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BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLANDFEDERAL REPUBLIC OF GERMANY

Tag der Anmeldung: 20. Mai 1955 Bekanntgemacht am 5. Januar 1956Registration date: May 20, 1955. Advertised January 5, 1956

DEUTSCHES PATENTAMTGERMAN PATENT OFFICE

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung und Reinigung des Antibiotikums Bacitracin, das aus einer Kombination von Verfahrensstufen besteht und ein Bacitracin besonders hoher Qualität und Beständigkeit liefert.The invention relates to a method for obtaining and purifying the antibiotic bacitracin, which consists of a combination of process steps and a particularly high bacitracin Delivers quality and consistency.

Zur Gewinnung des wertvollen Antibiotikums Bacitracin sind bereits viele Verfahren angewendet worden, wie z. B. die Fällung mit Gerbsäure oder Pikrinsäure oder die Lösungsmittelextraktion mit polaren organischen Lösungsmitteln und andere Verfahren.Many processes have already been used to obtain the valuable antibiotic bacitracin, such as B. the precipitation with tannic acid or picric acid or the solvent extraction with polar organic Solvents and other processes.

Es wurde nun gefunden, daß durch die Kombination von zwei Verfahrensstufen in bestimmter Reihenfolge die Isolierung eines Bacitracin von besonders hoher Reinheit und Beständigkeit erreicht wird. Ein Vergleich des nach diesem neuen Verfahren erhaltenen Produkts mit den nach anderen Verfahren hergestellten Stoffen und mit den im Handel erhältlichen Bacitracinproben hat seine Überlegenheit ergeben. Darüber hinaus hat sich gezeigt, daß das nach dem vorliegenden, verhältnismäßig einfachen Verfahren hergestellte Produkt oft wesentlich reiner ist als die Stoffe, die durch langwierige Laboratoriumsverfahren zur Isolierung des Antibiotikums in höchster Reinheit zwecks Untersuchung der chemischen Struktur und der Eigenschaften hergestellt wurden.It has now been found that by combining two process steps in a certain order the isolation of a bacitracin of particularly high purity and resistance is achieved. A comparison of the product obtained by this new process with the substances produced by other processes and with those commercially available Bacitracin samples have shown its superiority. In addition, it has been shown that after the present, relatively simple process is often much purer than the product Substances obtained through lengthy laboratory procedures to isolate the antibiotic in the highest purity for the purpose of studying the chemical structure and properties.

Das Verfahren nach der Erfindung besteht darin, daß man das Bacitracin mit einem löslichen Molybdatsalz aus der unreinen wäßrigen Lösung ausfällt, das Bacitracin anschließend aus der Fällung bei einem leicht sauren bis leicht basischen p_H-Wert von minde-The method of the invention is that one precipitates the bacitracin with a soluble molybdate from the impure aqueous solution, the bacitracin then from the precipitation at a slightly acidic to slightly basic _pH value of minde-

509 627/171509 627/171

P 14140 IVa/'30hP 14140 IVa / '30h

si ens etwa 5 extrahiert und das Bacitracin dann mit einem teilweise mit Wasser mischbaren polaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Butanol, extrahiert. Das gereinigte Bacitracin kann dann aus dem Lösungsmittelextrakt, beispielsweise durch Extraktion mit Wasser, gewonnen werden. Die wäßrige Lösung kann, vorzugsweise aus dem gefrorenen Zustand, getrocknet werden, oder sie kann auch für viele Zwecke als reiner wäßriger Extrakt verwendet werden.they extracted about 5 and the bacitracin then with a partially water-miscible polar organic solvent, preferably butanol, extracted. The purified bacitracin can then be extracted from the solvent, for example by extraction with water. The aqueous solution can, preferably from the frozen state, dried, or it can also be used as a pure aqueous extract for many purposes will.

Wenn das erlindungsgemäße Verfahren nach der folgwidcM) Beschreibung durchgeführt wird, erhält man ein Produkt mit einer nach einem Standard-Bacitracinprüfimgsverfahren festgestellten Wirksamkeil von 65 bis 80 Einheiten pro mg. Durch sorgfältiges Arbeiten erhält man ein Material, das im allgemeinen eine Wirksamkeit von über 70 Einheiten pro mg besitzt. Die höchste Bacitracinwirksamkeit, von der bisher in der wissenschaftlichen Literatur be-If the inventive method according to the consequential) description is carried out a product using a standard bacitracin test method determined effective wedge of 65 to 80 units per mg. By careful Working gives a material that generally has an effectiveness of over 70 units per mg owns. The highest bacitracin efficacy reported in the scientific literature to date

so richtet wurde und die unter Verwendung eines Verfahrens mit Ausfällung und wiederholter Lösungsmittelextraktion erreicht wurde, betrug 66 Einheiten pro mg (Craig u. a., Journal of Biological Chemistry, Bd. 199, S. 259 bis 266 [1952]). Im Handel erhältliche Bacitracinproben wurden auf ihre Beständigkeit bei erhöhten Temperaturen in trockenem Zustand untersucht. Vergleiche der Beständigkeit haben gezeigt, daß das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Produkt weit überlegen ist.so was judged and made using a procedure achieved with precipitation and repeated solvent extraction was 66 units per mg (Craig et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 199, pp. 259-266 [1952]). Commercially available Bacitracin samples were tested for resistance to elevated temperatures when dry. Comparisons of the resistance have shown that that obtained by the process of the invention Product is far superior.

ao Bei der Durchführung des Verfahrens wird die unreine· wäßrige Lösung, z. B. eine Bacitracingär-(lüssigkeit, filtriert, um verschiedene Feststoffe zu entfernen. Im Falle der Gärflüssigkeit wird dies vorzugsweise bei einem sauren ρ,,-Wert und unter Zugabe einer Filtrierhilfe durchgeführt, um ein klares Filtrat zu erhalten, Gärilüssigkeiten, die mindestens etwa 20 Einheiten Bacitracin je ecm enthalten, sind sehr geeignet, und die Sauerstellung auf einen p_H-Wert von etwa 1,5 bis etwa 3 hat sich als zufriedenstellend erwiesen. Schwefelsäure wird gegenüber anderen Säuren bevorzugt, es kann aber jede Mineralsäure verwendet werden.ao When carrying out the process, the impure aqueous solution, e.g. B. a Bacitracingär- (liquid, filtered to remove various solids. In the case of the fermentation liquid, this is preferably carried out at an acidic ρ ,, value and with the addition of a filter aid in order to obtain a clear filtrate bacitracin 20 units each contain ECM, are very suitable, and the acidification to a _pH value of about 1.5 to about 3 has proved to be satisfactory. sulfuric acid over other acids are preferred, but it may be any mineral acid may be used.

Die Ausfällung des Bacitracins aus einer unreinen wäßrigen Lösung wird bei einem sauren p_H-Wert, vorzugsweise zwischen etwa 1,5 und etwa 4 durchgeführt. Wie gefunden wurde, ist es am zweckmäßigsten, den Pn-Wert' der filtrierten Bacitracinlösung von dem stärker sauren Wert auf einen p_N-Wert von mindestens 5 einzustellen, bevor das wasserlösliche Molybdat zugesetzt wird. Alkalien, wie z. B. Ammoniumhydroxyd, Natriumhydroxyd, Natriumcarbonat, Kaliumhydroxyd usw., sind hierzu geeignet. Der p_H-Wert wird dann langsam erneut auf etwa 1,5 bis 4 eingestellt. Für diese Einstellung ist Schwefelsäure gut geeignet.The precipitate bacitracin from an impure aqueous solution is carried out at an acidic _pH value, preferably between about 1.5 and about 4 hours. As has been found, it is before the water-soluble molybdate is added most conveniently, the Pn value 'adjust the filtered Bacitracinlösung of the more acidic value to a value of at least _N p. 5 Alkalis, such as B. ammonium hydroxide, sodium hydroxide, sodium carbonate, potassium hydroxide, etc., are suitable for this purpose. The _pH value is then adjusted to about 1.5 to slow again. 4 Sulfuric acid is well suited for this setting.

Gleichfalls verwendbar sind Salzsäure, Bromwasserstolfsäure und Phosphorsäure. Die Einhaltung dieser Reihenfolge der Arbeitsgänge begünstigt die Bildung einer grobkörnigeren Form des gefällten Bacitracinmolybdats, die sich leichter abfiltrieren läßt. Es ist jedoch nicht erforderlich, daß die Zugabe des Molybdats bei einem höheren p^-Wert erfolgt und sich eine Sauerstellung anschließt. Von den wasserlöslichen Molybdaten hat sich Ammoniummolybdat für die Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren als sehr gut geeignet erwiesen. Andere Salze, wie z. B. die Kalium-, Lithium- und Natriumsalze, sind jedoch gleichfalls geeignet. Wenn der feste Stoff in Gegenwart einer Filtrierhilfe abfiltriert wird, so wird dadurch ein schnelles und vollständiges Arbeiten erreicht.Hydrochloric acid, hydrobromic acid and phosphoric acid can also be used. Compliance with this The sequence of operations favors the formation of a coarser-grained form of the precipitated bacitracin molybdate, which can be filtered off more easily. However, it is not necessary to add the molybdate takes place at a higher p ^ value and an acid position follows. Of the water-soluble Molybdate has proven to be ammonium molybdate for use in the method according to the invention proved to be very suitable. Other salts, such as B. the potassium, lithium and sodium salts, however also suitable. If the solid is filtered off in the presence of a filter aid, it becomes a achieved fast and complete work.

Der ausgefällte Komplex des Bacitracinmolybdats wird in Wasser bei einem p_H-Wert von mindestens 5 behandelt, um eine klare Lösung des Bacitracins zu erhalten und das Molybdän auszufällen. Diese Verfahrensstufe kann mit Alkalimetallhydroxyden, Erdalkalimetallhydroxyden und wasserlöslichen organisehen Basen durchgeführt werden. Ammoniumhydroxyd ist jedoch für diesen Zweck besonders geeignet. Zu den geeigneten Verbindungen gehören Natrium-, Kalium- und Lithiumhydroxyde, -carbonate und -bicarbonate, Bariumhydroxyd, Calciumhydroxyd, '80 Trimethylamin, Triäthylamin, Triäthanolamin usw. Nachdem das Bacitracin sich gelöst hat und die Unlösliche Molybdän verbindung ausgefallen ist, wird diese unter Verwendung einer geeigneten Menge einer Filtrierhilfe abfiltriert und so ein klares Filtrat erhalten. Das Filtrat kann in einer Konzentration von bis zu 400 Einheiten je ecm erhalten werden, wenn ein geeignetes Volumen Flüssigkeit verwendet wird. Der feste Stoff kann gewaschen oder erneut mit Wasser aufgeschlämmt werden, um das Bacitracin im wesentliehen vollständig aus ihm zu entfernen.The precipitated complex of Bacitracinmolybdats is treated in water at a _pH value of at least 5 in order to obtain a clear solution and bacitracin precipitate the molybdenum. This process step can be carried out with alkali metal hydroxides, alkaline earth metal hydroxides and water-soluble organic bases. However, ammonium hydroxide is particularly suitable for this purpose. Suitable compounds include sodium, potassium and lithium hydroxides, carbonates and bicarbonates, barium hydroxide, calcium hydroxide, '80 trimethylamine, triethylamine, triethanolamine, etc. After the bacitracin has dissolved and the insoluble molybdenum compound has precipitated, it is used a suitable amount of a filter aid is filtered off and a clear filtrate is obtained. The filtrate can be obtained in a concentration of up to 400 units per cm if a suitable volume of liquid is used. The solid can be washed or reslurried with water to substantially completely remove the bacitracin from it.

Das aus dieser Verfahrensstufe erhaltene wäßrige ' Filtrat kann mittels eines polaren organischen Lösungsmittels, das mit Wasser teilweise mischbar ist, vorzugsweise Butanol (Pentanole, Hexanole, Benzylalkohol und Phenole sind gleichfalls geeignet), bei einem p_irWert zwischen etwa 6 und 8,5 extrahiert werden. Dieser P₁₁-Wert wird vorzugsweise mit einem Alkalimetallhydroxyd, wie z. B. Natrium- oder Kaliumhydroxyd, eingestellt. Der Lösungsmittelextrakt kann dann mit Wasser in Gegenwart einer Säure, beispielsweise Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäuren, erneut extrahiert werden. Durch Einstellung des p_u-Wertes dieser Lösung (auf etwa 5 bis 7), die am zweckmäßigsten durch Einwirkung eines basischen Ionenaustauscherharzes auf die Lösung bewirkt wird, entsteht eine hochgradig gereinigte wäßrige Lösung des Bacitracins, die aus dem gefrorenen Zustand getrocknet werden kann und ein trockcnes Produkt besonders hoher Wirksamkeit und Beständigkeit ergibt.The aqueous' filtrate obtained from this process step, by means of a polar organic solvent which is partially miscible with water, preferably butanol (pentanols, hexanols, benzyl alcohol and phenols are also suitable), extracted at a p _ir value between about 6 and 8.5 will. This P ₁₁ value is preferably measured with an alkali metal hydroxide, e.g. B. sodium or potassium hydroxide, adjusted. The solvent extract can then be re-extracted with water in the presence of an acid such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid and phosphoric acids. By adjusting the p _u value of this solution (to about 5 to 7), which is most conveniently effected by the action of a basic ion exchange resin on the solution, a highly purified aqueous solution of bacitracin results, which can be dried from the frozen state and a dry product that is particularly effective and durable.

Es wurde gefunden, daß sowohl die Menge des verwendeten Molybdats als auch der p_Jt-Wert der Fällung bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens innerhalb gewisser Grenzen verändert werden kann. Bei bestimmten p_H-Werten und Molybdatmengen werden jedoch maximale Ausbeuten erhalten. In der folgenden Tabelle sind die Ergebnisse aufgeführt, die durch die Fällung einer filtrierten Bacitracinbrühe unter Standardbedingungen mit einer feststehenden Menge Ammoniummolybdat bei unterschiedlichen p_n-Werten erhalten wurden. In diesem Fall wurden 100 ecm filtrierte Bacitracinbrühe mit 1,04 g Ammoniummolybdat nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren behandelt. Die anfängliche Wirksamkeit der Brühe betrug 130 Einheiten je ecm.It has been found that both the amount of molybdate used and the p _Jt value of the precipitation can be varied within certain limits when carrying out the process according to the invention. In certain p _H values and Molybdatmengen but maximum yields. The table below shows the results obtained by precipitating a filtered bacitracin broth under standard conditions with a fixed amount of ammonium molybdate at different p _n values. In this case, 100 cc of filtered bacitracin broth was treated with 1.04 g of ammonium molybdate by the method described above. The initial effectiveness of the broth was 130 units per cm.

627/171627/171

P 14140 IVa/30hP 14140 IVa / 30h

In der ersten Spalte der Tabelle ist der p_H-Wert angegeben,, bei dem die verschiedenen Versuche durchgeführt wurden. In der zweiten Spalte ist die Anzahl der Bacitracineinheiten angegeben, die in der Gärflüssigkeit ungefällt zurückblieben, und in der dritten Spalte ist der Prozentsatz des nach diesem Verfahren ausgefällten Antibiotikums angegeben.In the first column of the table of the _pH value is specified ,, in which the various tests were carried out. The second column shows the number of bacitracin units that remained unprecipitated in the fermentation liquor, and the third column shows the percentage of antibiotic precipitated by this method.

PH-WertPH value

3,8
3,5
2,153.8
3.5
2.15

1,81.8

Verbrauchte
Einheiten je ecmConsumed
Units per ecm

AusgefälltFailed

7.7th

40,540.5

71,671.6

100,0100.0

Wie vorstehend angegeben, verursacht auch die Menge des für die Ausfällung verwendeten Molybdats Veränderungen in der Wirksamkeit des Verfahrens. Im allgemeinen ist es vorzuziehen, mindestens etwa 150 mg Molybdat (in Form von Ammoniummolybdat) je 100 ecm filtrierter unreiner wäßriger Bacitracinlösung zu verwenden. In der nachfolgenden Tabelle sind die Ergebnisse einer Versuchsreihe aufgeführt, bei der die filtrierte Gärflüssigkeit mit einem Gehalt von 96 Einheiten je ecm mit unterschiedlichen Mengen Ammoniummolybdat bei einem p_H-Wert von 2 gefällt wurde.As indicated above, the amount of molybdate used for the precipitation also causes changes in the effectiveness of the process. In general, it is preferable to use at least about 150 mg of molybdate (in the form of ammonium molybdate) per 100 cubic centimeters of filtered impure aqueous bacitracin solution. In the following table the results of a series of experiments are shown, wherein the filtered fermentation liquor ever ecm precipitated with a content of 96 units with different amounts of ammonium molybdate at a p _H -value of the second

■ Gewicht
des zugesetzten
1 Ammonium-
molybdats
in mg/100 ecm■ weight
of the added
1 ammonium
molybdats
in mg / 100 ecm Verbrauchter Gehalt
der wäßrigen'
Gärflüssigkeit
,in Einheiten/ccmSalary used up
the watery '
Fermentation liquid
, in units / ccm Ausgefällt
■ VoFailed
■ Vo 66,766.7 96,096.0 O *O * 133,0133.0 75,075.0 20,820.8 266,0266.0 2,02.0 98,098.0 333,0333.0 10,010.0 89,789.7 466,0466.0 1,21.2 98,7 _; 98.7 _; 533,o533, o 1,01.0 100,0100.0

Vergleichbare Mengen der anderen wasserlöslichen Molybdate haben¹ ähnliche Ergebnisse.Comparable amounts of the other water-soluble molybdates have ¹ similar results.

Es wurde festgestellt, daß das durch Molybdat aus unreinen wäßrigen Lösungen ausgefällte Bacitracin durch Behandlung der Fällung mit Wasser und einem Alkali, vorzugsweise Ammoniumhydroxyd, gewonnen werden kann. Es wurden jedoch auch viele andere alkalische Mittel mehr oder weniger wirksam für die Gewinnung des Bacitracin aus derartigen Fällungen angewendet. Im allgemeinen kann das Verfahren mit Wasser oder Butanol durchgeführt werden, und viele andere alkalische Mittel, wie z. B. Ammoniumhydroxyd, Triäthylamin, Calciumhydroxyd und Natriumhydroxyd, können angewendet werden. Die Gegenwart gewisser Salze, wie z. B. Calciumchlorid oder Triäthylaminsulfat, begünstigt in gewissem Ausmaß die Löslichmachung des Antibiotikums. Wie vorstehend erwähnt, ist es oft erwünscht, die feste Molyb- datfällung aus der Bacitracinlösung abzufiltfieren und den festen. Stoff dann erneut zu extrahieren, um dieIt was found that the bacitracin precipitated by molybdate from impure aqueous solutions obtained by treating the precipitation with water and an alkali, preferably ammonium hydroxide can be. However, many other alkaline agents have been found to be more or less effective for that Obtaining the bacitracin from such precipitations applied. In general, the procedure can be performed with Water or butanol can be carried out, and many other alkaline agents, such as. B. ammonium hydroxide, Triethylamine, calcium hydroxide and sodium hydroxide can be used. The presence certain salts, such as B. calcium chloride or triethylamine sulfate, favored to some extent solubilization of the antibiotic. As mentioned above, it is often desirable to use the solid molybdenum Filtration of the precipitation from the bacitracin solution and the solid. Then extract the substance again to get the

" maximale Gewinnung des wertvollen Antibiotikums sicherzustellen. In der folgenden Tabelle sind die Wirksamkeiten der verschiedenen Kombinationen von Reagentien für dieses Extraktionsverfahren miteinander verglichen."Ensure maximum recovery of the valuable antibiotic. The following table lists the Efficacies of the various combinations of reagents for this extraction procedure with one another compared.

AnzahlQuantity Ausbeuteyield GewinnungsmediumExtraction medium der Auf-
schläm-the up
muddy (aus der
Gär-(from the
Fermentation mungenmings flüssigkeit)liquid) Butanol-Triäthylamin-Butanol triethylamine Calciumchlorid Calcium chloride 22 86,5 :86.5: Wasser-Calciumchlorid-Water calcium chloride Calciumhydroxyd,Calcium hydroxide, Ph"Wert 7 bis 8 ......Ph "value 7 to 8 ...... 22 74,274.2 Wasser-n-Butanol-Cal-Water-n-butanol-cal- ciumhydroxyd cium hydroxide II. 50,750.7 n-Butanol-Ammoniak ....n-butanol ammonia .... I 'I ' 61,561.5 n-Butanol-Triäthylamin-n-butanol triethylamine Triäthylaminsulfat.....Triethylamine sulfate ..... II. 53,653.6 Wasser-Calciumchlorid-Water calcium chloride CalciumhydroxydCalcium hydroxide •PH-Wert 6 bis 7 • PH value 6 to 7 II. 27,627.6 Wässer-Calciumchlorid-Water calcium chloride CalciumhydroxydCalcium hydroxide p_H-Wert 8 bis 10 _pH value 8 to 10 22 40,840.8 Wasser;NatriumhydroxydWater; sodium hydroxide 22 58,8 .58.8. Wasser-Calciumchlorid-Water calcium chloride CalciumhydroxydCalcium hydroxide p_H-Wert 5,5 _pH value 5.5 33 46,7 .46.7. Wasser-Ammoniumhydro-Water ammonium hydro xyd-p_H-Wert 6,3 _xyd-pH value 6.3 85,585.5

Es wurde gefunden, daß die Verwendung < von Ammoniumhydroxyd mit Wasser am zweckmäßigsten ist, die anderen Mittel haben sich jedoch auch als wirksam erwiesen.It has been found that the use of ammonium hydroxide with water is most expedient however, the other remedies have also been shown to be effective.

Bei der Extraktion des Antibiotikums aus seinem Molybdatkomplex ist zur Erzielung maximaler Reinheil eine gewisse Sorgfalt erforderlich. Es ist wesentlich, daß hierbei die wäßrigen Extrakte oder Lösungsmittelextrakte zur Entfernung sämtlicher suspendierten Stoffe sorgfältig geklärt werden, um die Herstellung von Bacitracin höchster Reinheit sicherzustellen. Die gereinigte wäßrige Lösung des Bacitracins kann mit Ammoniumoxalat und einem Ferrocyanid behandelt werden, um sämtliche Spuren von Calcium und Schwermetallen zu entfernen. Wenn in den vorangehenden Verfahrensstufen sorgfältig gearbeitet wurde, sind diese Verunreinigungen im allgemeinen nur in begrenztem Ausmaß anwesend. Wenn zwei Extraktionsstufen mit dem teilweise wassermischbaren po- -·, laren organischen Lösungsmittel angewendet werden, kann es ratsam sein, diese Behandlung der wäßrigen Lösung vor der zuletzt erfolgenden Butanolextraktion vorzunehmen. Der Zusatz eines Entfernungsmittels für mehrwertige Metalle zur wäßrigen Lösung vor der letzten Extraktion mit Butanol hat ebenfalls Vorteile. Er hilft, die Extraktion von Spuren von Verunreinigungen an mehrwertigen Metallen in das Lösungsmittel zu verhindern und verhindert so das Auftreten dieser Stoffe in dem Produkt.When extracting the antibiotic from its molybdate complex, a certain amount of care is required to achieve maximum purity. It is essential that the aqueous or solvent extracts are carefully clarified to remove any suspended matter in order to ensure the production of bacitracin of the highest purity. The purified aqueous solution of bacitracin can be treated with ammonium oxalate and a ferrocyanide in order to remove all traces of calcium and heavy metals. If care has been taken in the preceding process steps, these contaminants will generally only be present to a limited extent. If two extraction stages are used with the partially water-miscible polar organic solvent, it may be advisable to carry out this treatment of the aqueous solution before the last butanol extraction that takes place. The addition of a removal agent for polyvalent metals to the aqueous solution prior to the final extraction with butanol also has advantages. It helps to prevent the extraction of traces of polyvalent metal impurities into the solvent, thus preventing these substances from appearing in the product.

In einigen Fällen hat es sich als zweckmäßig erwiesen, die gereinigten wäßrigen Konzentrate des Bacitracins 125' mit Kohle zu behandeln, um im Endprodukt nochIn some cases it has proven to be useful to use the purified aqueous concentrates of Bacitracin 125 ' treat with charcoal to still be in the end product

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P 14140 IVa/30hP 14140 IVa / 30h

vorhandene farbige Verunreinigungen zu entfernen. Diese farbigen Verunreinigungen beeinträchtigen jedoch die Qualität des fertigen Produktes nicht ernstlieh und brauchen zur Erzielung eines brauchbaren Produktes hoher Qualität nicht entfernt zu werden. Es wurde festgestellt, daß die rasche Durchführung der verschiedenen Verfahrensstufen zu einem gewissen Ausmaß die Gewinnung eines Materials höchster Qualität sicherstellt. Dies betrifft besonders die Verfahrensstufen, bei denen das Bacitracin mit dem Molybdän zusammenkommt. Wenn der Molybdatkomplex des Bacitracins zur Gewinnung des Bacitracins behandelt wird, ist es ratsam, das Gemisch so bald wie möglich zu filtrieren, da ein langes Abstellen zur Folge haben kann, daß die Filtrierung schwieriger wird.to remove any colored impurities. However, these colored impurities are detrimental the quality of the finished product is not serious and need to achieve a usable one High quality product not to be removed. It was found that the rapid implementation of the various process stages to a certain extent the recovery of a material of the highest quality Ensures quality. This applies in particular to the process steps in which the bacitracin with the Molybdenum comes together. When the molybdate complex of the bacitracin is used to produce the bacitracin is treated, it is advisable to filter the mixture as soon as possible because of a long shutdown can result in more difficult filtration.

Es ist zu beachten, daß das Verfahren eine besondere Kombination von Verfahrensstufen darstellt, nämlich eine Molybdatfällung und eine Butanolextraktion, die zur Herstellung eines Bacitracins hoher Qualität und hoher Beständigkeit überraschend wirksam sind. Es wurde so ein Stoff mit einer bei bisherigen experimentellen Arbeiten, geschweige denn industriellen Arbeiten, unerreichten Qualität erhalten. Die Kombination der Verfahrensstufen ergibt dieses einzigartige Produkt. Kombinationen anderer bekannter Verfahrensstufen zur Gewinnung von Bacitracin wurden mit dem vorliegenden Verfahren verglichen, wobei jedoch keine! dieser Kombinationen ein Produkt gleicher Qualität ergab.It should be noted that the process represents a particular combination of process steps, viz a molybdate precipitation and a butanol extraction, which lead to the production of a high quality and bacitracin high resistance are surprisingly effective. It became such a substance with a previous experimental one Work, let alone industrial work, receive unmatched quality. The combination of the process steps results in this unique product. Combinations of other known process steps for the production of Bacitracin were with the compared with the existing procedures, but none! these combinations produce a product the same Quality resulted.

In der folgenden Tabelle ist die Beständigkeit von Bacitracinprobcn angegeben, die bei erhöhten Temperaturen in trockenem Zustand 64 und 14 Tage lang aufbewahrt wurden. In gleichmäßigen Abständen wurden Proben entnommen und ihre Wirksamkeiten festgestellt. Hieraus wurde eine Halbwertszeit der Bacitracinprobe unter bestimmten Bedingungen errechnet. Bei den Proben 1 und 2 handelt es sich um eiTindungsgcmäß hergestellte Stoffe, bei den Proben 3 bis 6 um typische im Handel erhältliche Bacitracinproben. The following table shows the resistance of bacitracin samples to those at elevated temperatures were stored in a dry state for 64 and 14 days. At regular intervals Samples were taken and their effectiveness determined. This became a half-life of the Bacitracin sample calculated under certain conditions. Samples 1 and 2 are properly manufactured substances, samples 3 to 6 µm typical commercially available bacitracin samples.

Probesample AnfänglicheInitial HalbwertszeitHalf-life HalbwertszeitHalf-life Nr.No. Wirksamkeit
Kinlieilen je mgeffectiveness
Kinlieilen per mg bei 35 bis 37⁰ at 35 to 37 ⁰ bei 55 bis 57⁰ at 55 to 57 ⁰ II. 78,178.1 293 Tage293 days 26 Tage26 days 78,078.0 346 -346 - 31 -31 - 33 55.755.7 104104 15 -15 - 44th 6t,o6t, o 103103 14 -14 - 55 5».05 ».0 12g12g 18 -18 - 66th 57.057.0 134 -134 - 23 -23 -

Es ist zu beachten, daß diese Halbwertszeiten unter der Annahme berechnet wurden, daß es sich bei der Zersetzung um eine Reaktion erster Ordnung handelt. Diese Zahlen verdeutlichen die sehr stark verbesserte Beständigkeit des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Produktes, verglichen mit den im Handel erhältlichen Stoffen.Note that these half-lives were calculated assuming that the Decomposition is a first order reaction. These numbers illustrate the very much improved Resistance of the product produced by the process according to the invention, compared with the commercially available fabrics.

Das folgende Beispiel dient zur Erläuterung der Erfindung, das jedoch nicht als die einzige Ausführungsforni anzusehen ist.The following example serves to illustrate the invention, but not as the only embodiment is to be seen.

example

Bacitracinflüssigkeit mit einem Gehalt von 32,5 Einheiten je ecm wurde mit Schwefelsäure auf einen p_H-Wert von 2,6 eingestellt. 60 g Diatomeenerde wurde als Filtrierhilfe pro Liter Flüssigkeit zugesetzt. Das Gemisch wurde auf einem Porzellanfilter filtriert und mit Wasser gewaschen, so daß das Volumen des Filtrats 25% größer war als das ursprüngliche Volumen der Flüssigkeit. Die Wirksamkeit des Filtrats betrug 28,3 Einheiten je ecm. Sie wurde mit einer 2oprozentigen wäßrigen Natriumhydroxydlösung auf einen p_n-Wert von 5,2 eingestellt. Auf 401 des Filtrats wurden 50 g Diatomeenerde als Filtrierhilfe zugesetzt. Das Gemisch wurde gerührt, und 100 g Ammoniummolybdat wurden allmählich zugesetzt. Nach 30 Minuten weiteren Rührens wurde der p_H-Wert des Gemischs mit 5oprozentiger Schwefelsäure langsam auf 2,5 eingestellt. Das Gemisch wurde weitere 30 Minuten lang gerührt und dann durch ein Porzellanfilter filtriert, der zuvor mit Diatomeenerde bedeckt worden war. Insgesamt wurden 180 g Filtrierhilfe verwendet. Das Filtrat wurde verworfen.Bacitracinflüssigkeit with a content of 32.5 units was adjusted with sulfuric acid to a _pH value of 2.6 per cc. 60 g of diatomaceous earth was added as a filter aid per liter of liquid. The mixture was filtered on a porcelain filter and washed with water so that the volume of the filtrate was 25% larger than the original volume of the liquid. The effectiveness of the filtrate was 28.3 units per cm. _{It was adjusted to a p n} value of 5.2 with a 2% strength aqueous sodium hydroxide solution. 50 g of diatomaceous earth were added to 40 liters of the filtrate as a filter aid. The mixture was stirred and 100 g of ammonium molybdate was gradually added. After 30 minutes of additional stirring the _pH value was adjusted to the mixture with 5oprozentiger sulfuric acid slowly to 2.5. The mixture was stirred for an additional 30 minutes and then filtered through a porcelain filter previously covered with diatomaceous earth. A total of 180 grams of filter aid was used. The filtrate was discarded.

Das feste Produkt auf dem Porzellanfilter wurde in 1900 ecm Wasser suspendiert und das Gemisch wurde mit 3oprozentigem wäßrigem Ammoniumhydroxyd behandelt, bis ein stabiler p_u-Wert von 6,8 erhalten wurde. Die Lösung wurde von dem Feststoff abzentrifugiert. Die geklärte Flüssigkeit hatte ein Volumen von 1850 ecm und hatte eine Wirksamkeit von 345 Einheiten Bacitracin je ecm. Das feste Material wurde in 1400 ecm Wasser erneut suspendiert, mehrere Minuten lang gerührt und mittels weiteren 10 g Filtrierhilfe filtriert. Insgesamt wurden 1445 ecm Filtrat erhalten, welches 132,5 Einheiten Antibioticum je ecm enthielt. Die beiden wäßrigen Lösungen wurden ' vereinigt und mit einer 2oprozentigen Natriumhydroxydlösung auf einen p_n-Wert von 7,8 eingestellt. Die Lösung wurde mit 366 ecm Butanol gesättigt und dann fünfmal mit jeweils 600 ecm mit wassergesättigtem Butanol extrahiert. Die vereinigten Lösungsmittelextrakte, die ein Gesamtvolumen von 3027 ecm hatten, enthielten 155 Einheiten Antibiotikum je ecm. Die erschöpfte wäßrige Lösung wurde verworfen. Die vereinigten Butanolextrakte wurden mit 600 ecm Wasser gerührt, und das Gemisch wurde mit Schwefelsäure auf einen p_H-Wert von 3 eingestellt. Die Extraktion mit Wasser wurde fünfmal wiederholt. Die wäßrigen Extrakte wurden dann vereinigt und ergaben 3789 ecm Lösung, die 100 Einheiten Antibiotikum je ecm enthielt. Das Butanol wurde verworfen. The solid product on the porcelain filter was suspended in 1900 ecm of water and the mixture was treated with 3 percent aqueous ammonium hydroxide until a stable p _u value of 6.8 was obtained. The solution was centrifuged off from the solid. The clarified liquid had a volume of 1850 ecm and an effectiveness of 345 units of bacitracin per ecm. The solid material was resuspended in 1400 ecm of water, stirred for several minutes and filtered using a further 10 g of filter aid. A total of 1445 ecm of filtrate was obtained which contained 132.5 units of antibiotic per ecm. The two aqueous solutions were combined and adjusted to a p _n value of 7.8 with a 2% sodium hydroxide solution. The solution was saturated with 366 ecm butanol and then extracted five times with 600 ecm each time with water-saturated butanol. The combined solvent extracts, which had a total volume of 3027 ecm, contained 155 units of antibiotic per ecm. The exhausted aqueous solution was discarded. The combined butanol extracts were stirred with 600 cc of water, and the mixture was adjusted with sulfuric acid to a p _H value of the third The extraction with water was repeated five times. The aqueous extracts were then combined to give 3789 ecm solution containing 100 units of antibiotic per ecm. The butanol was discarded.

Der konzentrierte wäßrige Extrakt des gereinigten Bacitracins wurde derart auf einen p_n-Wcrt von 6,2 eingestellt, daß die Lösung mit einem starken basischen Ionenaustauscherharz in Hydroxylform zusammengebracht wurde. Die Lösung wurde dann unter Vakuum auf 452 ecm Lösung mit einem Gehalt von 718 Einheiten je ecm konzentriert. Der Lösung wurden 2 g Ammoniumoxalat und 1,5 g Kaliumferrocyanid zugesetzt. Es bildete sich eine leichte trübe Fällung. 27 ecm einer wäßrigen Lösung von Äthylendiamin-tetraessigsäure, wurde als AbscheidungsmittelThe concentrated aqueous extract of the purified bacitracin was _{adjusted to a p n} value of 6.2 in such a way that the solution was brought into contact with a strong basic ion exchange resin in hydroxyl form. The solution was then concentrated under vacuum to 452 ecm solution containing 718 units per ecm. 2 g of ammonium oxalate and 1.5 g of potassium ferrocyanide were added to the solution. A slightly cloudy precipitate formed. 27 ecm of an aqueous solution of ethylenediamine-tetraacetic acid was used as a deposition agent

509627/171509627/171

P 14140 IVa/30 hP 14140 IVa / 30 h

zugesetzt, und der p_H-Wert wurde mit einer 2Oprozentigen Natriumhydroxydlösung auf 7,8 eingestellt. Die Lösung wurde mit 55,5 ecm Butanol gesättigt und dann siebenmal mit jeweils 100 ecm mit Wasser gesättigtem Butanol extrahiert. Die vereinigten Lösungsmittelextrakte wurden mit einem gleichen Volumen Wasser behandelt, und der p_H-Wert wurde mit einem sauren Ionenaustauscherharz in der Wasserstofform auf 6,2 eingestellt. Das zweiphasige Gemisch wurde unter Vakuum auf 210 ecm konzentriert und dann in gefrorenem Zustand getrocknet, wobei 3,2 g hochgradig reines Bacitracin mit 78 Einheiten je mg erhalten wurden. Es zeigte sich, daß dieses Material für die Verwendung in pharmazeutischen Präparaten außerordentlich zufriedenstellend war und infolge seiner erhöhten Beständigkeit und hohen Wirksamkeit deutliche Vorteile aufwies.added and the _pH value was adjusted with a sodium hydroxide solution 2Oprozentigen to 7.8. The solution was saturated with 55.5 ecm of butanol and then extracted seven times with 100 ecm of butanol saturated with water each time. The combined solvent extracts were treated with an equal volume of water and the _pH value was adjusted with an acidic ion exchange resin in the hydrogen form to 6.2. The two-phase mixture was concentrated to 210 cc under vacuum and then dried in the frozen state to give 3.2 g of highly pure bacitracin at 78 units per mg. It was found that this material was extremely satisfactory for use in pharmaceutical preparations and, as a result of its increased resistance and high effectiveness, had clear advantages.

Claims

Patent claims:
20th

i. A process for the recovery and purification of bacitracin, characterized in that befindliches in aqueous solution bacitracin reacted with a soluble molybdate, adjusts the Bacitracinmolybdat in water to a _pH value of at least about 5, separating the aqueous concentrate of the bacitracin and the Bacitracinlösung at a slightly alkaline _pH value, preferably extracted from about 6 to about 8.5 with a polar organic solvent. • 2. A method according to claim 1, characterized in that bacitracin is precipitated with molybdate at a _pH value of about 1.5 to about 4 hours.

3. The method according to claim 1, characterized in that bacitracin is extracted with butanol at a _pH value of about 7.5 to about 8.5.

4. The method according to claim 3, characterized in that the butanol extract with water at, an acidic _pH-value to form a pure aqueous concentrate of the bacitracin is extracted again. ^!

5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the molybdate is Ammonium molybdate is used.