DK144731B - Fremgangsmaade til isolering af proteinhormoner stammende fra humant hypolysevaev - Google Patents

Description

i 144731

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til isolering af proteinhormoner stammende fra humant hypofysevsv, hvorved en vandig ekstrakt indeholdende proteinhormonerne underkastes en fraktioneret fældning med et fældningsmiddel.

Opfindelsen har især til formål at isolere det rene væksthormon fra ekstrakter af hypofysevæv.

Det er kendt at isolere væksthormon ved ekstraktion af hypofysevæv og udfældning af væksthormonet fra ekstrakten ved hjælp af et fældningsmiddel.

Som eksempler på trykskrifter, hvor processer til udvinding af humant væksthormon er beskrevet, skal nævnes: 1) Biochimica et biophysioa acta 1963, 74, S. 525-531, og 2) Acta endocrinologica 1971, 66, S. 478-590.

En metode til adskillelse af blandinger af hypofysehormoner er omtalt i CH patentskrift nr. 230 807. Fra US patentskrifterne nr. 3 415 804 og 3 652 530 kendes fremgangsmåder til fraktionering af proteinstoffer under anvendelse af polyethylenglycol. Anvendelsen af visse blok-copolymere er kendt fra beskrivelsen til DK patentansøgning nr. 3321/74.

Ved de kendte processer til udvinding af humant væksthormon opnås de største udbytter med dybfrosne hypofyser som udgangsmateriale og ved anvendelse af skånsomme ekstraktions- og fældningsbetingelser. Typisk gås frem på følgende måde: 1) dybfrosne hypofyser ekstraheres med en neutral eller basisk puffer, 2) ekstrakten fældes med et fældningsmiddel og/eller 144731 2 ved indstilling af pH-værdien til 4,8, 3) bundfaldet ekstraheres med en neutral eller sur puffer, 4) ekstrakten oprenses yderligere ved gentagne fældninger og/eller søjlechromatografi, f.eks. gelfiltrering på "Sephadex ^ G100".

Som fældningsmidler i ovennævnte trin 2 er tidligere anvendt dels ammoniumsulfat, der imidlertid giver et urent slutprodukt, dels acetone, der denaturerer proteinerne 1 en sådan grad, at de bliver vanskeligt opløselige ved de efterfølgende ekstraktioner, hvilket resulterer i et ringe udbytte.

Kvaliteten af væksthormonet undersøges ved anvendelse af blandt andet følgende metoder:

Biologisk aktivitet (Tibia-test):

Greenspan, F.S. et al.: "Bioassay of hypophyseal growth hormone: the tibia test”, Endocrinology 45 (1949), p.

455-463.

Immunologisk aktivitet:

Radial immunodiffusion:

Mancini, G. et al.:"Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion", Immunochemistry 2 (1965), p. 235-254.

Radioimmunoassay:

Hanssen, K.F.:"Radioimmunoassay of growth hormone in human plasma", Acta Endocrinologies 71 (1972), p. 649-664.

Gelfiltrering:

Schleyer, M. et al.:"Comparative Investigation of Diffe- 144731 3 rent Human Growth Hormone Preparations", Hormone and Metabolic Research-2 (1970), p, 174-18Q.

Elektroforese i polyacrylamidgel (PAGE);

Ornstein, L., Apn.N.Y, Acad. Sei. 121 (1964), p. 321 ff.,

Davis, B.J., Ann. H.y. Acad. Sci. 121 (1964). p. 404 ff.

Den biologiske aktivitet bestemmes ved Tibiatesten i forhold til WHO’s 1. inters^tipnale standard for oksens væksthormon, hvis aktivitet er defineret som 1 int. enh./mg; den immunologiske aktivitet bestemmes ved radioimmunoassay i forhold til NEiSJ’s 1. internationale reference-præparat af menneskets væksthormon, hvor aktiviteten af hver ampul pr. definition er '0,350 internationale enheder. Det har vist sig* at de to aktivitetsbestemmelser stemmer udmærket overens, og der tales derfor i de efterfølgende eksempler kun pm "enheder”.

Et rent væksthormon er kendetegnet ved 1) en aktivitet på 2 internationale enheder pr. mg protein eller mere, 2) mere end 90% findes på monomer form, 3) ved PAGE af 100 μg kan efter proteinfarvning kun påvises bånd svarende til væksthormon eller væksthormon og 1-2 deamidere-de former heraf.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, der er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte, opnås et rent produkt i højt udbytte, Således virker polyethylen-glycol, PEG, mere selektivt som udfældningsmiddel end ammoniumsulfat, hvorved væksthormonet f&s i renere tilstand.

Endvidere undgås den denaturering, som acetone forårsager.

Den overraskende effekt af opfindelsen ligger i, at der allerede i første trin opnås ét stort udbytte af forholdsvis rent væksthormon, sojp herpffer simpelt og uden væsentlige tab kan oparbejdes til meget rent væksthormon. Sam- 4 1447$1 menlignet med andre fældningsmetoder er PEG-metoden ifølge opfindelsen simpel, selektiv og'højtydende. Der er ikke tidligere beskrevet metoder til fremstilling af væksthormon, der fører til så stort udbytte af så rent væksthormon.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ikke begrænset til anvendelse ved primære hypofyseekstrakter, men er tillige anvendelig ved isolering af proteinhormoner fra f.eks. dyrkningsmedier fra vævskulturer.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal i det efterfølgende belyses nærmere ved hjælp af nogle udførelseseksempler. Det skal bemærkes, at indstillingen af pH-værdien i eksempel 3 sker forudvfor tilsætningen af PEG, hvorved der på kendt måde ved det isoelektriske punkt udfældes en mængde rent væksthormon, som oparbejdes for sig; ca. halvdelen af væksthormonmængden findes imidlertid stadig i opløst tilstand og udvindes i stort udbytte og i udenatureret form ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

EKSEMPEL 1 · 24 dybfrosne humane hypofyser homogeniseres under tilsætning af 100 ml af en puffer (I) med følgende sammensætning: 1,8% dinatriumhydrogenphosphat i vand, tilsat IN natriumhydroxid til pH=8,7. Blandingen centrifugeres.

Til 90 ml supernatant sættes 24 ml af en vandig opløsning indeholdende 12 g polyethylenglycol 6000, således at koncentrationen er i alt 10,5' vægt/vol. % PEG. Efter omrøring i 30 minutter centrifugeres, og bundfaldet, der består af en kompliceret blanding af ballaststoffer, bortkastes.

Supernatantens pH-værdi indstilles på 4,8 med IN saltsyre, og efter centrifugering ekstraheres bundfaldet med 60 ml af en puffer- (II) me.d følgende sammensætning: 1,4% U4731 5 dinatriumhydrogenphosphat, 4,9$ mononatriumhydrogenphos-phat, tilsat IN natriumhydroxid til pH=7,0. Efter 1 times omrøring centrifugeres, og supematanten tilsættes 60 ml mættet ammoniumsulfatopløsning. Der centrifugeres atter, og bundfaldet opløses i 25 ml af en opløsning (III) med følgende sammensætning: 2$ aminoeddikesyre og 0,25$ natriumhydrogencarbonat. Opløsningen appliceres på en søjle, 79 cm lang og 2,5 cm i diameter, indeholdende "Sephadex® G1Q0", equilibreret' med opløsning III. Søjlen elueres med opløsning III, fraktionerne svarende til elueringsvoluminet 260-320 ml opsamles. De opsamlede-fraktioner indeholder 260 enheder humant væksthormon, med en specifik aktivitet på 2,2 enheder pr. mg protein. E-lektroforese på polyacrylamidgel af 100 jig protein udviser kun 3 bånd, svarende til væksthormon og de deamide^-rede former.

EKSEMPEL 2 250 dybfrosne humane hypofyser ekstraheres som angivet i eksempel 1 med 1500 ml af puffer I. Til supematanten på 1450 ml sættes 460 ml af en opløsning bestående af 230 g polyethylenglycol 3000 og 270 ml vand, således at koncentrationen er i alt 12 vægt/vol. $ PEG. Efter omrøring i 20 minutter og fracentrifugering af udfældede ballaststoffer indstilles pH-værdien med IN saltsyre på 4,9. Efter omrøring i 20 minutter og centrifugering, ekstraheres bundfaldet som angivet i eksempel 1 med 1000 ml af puffer II, Efter omrøring natten over og centrifugering sættes til supematanten 1000 ml mættet ammoniumsulfatopløsning. Der centrifugeres atter, og bundfaldet opløses i 300 ml af en opløsning af 126 g urinstof i 207 ml puffer III (se eksempel 1). Opløsningen appliceres på en søjle, 100 cm lang og 11,4 cm i diameter, indeholdende "Sephadex® G100”, equilibreret med puffer III. Søjlen elueres med puffer III. Fraktioner svarende til elueringsvoluminet for væksthormon opsamles. De samlede fraktioner indeholder 2900 enheder humant væksthormon, med en 144731 6 specifik aktivitet på 2,6 enheder pr. mg protein. Elek-troforese på polyacrylamidgel af 100 pg udviser kun 2 bånd, svarende til væksthormon og en deamideret form.

EKSEMPEL 3 500 dybfrosne humane hypofyser ekstraheres som angivet i eksempel 1 med 2000 ml puffer I. Efter centrifugering indstilles pH-værdien på 4,8, hvilket er nær væksthormonets isoelektriske punkt. Der centrifugeres, hvorefter buhdfal4et oparbejdes under punkt a), medens superna-tanten oparbejdes under punkt b).

a) Bundfaldet oparbejdes til rent væksthormon ved ekstraktion med puffer II, derefter fældning med ammoniumsulfat og genopløsning i puffer III og søjlechromatogra-fering, alt som angivet i eksempel 2. Der opnås herved 3400 enheder væksthormon med en specifik aktivitet på 2,7 enheder pr. mg protein.

b) Supernatanten på 1950 ml tilsættes 650 ml opløsning bestående af 325 g polyethylenglycol 3000 og 380 ml vand, således at koncentrationen er i alt 12,5 vægt/'vol. % PEG.

Der centrifugeres. Bundfaldet underkastes ekstraktion med puffer II, fældning med ammoniumsulfat, genopløsning i puffer III og søjlechromatografering, alt som angivet i eksempel 2, Der opnås herved 4230 enheder væksthormon med en specifik aktivitet på 2,6 enheder pr. mg protein.

. Totaludbyttet af væksthormon fra 500 hypofyser har således været 7630 enheder.

Den ovenfor under punkt bj resulterende supernatant på 2550 ml tilsættes 650 ml opløsning bestående af 325 g polyethylenglycol 3000 og 380 ml vand (til ialt 20 vægt/ vol,-% FEG). pH-værdien er uændret indstillet på 4,8.

Der centrifugeres, og bundfaldet, som består af ballast-stoffer, bortkastes. Til 2000 ml af supernatanten sættes 144731 7 1000 ml opløsning bestående af 500 g polyethylenglycol 3000 og 585 ml vand (til ialt 30 vægt/vol.-% PEG). Efter omrøring i 1 time centrifugeres, og det heraf resulterende bundfald indeholder follikelstimulerende hormon, FSH og luteiniseringshormon, LH.

EKSEMPEL 4 100 ml dyrkningsmedium fra vævskultur af hypofyseforlap, indeholdende 5 enheder væksthormon koncentreres ved ultrafiltrering til 1 ml. Der tilsættes 0,5 ml af en vandig opløsning, indeholdende 0,5 g polyethylenglycol 6000 pr. ml, således at koncentrationen er i alt 16,6 vægt/vol.

%. PEG. Opløsningens pH-værdi indstilles på 4,8. Udfældningen fraskilles, opløses i 0,5 ml vand og appliceres på en søjle, 63 cm lang og 0,9 cm i diameter, indeholdende "Sephadex® G100”, equilibreret med puffer III.

Der elueres med puffer III. Fraktionerne indeholdende væksthormon opsamles. De samlede fraktioner indeholder 1,0 enheder humant væksthormon med en specifik aktivitet på 2,0 enheder pr. mg protein.