FI57669B - Foerfarande foer isolering och utvinning av proteinhormoner haerstammande fraon hypofysvaevnad - Google Patents
Foerfarande foer isolering och utvinning av proteinhormoner haerstammande fraon hypofysvaevnad Download PDFInfo
- Publication number
- FI57669B FI57669B FI772297A FI772297A FI57669B FI 57669 B FI57669 B FI 57669B FI 772297 A FI772297 A FI 772297A FI 772297 A FI772297 A FI 772297A FI 57669 B FI57669 B FI 57669B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- growth hormone
- pituitary
- protein
- buffer
- solution
- Prior art date
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 14
- 238000009413 insulation Methods 0.000 title 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 29
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 27
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 27
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 19
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 description 18
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 15
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 14
- 239000000960 hypophysis hormone Substances 0.000 description 12
- 102000006877 Pituitary Hormones Human genes 0.000 description 10
- 108010047386 Pituitary Hormones Proteins 0.000 description 10
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 10
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 9
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 9
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 9
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 9
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 9
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 9
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 3
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 3
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 3
- 229940113125 polyethylene glycol 3000 Drugs 0.000 description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 3
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 1
- 235000013905 glycine and its sodium salt Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229940093429 polyethylene glycol 6000 Drugs 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
- C07K14/615—Extraction from natural sources
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/854—Glands
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
ESr^l [B] ««kuulutusjulkaisu 5766q ^ UTLÄGG N I NGSSKRI FT 3 'oo; 1«1 27/00 A 61 K J7/52 SUOMI —FINLAND (21) P«t*nttlh*k«mu* —PK*«>t»ft*öknJn| 772297 (22) Htk«<nitpilvi—An*öknln|«dt| 27.07.77 ^ ^ (23) Alkupilvt—GiMghatadtf 27.07.77 (41) Tulkit ]ulklMktl — Bllvlt offwtllf 31.01.78
Patentti- ja rekisterihallitus (44) Nlktivikstpum j« kuuLiulkaitun pvm.—
Patent- och registerstyrelsan ' Anrtkan uthfd och utUkrifwn publlcerad 30.05.80 (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begirt prlorltet 30.07.76
Tanska-Danmark(DK) 3^68/76 (71) Nordisk Insulinlaboratorium, Ved Station 2, DK-2820 Gentofte,
Tan ska-Danmark (DK) (72) Erik Pedersen, 01stykke, Tanska-Danmark(DK) (7U) Berggren Oy Ab (5I4) Menetelmä aivolisäkekudoksesta peräisin olevien proteiinihormonien eristämiseksi ja talteenottamiseksi - Förfarande för isolering och utvinning av proteinhormoner härstämmände frän hypofysvävnad Tämän keksinnön kohteena on menetelmä aivolisäkekudoksesta peräisin olevien ihmisen kasvuhormonin HGH, ja mahdollisesti follikkelia stimuloivan hormonin FSH, ja lutenisoivan hormonin LH, eristämiseksi ja talteenottamiseksi saattamalla mainitut hormonit sisältävä vesiuute jakosaostuksen alaiseksi·
Keksinnön tarkoituksena on eristää ihmisen kasvuhormonia HGH siten, että saadaan suuri saanto puhdasta kasvuhormonia aivolisäkeuutteista, sekä että samalla menetelmällä voidaan myös haluttaessa eristää muita tärkeitä aivolisäkkeen hormoneja nimittäin follikkelia stimuloivaa hormonia FSH ja lutenisoivaa hormonia LH.
Kasvuhormonien eristämiseksi aivolisäkekudoksesta tunnetaan menetelmä, jossa kasvuhormoni ensin uutetaan ja sitten saostetaan uutteesta saostusaineen avulla.
Esimerkkeinä kirjoituksista, joissa ihmisen kasvuhormonin talteen-ottoprosesseja on selostettu, mainittakoon:
Biochemica et Biophysica Acta 1963, 74, sivut 525-531, ja 2
Acta Endocrinologica 1971, 66, sivut 478-490.
2 57669
Menetelmää aivolisäkehormonien seosten erottamiseksi on selostettu sveitsiläisessä patenttijulkaisussa 230 807. US-patenteista 3 415 804, 3 652 530, 3 763 135 ja 3 808 189 on tullut tunnetuksi menetelmiä proteiiniaineiden jakosaostamiseksi käyttämällä polyetyleeniglykolia saostusaineena. Tämän perusteella ei kuitenkaan voida edellyttää, että polyetyleeniglykoli on sopiva aivolisäkehormonien jakosaostuk-seen tai kasvuhormonin valikoivaan saostukseen säädetyissä olosuhteissa. Tiettyjen segmenttipolymeerien käyttö on tunnettu DE-hakemus-julkaisusta 2 428 982 (US-patentti 3 850 903) .
Tunnetuissa prosesseissa ihmisen kasvuhormonin talteenottamisessa saavutetaan suurimmat saannot pakastettujen aivolisäkkeiden ollessa lähtöaineina ja käyttämällä lieviä uutos- ja saostusolosuhteita. Tyypillisesti menetellään seuraavalla tavalla: 1) pakastetut aivolisäkkeet uutetaan neutraalilla tai emäksisellä puskurilla, 2) uutteet saostetaan saostusaineen avulla ja/tai asettamalla pH arvoon 4,8, 3) sakka uutetaan neutraalilla tai happamalla puskurilla, 4) uute puhdistetaan edelleen peräkkäisillä saostuksilla ja/tai pylväskromatografilla, esim. käyttäen dekstraanigeeli- (Sephadex G100)suodatusta. (Valm. Pharmacia Fine Chemicals, Ruotsi).
Saostusaineena yllämainitussa vaiheessa 2 on aikaisemmin käytetty joko ammoniumsulfaattia, joka kuitenkin aikaansaa epäpuhtaan lopputuotteen, tai asetonia, joka denaturoi proteiinit siinä määrin, että ne tulevat vaikeasti liukeneviksi seuraavissa uuttovaiheissa, mikä aiheuttaa pienen tuotoksen.
Julkaisussa Adv. in Enz. 42 (1975) s. 73-166, on yhteenveto tekniikan tasosta koskien kasvuhormonin (HGH) määrittämistä, karakterisointia, puhtautta jne. Kasvuhormonin eristämistä ja karakterisointia käsittelevässä kappaleessa mainitaan, että nykyaikaisia puhdistusmenetelmiä käyttäen saadaan 1-6 g HGH:ta 1 kg kohti aivolisäkekudosta. Koska yksi aivolisäke keskimäärin painaa 0,5 g (ensimmäinen rivi, taulukko I), saadaan 0,5-3 mg HGH:ta yhtä aivolisäkettä kohti. Taulukosta I ilmenevällä ammoniumsulfaattimenetelmällä kasvuhormonin eristämiseksi saadaan 1,4 mg HGH:ta aivolisäkettä kohti, jonka kasvuhormonin spesifinen aktiivisuus puhdistuksen jälkeen on 2 yks./mg siis 3 57669 korkeintaan 3 yks./aivolisäke. Esillä olevan keksinnön mukaisella menetelmällä saadaan 7630 yks./500 aivolisäkettä (esim. 3) siis noin 15 yks./aivolisäke.
Kasvuhormonin laatua tutkitaan käyttämällä muun muassa seuraavia menetelmiä:
Biologinen aktiivisuus (tibia-koe), Greenspan, F.S.et ai.: "Bioassay of hypophyseal growth hormone: the tibia test", Endocrinology 45 (1949), s. 455-463;
Immunologinen aktiivisuus, radiaali-immunodiffusio tai radioimmuno-koe, Mancini, g.et al.: "Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion", Immunochemistry 2 (1965), s. 235-254 ja Hanssen, K.F.: "Radioimmunoassay of growth hormone in human plasma", Acta Endocrinologica 71 (1972), s. 649-664; Geelisuodatus (polymeerien tutkimus), Schleyer, M.et al.: "Comparative Investigation of Different Human Growth Hormone Preparations" Hormone and Metabolic Research 2 (1970), s. 174-180; Elektroforeesi polyakryyliamidigeelissä (PAGE) (tuntemattomien proteiinien tutkimus), Ornstein, L., Ann.N.Y. Acad. Sei.121 (1964), s. 321 ff., Davis, B.J., Ann.N.Y. Acad. Sei.121 (1964), s. 404 ff.
Biologinen aktiivisuus määritettiin tibia-kokeella WHO:n 1. kansainvälisen härän kasvuhormonistandardin, jonka aktiivisuus on 1 ky/mg (ky = kansainvälinen yksikkö), suhteen ja immunologinen aktiivisuus määritettiin radioimmuno-kokeella NBSB:n 1. kansainvälisen ihmisen kasvuhormonireferenssipreparaatin, jossa kunkin ampullin aktiivisuus on 0,350 ky, suhteen.
Puhdas kasvuhormoni on tunnettu siitä, 1) että sen aktiivisuus on suurempi kuin kaksi kansainvälistä yksikköä proteiinin milligrammaa kohti, 2) että enemmän kuin 90 % siitä on monomeerimuodossa, 3) että 100 mikrogramman PAGE-määrä voi proteiinivärjäyksen jälkeen osoittaa vain nauhoja, jotka vastaavat kasvuhormonia tai kasvuhormonin muotoja, joissa 1 tai 2 amidiryhmää on lohkaistu.
Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että vesiuute saostetaan yhdellä tai useammalla polyetyleeniglykolierällä sekoittamalla vesiuutteeseen 10-17 paino-% polyetyleeniglykolia, jonka molekyylipaino on välillä 3000-6000, jolloin liuoksen pH säädetään ennen sekoitusta tai sen jälkeen arvoon 4-6, edullisesti 4,5-5,0, suhteellisen puhtaan kasvuhormonin saostamiseksi suurella saannolla, 4 57669 minkä jälkeen emäliuokseen haluttaessa lisätään vielä polyetylee-niglykolia 20-30 paino-%:iin asti follikkelia stimuloivan hormonin ja lutenisoivan hormonin saostamiseksi, jotka voidaan sen jälkeen eristää tunnetulla tavalla.
Suorittamalla saostus tällä tavalla saadaan puhdasta tuotetta suurin saannoin. Niin ollen polyetyleeniglykoli (PEG) toimii valikoivaminin saostusaineena kuin ammoniumsulfaatti. Tällöin saadaan aivolisäke-hormoneja, erikoisesti kasvuhormonia puhtaassa tilassa. Lisäksi vältetään se denaturointi, jonka asetoni aiheuttaa.
Keksinnön mukainen menetelmä ei sovellu vain primäärisiin aivolisäke-uutteisiin, vaan se on yhtä käyttökelpoinen peptidi- ja proteiini-hormonien eristämiseen esimerkiksi aivolisäkekudosviljelmien kas-vatusvällaineista.
Keksinnön mukaan on edullista suorittaa saostus polyetyleeniglykolil-la pH-arvon ollessa välillä 4,5-5,0, mikä on optimiarvo. Erittäin hyviä tuloksia saavutetaan pH-arvon ollessa noin 4,8.
Saostusaineena käytettävän polyetyleeniglykolin molekyylipaino on keksinnön mukaan välillä 3000-6000.
Tärkeimpien aivolisäkehormonien erottamiseksi ja eristämiseksi voidaan keksinnön mukainen menetelmä tarkoituksenmukaisesti toteuttaa siten, että polyetyleeniglykolin pitoisuus uutteessa nostetaan asteittain arvosta 10 arvoon 30 % (paino/tilavuus). Suodattamalla pois kunkin lisäyksen jälkeen muodostunut sakka aikaansaadaan yksityisten aivolisäkehormonien tehokas erottaminen. Jakeita voidaan sen jälkeen kutakin erikseen käsitellä puhtaitten hormonien tuottamiseksi.
Keksinnön erään edullisen sovellutusmuodon mukaan kasvuhormoneja tal-teenotettaessa on tarkoituksenmukaista eristää uutteista seostettavat jakeet silloin, kun ne sisältävät 10-14 % (paino/tilavuus) poly-etyleeniglykolia. Tällöin saadaan suuri saanto saostetusta kasvuhormonista, joka voidaan puhdistaa tunnetulla tavalla.
✓ Lähtöaineena kyseessä olevassa menetelmässä voidaan käyttää joko aivolisäkekudoksen tai aivolisäkehormoneja sisältävien kudosviljelmien uutetta. Uute voi olla valmistettu tunnetulla tavalla, joko jauhaen, hakaten tai muulla tavalla hienontamalla aivolisäkkeitä ja uuttamalla puskurivesiliuoksilla. Sopiva uuttoaine on fosfaattipuskuri-vesiliuos, jonka pH-arvo on 8-9, esimerkiksi 8,7. Sen sijasta voidaan käyttää muita puskureita, joilla on suurempi tai pienempi pH-arvo.
5 57669
Tarkoituksenmukaista on lisätä yhdistettä PEG suodatettuun uutteeseen, jonka pH-arvo on 8-9, jonka jälkeen pH pienennetään arvoon 4,5-5,0, esim. arvoon 4,8 lisäämällä happoa, kuten suolahappoa, rikkihappoa, fosforihappoa tai etikkahappoa. On kuitenkin myös mahdollista asettaa pH ensin arvoon 4,5-5,0 ja sen jälkeen lisätä yhdistettä PEG. Mahdollisesti voi pH-arvon säätö tapahtua samanaikaisesti PEG-lisäyksen kanssa.
PEG määrä riippuu siitä aivolisäkehormonista, jonka halutaan saostuvan, ja asteittainen lisäys suoritetaan, kun mahdollisimman paljon aivolisäkehormoneja halutaan erottuvan. Niinpä voidaan alkaa PEG-lisäyksellä n. 10 % ja pH säädetään esim. arvoon 4,8 ennen tai jälkeen lisäyksen, jonka jälkeen seos suodatetaan. Suodatuksen jälkeen lisätään PEG yhtenä tai useampana eränä kunnes sen pitoisuus on noin 17 %. Täten saadut jakosaostuksen sakat sisältävät suuren tuotoksen kasvuhormonia. PEG:tä edelleen lisättäessä aina pitoisuuteen 30 %, saostuu muita jakeita, jotka etupäässä voivat sisältää aivolisäkehormoneja FSH ja LH.
Saostetut jakeet jälkikäsitellään tunnetulla tavalla. Niinpä sakka voidaan eristää linkoamalla, jonka jälkeen se liuotetaan jälleen puskuriin, pH-arvon ollessa välillä 6,5-8, esim. 7,0. Sen jälkeen suoritetaan saostus kyllästetyllä ammoniumsulfaattiliuoksella. Muodostunut sakka erotetaan linkoamalla ja liuotetaan puskuriin. Liuos kromatografoidaan kolonnissa, joka käsittää molekyyliseulan ja happaman tai emäksisen ioninvalhtohartsin. Kromatografoinnin yhteydessä eristetään jakeet, jotka sisältävät puhtaita aivolisäkehormoneja, mm. kasvuhormonin.
Keksinnön mukaista menetelmää kuvataan lähemmin seuraavassa esimerkkien avulla.
Esimerkki 1 24 pakastettua ihmisen aivolisäkettä homogenoidaan lisäten 100 ml puskuria (I), jolla on seuraava koostumus: 1,8 % dinatriumvetyfos-faattia vedessä,pH:n ollessa saatettu arvoon 8,7 lisäämällä IN natriumhydroksidiliuosta. Seos lingotaan. 90 mlraan nestettä lisätään 24 ml vesiliuosta, joka sisältää 50 g polyetyleeniglykolia 6000 100 mlrssa liuosta. 30 minuutin hämmennyksen jälkeen lingotaan, ja nesteen pH säädetään arvoon 4,8 IN suolahapolla. Linkoamisen jälkeen 6 57669 sakka uutetaan 60 ml:lla puskuria (II), jolla on seuraava koostumus: 1,4 % dinatriumvetyfosfaattia, 4,9 % mononatriumdivetyfosfaattia, pH:n ollessa saatettu arvoon 7,0 lisäämällä IN natriumhydroksidi-liuosta. 1 tunnin hämmennyksen jälkeen lingotaan, ja nesteeseen lisätään 60 ml kyllästettyä ammoniumsulfaattiliuosta. Lingotaan jälleen, ja sakka liuotetaan 25 ml:aan liuosta (III), jolla on seuraava koostumus: 2 % aminoetikkahappoa ja 0,25 % natriumvetykarbo-naattia. Liuos kromatografoidaan pylväässä, jonka pituus on 79 cm ja läpimitta 2,5 cm, ja joka sisältää dekstraanigeeliä Sephadex G100, jonka erotuskyky on 4000-150 000 (valm. Pharmacia Fine Chemicals, Ruotsi), tasapainoitettuna liuoksella III. Pylväs eluoidaan liuoksella III, ja eluointitilavuutta 260-320 ml vastaavat jakeet kerätään. Kerätyt jakeet sisältävät 260 yksikköä ihmisen kasvuhormonia, ominais-aktiivisuuden ollessa 2,2 yksikköä proteiinin milligrammaa kohti. 100 mikrogramman proteiinimäärän elektroforeesi polyakryyliamidigeelissä osoittaa vain 3 nauhaa, vastaten kasvuhormonia ja deamidoituja muotoja.
Esimerkki 2 250 pakastettua ihmisen aivolisäkettä uutetaan kuten on selostettu esimerkissä 1 1500 ml:11a puskuria I. Nesteeseen lisätään 460 ml liuosta, joka sisältää 230 g polyetyleeniglykolia 3000 ja 270 ml vettä. 20 minuutin hämmennyksen ja linkoamisen jälkeen nesteen pH säädetään arvoon 4,9 IN suolahapolla. 20 minuutin hämmennyksen ja linkoamisen jälkeen sakka uutetaan kuten esimerkissä 1 on selostettu 1000 ml:11a puskuria II. Yön yli suoritetun hämmennyksen ja linkoamisen jälkeen nesteeseen lisätään 1000 ml kyllästettyä ammonium-sulfaattiliuosta. Lingotaan jälleen, ja sakka liuotetaan 300 ml:aan liuosta, jossa on 126 g virtsa-ainetta 207 ml:ssa puskuria III (ks. esimerkkiä 1). Liuos kromatografoidaan pylväässä, jonka pituus on 100 cm ja läpimitta 11,4 cm, ja joka sisältää Sephadex GlOO-geeliä, tasapainoitettuna puskurilla III. Pylväs eluoidaan puskurilla III. Kasvuhormonin eluointitilavuutta vastaavat jakeet kerätään. Kerätyt jakeet sisältävät 2900 yksikköä ihmisen kasvuhormonia, ominais-aktiivisuuden ollessa 2,6 yksikköä proteiinin milligrammaa kohti.
100 mikrogramman elektroforeesi polyakryyliamidigeelissä osoittaa vain 2 nauhaa, vastaten kasvuhormonia ja yhtä deamidoitua muotoa.
Esimerkki 3 500 pakastettua ihmisen aivolisäkettä uutetaan kuten esimerkissä 1 on selostettu 2000 ml:11a puskuria I. Linkoamisen jälkeen pH säädetään arvoon 4,8. Lingotaan uuudelleen. Sakka muutetaan puhtaaksi 7 57669 kasvuhormoniksi uuttamalla puskurilla II, saostamalla, liuottamalla puskuriin III sekä pylväskromatografoimalla, kuten on selostettu esimerkissä 2. Saadaan 3400 yksikköä kasvuhormonia, ominaisaktiivi-suuden ollessa 2,7 yksikköä proteiinin milligrammaa kohti.
Päällä olevaan nesteeseen lisätään 650 ml liuosta, joka sisältää 325 g polyetyleeniglykolia 3000 ja 380 ml vettä. Seos lingotaan. Sakka uutetaan puskurilla II, saostetaan amminiumsulfaatilla, liuotetaan uudelleen puskuriin III sekä pylväskromatografoidaan, kuten on selostettu esimerkissä 2. Kerätyt kasvuhormonipitoiset jakeet sisältävät 4230 yksikköä kasvuhormonia, ominaisaktiivisuuden ollessa 2,6 yksikköä proteiinin milligrammaa kohti.
Kokonaistuotos 500 aivolisäkkeestä oli siis 7630 yksikköä.
Esimerkki 4 500 pakastettua ihmisen aivolisäkettä uutetaan kuten esimerkissä 1 on selostettu 2000 ml:11a puskuria I. Linkoamisen jälkeen pH säädetään arvoon 4,8. Lingotaan uudelleen. Nesteeseen lisätään 1300 ml liuosta, joka sisältää 650 g polyetyleeniglykolia 3000 ja 760 ml vettä. Lingotaan jälleen. Sakka uutetaan puskurilla II ja suoritetaan saostus ammoniumsulfaatilla, kuten on selostettu esimerkissä 2. 2000 ml:aan nestettä lisätään 1000 ml liuosta, jossa on 500 g polyetyleeniglykolia 3000 585 ml:ssa vettä. 1 tunnin hämmennyksen jälkeen suoritetaan linkoaminen. Sakka sisältää aivolisäkehormonit FSH ja LH.
Esimerkki 5 100 ml aivolisäkekudosviljelmästä saatua kasvatusväliainetta, joka sisältää 5 yksikköä kasvuhormonia, väkevöidään ultrasuodattamalla 1 ml:aan. Siihen lisätään 0,5 ml vesiliuosta, joka sisältää 0,5 g polyetyleeniglykolia 6000 millilitraa kohti. Liuoksen pH säädetään arvoon 4,8. Saostuma erotetaan, liuotetaan 0,5 ml:aan vettä, jonka pH säädetään arvoon 7-8 NaOH-liuoksella, ja liuos kromatografoidaan pylväässä, jonka pituus on 63 cm ja läpimitta 0,9 cm, ja joka sisältää Sephadex GlOO-geeliä, tasapainoitettuna puskurilla III. Eluointi suoritetaan puskurilla III. Kasvuhormonia sisältävät jakeet kerätään. Kerätyt jakeet sisältävät 1,0 yksikköä ihmisen kasvuhormonia, ominais-aktiivisuuden ollessa 2,0 yksikköä proteiinin milligrammaa kohti.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK346876 | 1976-07-30 | ||
| DK346876A DK144731C (da) | 1976-07-30 | 1976-07-30 | Fremgangsmaade til isolering af proteinhormoner stammende fra humant hypofysevaev |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI772297A FI772297A (fi) | 1978-01-31 |
| FI57669B true FI57669B (fi) | 1980-05-30 |
| FI57669C FI57669C (fi) | 1980-09-10 |
Family
ID=8123219
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI772297A FI57669C (fi) | 1976-07-30 | 1977-07-27 | Foerfarande foer isolering och utvinning av proteinhormoner haerstammande fraon hypofysvaevnad |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4115375A (fi) |
| JP (1) | JPS5338611A (fi) |
| AR (1) | AR213530A1 (fi) |
| AU (1) | AU507547B2 (fi) |
| BE (1) | BE857327A (fi) |
| CA (1) | CA1077839A (fi) |
| DD (1) | DD131375A5 (fi) |
| DE (1) | DE2733565A1 (fi) |
| DK (1) | DK144731C (fi) |
| ES (1) | ES461179A1 (fi) |
| FI (1) | FI57669C (fi) |
| FR (1) | FR2359852A1 (fi) |
| GB (1) | GB1537795A (fi) |
| HU (1) | HU175512B (fi) |
| IL (1) | IL52610A (fi) |
| IT (1) | IT1086345B (fi) |
| NL (1) | NL7708426A (fi) |
| NO (1) | NO147820C (fi) |
| SE (1) | SE7708678L (fi) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1156766B (it) * | 1977-05-25 | 1987-02-04 | Anvar | Polipeptidi dotati di attivita' timica o antagonista e procedimento per la loro sintesi |
| JPS5630925A (en) * | 1979-08-21 | 1981-03-28 | Sumitomo Chem Co Ltd | Purification of human growth hormone |
| IT1197570B (it) * | 1983-02-11 | 1988-12-06 | Serono Ist Farm | Miscele di fsh e lh da ipofisi porcine in rapporto definito |
| JPS6255087A (ja) * | 1985-03-25 | 1987-03-10 | シタス オンコロジー コーポレイション | 融合蛋白質をコ−ドする組換ｄｎａ配列 |
| US4612367A (en) * | 1985-04-08 | 1986-09-16 | Eli Lilly And Company | Process for purifying growth hormone-like materials |
| HU198626B (en) * | 1986-05-27 | 1989-11-28 | Sandoz Ag | Process for producing pharmaceutical compositions comprising somatostatin analogues as active ingredient |
| DD270466A5 (de) * | 1987-01-30 | 1989-08-02 | �������������@��������@�K@���������@����Kk�� | Verfahren zur rueckgewinnung von somatropinen aus verduennten waessrigen loesungen |
| US5525519A (en) * | 1992-01-07 | 1996-06-11 | Middlesex Sciences, Inc. | Method for isolating biomolecules from a biological sample with linear polymers |
| US6162905A (en) * | 1996-11-07 | 2000-12-19 | Ibsa Institut Biochimique S.A. | FSH and LH separation and purification process |
| US6437101B1 (en) | 1999-05-07 | 2002-08-20 | Akzo Nobel N.V. | Methods for protein purification using aqueous two-phase extraction |
| US6437102B1 (en) * | 1999-11-24 | 2002-08-20 | Bayer Corporation | Method of separating prions from biological materials |
| EP2121057A4 (en) * | 2007-02-06 | 2012-10-10 | Incept Llc | POLYMERIZATION WITH PRECIPITATION OF PROTEINS FOR ELUTION IN A PHYSIOLOGICAL SOLUTION |
| RU2492177C2 (ru) * | 2011-12-15 | 2013-09-10 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП ГосНИИгенетика) | СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО ГОРМОНА РОСТА ЧЕЛОВЕКА, СЕКРЕТИРУЕМОГО ДРОЖЖАМИ Saccharomyces cerevisiae |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL286954A (fi) * | 1962-01-03 | |||
| US3763135A (en) * | 1971-11-08 | 1973-10-02 | Baxter Laboratories Inc | Gamma globulin production from cohn fraction iii using polyethylene glycol |
| US3808189A (en) * | 1973-03-15 | 1974-04-30 | American Cyanamid Co | Isolation of gamma globulin preparations enriched in iga and igm using polyethylene glycol |
-
1976
- 1976-07-30 DK DK346876A patent/DK144731C/da not_active IP Right Cessation
-
1977
- 1977-07-25 US US05/819,019 patent/US4115375A/en not_active Expired - Lifetime
- 1977-07-26 DE DE19772733565 patent/DE2733565A1/de not_active Withdrawn
- 1977-07-27 GB GB31488/77A patent/GB1537795A/en not_active Expired
- 1977-07-27 AR AR268583A patent/AR213530A1/es active
- 1977-07-27 FI FI772297A patent/FI57669C/fi not_active IP Right Cessation
- 1977-07-27 IL IL52610A patent/IL52610A/xx unknown
- 1977-07-28 SE SE7708678A patent/SE7708678L/xx not_active Application Discontinuation
- 1977-07-28 AU AU27387/77A patent/AU507547B2/en not_active Expired
- 1977-07-28 HU HU77NO220A patent/HU175512B/hu unknown
- 1977-07-28 IT IT26257/77A patent/IT1086345B/it active
- 1977-07-29 NO NO772697A patent/NO147820C/no unknown
- 1977-07-29 NL NL7708426A patent/NL7708426A/xx not_active Application Discontinuation
- 1977-07-29 CA CA283,798A patent/CA1077839A/en not_active Expired
- 1977-07-29 ES ES461179A patent/ES461179A1/es not_active Expired
- 1977-07-29 BE BE179787A patent/BE857327A/xx unknown
- 1977-07-29 FR FR7723464A patent/FR2359852A1/fr active Granted
- 1977-07-30 JP JP9096377A patent/JPS5338611A/ja active Pending
- 1977-08-01 DD DD7700200373A patent/DD131375A5/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU507547B2 (en) | 1980-02-21 |
| DD131375A5 (de) | 1978-06-21 |
| NO772697L (no) | 1978-01-31 |
| NO147820C (no) | 1983-06-22 |
| DK346876A (da) | 1978-01-31 |
| IL52610A (en) | 1980-10-26 |
| FI772297A (fi) | 1978-01-31 |
| BE857327A (fr) | 1978-01-30 |
| FR2359852B1 (fi) | 1983-01-28 |
| NL7708426A (nl) | 1978-02-01 |
| FR2359852A1 (fr) | 1978-02-24 |
| HU175512B (hu) | 1980-08-28 |
| DK144731C (da) | 1982-10-18 |
| IT1086345B (it) | 1985-05-28 |
| US4115375A (en) | 1978-09-19 |
| NO147820B (no) | 1983-03-14 |
| JPS5338611A (en) | 1978-04-08 |
| CA1077839A (en) | 1980-05-20 |
| DE2733565A1 (de) | 1978-02-02 |
| SE7708678L (sv) | 1978-01-31 |
| IL52610A0 (en) | 1977-10-31 |
| ES461179A1 (es) | 1978-05-16 |
| FI57669C (fi) | 1980-09-10 |
| GB1537795A (en) | 1979-01-04 |
| AR213530A1 (es) | 1979-02-15 |
| AU2738777A (en) | 1979-02-01 |
| DK144731B (da) | 1982-05-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Skeggs Jr et al. | The purification and partial characterization of several forms of hog renin substrate | |
| FI57669B (fi) | Foerfarande foer isolering och utvinning av proteinhormoner haerstammande fraon hypofysvaevnad | |
| Ghosh et al. | Purification and properties of molecular-weight variants of human placental alkaline phosphatase | |
| ELLIS | Studies on the serial extraction of pituitary proteins | |
| Hwang et al. | Purification of human prolactin | |
| Bosmann et al. | Cellular membranes: the isolation and characterization of the plasma and smooth membranes of HeLa cells | |
| US4010148A (en) | Purified thymosin and process | |
| US20060079460A1 (en) | Purified LH | |
| EP1257564B1 (en) | Process for purification of recombinant hcg having a specific bioactivity | |
| US4348316A (en) | New protein PP15, a process for its preparation and its use | |
| Handley et al. | Characterization of the collagen synthesized by cultured cartilage cells | |
| CA2037244C (en) | Method for purifying somatotropin monomers | |
| Kibbelaar et al. | Fractionation of the water-insoluble proteins from calf lens | |
| SU1367837A3 (ru) | Способ получени средства, селективно тормоз щего рост или размножение нормальных и лейкемических клеток миелоидов | |
| Papkoff et al. | The isolation and characterzation of growth hormone from sheep pituitary glands | |
| Meinardi et al. | Studies of substance P | |
| Alvino et al. | In vitro synthesis of 300 oo M r rat thyroglobulin subunit | |
| Landefeld et al. | Isolation and characterization of subunits from equine pituitary follicle-stimulating hormone | |
| Kuznetzov et al. | Pituitary gonadotropic hormone from a chondrostean fish, starred sturgeon (Acipenser stellatus Pall.): III. Polymorphism | |
| Hawker et al. | Progress on the isolation of porcine thyrocalcitonin | |
| Lowry et al. | Purification of anterior pituitary and hypothalamic hormones. | |
| US4681931A (en) | Process for the isolation and purification of alpha-interferons | |
| US4588685A (en) | Process for the preparation of a new-type active substance selectively inhibiting food intake | |
| EP0047149B1 (en) | A purified polypeptide, a process for its preparation, its use and pharmaceutical compositions containing it | |
| Di Marzo et al. | β-Endorphin in Neoroblastoma x Glioma hybrid cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: NORDISK INSULINLABORATORIUM |