DK143147B - Fremgangsmaade til paavisning af urobilinogen eventuelt sammen med bilirubin samt middel til brug ved fremgangsmaaden - Google Patents

Description

(W

(11) FREMLÆGGELSESSKRIFT 143147 DANMARK i«) int.ci.3 g 01 m 33/50 §(21) Ansøgning nr. 3033/72 (22) Indleveret den 1 6. jun. 1972 (24) Løbedøg 1 6. jun. 1972 (44) Ansøgningen fremlagt og fremlseggeteesskriftet offentliggjort den 29· jun. 1 9o1

DIREKTORATET FOR

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (3°) Prioritet begaret fra den

19· jun. 1971a 2130559a DE

(41) Aim. tilg. 20. dec. 1972 <71> BOEHRINGER MANNHEIM GMBH, Mannheim-Waldhof, DE.

(72) Opfinder: Walter Rittersdorf, Kas seler-Strasse 6, Mannheim-Waldhof, DE: Hans-Georg Rey, Herafelderstrasse 18, Mannheim-Waldhof, DE: Dieter Berger, Johann-Sebastian-Bach Str. 18, Viernhelm, DE: Peter Rieckmann,

Stegervi aldw eg 10, Mannheim-Waldhof, DE.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Firmaet Chas. Hude._ (54) Fremgangsmåde til påvisning af urobilinogen, eventuelt sammen med bi*= lirubin, samt middel til brug ved fremgangsmåden.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til påvisning af urobilinogen, eventuelt- sammen med bilirubin,i legemsvæsker, fortrinsvis i urin.

Det er kendt, at man kan påvise urobilinogenstoffer (bilaner), in= dol, sulfonamider, porphobilinogen, urinindikan og 5-hydroxy-indol-eddikesyre med en opløsning af p-dimethylaminobenzaldehyd i saltsyre. Denne påvisning er i litteraturen kendt som Ehrlich's reaktion. Den har navnlig fået betydning i den medicinske diagnostik som påvisning af "formerede urobilinogener" i urin. Selv om prøven ikke er meget specifik, gælder den som standardmetode for diagnosen af lever- og galdelidelser.

Da prøvepapirer i den klinisk-kemiske diagnostik stadig vinder mere 2 143147 betydning, er der i mellemtiden også blevet udviklet prøvepapirer til påvisning af urobilinogen på basis af Ehrlich’s reaktion. Disse prøvepapirer er behæftede med to væsentlige mangler: 1. Farvereaktionen udvikler sig så langsomt, at man, før aflæsningen, må vente mindst ét minut.

2. Prøvepapirerne har ifølge deres natur den Ehrlich’ske prøves u-specificitet, således at falske positive resultater ikke kan udelukkes.

Det har allerede for lang tid siden været omtalt, at urobilinogen kobler med diazoteret sulfanilsyre til et gult farvestof. Denne reaktion blev i 1884 opdaget af Ehrlich og beskrevet som den såkaldte "gule diazoreaktion". Reaktionen blev tilmed i den følgende tid un- dersøgt flere gange, dog kunne man indtil i dag ikke med sikkerhed fastslå, om det utvivlsomt drejede sig om en diazokobling med urobilinogen, eller om også andre stoffer var ansvarlige for dannelsen af de gule farvestoffer, (sml. Biologie der Gallenfarbstoffe, Georg Thieme-Verlag, Stuttgart I960, s. 32 og s. 211). Da det her drejede sig mere om et kuriosum end om et anvendeligt middel til den kliniskkemiske diagnostik, var den gule diazoreaktion praktisk betydningsløs og er næppe blevet omtalt i de pågældende lærebøger.

Fra svensk fremlæggelsesskrift nr. 344.503 er det kendt, at visse substituerede benzaldehydsalte giver en farvereaktion med urobilinogen, som forstyrres mindre end med det kendte p-dimethylaminobenzal= dehyd, men reaktionen er ikke så specifik som ved fremgangsmåden i-følge opfindelsen, og den kræver en reaktionstid på 1-2 minutter.

Der er nu på overraskende måde fundet en specifik og meget hurtig fremgangsmåde til påvisning af urobilinogen, eventuelt sammen med bilirubin, hvilken fremgangsmåde ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man anvender stabile benzoldiazoniumsalte, hvis eventuelt flere gange substituerede phenylrest i ortho- eller parastil-lingen indeholder i det mindste én fleratomig elektrondonatorgruppe med i det mindste ét mesomeridygtigt elektronpar, idet summen af de Hammett*ske sigmaværdier af alle substituenter ikke må overskride værdien +0,4, som indikatorstoffer.

143147 3

Elektrondonatorgrupper er ifølge opfindelsen grupper, der indeholder oxygen, svovl eller nitrogen i direkte binding med phenylresten. Oxygenholdige grupper er eksempelvis hydroxy-, alkoxy-, aralkoxy-eller aryloxygrupper. Som svovlholdige grupper kommer i og for sig kun alkylmercapto- eller arylmercaptogrupper i betragtning, da frie mercaptogrupper, på grund af deres oxydationsfølsomhed, i reglen ikke er brugbare. Som kvælstofholdige grupper er acylamino-, arylamino-eller arylalkylaminogrupper brugbare, medens usubstituerede amino-grupper og alkylaminogrupper, på grund af deres basicitet under re-aktionsbetingelseme, for det meste protoneres og så ikke mere har noget mesomeriegnet elektronpar. Ved valget af substituentepne må det yderligere huskes, at disse ikke reagerer med diazogruppen.

Dette gælder navnlig o-acylamino- og o-arylaminogrupper.

Ifølge opfindelsen er navnlig benzoldiazoniumsalte egnede af den almindelige formel I

R·^ Rx ^)-Nj^ & (I) r4 i hvilken X® er en stabiliserende anion, og og R2 er fleratomige elektrondonatorgrupper med mindst ét mesomeridygtigt elektronpar, idet én af resterne R^ og R2 også kan være hydrogen, halogen eller en lavere alkylgruppe, og resterne R^ og R^ er hydrogen eller en gruppe, der ikke sterisk hindrer diazokoblingen med urobilinogen, idet summen af de Hammett’ske sigmaværdier for alle substituenteme Rl’ R2’ R3 °S r4 ihhe må overskride +0,4.

Forbindelserne I er navnlig egnede til anvendelse på sugedygtige bærere.

Benzoldiazoniumsaltene ifølge opfindelsen reagerer med urobilinogen næsten momentant og giver meget specifikke røde til blå farvestoffer, som er særlig velegnede til påvisning selv af meget små koncentrationer. Udover dette har forbindelserne ifølge opfindelsen den sto- 4 1 A3 147 re fordel, at farvereaktionen ikke forstyrres af urinstof. De hidtil kendte prøvepapirer bliver farvet gule af det i urin tilstedeværende urinstof alt efter koncentrationen, hvad der kan væsentligt vanskeliggøre påvisningen af små urobilinogenmængder. Derudover bliver farvereaktionen ifølge opfindelsen netop ikke påvirket af de stoffer, som hyppigt forekommer i urin, og som for det meste, som bekendt, forstyrrer Ehrlich's prøve. Til disse forstyrrende stoffer hører navnlig de aromatiske aminer, som i mange tilfælde, i form af lægemidler (sulfonamider, sulfonylurinstoffer etc.), udskilles sammen med urinen. Tilstedeværelsen af disse aromatiske aminer i urin førte hidtil til gule, eventuelt orange farvereaktioner, som både kunne overdække og forfalske den ved urobilinogen fremkaldte farvning .

Til påvisning af det til diagnostisering af lever- og gallelidelser ligeledes vigtige bilirubin er tillige diazoniumsalte (f.eks. diazosulfanilsyre, p-nitrobenzoldiazoniumsalt eller 2,4-dichlorben= zoldiazoniumsalt) allerede i lang tid blevet anvendt. Disse giver dog formentlig med urobilinogen ingen brugbar farvereaktion.

I modsætning hertil tillader forbindelserne ifølge opfindelsen, at man specifikt kan påvise urobilinogen ved siden af bilirubin. I nogle tilfælde reagerer tilmed også bilirubin med farvestofferne ifølge opfindelsen, idet dog reaktionen først fremkommer, efter at farvereaktionen med urobilinogen allerede er udviklet vidtgående, og adskiller sig farvemæssigt så stærkt, at det mærkelig nok endog er muligt at bestemme begge gallefarvestoffer med ét reagens ved siden af hinanden, og at skønne over mængdeforholdene ifølge den udviklede blandingsfarve. Således viser altså en rødfarvning tilstedeværelsen af urobilinogen og en senere udviklet blåfarvning tilstedeværelsen af bilirubin. Ved samtidig tilstedeværelse af begge gallefarvestoffer farver prøvestrimlen sig først rød og senere tiltagende violet.

I undtagelsestilfælde udvikler farvereaktionerne sig samtidig, hvorved prøveresultatet dog ikke påvirkes.

I tilfælde af, at reaktionen med bilirubin skal undertrykkes, kan man nå dette ved, at man som indikator anvender et diazoniumsalt med relativ lav elektrophili og lader reaktionen afløbe under tilsæt- 143147 5 ning af kationiske befugtningsmidler.

Det er på denne måde muligt at modificere midlerne til påvisning af urobilinogen, eventuelt sammen med bilirubin, således at de bliver optimalt velegnede til det tilstræbte formål.

Opfindelsen angår endvidere et middel til brug ved den beskrevne' fremgangsmåde, hvilket middel er ejendommeligt ved et indhold af mindst ét diazoniumsalt som defineret i det foregående og en fast organisk eller uorganisk syre.

Forbindelserne af den almindelige formel I bliver fortrinsvis anvendt til fremstilling af prøvepapirer. Stofferne bliver til dette formål sammen med en syre og eventuelt med tilsætningsstoffer, som f.eks. stabilisatorer og befugtningsmidler anbragt på en sugedygtig bærer. Desuden er forbindelserne I egnede til fremstilling af prøvefilmstrimler ifølge DOS 1.598.153 og til påvisning af urobilinogen i opløsninger.

Til fremstilling af den foretrukne udførelsesfonn af de nye diagnostiske midler bliver en sugedygtig bærer, fortrinsvis filtrerpapir, vædet med en opløsning, som indeholder 0,05-5 g, fortrinsvis 0,1-1 g (per 100 ml) af et diazoniumsalt af den almindelige formel I samt 2-30 g, fortrinsvis 5-20 g af faste uorganiske eller organiske syrer, som eventuelt indeholder befugtningsmidler eller stabilisatorer eller begge dele.

Som opløsningsmidler for imprægneringsopløsningerne kommer frem for alt vand og letflygtige, organiske opløsningsmidler, som ikke reagerer med diazoniumsaltene i betragtning. Disse er fortrinsvis lavere alkoholer, ethylacetat og acetonitril.

Ved fremstillingen af diazoniumsaltopløsningen kan man enten gå således frem, at man tilfører det færdige diazoniumsalt til opløsningen, eller ved at man på kendt måde fremstiller saltet i opløsningen ved diazotering af en aromatisk amin.

Foretrukne og ifølge opfindelsen særligt brugbare er de forbindelser af den almindelige formel I, i hvilken er en hydroxy-, alkylmerc- 143147 6 apto- eller lavere alkoxygruppe og R2 en hydroxy-, alkoxy-, phen= oxy-, aralkoxy-, alkylmercapto-, phenylmercapto-, phenylalkylamino-, eventuelt substitueret phenylamino- eller acylaminogruppe, idet én af resterne og R2 også kan være hydrogen, halogen eller en methyl-gruppe og og hydrogen, et halogenatom, en hydroxy-, alkoxy-, phenoxy-, alkylmercapto-, phenylmercapto-, phenylalkylamino-, eventuelt substitueret phenylamino-, acylamino-, alkyl-sulfo- og carb= oxylgruppe og )^et halogenid eller anionen af en oxygensyre eller én ved halogenhydrogen koordinativt mættet Lewissyre.

Af holdbarhedsgrunde bliver der normalt kun anvendt stabile dizo= niumsalte, d.v.s. salte, som har en stabiliserende anion. Disse er navnlig sulfat-, tetrafluoroborat-, tetrachlorozinkat- og hexachlo= roantimonationen samt arylsulfonationerne.

Som faste uorganiske og organiske syrer kommer eksempelvis o-phos= phorsyre, metaphosphorsyre, sulfosalicylsyre, oxalsyre eller sure salte, f.eks. kaliumbisulfat på tale. Man kan også anvende addukter af Lewissyrer og Lewisbaser, når de reagerer tilsvarende surt. Navnlig har den i handlen værende metaphosphorsyre vist sig egnet; den indeholder ca. 50-60% af dens natriumsalt, da dette erfaringsmæssigt giver særlig stabile prøvepapirer.

Metaphosphorsyre og oxalsyre har tillige den fordel, at de giver prøvepapirer, som kun reagerer meget langsomt med bilirubin.

De stabiliserende tilsætninger er allerede tilstrækkelig kendt fra diazokemien. Sådanne tilsætninger er f.eks. natriumfluoroborat, na= triumarylsulfonat, magnesiumsulfat eller natriummetaphosphat.

Anvendelse af befugtningsmidler er ikke blot anbefalet på grund af den opnåede bedre befugtelighed, idet de også udøver yderligere specifikke virkninger. Således bevirker anioniske befugtningsmidler, navnlig sulfater og sulfonater en forhøjelse af følsomheden og en let bathochrom farveforskydning ved påvisningen af urobilinogen.

Som eksempler på anioniske befugtningsmidler skal nævnes natrium= laurylsulfat og natrium-p-dodecylbenzolsulfonat.

I mange tilfælde er det ønsket kun at påvise et signifikant forhø- 143147 7 jet urobilinogen-spejl. I disse tilfælde er det muligt at nedsætte følsomheden og reaktionshastigheden ved en tilsætning af kationiske befugtningsmidler, som f.eks. laurylpyridiniumchlorid.

Ikke-ionogene befugtningsmidler, som f.eks. polyoxyethylentriglyce= rid, påvirker i almindelighed kun befugteligheden af prøvepapireme.

Befugtningsmidleme tilsættes i mængder på ca. 0,1-3 g, fortrinsvis 0,3-1 g per 100 ml imprægneringsopløsning.

De enkelte bestanddele af recepten kan også påføres efter hinanden, når opløselighederne kræver det, eller når særlige virkninger skal opnås. Således kan det f.eks. af stabilitetsgrunde være gunstigt først at tilføre diazoniumsaltet og stabilisatoren og derpå først at efterimprægnere med syre.

Efter imprægneringen af de sugedygtige bærere, bliver disse tørret ved så lav en temperatur som muligt for ikke at beskadige diazonium-saltene.

Som sugedygtige bærere kommer frem for alt filtrerpapir på tale, men også en flis og et filt af syrebestandige kunststoffer som f.eks. polypropylen og polyester kan anvendes.

De med reagenserne forsynede sugedygtige bærere bliver fortrinsvis skåret i små firkanter og påklæbet kunststoffolier eller indklæbet mellem kunststoffolier eller kunststoffolier og finmaskede net.

Selvom prøvepapirerne udgør en foretrukket udførelsesform for den omhandlede opfindelse og er de eleganteste diagnostiske midler over for indholdsstoffer i legemsvæsker, er det naturligvis også muligt at anvende diazoniumsaltene ifølge opfindelsen til urobilinogenpå-visning i flydende fase. Drypper man diazoniumsaltene i sur opløsning til urobilinogenholdigt urin, erholder man røde til blå farvninger eller udfældninger, som eventuelt kan ekstraheres ved hjælp af organiske opløsningsmidler, som f.eks. chloroform.

Til gennemførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen til påvisning af urobilinogen i legemsvæsker, dypper man de nye diagnostiske midler i den opløsning, der skal undersøges og aflæser farveomslaget 143147 8 efter kort tid.

De ifølge opfindelsen anvendte diazoniumsalte, henholdsvis de tilsvarende aminer er almindeligt kendte.

Til kvantitativ påvisning af urobilinogen i urin ved hjælp af fotometriske metoder har 4-methoxybenzoldiazoniumsalte samt 2,4-dimeth= oxybenzoldiazoniumsalte særligt vist sig egnede som påvisningsreagenser.

De Hammett1ske sigmaværdier er som bekendt mål for den elektrontiltrækkende eller elektronafgivende virkning af substituenter (i første tilfælde får man positive, i sidste negative sigmaværdier). Sigmaværdierne er additive, idet summens fortegn angiver, om - sammenlignet med substituenten hydrogen - den elektrontiltrækkende eller den elektronafgivende effekt er overvejende. Grænseværdien ifølge opfindelsen +o,4 siger altså, at virkningen af den elektronafgivende substituent kun må forefindes til sigmaværdien +0,4. Eksempelvis kan et benzoldiazoniumsalt med en hydroxylgruppe i parastilling (sigmaværdi = -0,37) have endnu én eller flere elektrontiltrækkende grupper med en totalsigmaværdi indtil +0,83, medens et sådant dia-zoniumsalt, som er substitueret med en o-methoxy- eller p-acetamino-gruppe (sigmaværdi i begge tilfælde = *0), kun må indeholde grupper indtil en total sigmaværdi på +0,4.

Selvom Hammett-beregninger i dag gennemføres rutinemæssigt og er et værdifuldt middel til teoretiske forklaringer i de aromatiske stoffers kemi, er det ikke tilladeligt at betragte disse som almengyldige absolutværdier. Snarere drejer det sig om tilnærmelsesværdier, som er behæftet med visse usikkerheder ved den empiriske tilvejebringelse. Disse usikkerheder spiller dog kun i sjældne grænsetilfælde en rolle, som ikke på nogen måde indvirker på den tekniske lære ifølge opfindelsen.

de følgende eksempler er fremgangsmåden ifølge opfindelsen og de diagnostiske midler ifølge opfindelsen nærmere belyst.

1 A3147 9

Eksempel 1

Filtrerpapir (Schleicher und Schiill 23 SL) imprægneres med en opløsning af følgende sammensætning og tørres ved 40°C.

4-methoxybenzoldiazoniumfluoborat 0,3 g metaphosphorsyre 10,0 g dodecylbenzolsulfonsyre (natriumsalt) 0,4 g methanol 5,0 ml vand ca. 100,0 ml

Prøvepapiret giver ved neddypning i urin efter ca. 5-10 sekunder følgende farvereaktioner:

Urobilinogenfri urin : ingen farvning urin med normalt urobilinogenindhold : rosa urin med forhøjet urobilinogenindhold : carminrødt.

Lignende farvereaktioner giver prøvepapirer, som indeholder 0,3 g af de følgende diazoniumsalte: 2-methoxybenzoldiazoniumfluoborat 2-hydroxybenzoldiazoniumsulfat 4-hydroxyb enz oldiaz oniumsulfat 2,4-dihydroxybenzoldiazoniumfluoborat.

Eksempel 2

Filtrerpapir (Schleicher und Schiill 23 SL) imprægneres med en opløsning af følgende sammensætning og tørres ved 40°C.

* 4-methoxybenzoldiazoniumfluoborat 0,3 g oxalsyre 10,0 g methanol ca. 100,0 ml

Enkelte prøver af det således fremkomne prøvepapir (a) blev efter-imprægneret med opløsninger, hver med 0,4 g polyoxyethylentriglyce= rid (b), dodecylbenzolsulfonsyre (natriumsalt) (c), henholdsvis 10 143U7 laurylpyridiniumchlorid (d) i 100 ml methylenchlorid og tørret i en varm luftstrøm. Prøvepapirerne giver med urobilinogenholdig urin efter ca. 5-10 sekunder følgende reaktioner:

Prøvepapir Reaktionsfarve Urin med mg% urobilinogen _ _ 0*5_1*0_2*0 a teglrødt + ++ +++ b " + ++ +++ c carminrødt ++ +++ ++++ d teglrødt + ++ (+ = svag, ++ = middel, +++ = stærk, ++++ = meget stærk)

Eksempel 5

Filtrerpapir (Schleicher und Schull) imprægneres med en opløsning af følgende sammensætning og tørres ved 40 C.

4-ethoxyanilin 0,25 g isoamylnitrit 1,0 ml oxalsyre 10,0 g dodecylbenzolsulfonsyre (natriumsalt) 0,4 g methanol ca. 100,0 ml 'Prøvepapiret reagerer carminrødt med urobilinogenholdig urin. Med lignende, til dels noget mere violette farvetoner reagerer prøve-papirer, ved hvilke 4-ethoxyanilin er erstattet med samme mængder 2-ethoxy-, 4-butoxy-, 4-phenoxy-, 4-methoxy-2-methyl-, 2-methoxy-5-methyl-, 2-methylmercapto-, 4-methylmercapto-, 4-chlor-2-methoxy-5-methyl-, 5-chlor-2-hydroxy- eller 4-benzyloxyanilin.

Eksempel 4

Filtrerpapir (Schleicher und Schull 23 SL) imprægneres med følgende opløsninger efter hinanden og tørres.

143147 11 I. 4-acetamidobenzoldiazoniumfluoborat 0,3 g natriummetaphosphat 5,0 g vand ca. 100,0 ml II. oxalsyre 15,0 g natriumlaurylsulfat 0,5 g methanol ca. 100,0 ml

Prøvepapiret reagerer med urobilinogenholdig urin med carminrød far ve. Et på samme måde med 3-methoxy-4-acetamidobenzoldiazoniumfluo= borat imprægneret papir reagerer med rødviolet farve.

Eksempel 5

Filtrerpapir (Schleicher und Schtill 23 SL) imprægneres med en opløsning af følgende sammensætning og tørres ved 40°C.

3-chlor-4-methoxybenzoldiazoniumtoluolsulfonat 0,5 g sulfosalicylsyre 5>0 g dodecylbenzolsulfonsyre (natriumsalt) 0,8 g methanol ca. 100,0 ml.

Prøvepapiret giver ved neddypning i urobilinogenholdig urin straks en carminrødtfarvning. Ved neddypning i bilirubinholdig urin får man efter 10-20 sekunder en blågrøn farvning. Uriner, som indeholder urobilinogen og bilirubin, leverer alt efter forholdet mellemtoner mellem disse farvninger.

Eksempel 6

Polyesterflis imprægneres med opløsninger af følgende sammensætning og tørres ved 40°C.

Benzoldiazoniumsalt (a-f) 0,1 g sulfosalicylsyre 10,0 g dodecylbenzolsulfonsyre (natriumsalt) 0,4 g methanol/vand 1:1 ca. 100,0 g 143147 12 Følgende diazoniumsalte anvendtes: a 2-methoxy-5-chlorbenzoldiazonium= tetrachlorozinkat (ægterødtsalt RC) b 4-benzamido-2-methyl-5-methoxybenzol= diazoniumtetrachlorozinkat (ægtevioletsalt B) c 4-benzamido-2,5-dimethoxybenzoldia= zoniumtetrachlorozinkat (ægteblåtsalt RR) d 4-benzamido-2,5-diethoxybenzoldia= zoniumtetrachlorozinkat (ægteblåtsalt BB) e 4-methoxyphenylaminobenzoldiazonium= chlorid (variaminblåtsalt B) f phenylaminob enz oIdiazoniumhydrogen= sulfat

Med urobilinogenholdig urin fik man følgende farvninger: a rødt - blåt b rødviolet c blåviolet d blåviolet e blågrønt f blågrønt

Eksempel 7

Filtrerpapir (Schleicher und Schull 23 SL) dyppes i vandige opløsninger, som foruden 5 g kaliumhydrogensulfat hver indeholder 0,5 g af de følgende diazoniumsalte på 100 ml.

2.4- dimethoxybenzoldiazoniumfluoborat 3.4- dimethoxybenzoldiazoniumfluoborat 2.5- dimethoxybenzoldiazoniumfluoborat 3.4.5- trimethoxybenzoldiazoniumfluoborat 4- hydroxy-3,5-dichlorbenzoldiazoniumfluoborat 5- chlor-2,4-dimethoxybenzoldiazoniumfluoborat

Alle disse prøvepapirer reagerer med urobilinogenholdig urin med 143147 13 røde til lillarøde farvetoner.

Bliver disse prøvepapirer efterimprægneret med l^ige opløsninger af de følgende befugtningsmidler, får man kraftigere rødviolette til blåviolette farvninger.

Dodecylbenzolsulfonsyre (natriumsaltet) i methylenchlorid. Natriumlaurylsulfat i chloroformmethanol.

Dodecansulfonsyre (natriumsaltet) i chloroformmethanol. Dioctylnatriumsulfosuccinat i methylenchlorid.

Eksempel 8

Filtrerpapir (Schleicher tind Schull 23 SL) imprægneres med en opløsning af følgende sammensætning og tørres ved 40°C.

5-aminosalizylsyre 0,2 g metaphosphorsyre 15,0 g natriumnitrit 0,1 g dodecylbenzolsulfosyre (natriumsaltet) 0,4 g methanol 5,0 ml vand 100,0 ml

Prøvepapiret reagerer med urobilinogenholdig urin med teglstensrød farve. Et på samme måde med 5-amino-3-sulfosalizylsyre imprægneret papir reagerer med teglstensrød farve.

Eksempel 9 5,0 ml urobilinogenholdig urin omsættes med 2,0 ml af en opløsning af 2% 2,4-dimethoxybenzoldiazoniumfluoborat i 2n-saltsyre.: Efter 2 minutter tilsættes 5,0 ml chloroform, og der rystes kraftigt. Derefter bliver en del af chloroformfasen overført til en cuvette og ex-tinctionen målt ved 495 nm. Ved sammenligning med extinctionen af en standard kan det nøjagtige urobilinogenindhold i urinen bestemmes.

Claims (3)

143147 14 Patentkrav.

1. Fremgangsmåde til påvisning af urobilinogen, eventuelt sammen med bilirubin, kendetegnet ved, at man anvender stabile benzoldiazoniumsalte, hvis eventuelt flere gange substituerede phe-nylrest i ortho- eller parastillingen indeholder i det mindste én fleratomig elektrondonatorgruppe med mindst ét mesomeridygtigt elektronpar, idet summen af de Hammett*ske sigmaværdier af alle substi-tuenter ikke må overskride værdien +0,4, som indikatorstoffer.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man anvender forbindelser af den almene formel X R3 R1 R2 —^ ΐβ (I) R4 hvor er en stabiliserende anion, og R'*' og R2 er fleratomige elek- trondonatorgrupper med mindst ét mesomeridygtigt elektronpar, idet den ene af resterne R og R også kan være hydrogen, halogen eller 3 4 en lavere alkylgruppe, og resterne R og R er hydrogen eller en diazokobling med urobilinogen sterisk ikke hindrende gruppe, idet summen af de Hammett*ske sigmaværdier for alle substituenterne R^, R2, R3 og R4 ikke må overstige +0,4, som indikatorstoffer.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at man anvender forbindelser af den almene formel I, hvor R^ er hydroxy-, 2 alkylmercapto- eller lavere alkoxygrupper, og R er en hydroxy-, alkoxy-, phenoxy-, aralkoxy-, alkylmercapto-, phenylmercapto-, phe- nylalkylamino, eventuelt substitueret phenylamino- eller acylamino- gruppe, idet en af resterne R og R også kan være hydrogen, halogen 3 4 eller en methylgruppe, og R og R kan være hydrogen, et halogenatom, en hydroxy-, alkoxy-, phenoxy-, alkylmercapto-, phenylmercapto-, phe-