DK141758B - Fremgangsmåde til kontinuerlig fremstilling af hydroxocobalamin. - Google Patents

Description

MÉP

I 2222* \R0> OD FREMLÆGGELSESSKRIFT 1^1758 DANMARK <61) lnt c| i 0 07 H 23/00 «(21) Ansøgning nr. 937/67 (22) Indleveret den 21. feb. 1967 (23) Løbedeg 21. feb. 19^7 (44) Ansøgningen fremlagt og fremlæggetseeskriftet offentliggjort den 9· JtW. 19^0

DIREKTORATET FOR

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (3°) Prioritet begearøt fra den

7. mar. 1966, 52505, FR

(71) JEAN BOIGE, 55, Avenue Vercingetorix a Aulnay-gous-Bois (Seine St-DenisTi FR.

(72) Opfinder: Samme.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Dansk Patent Kontor ApS. ________ (54) Fremgangsmåde til kontinuerlig fremstilling af hydroxocobalamin.

Den foreliggende opfindelse angår en forbedret fremgangsmåde af den i krav l's indledning omhandlede art til kontinuerlig fremstilling af hydroxocobalamin (eller vitamin B 12b) ud fra cyancobalamin (eller vitamin B 12).

Den kendte fremgangsmåde, som danner basis for den foreliggende opfindelse, består af en hydrogenering af en sur opløsning af cyancobalamin efterfulgt af en oxidation, hvor hydrogeneringen foretages ved hjælp af hydrogen in statu nascendi ved kontakt af en sur opløsning af cyancobalamin med granuleret zink, hvorefter oxidationen foretages ved gennembobling af en oxiderende gas, såsom luft eller oxygen, gennem den fremkomne vandige væske.

Mere nøjagtigt består denne proces i, at man lader en sur opløsning 141758 2 af cyancobalamin passere gennem en kolonne af granuleret zink; den anvendte syre er en stærk syre, såsom f.eks. saltsyre, hydrogenbro-mid, hydrogeniodid eller svovlsyre, således at pH-værdien af opløsningen er beliggende omtrent imellem 1,5 og 3, fortrinsvis imellem 2 og 2,5, og zinken i kolonnen har en komstørrelse beliggende imellem 200 og 1400 μ, fordelagtigst imellem 500 og 800 μ, medens arbejdsforløbet foretages ved omgivelsernes temperatur og ved atmosfæretryk. Efter at den behandlede opløsning er løbet af zinkkolonnen og fortyndet med vand, lader man luft eller en anden oxiderende gas boble gennem denne opløsning. Man fraskiller derpå de opløste zinksalte ved hjælp af en uorganisk base, såsom natriumcarbonat, ammoniak eller bariumhydroxid, hvilken base udfælder dem, og man fraskiller på i og for sig kendt måde hydroxocob al amine t fra den foreliggende vandige opløsning, f.eks. ved afdampning.

Den hastighed, hvormed den sure opløsning af cyancobalamin passerer gennem zinkkolonnen, reguleres fortrinsvis på en sådan måde, at pH-værdien af opløsningen ved udgangen af kolonnen er omkring 6,5.

Skønt udbyttet ved denne hidtidige fremgangsmåde er meget fordelagtigt fra et industrielt synspunkt, har man dog ved erfaring konstateret, at det varierer fra den ene arbejdsgang til den anden, og at det undertiden kan afvige temmelig mærkbart fra det teoretiske udbytte.

I særdeleshed har man konstateret, at udbyttet falder, når arbejdsgangen fortsat udføres på den samme zinkkolonne. Det er således nødvendigt at skifte zinken ud efter nogle på hinanden følgende arbejdsforløb.

Ved at iagttage zinkkomstørrelsen og væskens gennemstrømningshastighed har man kunnet konstatere variationer, der undertiden har væsentlig indflydelse på udbyttet, hvilket tvinger en til en meget nøjagtig og temmelig følsom indstilling af enhver ændring, som kan påvirke højden af kolonnen og zinkkomstørrelsen.

Ved at analysere fænomenerne på tæt hold har man bemærket, at forskellene i udbytte skyldes en adsorption af dannede eobalaminer på zinkkornene. De således adsorberede produkter kunne kun genvindes fuldstændigt efter udvaskninger under tryk af zinkkolonnen. Hvis disse 3 141758 cobalaminer yderligere forblev for lang tid i kontakt med zinkkolonnen, kunne de nedbrydes og blive uegnede til at kunne overføres til hydroxocobalamin. Af denne grund kan angrebet af syren på zinken således foregå på uregelmæssig vis.

Era USA-patent nr. 2.738.301 kendes der endvidere en fremgangsmåde af en anden art, ved hvilken fremgangsmåde hydroxocobalaminen fremstilles portionsvis ved at omsætte en opløsning af cyaneobalamin med hydrogen i nærværelse af en katalysator. Opløsningsmidlet for cyancobalaminet angives at kunne være vand, en alkohol eller en vandig blanding deraf, uden at det dog angives, hvorvidt et opløsningsmiddel er foretrukket fremfor et andet. »

Det er derfor overraskende, at man ved den indledningsvis beskrevne, kendte fremgangsmåde, hvor man udfører hydrogeneringen kontinuerligt, opnår et kvantitativt og kvalitativt bedre udbytte, når begyndelsesopløsningen af cyaneobalamin foruden vand indeholder et andet opløsningsmiddel for cyancob al aminer. Nærmere bestemt opnås en bedre omsætning ved en fremgangsmåde, der er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

Det anvendte organiske opløsningsmiddel, der er blandbart med vand, har fortrinsvis de egenskaber at være meget opløsligt i vand, at sænke overfladespændingen af cyancobalaminopløsningen og at virke som opløsningsmiddel på samme tid for cyaneobalamin, hydroxocobalamin, cobalamineme og nedbrydningsprodukteme af de sidstnævnte, såsom produkterne kaldet gule stoffer.

Opløsningsmidlet vælges blandt de følgende stoffer:

Acetone, tetrahydrofuran, dioxan, methylalkohol, ethylalkohol, butyl-alkohol, isopropylalkohol og isobutylalkohol.

Den nødvendige mængde af organisk opløsningsmiddel skal være tilstrækkelig til at hindre adsorption af cobalaminer på zinken, men må ikke være for stor til at forstyrre syrevirkningen på zinken. Erfaringen viser, at denne mængde sædvanligvis er beliggende imellem 5 og 259$ af den vandige opløsning af cyaneobalamin, idet den foretrukne mængde er omkring 10$.

4

U175B

Ved en fordelagtig udførelsesf orm af den forbedrede fremgangsmåde ifølge opfindelsen er det anvendte organiske opløsningsmiddel i øvrigt det samme som opløsningsmidlet beregnet til den senere kromatografiske arbejdsgang, hvilket tillader adskillelse af det dannede hydroxocobalamin og det cyancobalamin, der ikke har reageret.

Forsøg har vist det overraskende resultat, at de således definerede midler på kendelig måde forøger udbyttet ved fabrikationen både kvalitativt og kvantitativt. Man kan af erfaring forklare dette bemærkelsesværdige resultat ved at antage, at tilstedeværelsen af opløsningsmidlet ved at sænke overfladespændingen af cyancobalaminopløs-ningen hindrer den fysiske adsorption af hydroxocobalamin til zinken. Dette bevirker, at reaktionen er mere fuldstændig, og åt det dannede produkt kan reoxideres øjeblikkeligt.

Man kan således forklare, at forhøjelsen af det opnåede udbytte ved en arbejdsgang er af størrelsesordenen 10 til 20$, hvilket i øvrigt giver en praktisk taget kvantitativ omdannelse af cyancobalamin til hydroxocobalamin.

Forsøg viser yderligere, at den fremkomne hydroxocobalaminopiøsning indeholder langt mindre af nedbrydningsprodukter, hvilket i høj grad letter de senere rensninger. Det er sandt, at nedbrydningsprodukterae undertiden optræder i ringe mængde i hydroxocobalaminet som følge af, at cyaneobal aminet på reduceret form forbliver adsorberet i for lang tid på zinken. Den senere oxidation er således ikke længere i stand til at overføre cobalt med valensen 2 til valensen 3, og man opnår nedbrydningsprodukter, hvori gruppen CT er blevet fjernet, men hvori cobalten er forblevet divalent.

I visse tilfælde kan de adsorberede produkter nedbrydes mere grundigt af hydrogen in statu nascendi og består så af det, man kalder gule stoffer, hvis kemiske sammensætning afledes fra cyancobalaminets, men hvori der udover gruppen CTT er forsvundet visse kæder. Man har endnu ikke kunnet bestemme den nøjagtige sammensætning af disse gule stoffer, men deres spektrum er fuldstændig forskelligt fra cyancobalamins og hydroxocobalamins, hvilket betyder en væsentlig forskel i struktur. Forsøg viser yderligere, at de førnævnte nedbrydningsprodukter og i særdeleshed de gule stoffer praktisk taget ikke har terapeutisk værdi, 5 141758 thi det, som gør hydroxocobalaminet nyttigt, er muligheden for det co-baltatom, som stoffet indeholder, til at antage di- og trivalent form, og således ved at gå frem fra den ene form til den anden at tillade nyttige biokemiske reaktioner.

Tilstedeværelsen af disse gule stoffer i det dannede hydroxocobalamin tillige med tilstedeværelsen af de andre nedbrydningsprodukter er praktisk taget uden betydning i et ved fremgangsmåden ifølge åen fore- m liggende opfindelse fremstillet produkt.

De følgende eksempler illustrerer fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse.

Eksempel 1.

Sammenligningseksempel.

a) Gennem en kolonne med en diameter på 50 mm og en højde på 250 mm og indeholdende granuleret zink, hvis middolkornstørrelse er omkring 1000 μ, leder man en sur opløsning af 0,1 'S saltsyre, indeholdende 15 g/liter cyancobalamin i opløsning, med en hastighed på 1 liter/h.

Man følger pH-værdien af den udløbende væske, og man reoxiderer øjeblikkeligt ved gennembobling af luft ifølge den kendte teknik. pH-Vær-dien ved udgangen af kolonnen er omkring 6,5; spektret efter reoxida-tionen sandsynliggør, at omdannelsen af eyancohalaminet til hydroxo-cobalamin er praktisk taget kvantitativ.

Efter ca. 2 timers forløb har pH-værdien en tendens til at stige. Man sænker fødningshastigheden en smule, og man konstaterer, at pH-værdi-en atter bliver normal, men at væsken er mere brun.

Efter 4 timers forløb viser en spektroskop!sk undersøgelse, a,t omdannelsen af cyancobalamin til hydroxocobalamin er mindre god. Man er tvunget til at standse operationen for at rense kolonnen og fjerne de nedbrydningsprodukter, som har udfaldet sig på zinken.

En korrekt arbejdsgang kan under gode betingelser absolut ikke foretages efter de 4 timer. Blandt andet har man konstateret, at når zinken begynder at blive tilsmudset, er det nødvendigt at mindske ud-strømningshastigheden for at opnå en fuldstændig hydrogenering, og netop herved fremkommer der nedbrydningsprodukter, som formindsker udbyttet ved arbejdsforløbet.

6 t41758 b) Efter at zinken er renset med megen omhu, gentager man arbejdsgangen med en lignende opløsning af cyancobalamin, idet man dog har tilsat 10io acetone.'

Man tilfører opløsningen med samme hastighed, 1 liter/h, på zinkkolonnen. Udbyttet ved begyndelsen af arbejdsforløbet er praktisk taget kvantitativt.

Man fortsætter fødningen af kolonnen. Efter 4- timers forløb har der ikke vist sig nogen ændring, og man kan fortsætte hydrogeneringen uden afbrydelse,uden at standse i mere end 15 timer, og uden at der viser sig nogen ændring. Zinken forbliver ren, og hydrogeneringen foretages hele tiden uforstyrret. Man stopper hydrogeneringen, selv om den ville kunne fortsætte uden besvær.

Før standsningen af arbejdsforløbet ændrer man gennemstrømningshastigheden ved at forøge den til 2 liter/h (dobbelt hastighed), og dette sker uden synligt besvær og uden ændring af resultaterne med hensyn til kvaliteten og udbyttet.

Man ser, at tilsætningen af opløsningsmiddel bevirker, at man opnår en ensartet, tidsuafhængig hydrogenering såvel som en større smidighed i arbejdsforløbets udførelse.

Dette tillader således også en mere økonomisk anvendelse af fremgangsmåden.

Eksempel 2.

15 g cyancobalamin opløses i 3 liter 0,1 IT saltsyre, hvortil man sætter 300 ml acetone. Man lader denne opløsning løbe gennem en kolonne med 600 g granuleret zink med en middelkomstørrelse på omkring 1000 μ. Man regulerer strømmen af syreopløsning, idet man holder pH-værdien af væsken, der forlader kolonnen, omkring 6,5.

Man gennemskyller dernæst kolonnen med 500 ml vand. Væsken, der forlader kolonnen, opsamles efterhånden i en kolbe, hvor der kontinuer-

Claims (2)

141758 7 ligt gennembobler en strøm af luft for efterhånden at reoxidere væsken ved udløbet. Oxidationen fortsættes i 10 minutter efter optagelsen af det sidste vaskevand. Opløsningen er nu rubinrød. lan måler hydroxoc obal amine t på dette stadium på et spektrofotometer, og man finder 14,5 g produkt. Man neutraliserer med en 0,1 ΪΓ natriumcarbonatopløsning under omrøring for at fjerne zinksaltene. Efter at have filtreret opløsningen kromatograferer man på aluminiumoxid, og man udkrystalliserer ved hjælp af acetone. En prøve viser, at det opsamlede hydroxocobalamin indeholder mindre end 3 o/oo cyancobalamin. Eksempel 3. Man opløser 15 g vitamin B 12 i 2,5 liter 0,2 N svovlsyre. Der tilsættes 200 ml tetrahydrofuran, og efter blanding lader man væsken løbe gennem zinkkolonnen. Efter reoxidation måler man det fremkomne hydroxocobalamin på et spektrofotometer, og man finder 14,2 g. Eksempel 4. Man går ud fra 10 g cyancobalamin, som opløses i 2 liter 0,1 N saltsyre, og man tilsætter 200 ml dioxan. Denne opløsning lader man løbe igennem en zinkkolonne, og efter oxidationen måler man det fremkomne hydroxocobalamin. Man får på dette stadium 9,8 g hydroxocobalamin. Eksempel 5. Man går ud fra 10 g cyancobalamin, som opløses i 2 liter 0,1 N saltsyre. Man tilsætter 400 ml ethylalkohol. Denne opløsning lader man ifølge den samme teknik løbe igennem en zinkkolonne, og efter oxidation måler man det fremkomne hydroxocobalamin. Man finder 9,8 g hydroxocobalamin. PAIENIERA?.

1. Fremgangsmåde til kontinuerlig fremstilling af hydroxocobal-