spektrum (flydende film) :v β-lactam C.O 1800 cm"^, ester C=0 1760 cm-1.
Eksempel 9.
23 145543
Fremstilling af clavulansyre-phthalidestere.
Til en omrørt opløsning af 0,43 g 3-bromphthalid i 5 ml tørt dime-thylformamid sættes 0,5 g natriumclavulanat, og opløsningen lades henstå ved stuetemperatur i 2 timer. Opløsningen behandles med 20 ml ethylacetat, 10 ml cyclohexan og 30 ml vand og rystes grundigt.
Den ikke-vandige fase vaskes med 20 ml vand, tørres over natriumsulfat og inddampes, hvorved der fås en lysegul gummi. De to diaste-reomere estere adskilles under anvendelse af højtryksvæskechroma-tografi på en 40 cm x 10 mm søjle af silicagel (Merckosorb SI 60, 5^u) og elueres med ethylacetat med en strømningshastighed på 3 ml/ minut.
Den første phthalidester (retentionstid 7,15 minutter) krystalliserer af ethylacetat i form af nåle med smeltepunkt 102°C og har følgende spektrer: IR-spektrum (nujol mull) v S-lactam C=0 1790 cm \ ester C=0 1755 cm *".
NMR-spektrum (CD3COCD3): 3,14 (d, 1, J = 17,5 Hz), 3,76 (dd, 1, J = 17.5 Hz, J2 = 2,5 Hz), 4,25 (d, 2, J = 7,5 Hz), 5,0 (dt, 1, = 7.5 Hz, J2 = 1,5 Hz), 5,4 (s, 1, J = 1,5 Hz), 5,82 (d, 1, J = 2,5 Hz), 7,7 (s, 1), 8,06 δ (m, 4) .
Molvægt (massespektometri): 331,0696 svarer til cigHi3N07 (beregnet 331,0692).
Den anden diastereoisomere (retentionstid 8,85 minutter) har følgende spektrer: IR-spektrum: (CH2Cl2-opløsning): v β-lactam C=0 1800 cm 1, ester C=0 1780 cm-1.
24 145543 NMR-spektrum (CDC13): 2,42 (bred S, 1, udskiftelig med D2°), 3,12 (d, 1, J = 18. Hz), 3,60 (dd, 1, ^ * 18 Hz, J2 = 2,5 Hz), 4,30 (d, 2, J = 7,5 Hz), 5,0 (dt, 1, = 7,5 Hz, J2 = 1,5 Hz), 5,12 (d, 1, J « 1,5 Hz), 5,76 (d, 1, J = 2,5 Hz), 7,52 (S, 1), 7,856 (m, 4) .
CH-OH
py' i + COONa
__yCH2OH
0 1 °f0° —^ ^===-0
Eksempel 10.
Fremstilling af nonylclavulanat.
44 mg natriumclavulanat i 2 ml tørt dimethylformamid behandles med 76 mg nonyliodid og lades henstå ved stuetemperatur i 2 timer. Opløsningen inddampes, og remanensen fraktioneres på silicagel og elueres med ethylacetat-hexan i forholdet 2:1, hvorved produktet fås i form af en olie.
IR-spektrum (film): 1800, 1745 og 1690 cm \
Molvægt (massespektrometri) = 325,1890, hvilket svarer til C17H27N05 (beregnet 3-25,1889).
Eksempel H· 25 145543
Fremstilling af methylclavulanat.
130 mg clavulansyre i 10 ml ethanol behandles med en overskydende mængde diazomethan i ether. Efter 2 minutter ved stuetemperatur vises reaktionen ved hjælp af tyndtlagschromatografi at være fuldstændig. Opløsningen inddampes i vakuum, og remanensen renses ved chromatografi på silicagel og elueres med ethylacetat. Fraktionerne indeholdende methylclavulanat sammenhældes og inddampes, hvorved der fås 104 mg af en klar olie.
Eksempel 12.
Fremstilling af methylclavulanat.
200 mg clavulansyre i 5 ml acetonitril afkøles og omrøres ved 0°C. 0,5 ml methanol og derefter 206 mg dicyclohexylcarbodiimid tilsættes, og reaktionsblandingen omrøres ved stuetemperatur natten over. Suspensionen filtreres, og filtratet inddampes i vakuum, hvorved der fås. råt methylclavulanat. Råproduktet renses ved chroma-tografi på silicagel og elueres med ethylacetat, hvorved der fås 140 mg af en klar olie.
Eksempel 13.
Fremstilling af phenylclavulanat.
100 mg clavulansyre i 5 ml acetonitril afkøles og omrøres ved 0°C.
Til opløsningen sættes 0,94 g phenol og 100 mg dicyclohexylcarbodiimid, og reaktionsblandingen omrøres ved stuetemperatur natten over. Suspensionen filtreres, og filtratet inddampes. Remanensen fraktioneres på silicagel og elueres med ethylacetat-hexan i forholdet 1:1, hvorved der fås 70 mg phenylclavulanat.
IR-spektrum (film): 1800, 1770 og 1690 cm 26 145543 NMR-spektrum (CDC13) : 2,18 (bred s, 1), 3,06 (dd, 1, J = 17 Hz, J2 = 0,9 Hz), 3,54 (dd, 1, = 17 Hz, J2 = 2,6 Hz), 4,29 ( d, 2, J = 7,5 Hz), 5,1 (dt, 1, = 7,5 Hz, J2 = 1,5 Hz), 5,29 (d, 1, J = 1,5 Hz), 5,76 (dd, 1, = 2,6 Hz, J2 = 0,9 Hz), 7,35 6 (m, 5).
Molvægt (massespektrometri) = 275,0777, hvilket svarer til C^H-^NOg (beregnet 275,0794).
Eksempel 14.
Fremstilling af 2,2,2-trichlorethylclavulanat.
221 mg natriumclavulanat suspenderes i 5 ml tørt tetrahydrofuran og omrøres ved 0°C. 211 mg chlormyresyretrichlorethylester i 1 ml tørt tetrahydrofuran sættes til den ovenfor anførte suspension i løbet af 20 minutter. Blandingen lades opnå stuetemperatur og omrøres natten over. Suspensionen filtreres, og filtratet inddampes i vakuum. Remanensen chromatograferes på silicagel og elueres med ethylacetat-hexan i forholdet 2:1, hvorved der fås det ønskede produkt i form af en olie.
IR-spektrum (film): 1800, 1760 og 1690 cm *".
NMR-spektrum (CDCl^): 1,56 (bred S, 1), 3,07 (dd, 1, = 17,5 Hz, J2 = 0. 7 Hz), 3,56 (dd, 1, ^ = 17,5 Hz, J2 = 2,5 Hz), 4,24 (d, 2, J = 7,5 Hz), 4,69 (d, 1, J = 12 Hz), 4,92 (d, 1, J = 12 Hz), 5,02 (dt, 1, J2 = 7,5 Hz, J2 = 1,3 Hz), 5,19 (d, 1, J = 1,3 Hz), 5,73 6 (dd, 1, ^ = 2,5 Hz, J2 = 0,7 Hz).
Molvægt (massespektrometri) = 328,9621, hvilket svarer til C^qH^qNOjjCI. (beregnet 328,9625).
27 145543 /°Η50Η γη ωη -r*)^y C1C0.0R -Γ^°\ / 2 ' 0 ! COONa / j
/ CO-O-CO-O-R
>0 Fl™ R=CH,C1, j /- 6 J Nv. /
CT
l
COOR
Eksempel 15.
Fremstilling af benzylester af clavulansyre.
En opløsning af 0,55 g rent lithiumclavulanat i 3 ml varmt vand sættes dråbevis i løbet af 5 minutter til en omrørt opløsning af 1,8 ml benzylbromid i 8 ml dimethylformamid. Blandingen omrøres ved stuetemperatur (20°C) i 2 timer. Tyndtlagschromatografi (ethylacetat-SiC>2) viser derefter, at en stor andel af clavulanat-saltet er blevet esterificeret. Reaktionsblandingen hældes på toppen af en søjle af 200 g silicagel fremstillet i cyclohexan--ethylacetat i forholdet 10:1 og elueres med cyclohexan og ethyl-acetat, gradueret fra et forhold på 10:1 til 1:1, derefter med rent ethylacetat. Fraktioner indeholdende benzylclavulanat sammenhældes og inddampes under reduceret tryk, hvorved der fås en olie, fra hvilken de resterende opløsningsmidler afdampes under højt vakuum, hvorved der fås 0,37 g (47% af det teoretiske) rent benzylclavulanat.
Eksempel 16- 28 145543
Benzyloxycarbonylmethylclavulanat.
CH2OH
_/ CHo0H
ΓΤ )=/ —> ΓΤ w t \ C00Na C00CH_C00CHoCrHc 2 2 6 5 0,6 g natriumclavulanat og 0,46 ml benzylbromacetat opløses i 7 ml Ν,Ν-dimethylformamid. Efter henstand i 2 timer ved stuetemperatur afdampes opløsningsmidlet i vakuum. 50 ml diethylether, 25 ml ethyl-acetat og 50 ml isvand tilsættes, og blandingen rystes og adskilles.
Den vandige fase vaskes med yderligere 50 ml af opløsningsmiddelblandingen. De samlede opløsningsmiddelfaser vaskes med 10 ml isvand, tørres over natriumsulfat og inddampes til en olie, som underkastes chromatografi på silicagel under anvendelse af cyclo-hexan og ethylacetat som eluenter. De fraktioner, som indeholder benzyloxycarbonylmethylclavulanat isoleres og inddampes, hvorved der fås en farveløs olie.
IR-^Spektrum (film) : 3510 (b, OH) , 1805 (β-lactam C=0) , 1760 (bred, ester C=0'er) og 1700 cm 1 (C=C).
NMR-Spektrum (CDC13) : 1,86 (IH, bs, forsvinder ved deutering, C^OH) , 3,04 (IH, d, J 18Hz, 6β-Η), 3,46 (IH, dd, J 18Hz, J 2,5Hz, 6a-H), 4,19 (2H, d, J 8Hz, CH2OH), 4,71 (2H, s, OCH^CO), 4,97 (IH, t, J 8Hz, =CHCH2OH), 5,14 (IH, s, 3-CH), 5,19 (2H, s, PhCH2), 5,66 (IH, d, J 2,5Hz, 5-CH), 7,34 (5H, s, PHCH2).
Eksempel 17.
Natriumcarboxymethylclavulanat.
29 145543
CH-OH
/ 2 CHo0H
COOCH2COOCH2CgH5 COOCH2COONa 0,2 g benzyloxycarbonylmethylclavulanat i 5 ml gendestilleret tetrahydrofuran hydrogeneres ved 22°C over 0,2 g 5%'s palladiseret bariumsulfat i 30 minutter. Katalysatoren fjernes ved filtrering.
Til filtratet sættes derefter 1,0 ml vand og 0,11 g fast natrium-hydrogencarbonat. Blandingen afkøles til 10°C og omrøres i 5 minutter. Overskydende NaHCO^ frafiltreres, og filtratet inddampes i vakuum, hvorved der fås et sprødt skum.
IR-Spektrum (koncentreret dimethylsulfoxidopløsning): 1801 (β-lactam OO) , 1753 (ester C=0) , 1700 (C=C) og 1630 cm-1 (COO~) .
Eksempel 18.
Benzhydrylclavulanat.
n CH90H
/ ^0 CHo0H
r~ y COOH 'COOCH(C6H5)2 112 mg diphenyldiazomethan i petroleumsether (kogeinterval 40 - 60°C) sættes til en opløsning af 38 mg clavulansyre i 4 ml tetrahydrofuran.
Den resulterende opløsning omrøres natten over ved stuetemperatur, hvorefter opløsningsmidlet fjernes under reduceret tryk, hvorved der fås en olieagtig remanens, som chromatograferes på silicagel og elueres med ethylacetat-hexan-blanding, hvorved der fås 135 mg af den i overskriften nævnte forbindelse.
IR-Spektrum (CHCl^): 3400 (OH), 1805 (β-lactam C=0), 1755 cm ^ (ester C=0) og 1700 (C=C).
30 145543 NMR-Spektrum (CDC13): δ = 2,05 (IH, s, OH), 3,03 (IH, d, J 17Hz, ββ-CH), 3,53 (IH, dd, J 17Hz, J' 2,5Hz, 6a-CH), 4,22 (2H, d, J 7Hz, =CHCH2), 4,94 (IH, t, J 7Hz, =CHCH2), 5,27 (IH, s, 3-CH), 5,76 (IH, d, J 2,5Hz, 5-CH), 7,03 (IH, s, CHPh2), 7,46 (10H, s, aromatiske protoner).
Eksempel 19.
2-Benzyloxycarbonylamino-2-methoxycarbonylethylclavulanat.
CH-OH
—/H20H —> I
/ ^ y—Kw/ O \ o Λ v \ ΡΟΠΤΤ cooch2chcooch3 NHCOOCH2CgH5 500 mg benzyloxycarbonyl-L-serin-methylester og 143 mg dicyclo-hexylcarbodiimid sættes til en til 0°C afkølet og omrørt opløsning af 138 mg clavulansyre i 4 ml tetrahydrofuran. Reaktionsblandingen lades opvarme til stuetemperatur og omrøres natten over. Reaktionsblandingen filtreres, vaskes og tørres, og opløsningsmidlet fjernes under reduceret tryk, hvorved der fås en remanens, som chromato-graferes på silicagel og elueres med ethylacetat-hexan, hvorved der fås 103 mg af den i overskriften nævnte forbindelse i form af en gummi.
IR-Spektrum (CHC13): 3400, (bred, OH og NH), 1805 (β-lactam C=0), 1760 og 1725 (C=0 x 3) og 1700 cm-1 (C=C).
NMR-Spektrum (CDC13): d = 2,42 (IH, s, OH), 3,08 (IH, d, J 17H?, 6β-0Η), 3,58 (IH, d, J 17Hz, J' 2,5Hz, 6ct-CH) , 3,88 (3H, s, C00CH3) , 3,98 -5,15 (6H, m, =CHCH2 og C00CH2CH), 5,2 (IH, m, 3-CH), 5,25 (2H, s, CH2Ph), 5,73 (IH, d, J 2,5Hz), 6,01 (IH, m, NH), 7,53 (5H, s, aromatiske protoner).
Eksempel 20.
2-Amino-2-methoxycarbonylethylclavulanat-hydrochlorid.
3ί 145543
CH0OH CHo0H
n>=/ ry w J-V/ * /-K\/ <f \ o \
' V
COOCH0CH-COOCH, COOCH-CHCOOCH- 2 j 3 2 i 3 NHCOOCH2C6H5 NH2, HC1 85 mg 2-benzyloxycarbonylamino-2-methoxycarbonylethylclavulanat i 2 ml destilleret tetrahydrofuran indeholdende 10 mg eddikesyre hydrogeneres over 40 mg 10% palladium/kul. Efter 60 minutters forløb viser tyndtlagschromatografi (opløsningsmiddel:ethylace-tat) dannelse af et produkt og noget ikke-omsat udgangsmateriale. Katalysatoren frafiltreres, og filtratet inddampes, hvorved der fås en olie, som chromatograferes på én ionbytterkolonne ("Amber-lite"® IRA 401 i Cl--form) (eluering med ethylacetat-hexan), Ved inddampning af den resulterende opløsning fås det ønskede stof i form af en viskos gummi.
IR-Spektrum (flydende film): 1805 (β-lactam), 1760 (ester CO) og 1695 cm-1 (C=C).
NMR-Spektrum (D20): δ = 3,13 (IH, d, J 17Hz, δβ-CH), 3,57 (IH, dd, J 17Hz, J 3Hz, 6a-CH) , 3,8 (3H, s, OCH-j) , 4,14 (2H, d, J 7Hz, =CHCH2) , 5,70 (IH, d, J 3Hz, 5-CH), resterende spidser forstyrret af HOD.
Eksempel 21.
2-(2-Phenylsulfonyl)ethylclavulanat.
f^° ch2oh Ao ch2oh
/"V /-"Y
\ \ C00H COOCH«CH0SO_C H_ 2 2 2 6 5 32 145543
En opløsning af 199 mg clavulansyre i 8 ml tetrahydrofuran afkøles til 0°C og behandles med 206 mg dicyclohexylcarbodiimid, 79 mg py-ridin og 1,0 g β-(phenylsulfonyl)ethanol. Den omrørte opløsning lades antage stuetemperatur og omrøres ved stuetemperatur natten over. Suspensionen filtreres, og filtratet inddampes under reduceret tryk. Den vundne remanens chromatograferes på silicagel og elueres med ethylacetat-hexan-blandinger, hvorved der fås 155 mg af den i overskriften nævnte forbindelse i fom af en olie.
IR-Spektrum (CHC13): 3400 (bred OH), 1800 (β-lactam C=0), 1750 (ester C=0) , 1695 (C=C), 1310 og 1150 cm-1 (S02).
NMR-Spektrum (CDC13): S = 2,18 (IH, s, OH), 3,08 (IH, d, J 17Hz, 6β-0Η), 3,52 (IH, dd, J 17Hz, J' 2,5Hz, 6a-CH), 3,59 (2H, t, J 6Hz, CH2S02), 4,25 (2H, d, J 7,5Hz, =CHCH2), 4,57 (2H, t, J 6Hz, CH2CH2S02), 4,7 - 5,01 (2H, m, =CHCH2 og 3-CH), 5,7 (IH, d, J 2,5Hz, 5-CH), 7,5 - 8,2 (5H, m, Ph).
Eksempel 22.
2-Methylthioethylclavulanat.
CHo0H
COOH \ lCOOCH2CH2SCH3
En opløsning af 199 mg clavulansyre i 8 ml tetrahydrofuran afkøles til 0°C og behandles med 200 mg dicyclohexylcarbodiimid og 960 mg β-(methylthio)ethanol. Den omrørte opløsning lades antage stuetemperatur og omrøres ved denne temperatur natten over. Suspensionen filtreres, og filtratet inddampes under reduceret tryk. Den vundne remanens chromatograferes på silicagel og elueres med ethylacetat--hexan-blandinger, hvorved der fås 145 mg af den i overskriften nævnte forbindelse i form af en olie.
35 145543 IR-Spektrum (CHC13): 3400 (OH), 1805 (β-lactam C=0), 1750 (ester C=0), 1695 cm-1 (C=C).
NMR-Spektrum (CDC13): δ = 1,72 (IH, s, OH), 2,15 (3H, s, SCH-j) , 2,85 (2H, t, J 7Hz, CH2SCH3), 3,05 (IH, dd, J 17Hz, J' 1Hz, ββ-CH), 3,55 (IH, dd, J 17Hz, J' 2,5Hz, 6a-CH), 4,32 (2H, t, J 7Hz, CH2CH2SCH3), 4,30 (2H, d, J 7,5Hz, =CHCH2), 4,97 (IH, dt, J 7,5Hz, J' 1,5Hz, =CHCH2), 5,09 (IH, m, 3-CH), 5,73 (IH, dd, J 2,5Hz, J' 1Hz, 5-CH).
Eksempel 23.
2-Pyridylethylclavulanat.
0CH„OH CH_OH
=/ -> ΓΤ >=/* 'cooh cooch2ch2-^ h
En opløsning af 135 mg clavulansyre i 5 ml tetrahydrofuran afkøles til 0°C og behandles med 200 mg (2,5 ækvivalenter) 2-(2-hydroxy-ethyl)pyridin og 143 mg (1 ækvivalent) dicyclocarbodiimid. Den omrørte opløsning lades antage stuetemperatur og omrøres ved denne temperatur natten over. Suspensionen filtreres, og filtratet inddampes under reduceret tryk. Den vundne remanens chromatograferes på silicagel og elueres med ethylacetat indeholdende 5% methanol, hvorved der fås 100 mg af den i overskriften nævnte forbindelse i form af en olie.
IR-Spektrum (CHC13) : 3400 (OH) , 1805 (β-lactam OO) , 1750 (ester C=0) og 1695 cm-1 (C=c) .
NMR-Spektrum (CDC13) : δ = 2,20 (1*1, s, OH), 2,97 (IH, d, J 17Hz, ββ-CH), 3,11 (2H, t, J 7Hz, CH2CH2Py), 3,42 (IH, dd, J 17Hz, J* 2,5Hz, 6a-CH), 4,15 (2H, d, J 7Hz, =CHCH2), 4,45 - 4,9 (3H, m, CH2CH2Py og =CHCH2), 4,97 (IH, m, 3-CH), 5,51 (IH, d, J 2,5Hz, 5-CH), 7,0 - 7,4 (2H, m, pyridyl-3-CH og 5-CH), 7,45 - 7,85 (IH, m, pyri- 34 145543 dyl-4-CH), 8,35 - 8,70 (IH, m, pyridyl-6-CH).
Eksempel 24.
Phthalimidomethylclavulanat.
Æo CH„OH ^
-r Λ / λ CHo0H
’PO^ COONa COOCH2N \ 1,95 g phthalimidomethylchlorld sættes til en omrørt opløsning af 221 mg natriumclavulanat i 2 ml tørt dimethylformamid, og opløsningen lades henstå ved stuetemperatur i 4 timer. Opløsningen behandles med ethylacetat og vand og rystes grundigt. Den ikke--vandige fase fraskilles, tørres og inddampes under reduceret ttyk, hvorved der fås en remanens, som krystalliseres af ethylacetat-pe-troleumsether (kogeinterval 40 - 60°c), hvorved der fås 130 mg af den i overskriften nævnte forbindelse, smeltepunkt 163°C.
IR-Spektrum (CHCl^: 3400 (bred, OH), 1805 (β-lactam C=0), 1785, 1760 og 1735 cm ^ (phthalimidyl C=0, ester C-0).
NMR-Spektrum: δ = 1,7 (IH, s, OH), 3,08 (IH, d, J 17Hz, ββ-CH), 3,56 (IH, dd, J 17HZ, Jr 2,5Hz, 6<x-CH) , 4,25 (2H, d, J 7,0Hz, =CHCH2), 4,95 (IH, dt, J 7,5Hz, J' 1Hz, *CHCH2), 5,11 (IH, d, J 1Hz, -3-CH), 5,75 (IH, d, J 2,5Hz, 5-CH), 5,87 (2H, d, CH^Phth), 7,75 - 8,2 (4H, m, Phth).
Eksempel 25.
Allylclavulanat.
35 U5543
ro CH2°h CH-OH
W L, rTw 2 rf r^i COONa COOCH2CH=CH2
Til en omrørt opløsning af 2,05 g natriumclavulanat-tetrahy-drat i 9 ml tørt dimethylformamid sættes 2,44 ml allylbromid. Blandingen omrøres ved stuetemperatur i 3 timer, hvorefter opløsningsmidlet fjernes under vakuum ved under 30°C. Remanensen fordeles mellem vand og ethylacetat. Ethylacetatfasen vaskes med vand, tørres over magnesiumsulfat og inddampes. Remanensen renses ved kolonnechromatografi (Kieselgel 60/ethylacetat, Rf-værdi^0,53), hvorved der fås 1,31 g af den i overskriften nævnte forbindelse i form af en olie.
XR-Spektrum (film): 3400, 1805, 1745 og 1695 cm NMR-Spektrum (CDCl^, 90MHg): 6 = 1,98 (IH, singlet udskiftelig), 3,02 (IH, dublet, J 17Hz), 3,46 (IH, dobbelt dublet, J 17Hz x 3Hz), 4,19 (2H, dublet, J 7Hz), 4,61 (2H, dublet med finere kobling J 6Hz), 4,88 (IH, triplet med fin kobling, J 7Hz), 5,02 (IH, singlet med fin kobling), 5,29 (2H, triplet med fin kobling, J 8Hz), 5,64 (IH, dublet, J 3Hz), 5,7 - 6,1 (IH, multiplet).
Eksempel 26.
Acetonylclavulanat.
£H20H ^ o CH20H
—> i C
/ x /—V
\ ° \ c0ONa COOCH2COCH3 36 145543
Til en omrørt opløsning af 2,05 g natriumclavulanat-tetrahydrat i 9 ml tørt dimethylformamid sættes 2,35 ml bromacetone. Blandingen omrøres natten over ved stuetemperatur, hvorefter opløsningsmidlet fjernes i vakuum ved under 30°C. Remanensen fordeles mellem vand og ethylacetat. Ethylacetatopløsningen vaskes med vand, tørres over magnesiumsulfat og inddampes. Esteren isoleres ved kolonnechromato-grafi, (Kieselgel 60/ethylacetateluant, Rf-værdi 0,36),hvorved der fås 565 mg af den i overskriften nævnte forbindelse.
IR-Spektrum (film): 3400, 1800, 1755 og 1730 cm NMR-Spektrum (CDCl^ 90MHg): 6 = 2,14 (3H, singlet), 2,20 (IH, bred udskiftelig), 3,04 (IH, dublet, 17Hz), 3,46 (IH, dobbelt dublet, J 17Hz x 3Hz), 4,20 (2H, dublet med fin kobling, J 8Hz), 4,7 (2H, singlet), 4,97 (IH, dobbelt triplet, Jtr^p 8Hz, JdQub'x«l,5Hz) , 5,12 (IH, fint koblet singlet), 5,67 (lH, dublet J 3Hz).
Eksempel 27.
Cyclohexylclavulanat.
_^n CH,0H ^ CH.OH
COOH 'COO—/ \
En opløsning af N-ethoxycarbonyl-N-nitrosocyclohexylamin (1,4 g -fremstillet ved omsætning af nitrogendioxid på N-ethoxycarbonyl--cyclohexylamin i CC14 i nærværelse af vandfrit natriumacetat) i 25 ml dichlormethan ved 0°C behandles med 0,62 ml pyrrolidin og omrøres ved 0°c i 30 minutter. Til denne opløsning sættes i løbet af 5 minutter en opløsning af clavulansyre i tetrahydro-furan (fremstillet ved hydrogenering af 1 g benzylclavulanat i 30 ml tetrahydrofuran over 10%'s palladium/kul). Den resulterende opløsning behandles med en overskydende mængde natriumhydrogencar-bonatopløsning. Den resulterende blanding ekstraheres med flere portioner chloroform, og chloroformopløsningen tørres over magnesium 37 145543 sulfat og inddampes. Ved gentagen chromatografi (to gange med 1:1 ethylacetat:cyclohexan og én gang med chloroform på Kieselgel H) fås 46 mg af den i overskriften nævnte forbindelse.
IR-Spektrum (film): 3400, 18Q0, 1740 og 1695 cm \ NMR-Spektrum (CDC13): 6 = 1,1 - 2,0 (11H, m IH udskiftelig), 3,01 (IH, d, J = 16Hz), 3,45 (IH, dd, J = 16 og 3Hz), 4,17 (2H, d, J = 7Hz), 4,5 - 5,0 (IH, m), 4,87 (IH, t, J= 7Hz), 4,96 (IH, s), 5,63 (IH, d, J - 3Hz) .
Eksempel 28.
Propargylester.
^0 CH„OH ^
-^ \ / 2 ___>^0 CH2°H
,,_/ + HC^C-CH_Pr-> / ' / Y J—'w \ O ' C00Na 'cooch2-c=ch 4,4 g (0,015 mol) natriumclavulanat-tetrahydrat opløses i 25 ml tørt dimethylformamid, og under omrøring tilsættes langsomt 1,6 ml (2,53 g, 0,0212 mol) propargylbromid. Blandingen omrøres ved stuetemperatur i 2 timer og hældes derefter ud på 250 ml vand, og produktet ekstraheres tre gange med hver gang 100 ml ethylacetat. De samlede ethylacetatekstrakter vaskes fire gange med hver gang 100 ml vand og tørres over magnesiumsulfat. Den klare, tørre ethylacetatopløsning inddampes til tørhed i vakuum, hvorved der fås en tyk olie, som ifølge tyndtlagschromatografi (silicagel-plader/ethylacetat-fremkaldningsmiddel) indeholder to komponenter.
(S)
Olien opløses i 2 ml chloroform og chromatograferes på "Sephadex"^ LH20 under anvendelse af en l:l-blanding af chloroform og cyclohexan som eluent. Fraktionerne (25 ml) undersøges ved tyndtlagschromatografi, og de fraktioner, som indeholder den hurtigstløbende komponent i antagelige mængder, sammenhældes og inddampes i vakuum, hvorved 38 145543 der fås 2,2 g af en tyk olie. Denne olie størkner ved henstand natten over. Tyndtlagschromatografisk analyse viser kun én komponent. NMR-Spektrum viser tilstedeværelse af noget chloroform.
Produktet vaskes med ether, hvorved der fås 700 mg af et fast stof (smeltepunkt 65 - 66°C). Den lave genvinding skyldes stoffets kendelige opløselighed i dette opløsningsmiddel. Der fås de nedenfor anførte forsøgsresultater:
Analyse:
Beregnet for C 55,69 H 4,68 N 5,91
Fundet : C 55,55 H 4,68 N 6,12.
NMR-Spektrum (CDCl-j) : 8 = 2,01 (s IH), 2,6 (t IH) , 2,95 - 3,75 (m 2H), 4,29 (d 2H) , 4,79 - 5,00 (m 3H) , 5,13 (d IH ) , 5,75 (d IH) .
Eksempel 29.
4-Methoxybenzylester.
CH20H ^2^ II ✓As —r^°\ 9H 2oh _L_ ♦ O —» i
\ V /—*V
C00Na OCH, ° 1 3 cooch2c6h4och3 18,2 g natriumclavulanat (ca. 0,07 mol vandfrit natriumclavulanat, vandindhold 22,8%) opløses i 100 ml dimethylformamid og behandles med en opløsning af 13,5 g (0,07 mol) 4-methoxybenzylbromid i 25 ml dimethylformamid. Den klare opløsning omrøres ved stuetemperatur i 80 minutter og fortyndes derefter med 300 ml ethylacetat og 200 ml vand. Den vandige fase fraskilles og genekstraheres med 300 ml ethylacetat. Ethylacetatekstrakterne sammenhældes og vaskes seks gange med hver gang 200 ml vand og tørres over magnesiumsulfat.
Ved inddampning fås 19,5 g af en olie.
59 145543
Olien opløses i chloroform/cyclohexan i forholdet 1:1 og chroma-tograferes på en 65 x 400 mm kolonne af "Sephadex"® (500 g, LH20, fremstillet i en l:l-blanding af chloroform og cyclohexan). Fraktionerne indeholdende den ønskede ester sammenhældes og inddampes i vakuum, hvorved der fås en lysegul olie. Ved triturering med n-hexan fås et fast pulverformet produkt, som frafiltreres, vaskes på filterkagen med frisk n-hexan og tørres i vakuum, hvorved der fås 12,6 g (57% af det teoretiske), smeltepunkt 54,5 - 55,5 C.
IR-Spektrum (KBr-plade): ^max = 3400, 2950, 2840, 1795, 1735, 1690, 1615, 1515, 1305, 1250, 1175, 1005, 890 og 825 cm-1.
Det samme produkt kan fremstilles ud fra clavulansyre i tetrahydro-furanopløsning og 4-methoxybenzylalkohol og dicyclohexylcarbodiimid.
Udbytte (i 0,0052 møl-skala) 0,3 g (18% af det teoretiske).
Eksempel 30.
4-Nitrobenzylester.
CELBr I—X f.,o.
ΓΓ r7 , π _ nV
COONa N02 0 i:00CH2C6H4N02(p) 2,4 g natrium-clavulanat (ca. 0,01 mol, vandindhold 10%) opløses i 1 ml dimethylformamid og behandles med 2,2 g (ca. 0,01 mol) 4-ni-trobenzylbromid ved. stuetemperatur i 40 minutter. Blandingen fortyndes med 100 ml ethylacetat, vaskes fem gange med hver gang 60 ml vand og med 50 ml saltvand, tørres over magnesiumsulfat, filtreres og inddampes, hvorved der fås en olie. Olien tritureres med n-hexan og giver hurtigt et krystallinsk produkt. Det størknede produkt knuses i n-hexan, filtreres, vaskes på filterkagen med frisk opløsningsmiddel og tørres i vakuum.
40 145543
Udbytte 2,7 g (81% af det teoretiske), smeltepunkt 110 - 112°C.
Analyse:
Beregnet for ci5H24N2°7: C 53,89 H 4,22 N 8,38
Fundet ' :. C 54,07 H 4,30 N 8,32.
NMR-Spektrum (CDC13) : 8,25, 8,10, 7,55, 7,40 (ABq, 4H,—^~^—) , 5,70 (d, IH, C5H), 5,25 (s, 2H, CO.O.CH2-) , 5,05 (m, IH, C-jH) , 4,75 (m, IH^H), 4,10 (d, 2H, -CH20) , 3,2 (m, 2H, CHjj ), 1,95 (s, IH, OH).
J-'
Eksempel 31.
6-Me thoxynaphth-2-ylmethyles ter.
CH9OH
—_ / vyysiHj51 ^>0 CH20H
0JX/ COONa ^ xa
En opløsning af 2,2 g vandfrit natriumclavulanat (10 millimol) OCH3 og 2,51 g 6-methoxy-2-brommethylnaphthalen (10 millimol) i 80 ml tørt dimethylformamid omrøres ved stuetemperatur. Efter 3 timers forløb viser tyndtlagschromatografisk analyse, at der ikke mere er brommethylnaphthalen til stede i reaktionsblandingen. Reaktionsopløsningsmidlet fjernes i vakuum ved 30°C, og remanensen behandles med 100 ml ethylacetat. Suspensionen filtreres, og filtratet vaskes to gange med hver gang 25 ml vand, tørres over magnesiumsulfat, filtreres og inddampes, hvorved der fås 3,2 g af en orangefarvet olie. Ved chromatografi af dette produkt på "Sephadex" ®LH20 (100 g) (eluent chloroform:cyclohexan i forholdet 50:50, opsamling af fraktioner på 10 ml; fraktionerne 12 - 20 indeholder den ønskede ester som bestemt ved tyndtlagschromatogra-fi og visualiseret med TTC-spray*) fås en klar.olie, som størkner 41 . 145543 ved henstand. Dette materiale opløses i dichlormethan, og der tilsættes petroleumsether (kogeinterval 60 - 80°C), indtil opløsningen bliver uklar. Ved henstand i et åbent bægerglas dannes en gummi.
Den overstående væske lades afdampe yderligere, og der dannes 2,52 g af et hvidt krystallinsk fast stof, smeltepunkt 89 - 90°C (68% af det teoretiske).
Analyse:
Beregnet for C20H19NO65 C 65,04 H 5,15 N 3,79 Fundet : C 64,91 H 5,00 N 3,77.
NMR-Spektrum (CDC13): 6 = 1,45 (IH, bs, CH2OH), 2,9 (IH, d, 60-H), 3,36 (IH, dd, 6a-H), 3,8 (3H, s, OCH3), 4,03 (2H, d, CH20H), 4,7 (IH, t *—H), 4,93 (IH, s, CHCOO-), 5,27 (2H, s, -CH20C0), 5,65 (IH, d, 5β-Η), 7,37 (6H, m, aromatiske H'er).
* 4% triphenyltetrazoliumchlorid i methanol + et lige så stort rumfang methanolisk IN NaOH.
Eksempel 32.
2-Hethoxyethylester.
1) soci2 g:h2oh ch3och2ch2oh ch3och2ch2i > ΓΤ^=/ 000CH2CH2OCH3 43 g (0,455 mol) 2-methoxyethylchlorid (JACS 1930, 5*2, 653) sættes til en opløsning af 75 g (0,50 mol) natriumiodid i 500 ml acetone, og reaktionsblandingen opvarmes til kogning under tilbagesvaling 13-4 timer. Størstedelen af acetonet afdestilleres ved atmosfæretryk, og remanensen afkøles og fortyndes med 200 ml ether. Den etheriske opløsning filtreres fri for uorganiske salte og vaskes derefter med 100 ml saltvand, 100 ml 5%'s vandigt natriumthio-sulfat og igen med 100 ml saltvand i den anførte rækkefølge og tørres over magnesiumsulfat. Efter filtrering fjernes etheren ved destillation under atmosfæretryk, og produktet isoleres ved destillation, idet den fraktion, som koger mellem 130 og 140 C (atmosfære 42 145543 tryk) opsamles. Produktet, en tung lysegul væske, vejer 20 g (23% af det teoretiske i tilfælde af 100%'s renhed).
Til en opløsning af 6 g (0,0205 mol) natriumclavulanat-tetrahydrat i 100 ml dimethylformamid sættes 5,6 g (0,03 mol) 2-methoxyethyliodid ved stuetemperatur. Reaktionen omrøres i 5 timer, hvorefter tyndt-lagschromatografi (siliciumdioxidplader fremkaldt i ethylacetat, pletter visualiseret med alkalisk TTC-spray, R^-værdi 0,0 for na-triumclavulanat, R^-værdi 0,5 for ester) viser nogen esterdannelse. Reaktionsblandingen fortyndes med 200 ml ethylacetat og 500 ml vand, den vandige fase reekstraheres med 100 ml ethylacetat, og de samlede organiske ekstrakter vaskes fire gange med hver gang 100 ml vand, med 100 ml IN natriumhydrogencarbonatopløsning og tre gange med hver gang 100 ml vand igen og tørres over magnesiumsulfat. Efter filtrering inddampes opløsningsmidlet i vakuum, og den således vundne ester fås i form af en lysegul olie, som endelig tørres under stærkt vakuum til fjernelse af de sidste spor af opløsningsmiddel og ikke-omsat iodforbindelse. Ifølge PMR-spektrum er det vundne produkt i det væsentlige rent. Udbytte: mindre end 5% af det teoretiske.
PMR-Spektrum (CDCl^): <$ - 5,65 (IH d) , 5,05 (IH, s) og 4,9 (IH t) overlappende hinanden, 4,2 (4H m), 3,6 (2H m), 3,35 (3H, s) ligger over 3,3 (IH m), og 2,9 (IH s) .
Eksempel 33,
Dyrkning af Streptomyces clavuligerus. .
Streptomyces clavuligerus dyrkes ved 26°C på agarskråkultur indeholdende 1% "Yeatex" (gærekstrakt), 1% glucose og 2% "oxoid" agar nr. 3, pH-værdi 6,8. Et sterilt øje anvendes til at overføre mycelium og sporer fra skråkulturen i 100 ml af et flydende medium i en 500 ml Erlenmeyer-kolbe. Det flydende medium har nedenstående sammensætning: r "Oxoid" maltekstrakt 10 g/liter "Oxoid" bakteriologisk pepton 10 g/liter
Glycerol 20 g/liter
Ledningsvand 1 liter.
145543 43
Mediet indstilles på pH-værdi 7 ved tilsætning af natriumhydroxid- opløsning, og 100 ml's rumfang fordeles i kolberne, som lukkes med 2 skumpropper før autoklavering ved 1,0545 kg/cm i 20 minutter. En
O
podet kimkolbe rystes i 3 dage ved 26 C på et rotationsrysteapparat med en slaglængde på 5 cm. og en hastighed på 240 omdrejninger/mi-nut. Produktionstrinskolber indeholdende det flydende medium som ovenfor beskrevet podes med 5%'s vegetativt inokulum og dyrkes under samme betingelser som kimkolben. Prøver af kulturfiltrat undersøges for inhibitorvirkning mod β-lactamase fra Escherichia coli JT4. Optimal aktivitet fås efter 3 dages forløb. Resultaterne er anført i nedenstående tabel I. En zone af clavulansyre ved R^-værdi 0,46 afsløres, når kulturfiltratet undersøges ved den ovenfor beskrevne papirchromatografiske metode. Væksten i zonens størrelse svarer til væksten i β-lactamase-inhibitorstyrkebestemmelsen.
Streptomyces clavuligerus dyrkes også i 2-liters rystekolber indeholdende 400 ml af medium (produktionstrin) under anvendelse af samme medium og dyrkningsbetingelser som beskrevet tidligere i dette eksempel. I disse større beholdere er organismens vækst langsommere, og den optimale β-lactamase-inhiberende virkning fås 7-9 dage efter podningen med den vegetative kim. Resultaterne er også anført i tabel I.
Tabel·I.
β-Lactamase-inhiberende virkning af Streptomyces clavuligerus.
Vækst i 500 ml's og 2000 ml's kolber.
% inhibering af Escherichia coli-β-lactamase ved en endelig fortynding på Fermenteringstid (dage) 1/2500 af kulturfiltratet _500 ml's rystekolbe 2000 ml's rystekolbe 1 15 - 2 30 - 3 55 - 4 50 10 5 51 21 6 57 36 7 - 51 8-53 9 - 50.
145543 44
Eksempel 34.
Dyrkning af Streptomyces clavuligerus.
En "Yeatex"/glucose-stam-agarskråkultur anvendes til at pode en "yeatex"/glucose-agarskråkultur'i en Roux-flaske ved fremstilling af en mycelium/sporesuspension i sterilt vand. Roux-flaskens's skrå-„kultur inkuberes ved 26°C i 10 dage. Til denne skråkultur sættes 100 ml sterilt vand, og en myceliesuspension fremstilles.
Denne anvendes til at pode 50 liter dampsteriliseret kimmedium med nedenstående sammensætning i ledningsvand: "Oxoid" maltekstrakt 1 vægt/volumenprocent "Oxoid” bakteriologisk pepton 1 vægt/volumenprocent
Glycerol 1 vægt/volumenprocent 10% "Pluronic L81" antiskum- middel i sojabønneolie 0,05 vægt/volumenprocent.
('Pluronic" markedsføres af Jacobs and Van den Berg UK Ltd., 231 The Vale, London, W3, og indeholder en polypropylen-polyethylen blokpolymer, og sojabønneolie markedsføres af British Oil and Cake Mills Ltd., Stoneferry Road, Hull, Storbritannien).
Mediet er i en 90 liters rustfri stålfermenteringsbeholder med prelpla-der og omrøres af en 12,5 cm vingeskiverotor ved 240 omdrejninger/ minut. Der ledes steril luft ind med en hastighed på 50 liter/minut, og tanken inkuberes ved 26°C.
Efter 72 timers forløb anvendes kimfermentet til at pode 150 liter af samme medium under anvendelse af en 5 volumen/volumenprocents tilsætning ved en steril overførsel. Dette produktionstrinsmedium . er i en 300 liters rustfri stålfermenteringsbeholder, helt forsynet med prelplader, og omrørt af en 21,6 cm's vingeskiverotor med 210 omdrej ninger/minut. Steril luft indblæses i en mængde på 150 liter/ minut. Fermenteringen bibeholdes ved 26°C. Der tilsættes, når det er nødvendigt, antiskummiddel i 10 ral's portioner (10% "Pluronic L81" i sojabønneolie). Med regelmæssige mellemrum udtages prøver til bestemmelse af β-lactamase-inhibering. Det fermenterende stof høstes mellem 4. og 5. dag på det optimale niveau for β-lactamase-inhi-berende virkning, og resultaterne er anført i tabel II.
45 145543
Tabel II.
β-Lactamase-inhiberende virkning i prøver af kulturfiltrat udtaget fra en 300-liters fermenteringsbeholder med Streptomyces clavuligerus.
Fermenteringstid % inhibering ved β-lactamase-inhiberings- (dage) ___forsøg i en endelig fortynding på 1/2500 1,0 12 1.5 20 2.0 31 2.5 36 3.0 50 3.5 54 4.0 51 4.5 56 5.0 55.
Eksempel 35.
Isolering af råt clavulansyre-natriumsalt.
Indhøstet kulturvæske, der er fremstillet som beskrevet i eksempel 34, klares ved kontinuerlig flydende centrifugering, og myceliet kasseres. Af 150 liter fermentationsvæske fås 120 liter klaret kulturvæske. Dette filtrat viser 58%'s inhibering i β-lactamase--inhiberingsforsøget i en fortynding på 1/2500. Filtratet afkøles til 5°C, og der tilsættes 40 liter n-butanol. Blandingen omrøres, og der tilsættes 25%'s I^SO^, indtil pH-værdien er 2,0. Den syrnede blanding omrøres i yderligere 10 minutter, før faserne adskilles ved centrifugering. Den vandige fase kasseres. Til n-butanoleks-trakten sættes 0,5% "Norit GSX", og blandingen omrøres i 15 minutter. Kullet kasseres efter fjernelse ved filtrering under anvendelse af diatoméjord som filterhjælpestof. Til n-butanolet sættes en fjerdedel rumfang deioniseret vand, og blandingen omrøres, medens der tilsættes 20%'s NaOH-opløsning, indtil pH-værdien har indstillet sig på 7,0. Faserne adskilles ved centrifugering, og n-butanolfasen kasseres. Den vandige fase inddampes under reduceret tryk til 800 ml, hvorefter den frysetørres. Derved fås 35 g af et råt fast clavulansyreprodukt med en I5Q-værdi på 1,3 yug/ml ved β-lactamase-inhiberingsforsøget. Dette faste præparat oplagres tørt ved -20°C, inden det renses yderligere.
46 145543
Eksempel 36.
- Isolering af råt clavulansyre-natriumsalt.
1 liter kulturfiltrat med 53%'s inhibering ved 1/2500 i β-lactamase-inhiberingsforsøget percoleres ned over en 2,54 cm x 15,24 cm søjle af "Permutit Isopore harpiks FF IP (SRA 62)" i Cl -form (markedsført af Permutit Co. Ltd., 632 - 652 London Road, Isleworth,
Middlesex, Storbritannien). Kulturfiltratet efterfølges af 300 ml destilleret vand for at vaske søjlen. Eluering af den aktive β-lactamase-inhibitor udføres med 0,2M NaCl-opløsning. Der opsamles 20 ml's fraktioner, og de undersøges i en endelig fortynding på 1/2500 ved β-lactamase-inhiberingsforsøg. Aktive fraktioner sammenhældes og inddampes under vakuum til 20 ml. Denne opløsning afsaltes ved geludelukkelseschromatografi på en "Biorad Biogel P2"-søjle med en diameter på 3,81 cm og et gelleje på 40,64 cm og elueres med 1% n-butanol i vand ("Biogel P2" markedsføres af Biorad Laboratories, 32nd and Griffin Avenue, Richmond, California, U.S.A.). De aktive fraktioner, bestemt ved β-lactamase-inhiberings-forsøget, sammenhældes. Natriumchlorid elueres efter clavulansyre og bestemmes under anvendelse af sølvnitratopløsning. De kombinerede aktive fraktioner inddampes og frysetørres.
Af .1 liter kulturfiltrat fås ved den ovenfor angivne behandling 0,45 g råt fast clavulansyreprodukt med en I5g-værdi ' på 0,92^ug/ml. Dette faste stof oplagres ved -20°C inden yderligere rensning.
Eksempel 37.
Isolering af råt clavulansyre-natriumsalt.
Kulturfiltrat indeholdende 300^,ug/ml clavulansyre syrnes under anvendelse af et "in-line"-mixersystem og ekstraheres med n-butanol, og clavulansyre tilbageekstraheres i vand ved neutral pH-værdi.
Afkølet kulturfiltrat (5 - 10°C) pumpes til en "in-line"-mixer, ved hvis tilledning der sættes en tilstrækkelig mængde 6 volumen/volumen- 47 145543 procent salpetersyre til at holde en udgangs pH-værdi på 2,0 - 0,1.
Det syrnede filtrat ledes med en hastighed på 4 liter/minut gennem en glycolkølet pladevarmeveksler (A.P.V. Ltd.) for at holde en temperatur mellem 2 og 5°C. pH-Værdien måles i en gennemstrømningscelle, før væsken ledes ind i en tretrinsmodstrømsseparator (Westfalia Separator Ltd., model EG 1006).
Med afkølet vand mættet n-butanol (ved ca. 5°C) pumpes med en hastighed på 3 liter/minut ind i modstrømsseparatoren.
Det vandige udløb fra modstrømsseparatoren ledes bort. Indledt vand fjernes fra butanoludstrømningen fra modstrømsseparatoren under anvendelse af en vaeske/væske-centrifugalseparator (Alfa Laval Ltd., model 3024X - G). Butanolet opsamles i en rustfri ståltank forsynet med en kølekappe, i hvilken det oplagres ved ca.
5°C.
Fra tanken fjernes 40 liter prøver, og de blandes grundigt med 2 liter afkølet vand (5°C) mættet med n-butanol. pH-Værdien i denne blanding indstilles på 6,8 - 0,1 under anvendelse af 20%'s natriumhydroxidopløsning.
Denne vandige ekstrakt/butanolblanding ledes ind i en væske/væskecen-trifugalseparator (Sharpies Centrifuge Ltd., model M35PY - 5 PH) med en tilpumpningshastighed på 2 liter/minut.
Af 1800 liter kulturfiltrat isoleres 90 liter vandig fase indeholdende 39% af den clavulansyre, som er i kulturfiltratet.
15 liter af den vandige ekstrakt indstilles fra 2% til 8% totalfaststof ved tilsætning af 60 g natriumchlorid/liter og forstøvningstørres (Anhydro, København, type Lab. S 1). Betingelserne er: fødehas-tighed 2 liter/time; forstøverspænding 170 volt; heaterstilling 6 -7; indgangstemperatur 150°C; udgangstemperatur 80°C.
Det tørrede produkt med en totalvægt på 1 kg indeholder 62% af den clavulansyre, som er i den tilledte opløsning.
De resterende 75 liter vandig ekstrakt koncentreres ved ultrafiltrering (De Danske Sukkerfabrikker, laboratoriemodul, membrantype 48 145543 900). Driftsteknikken er at recirkulere retentatet fra en rustfri ståltank forsynet med et kølesystem og med en udgangsventil sat på en sådan måde, at der fås et differentialtryk hen over 40 membraner på 25 atmosfærer. Temperaturen holdes ved 2 - 5°C, og pH-vær-dien holdes ved 6/8 - 0,1 ved tilsætning af 2N saltsyre efter behov. Rumfanget reduceres til 34 liter, som indeholder 72% af den clavulansyre, som er i den tilledte opløsning.
Det vandige koncentrat oplagres ved ca. 5°C, indstilles på et faststofindhold på 8% og forstøvningstørres som ovenfor beskrevet. Det tørrede materiale indeholder 75% af clavulansyren i den til forstøvningstørringsapparaturet ledte opløsning.
Det totale forstøvningstørrede produkt fra 90 liter vandig ekstrakt indeholder 69,4 g clavulansyre, hvilket er 72% af clavulansyren i forstøvningstørringstilgangsvæsken og 21% af clavulansyren i de 1800 liter kulturfiltrat.
Eksempel 38.
Partiel rensning af rå clavulansyre.
Rå clavulansyrepræparater fremstillet som beskrevet i eksempel 3g renses ved ionbytterchromatografi. 18 g materiale fremstillet som beskrevet i eksempel 36 med en I5Q-værdi på l,3^ug/ml (endelig ' koncentration) opløses i 25 ml destilleret vand og hældes på et 3,81 cm x 40,64 cm leje af "Permutit FF IP (SRA 62)" harpiks i Cl -form. Søjlen elueres med en natriumchloridgradient dannet ved tyngdekrafttilledning af 0,5M natriumchlorid til et blandekar indeholdende 1 liter destilleret vand, som igen ledes til chroma-tdgrafisøjlen. 10 ml's fraktioner opsamles, og den β-lactamase-in-hiberende virkning undersøges under anvendelse af en 1/2500 fortynding af fraktionerne. Aktiviteten elueres efter et hovedfarvebånd mellem fraktionerne 24 og 30. De aktive fraktioner sammenhældes og koncentreres til 30 ml.
Denne opløsning afsaltes under anvendelse af et 5,08 cm x 45,72 cm leje af "Biorad Biogel P2" og elueres med 1% n-butanol i vand.
20 ml's fraktioner undersøges for clavulansyreindhold under anven- 4β 145543 delse af β-lactamaseinhiberingsforsøg. Fraktionerne sættes også på papirsstrimler, og der forstøves med enten "Ehrlich"- eller triphe-nyltetrazolium-forstøvningsreagenser som beskrevet i eksempel 4. Deh β-lactamase-inhiberende virkning korreleres med henholdsvis lyserøde og røde pletter, som fremkaldes af disse reagenser. Aktive fraktioner sammenhældes, med undtagelse af sådanne, som indeholder natriumchlorid, og inddampes til tørhed under vakuum. Derved fås 520 mg partielt renset clavulansyre-natriumsalt med en I^Q-værdi på 0,2^ug/ml ved standard β-lactamase-inhiberingsforsøget.
Tyndtlagschromatografi (silicagel) af dette clavulansyrepræparat giver følgende R^-værdier: n-butanol/ethanol/vand i forholdet 4:1:5 volumen/volumen, topfase, Rf-værdi 0,37; n-*butanol/eddikesyre/vand i forholdet 12:3:5 volumen/volumen, R^-vær-di 0,44; isopropanol/vand i forholdet 7:3 volumen/volumen, R^-værdi 0,78.
.Disse zoner bestemmes ved påsprøjtning af "EhrlichH-reagens. 6-Ami-nopenicillansyre lades løbe med som markeringsstof og bestemmes med samme sprøjtemiddel og har R^-værdier på henholdsvis 0,38, 0,39 og 0,77. · , : . :
Eksempel 39.
Partiel rensning af clavulansyre-natriumsalt.
Kulturfiltrat fremstillet som beskrevet i eksempel 34 opløsnings-middelekstraheres som beskrevet i eksempel 35, hvorved der fås et fast præparat, som yderligere renses ved ionbytningschromatografi under anvendelse af "Whatman" diethylaminoethylcellulose DE 52.
Dette faste stof (10 g) opløses i 20 ml destilleret vand og hældes på en 3,81 cm x 50,80 cm søjle af DE 52-cellulose, som i forvejen er ækvilibreret med 0,1M natriumphosphatpuffer med pH-værdi 7,5.
Søjlen elueres med en NaCl-gradient. 0,1M NaCl i 0,01M natriumphosphatpuf fer med pH-værdi 7,5 ledes ind i et mixerkammer indeholdende 1 liter 0,01M phosphatpuffer med pH-værdi 7,5, som igen ledes på søjlen. 10 ml's fraktioner opsamles, og de undersøges for β-lactamase-inhiberende virkning ved fortynding på 1/2500. Fraktionerne undersøges også for antibaktériel virkning ved hul- 50 145543 pladeforsøgsmetoden under anvendelse af næringsagarplader, på hvilke der er udpodet Klebsiella aerogenes. Fraktionerne med den højeste β-lactamase-inhiberende virkning og med inhiberingszoner i hulpladeforsøget sammenhældes, inddampes og afsaltes på en "Biorad Biogel P2"-søjle. Disse fraktioner vises ved hjælp af papirchro-matografi og tyndtlagschromatografi at indeholde clavulansyre.
Eksempel 40.
Isolering af fast clavulansyre-natriumsalt.
Et partielt renset fast præparat af clavulansyre (500 mg) fremstillet som beskrevet i eksempel 38 hældes på en "Whatman" mikrokry-stallinsk CC 31-cellulosesøjle med en lejestørrelse på 2,54 cm x 50,8ø cm. Det chromatografiske opløsningsmiddel er n-butanol/ethanol/ vand i volumen/volumen-forholdet 4:1:5, topfase. Søjlen drives ved 4°C, og der opsamles fraktioner på 4 ml. Fraktionerne undersøges for tilstedeværelse af clavulansyre ved at blive sat på filterpapir og sprøjtet med "Ehrlich" (lyserøde prøver)- eller triphenyltetrazolium (røde prøver)-forstøvningsreagens. Disse pletprøver -bekræftes ved β-lactamase-inhiberingsforsøg i en fortynding på 1/1250. Aktive fraktioner sammenhældes og tørres under vakuum på en roterende fordamper. Det faste stof opløses i et ringe volumen destilleret vand og frysetørres. Der fås 40 mg af et hvidt fast præparat af natriumsaltet af clavulansyre med en I,jQ-værdi på 0,08^ug/ml i β-lactamase-inhiberingsforsøget.
Eksempel 41.
Isolering af fast clavulansyre-natriumsalt.
Koncentreret reekstrakt (6 liter) (fra ultrafiltrering ifølge eksempel 37) indeholdende 10 g clavulansyre ifølge β-lacta-mase-inhiberingsforsøget som ovenfor beskrevet. Dette percderes med en hastighed på 1 liter/time på en 5,08 cm x 60,96 cm søjle af "Permutit Zerolit FF 1 P SRA 62"-anionbytterharpiks i qhlorid-form. Søjlen vaskes derefter med 2 liter deioniseret vand før eluering med en natriumchloridgradient. Gradienten dannes af et reservoir indeholdende 4 liter 1,4M NaCl, som ledes til et omrørt reservoir inde 5Ί 145543 holdende 4 liter 0,7M NaCl, som igen føres til et omrørt reservoir indeholdende 4 liter deioniseret vand, som via en pumpe er forbundet med søjlen. Søjlen elueres med'· en hastighed på 2,5 ml/ minut, og der opsamles fraktioner på 25 ml. Fraktionerne undersøges ved hjælp af β-lactamase-inhiberingsforsøget.
De aktive fraktioner (numrene 140 - 230) sammenhældes og inddampes i vakuum til næsten tørhed. 500 ml ethanol tilsættes, og det faste stof frafiltreres efter kraftig rystning. Ethanolekstrakten inddampes derefter i vakuum til tørhed på en rotationsfordamper og genopløses i 40 ml deioniseret vand. Dette hældes på en 10,16 cm x 60,96 cm søjle med "Biorad Biogel P2" og elueres med en 1%'s n-bu-tanolopløsning. Der opsamles fraktioner.på 25 ml, og de undersøges for β-lactamase-inhiberende virkning i en endelig fortynding på 1/2500. Undersøgelser for natriumindhold i 1/25-fortyndinger af fraktionerne udføres under anvendelse af sølvnitratopløsning. Fraktionerne indeholdende clavulansyre uden natriumchlorid sammenhældes, koncentreres til 20 ml ved afdampning af opløsningsmidlet under reduceret tryk og frysetørres. Derved fås 4,8 g af natriumsaltet af clavulansyre (I5Q-værdi ca. 0,06yug/ml).
Eksempel 42.
Hydrolyse af clavulansyre-methylester til dannelse af clavulansyre.
2,17 mg clavulansyreester opløses i 0,1 ml methanol og behandles med 0,208 ml 0,0482N natriumhydroxidopløsning. Efter 1 time ved stuetemperatur indeholder reaktionsblandingen adskillige produkter. Tyndtlagschromatografisk analyse viser, at en af de overvejende komponenter har en I^-værdi, som er identisk ved værdien for natriumsaltet af clavulansyre? farvereaktioner og biologisk undersøgelse er i overensstemmelse med dette stof, som er natriumsaltet af clavulansyre.
Langsom omdannelse af esteren til clavulansyre ses, når 1 mg/ml af forbindelsen inkuberes ved 37°C i 0,05M phosphatpuffer ved pH-værdi 7. Reaktionen følges af papirchromatografi (bioautografisk system). Under anvendelse af butanol/ethanol/vandsystemet til at følge reaktionen over en periode på 2 timer, aftager methylester-zonen ved en R^-værdi på 0,79 i størrelse, medens zonen for clavulansyre ved R^-værdi 0,12 stiger.
52 145543
Eksempel 43.
Fremstilling af lithiumsalt af clavulansyre.
En opløsning af 0,84 g benzylclavulanat i 30 ml ethanol blandes med en opløsning af lithiumhydrogencarbonat (fremstillet som nedenfor beskrevet) i 5 ml vand. Denne opløsning hydrogeneres over 0,27 g 10%'s palladium/kul i 25 minutter ved stuetemperatur (^20°C), hvorefter der ifølge tyndtlagschromatografi (Si02~ethyl-acetat:KMn04-spray) ikke kan påvises udgangsmateriale. Katalysatoren frafiltreres og vaskes med 5 ml vand og 5 ml ethanol, og de samlede filtrater inddampes under reduceret tryk. Den krystallinske' remanens tritureres med 25 ml acetone, og det faste stof frafiltreres·, vaskes med 10 ml acetone og tørres over P2Og, ^vor-ved. der fås 0,41 g produkt. Produktet optages i 3 ml vand, og der tilsættes langsomt acetone, indtil krystallisation begynder.
Efter afkøling i 20 minutter til 2 - 3°C kan der ved filtrering fås et krystaludbytte, som vaskes med en lille mængde acetone og tørres i vakuum (80 mg). Filtratet fortyndes med et lige så stort rumfang acetone og afkøles igen, hvorved der fås yderligere 80 mg udbytte.
Analyse:, første udbytte = 84,3¾ rent lithiumclavulanat andet udbytte = 85,1% rent lithiumclavulanat.
(Lithiumhydrogencarbonatopløsningen fremstilles ved at suspendere 14 g lithiumcarbonat i 480 ml vand ved 5 - 10°C og lede en konstant strøm af carbondioxidgas gennem suspensionen i 8 timer, hvorefter der er dannet en klar opløsning. Opløsningens volumen fyldes op til 500,0 ml med vand, der er mættet med C02· Denne opløsning indeholder derefter 5,15 vægt/volumenprocent LiHCQ^).
Eksempel 44.
Fremstilling af kaliumsalt af clavulansyre.
En opløsning af 2,89 g benzylclavulanat (med god renhed) i 100 ml ethanol og 17 ml vand hydrogeneres ved stuetemperatur og atmos- 53 145543 færetryk over 0,92 g 10%'s palladiseret kul (Engelhard 4505) i nærværelse af 1,0 g fint formalet kaliumhydrogencarbonat. Efter 30 minutters forløb viser tyndtlagschromatografi kun spor af tilbageværende benzylester.
Katalysatoren fjernes ved filtrering og vaskes med 10 ml vand og 10 ml ethanol. De samlede filtrater og vaskevæsker (som er neutrale, ^ pH-værdi 7) inddampes under reduceret tryk ved stuetemperatur, hvorved der fås en lysegul sirup. Denne opløses i 17 ml vand og fortyndes med 450 ml acetone. Den uklare blanding filtreres gennem kiselgur, og filtratet fortyndes til 1,0 liter med acetone. Forbindelsen krystalliserer, og efter 30 minutter ved stuetemperatur isoleres den ved filtrering, vaskes med 50 ml acetone og tørres i vakuum, hvorved der fås 0,75 g af det ønskede kaliumclavulanat i form af et farveløst krystallinsk fast stof, som er 98,5% rent kaliumclavulanat-anhydrat (indeholdende ca. 0,2 - 0,3% vand).
Eksempel 45.
Trimethylammoniumclavulanat.
En trimethylammoniumhydrogencarbonatopløsning fremstilles ved . at opløse 5 g trimethylamin i 50 ml iskoldt vand og lede C02 gennem opløsningen i en hurtig strøm, indtil pH-værdien i opløsningen er‘ ca. 8,5. Denne opløsning analyseres ved titrering med 1,0M saltsyre under anvendelse af screened methylorange som indikator og viser sig at være 0,4M.
Til en opløsning af 2,89 g benzylclavulanat i 100 ml ethanol sættes 0,9 g 10%'s palladiseret kul og 25 ml 0,4M trimethylammo-. niumhydrogencarbonat. Blandingen hydrogeneres i 30 minutter ved stuetemperatur og atmosfæretryk; tyndtlagschromatografi viser, at der ikke er udgangsmateriale tilbage. Katalysatoren fjernes ved filtrering og vaskes med 30 ml ethanol og 10 ml vand. Filtratet inddampes i vakuum, hvorved der fås en brun olie. Olien tritureres med 50 ml acetone, hvorefter den krystalliserer. Krystallerne isoleres ved filtrering, vaskes med 10 ml acetone og 10 ml ether og tørres i vakuum, hvorved der fås 0,84 g lysebrunt 145543 54 trimethylammoniumclavulanat. Analyse (ved høj tryksvægkechromatogra-fi) viser 68,7% som fri syre? 89,1% som trimethylammoniurnclavu-lanat.
IR-Spektrum (KBr): v = 3320 (bred, med skarp spids), 1775, 1690 og 1590 - 1620 cm-1 (bred).
Intet deoxy synligt i NMR-Spektret.
Eksempel 46.
Fremstilling af aluminiumclavulanat.
En opløsning af 2,89 g benzylclavulanat og 0,68 g aluminiumisopro-poxid i 150 ml tørt, gendestilleret tetrahydrofuran hydrogeneres over 0,86 g 10%'s palladiseret kul i 40 minutter (tyndtlagschroma-tografi viser intet ureageret benzylclavulanat efter dette tidsrum) . Katalysatoren frafiltreres og vaskes med 20 ml tetrahydrofuran, og filtratet inddampes til tørhed i vakuum. Den faste remanens tritureres med 100 ml acetone, og .det resulterende faste stof frafiltreres og tørres i exsiccator over phosphorpentoxid. Aluminiumsaltet fås på denne måde i form af 0,3 g hvidt fast stof. Analyse ved højtryksvæskechromatografi viser 48% clavulanat; aluminiumindholdet ifølge EDTA-titrering er 5,76%; Karl Fischer--bestemmelse viser 5,4% H20.
IR-Spektrum (KBr): v = 1790, 1695 og 1615 cm \ c max
Eksempel 47.
Fremstilling af magnesiumclavulanat.
En opløsning indeholdende natriumclavulanat (bedømt som ca. 4,4 g) i 15 ml vand hældes på en ionbyttersøjle, Zerolit FF(1P) , SRA62, og søjlen vaskes med ét rumfang vand. Søjlen elueres med 0,2M mag-nesiumchloridopløsning, og de opsamlede fraktioner undersøges ved papirchromatografi (påvisning med Ehrlich's reagens), og de mest intense fraktioner sammenhældes og inddampes under vakuum til et lille rumfang.
55 U55A3
Dette rå præparat af magnesiumsaltet afsaltes ved percolering gennem en søjle af "Biogel" P2 (papirchromatografi-Ehrlich's spray).
Det efsaltede materiale inddampes derefter, blandes med ethanol og chromatograferes på en cellulosesøjle under anvendelse af butanol/ethanol/vand i forholdet 4:1:5 v/v topfase som eluant. Fraktioner indeholdende størstedelen af materialet sammenhældes og inddampes til tørhed i vakuum. Ved triturering med acetone efterfulgt af filtrering fås det ønskede salt i form af 0,58 g hvidt fast stof. Højtryksvæskechromatografi-undersøgelse viser .j^j.
91% rent magnesiumclavulanat. Atomabsorption viser 5,13% Mg Karl Fischer-analyse viser 6,8% vand.
IR-Spektrum (KBr): ^max = 1780, 1693 og 1610 cm
Eksempel 48.
Magnesiumclavulanat.
En opløsning af 4,34 g benzylclavulanat og 1,61 g magnesiumacetat- te trahydr at i 100 ml ethanol hydrogeneres over 1,45 g 10%'s palladiseret kul, indtil der ikke yderligere optages hydrogen (ca. 20 minutter). På dette tidspunkt viser tyndtlagschromatogra-fi intet ikke-omsat benzylclavulanat. Katalysatoren fjernes ved filtrering og vaskes med 30 ml ethanol og 10 ml vand. Filtratet inddampes i vakuum, hvorved der fås 5,2 g lysegul·gummi indeholdende noget opløsningsmiddel. Denne tritureres med 50 ml acetone, og det resulterende faste stof frafiltreres, vaskes med 5 ml acetone og lufttørres, hvorved der fås 2,4 g farveløst fast stof. Højtryksvæskechromatografi-undersøgelse viser 75% rent magnesiumsalt.
. ' 56 145543
Eksempel 49.
Fremstilling af ammoniumclavulanat.
4734 g benzylclavulanat i 50 ml ethanol behandles med 1,155 g ammoniumacetat (1 ækvivalent) i 50 ml ethanol og hydrogeneres over 1,4 g 10%'s palladium/kul i 10 minutter. Katalysatoren frafiltre-res, og opløsningsmidlet fjernes i vakuum, hvorved der fås et halvfast stof. Remanensen opløses i 5 ml vand og behandles med 75 ml acetone. Den overstående væske dekanteres fra den oprindeligt dannede olie og stilles til side, hvorved der fås 0,348 g nåle. Højtryksvæskechromatografi-undersøgelse viser, at ammoniumclavu-lanatindholdet er 97,4%. Karl Fischer-analyse viser 0,44% vand.
IR-Spektrum (KBr)tv =1785, 1700 og 1595 cm c max 3
Eksempel 50.
Fremstilling af krystallinsk kaliumclavulanat.
En opløsning af 2,89 g benzylclavulanat i 100 ml ethanol indeholdende 1,0 g kaliumhydrogencarbonat hydrogeneres over 0,93 g 10%'s palladium/kul i 25 minutter ved stuetemperatur og atmosfæretryk.
På dette tidspunkt viser tyndtlagschromatografi intet ikke-redu-ceret benzylclavulanat. Katalysatoren fjernes ved filtrering og vaskes med 10 ml ethanol og derefter med 150 ml vand. Filtratet inddampes til et halvfast stof under reduceret tryk på rotationsfordamper. Til denne remanens sættes 800 ml acetone. Efter omrøring fås krystaller. Det krystallinske produkt frafiltreres, vaskes med 20 ml ether og tørres i vakuum, hvorved der fås 1,75 g krystallinsk kaliumclavulanat.
Analyse (ved højtryksvæskechromatografi): 89,1 vægt/vægtprocent i form af kaliumclavulanat.
NMR- og IR-Spektrer: I det væsentlige de samme som for tidligere fremstillet rent krystallinsk kaliumclavulanat). (NMR-Spektret viser forekomst af <3% deoxy, <0,5% acetone).
57 145543
Eksempel 51.
Eksempler på aktivitet af clavulansyre-methylester.
Undersøgelser for antibakteriel virkning i dyrkningsvæske viser, at clavulansyre-methylester har bredspektret virkning, men af lavere orden end clavulansyre. Det er ikke klarlagt, om denne virkning er virkningen af selve forbindelsen eller af clavulansyre, som frigøres ved langsom vandig hydrolyse af esteren. Clavulansyre-methylester viser betydelig antib akteriel synergisme i kombination med ampicillin eller cephaloridin mod bakterier, som er resistente mod disse antibiotika. Således reduceres den minimale inhiberingskoncentration (MIC) for ampicillin mod Staphylococcus aureus (Russell) fra SOO^ug/ral til <0,4 i nærværelse af l,0yug/ml clavulansyre-methylester. MIC-Værdien for cephaloridin reduceres fra 1,5^ug/ml til <0,03yug/ml i nærværelse af l^ug/ml clavulansyre--methylester. MIC-Værdien for ampicillin mod Proteus mirabilis C889 reduceres fra 500yug/ml til 31^ug/ml i nærværelse af 5^ug/ml clavulansyre-methylester.
Eksempel 52.
Antibakteriel synergisme mellem ampicillin og estere af clavulansyre .
De i tabel VIII anførte resultater er opnået med den nedenfor beskrevne metode.
Den minimale inhiberingskoncentration (MIC-værdi) for ampicillin, clavulansyrederivat og ampicillin i tilstedeværelse af l^ug/ml clavulansyrederivat bestemmes for en række β-lactamase-produ-cerende bakterier. Organismerne podes i "Oxoid" sensitivitetstestsdyrkningsvæske anbragt i små skakter i en plastbakke og indeholdende forskellige koncentrationsgradienter af ampicillin, clavulansyrederivat eller ampicillin plus l^ug/ml clavulansyrederivat (n.ikrotitermetode). Den endelige fortynding af inokulet i dyrknings- -2 væsken, dyrket natten over, er 0,5 x 10 . Bakken inkuberes ved 37°C natten over, og næsten morgen bestemmes endepunkterne ,for bak- 58 f45543 terievæksten. MIC-Værdierne i^ug/ml er anført i tabelform, hvoraf det fremgår, at synergisten ved lave koncentrationer på afgørende måde forbedrer den antibakterielle virkning af ampicillin mod visse grampositive og gramnegative bakterier. Mekanismen i denne synergisme antages at bestå i inhibering af ampicillin-nedbrydende β-lactamase-enzymer, men eksistensen af andre mekanismer kan ikke udelukkes.
Tabel VIII.
Antibakteriel synergisme mellem ampicillin og estere af clavulan-syre mod stammer af Klebsiella aerogenes.
Stamme Ampicillin Ampicillin +5/ug/ml af me- Ampcillin +5 ,ug/ml alene . thylesteren af clavulansyre af benzylesteren _af clavulansyre A' 500 1,9 1,9 E 70 500 3,9 3,9 62 500 3,9 3,9
Hverken clavulansyre-methylester eller clavulansyre-benzylester in-hiberer væksten af forsøgsorganismen ved en koncentration på !00^,ug/ ml.
Eksempel 53.
Antibakteriel virkning af clavulansyreester.
Under anvendelse af den nedenfor beskrevne mikrotitermetode, men under anvendelse af en fortynding på 1/100 af væsken, der har stået natten over, fås de i tabel IX anførte MIC-værdier for visse estere af clavur lansyre mod en række organismer.
Mikrotitermetode:
Seriefortyndinger af clavulansyrederivatet i "Oxoid"-sensitivi-tetsforsøgsvæske i en mikrotiter plastbakke podes med en dyrkningskultur, der har stået natten over, af hver organisme, således at den endelige fortynding af inokulet er 0,5 x 10-4. Kultu- 59 145543 rerne inkuberes natten over, og punkterne med bakterievækst bestemmes næste morgen ved at observere kulturens uklarhed. Resultaterne udtrykkes som tilnærmelsesvise MIC-værdier (minimum irihiberingskoncentrationyUg/ml.
Tabel IX.
Antibakteriel virkning af clavulansyreestere.
Organisme MIC-værdier for estere af clavulansyre MIC*-værdi
Benzyl- Nonyl- Pivaloyl- Phthalidyl- for clavulan- ester ester oxymethyl- ester syre-natri- _ester_umsalt_
Bacillus subtilis A 250 31 62 125 62
Staphylococcus aureus Oxford 62 31 31 31 15
Staphylococcus. 125 31 62 15 15
Russell
Escherichia coli 10418 125 -^500 125 125 125 * MIC-Værdien for clavulansyre-natriumsaltet er medtaget af sammenligningshensyn; de høje MIC-værdier skyldes de anvendte kraftigo inokula.
Eksempel 54.
Påvisning af synergisme mellem ampicillin og estere af clavulansyre imod Staphylococcus aureus Russell.
Tabel XII
MIC (yug/ml) R Ester Ampicillin Ampicillin alene alene +l^ug/ml ester +5yUg/ml ester CH3 62 125 0,06 0,03 CH2CgH5 16 250 0,4 0,08 CH2C0C6H5 62,5 500 0,9 < 0,1 phthalidyl 62,5 500 4,0 1,6 CH2COCH3 31 250 0,8 <0,1 60 145543
Tabel XII fortsat CH2CH20'C0CH3 125 500 1,25 0,08 CH2CH2Br 125 500 1,25 0,3 cyclohexyl 500 62,5 10 2,5 p-CH2CgH5CH3 62 500 1,25 0,3 CH2CsCH 62 500 0,6 0,16 CH2CH2OCH3 25 1000 2,5 0,6
CgHg 62,5 500 0,9 < 0,1 6-methoxy 62 250 2,5 0,3 naph thylmethy1 Påvisning af synergisme mellem natriumcarboxymethylclavulanat og cephalosporiner mod Staphylococcus aureus Russell.
Tabel XIII
Cephalosporin MIC ( ,ug/ml)
Cephalosporin Cephalosporin alene + 1Q^ug/ml natri- umcarboxymethylclar ,________vulanat_
Cephaloridin >10 0,156
Cephalothin 2,5 0,31
Cefazolin >10 0,6
Cephalexin >10 2,5
Cephradin >10 2,5
Cefuroxim 2,5 2,5
Cephamandol >10 2,5 Påvisning af synergisme med natriumcarboxymethylclavulanat og peni-' cillin mod Staphylococcus aureus Russell.
Tabel XIV
Penicillin MIC (^ug/ml)
Penicillin Peniqillin + 10 ,ug/ml ε16Ω6 * natriumcarboxymethyl- ____clavulanat_
Ampicillin > 500 0,6
Amoxycillin 500 0,6 61 145543
Tabel XIV fortsat
Carbenicillin 250 5
Ticarcillin 250 5
Sulbenicillin 62,5 5
Epicillin > 500 1,25
Cyclocillin > 500 2,5
Benzylpenicillin > 500 2,5 Påvisning af synergisme mellem ampicillin og benzylesteren af clavulansyre mod forskellige bakterier.
Tabel XV
MIC (^,ug/ml)
Ampicillin Benzylester Ampicillin + 5,ug/ral alene alene benzylester '
Staphylococcus aureus Russell 125 62 <0,03
Klebsiella A 500 250 0,23
Escherichia coli JT4 > 4000 250 4000 * * MIC = 250^ug med 20 mg/ml synergist.
Påvisning af synergisme mellem ampicillin og methylesteren af clavulansyre mod forskellige bakterier.
Tabel XVI
...... ' ' I - " . -'ll··· I M — MIC (yug/ml)
Ampicillin Methylester Ampicillin + 5 .ug/ml alene alene methylester ' S taphylococcus aureus Russell 250 31-62 <0,5
Proteus C889 > 500 125 8
Escherichia coli JT 39 > 500 125 16 62 145643 Påvisning af synergisme mellem ampicillin og phthalidylesteren mod forskellige bakterier.
Tabel XVII
MIC (yug/ml) _ _
Ampicillin Phthalidyl- x Ampicillin + 5 ,ug/ alene ester alene ml phthalidylester
Staphylococcus aureus Russel 500 62 1/6
Klebsiella E70 > 500 125 3-6,2
Escherichia coli JT4 62 > 4000 2000 * .............I" - " '.M'*·· " '*' —- 1 1 ii ... if i Μ-- .. — 1 · * hvilken som helst af isomerene.
Påvisning af synergisme mellem ampicillin og phenylesteren mod forskellige bakterier.
Tabel XVIII MIC (^ug/ml)
Ampicillin Phenylester Ampicillin + 5,ug/ __alene alene ml phenyleste/ S taphylococcus aureus Russell 62,5 62 <0,1
Klebsiella E7Q 500 62 6
Escherichia coli JT4 > 4000 62 250
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK287078A DK145543C (da) | 1974-04-20 | 1978-06-26 | Fremgangsmaade til fremstilling af hydrolyserbare estere af clavulansyre |
Applications Claiming Priority (12)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB17410/74A GB1508977A (en) | 1974-04-20 | 1974-04-20 | Beta-lactam antibiotic from streptomyces clavuligerus |
GB1741074 | 1974-04-20 | ||
GB2771574 | 1974-06-21 | ||
GB2771574 | 1974-06-21 | ||
GB4365174 | 1974-10-09 | ||
GB4365174 | 1974-10-09 | ||
GB5352574 | 1974-12-11 | ||
GB5352574 | 1974-12-11 | ||
DK167275 | 1975-04-18 | ||
DK167275AA DK141254B (da) | 1974-04-20 | 1975-04-18 | Fremgangsmåde til fremstilling af clavulansyre eller et salt eller en ester deraf. |
DK287078 | 1978-06-26 | ||
DK287078A DK145543C (da) | 1974-04-20 | 1978-06-26 | Fremgangsmaade til fremstilling af hydrolyserbare estere af clavulansyre |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DK287078A DK287078A (da) | 1978-06-26 |
DK145543B true DK145543B (da) | 1982-12-06 |
DK145543C DK145543C (da) | 1983-05-09 |
Family
ID=27545198
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK287078A DK145543C (da) | 1974-04-20 | 1978-06-26 | Fremgangsmaade til fremstilling af hydrolyserbare estere af clavulansyre |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DK (1) | DK145543C (da) |
-
1978
- 1978-06-26 DK DK287078A patent/DK145543C/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK287078A (da) | 1978-06-26 |
DK145543C (da) | 1983-05-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4560552A (en) | Antibiotics | |
US4110165A (en) | Process for the production of clavulanic acid | |
US4529720A (en) | Antibiotic from Streptomyces clavulicerus | |
US6048977A (en) | Clavulanic acid and salts thereof | |
US6218380B1 (en) | Pharmaceutical compositions | |
DK141099B (da) | Fremgangsmåde til rensning af clavulansyre eller et salt deraf med en base. | |
US4421760A (en) | β-Lactam antibiotic, its preparation and use | |
US4525353A (en) | Antibiotics | |
US4060530A (en) | Clavulanic acid amides | |
JPH0115491B2 (da) | ||
US4140764A (en) | β-Lactamase inhibitors and process for their preparation | |
US4572801A (en) | 4-Carbamoyloxymethyl-1-sulfo-2-oxoazetidine derivatives and their production | |
EP0003069B1 (en) | Pseudomonic acid c, pharmaceutically acceptable salts or esters thereof, processes for their preparation and pharmaceutical or veterinary compositions containing them | |
DK145543B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af hydrolyserbareestere af clavulansyre | |
US4123540A (en) | Isoclavulanic acid as an antibacterial and a β-lactamase inhibitor | |
US4061649A (en) | Clavulanic acid sulphates | |
EP0015690B1 (en) | Penicillin derivatives, process for their preparation and pharmaceutical composition comprising them | |
US4673739A (en) | 4-carbamoyloxymethyl-1-sulfo-2-oxoazetidine derivatives and their production | |
FI58332C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av estrar av klavulansyra | |
US4349551A (en) | Penicillin derivatives and compositions containing them | |
EP0068680B1 (en) | Antibiotics | |
DK157302B (da) | Estere af clavulansyre til anvendelse som mellemprodukter ved fremstilling af clavulansyre eller farmaceutisk tolerable salte deraf | |
US4755596A (en) | Optically active carbacephems | |
CA1074325A (en) | Clavulanic acid and its salts | |
CA1076120A (en) | Clavulanic acid esters |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PUP | Patent expired |