DE930652C

DE930652C - Verfahren zur Herstellung von Dextranabbauprodukten fuer pharmazeutische Zwecke

Info

Publication number: DE930652C
Application number: DEL13912A
Authority: DE
Inventors: Montagne Von Lillienskiold; Werner Dr-Ing Willenberg
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1952-11-18
Filing date: 1952-11-18
Publication date: 1955-07-21

Description

Verfahren zur Herstellung von Dextranabbauprodukten für pharmazeutische Zwecke Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Dextran mit einem Molekulargewicht von Io4 bis 4 X io5 für pharmazeutische Zwecke, insbesondere in gelöster Form für Injektionszwecke, wie es durch Vergärung von Zuckerlösungen und Hydrolyse der erhaltenen Dextranlösungen erhalten wird.
Um aus Dextran ein leichtlösliches, insbesondere als Blutinfusionsmittel brauchbares Produkt zu erhalten, muß es partiell depolymerisiert werden.
Dies ist auf verschiedene Weise möglich, z. B. durch saure Hydrolyse (vgl. Stacey und Youd, Biochem. Journal 32, I943 bis I945 [I938] und USA.-Patentschrift 2 565 507), alkalische Hydrolyse (vgl. deutsche Patentschrift 836 704) und durch enzymatische Spaltung (vgl. deutsche Patentschrift 837007, französische Patentschrift I OI5 I47 und österreichische Patentschrift 172 062).
Weiterhin ist es notwendig, aus dem molekulardispersen Hydrolysat die Molekülgrößen zu gewinnen, die weder die Nieren zu schnell passieren, noch infolge zu hohen Molekulargewichts unerwünschte Nebenerscheinungen, wie erhöhte Blutsenkung und Speicherung, nach sich ziehen. Vorwiegend sind Molekulargrößen von 25 000 bis 200 000 als erwünscht anzusehen.
Polydisperse hochmolekulare Stoffe lassen sich nun gemäß allgemein bekannter Verfahren mit Hilfe eines Gemisches aus einem Lösungsmittel und einem Nichtlösungsmittel in zwei Fraktionen von verschiedenem Molekulargewicht trennen, von denen die schwerer lösliche Fraktion das höhere Molekulargewicht hat.
Die theoretischen Grundlagen dieser fraktionierten Fällung sind von G. V. Schulz untersucht worden (vgl. Journal phys. Chem. A. I79, 32I bis 355 [1937]). Später hat dann H. J. Staudinger diese Methode auf Glykogen (vgl. Makromol.
Chemie 2, 89 [I948]) und Schoch auf Stärke (vgl. Journal Am. Chem. Soc. 64, 2957 bis 296I [I942]) angewandt. In einer Dissertation von G. Swift, Birmingham, I946, 5. 93 bis 94, ist erstmalig die Fraktionierung von Dextran mit Alkohol beschrieben worden. Diese Methode wurde dann auch technisch ausgenutzt, und die Fraktionierung mit Aceton ist beispielsweise in der USA.-Patentschrift 2 565 507 und die Fraktionierung vorwiegend mit Alkohol in der schweizerischen Patentschrift 282 873, der englischen Patentschrift 673 103, der französischen Patentschrift I OI5 148 und der österreichischen Patentschrift 172 943 beschrieben.
Bei der fraktionierten Fällung von Dextran treten zwei flüssige Phasen auf, deren Scheidung durch Dekantieren oder Abhebern Tage benötigt.
Erfindungsgemäß wird eine wesentliche Beschleunigung der Aufarbeitung von abgebauten Dextranen dadurch erreicht, daß man die Trennung der spezifisch verschieden schweren flüssigen Phasen nicht der Schwerkraft überläßt, sondern durch Separatoren vornimmt. Bei größeren Mengen verwendet man Trennseparatoren, bei kleineren Mengen können Klärseparatoren angewandt werden.
In manchen Fällen ist es zweckmäßig, den Ablauf aus dem Trennseparator durch einen Klärseparator gehen zu lassen.
Auch zur Zeitersparnis ist eine Kombination beider Separatoren angebracht, indem man beim Trennseparator nicht den sonst üblichen langsamen Durchsatz beibehält, sondern durch einen schnelleren Zulauf die spezifisch leichtere Phase leicht trübe erhält und diese auf einem Klärseparator blank schleudert. Die Spuren der spezifisch schwereren Phase verbleiben dann in der Trommel des Klärseparators und können mit dem unteren Ablauf des Trennseparators vereinigt oder besser einem neuen zu fraktionierenden Gemisch zugeführt werden.
Auf diese Weise werden sowohl die zu medrig molekularen als auch die zu hoch mollelçu.laren Fraktionen von den gewünschten mittelmolekularen Fraktionen abgetrennt. In dem einen Falle verwertet man die spezifisch schwerere, in dem anderen Falle die spezifisch leichtere Phase direkt, während die nicht brauchbare Phase erneut den Aufarbeitungsprozeß durchläuft. Durch Wahl einer geeigneten-Trennscheibe beim Separator kann man jeweils die obere oder untere Schicht frei von der anderen Phase erhalten.
Die Zugabe des Nichtlösungsmittels zu der wäßrigen Dextranlösung kann bei Zimmertemperatur erfolgen und bei dieser Temperatur die Zentrifugierung vorgenommen werden. Zweckmäßig wird aber die wäßrige Lösung zunächst bei Zimmertemperatur durch Zusatz des Nichtlösungsmittels partiell gefällt, bis zur Wiederauflösung erwärmt und erst nach Abkühlung zentrifugiert. Man kann aber auch die Zugabe des Nichtlösungsmittels in der Wärme vornehmen und dann abkühlen. Grundsätzlich kann das Zentrifugieren bei jeder Temperatur unter dem Ausscheidungspunkt einer flüssigen Phase aus dem Lösungsmittelgemisch vorgenommen werden, doch ist die Zimmertemperatur wegen der beim Zentrifugieren erwünschten Temperaturkonstanz am vorteilhaftesten. Die Abkühlungsgeschwindigkeit kann durch künstliche Kühlung gesteigert werden, so daß man schon kurze Zeit nach der Zugabe des Nichtlösungsmittels zentrifugieren kann.
Die Erfindung bezieht sich auf Dextrane für technische wie für pharmazeutische Zwecke, insbesondere auf in gelöster Form für Injektionszwecke geeignete Dextrane von einem Molekulargewicht von I04 bis 4 X I05, hergestellt durch Vergärung von Zuckerlösungen und Hydrolyse der erhaltenen Dextranlösungen. Das Hydrolysenprodukt wird dann fraktioniert.
Als Ausgangsstoffe werden in bekannter Weise Rohzuckerlösungen von z. B. I20/G mit Nährsalzen versetzt und mit geeigneten Bakterien, z. B. einer Reinkultur von Leuconostoc mesenteroides, beimpft und beispielsweise bei 250 3 Tage lang vergoren.
Das gebildete Rohdextran wird mit Alkohol gefällt, der Niederschlag zur weitgehenden Entwässerung mit Alkohol ausgewaschen, gemahlen, getrocknet und noch einmal feinst gemahlen.
Beispiel 1 82 1 einer durch Aufschluß von Rohdextran mittels o,o56 n-H C1 gewonnenen 80/oigen Dextranlösung mit einer relativen Viskosität von 2,96 bei 3,63 O/o werden mit 6o 1 930/oigem Alkohol versetzt.
Bei 480 entsteht dabei eine Trübung. Es wird 45 Minuten unter Riihren mit Wasser gekühlt und bei 180 mit einer Geschwindigkeit von 6o 1/Std. zentrifugiert. Das in der leichteren Phase enthaltene Dextran hat eine relative Viskosität von 4,33 bei 5,96 O/o in wäßriger Lösung, während die höhermolekulare Fraktion die relative Viskosität von 9,14 bei 6,0I O/o Rückstand hat.
Beispiel 2 Eine 50/oige Dextranlösung mit der relativen Viskosität von 8,8 wird der Einwirkung von Dextranase aus Cellvibrio fulva unterworfen, bis der Viskositätswert auf 4,1 abgesunken ist, und dann wird auf 610 erhitzt, Alkohol zugegeben, bis eine schwache Trübung auftritt, weiter bis zum Verschwinden der Trübung erhitzt und auf Zimmertemperatur abgekühlt. Die beiden entstandenen Phasen werden in einem Separator der Bauart LAVAL getrennt. Bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 6o 1/Std enthält die spezifisch leichtere Phase keine suspendierten Tröpfchen. Bei der Fällung mit überschüssigem Alkohol liefert sie einen Niederschlag der relativen Viskosität von 2,6 bei 5,9O/.
Beispiel 3 Eine Lösung von größtenteils niedermolekularem Dextran in wäßrigem Alkohol (etwa 400 g Alkohol je Liter Lösung), erhalten bei Abtrennung von niedermolekularem Dextran aus polydispersen mit o,330/oiger H Cl aufgeschlossenen Dextranlösungen durch Fraktionierung, wird bis zum Siedepunkt erwärmt und Alkohol bis zur schwachen Trübung zugegeben. Nach dem Abkühlen hat sich nur wenig von der schwereren Phase gebildet. Das Gemisch wird lediglich durch einen Klärseparator geschickt, wobei ein klarer Ablauf erhalten wird, der eine relative Viskosität von nur I,42 bei 6,040/0 hat.
Die in der Trommel verbleibende Phase hat eine relative Viskosität von 2,5I bei 5,90°/o.
Beispiel 4 Eine einem salzsauren Aufschluß mit o,30/oiger H Cl entstammende Dextranlösung mit der relativen Viskosität von 3,6I bei 5,970/0 Rückstand, aus der durch vorhergegangenes Fraktionieren der größte Teil der Hochpolymeren entfernt worden ist, wird in der Hitze mit Alkohol versetzt, bis bei 800 sich eine schwache Trübung zeigt. Nach dem Abkühlen wird mittels eines Separators getrennt. Die schwerere Phase hat nach Entfernung des Alkohols eine relative Viskosität von 5,86 bei 5,95 O/o. Die leichtere Phase wird nochmals blank zentrifugiert und weist in wäßriger Lösung eine relative Viskosität von 2.48 bei 6,23 O/o Rückstand auf.
Beispiel 5 Eine Dextranfraktion zu hohen Molekulargewichtes wird durch salzsaure Hydrolyse mit o,360/oiger H Cl abgebaut. Die 70/oige Lösung mit einer relativen Viskosität von 3,63 bei 5,68O/o wird rnit so viel Alkohol versetzt, daß das Gemisch bei -CoO sich zu trüben beginnt. Nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur wird das Gemisch in einem Trennseparator getrennt. Die spezifisch leichtere Phase läuft dann noch nicht ganz klar ab und wird zweimal mittels eines Klärseparators geklärt. Das in der schwereren Phase enthaltene Dextran hat eine relative Viskosität von 6,73 bei 5,790/0, während die leichtere Phase Dextran mit einer relativen Viskosität von 3,54 bei 5,990/0 enthält.
Beispiel 6 Eine Dextranlösung mit der relativen Viskosität von 8,9I bei 60/0 wird in einer o,340/oigen HCl-Lösung bei 840 50 Minuten lang hydrolysiert. Sie hat nach dem Neutralisieren eine Viskosität von ,55 bei 5,75 O/o und wird bei einer mit dem Refraktometer gemessenen Konzentration von 7 Bx mit so viel Alkohol versetzt, daß bei 490 eine Trübung eintritt. Es wird auf I30 abgekühlt und in einem Treunseparator in zwei Phasen getrennt. Die leichtere Schicht läßt sich in einem weiteren Arbeitsgang völlig klären und enthält Dextran mit einer relativen Viskosität von 3,0I bei 5,95 0/0, während die Unterschicht Dextran einer relativen Viskosität von 6,25 bei 5,85 ovo enthält.
Beispiel 7 Dextran der relativen Viskosität von 8,15 bei 5,9 O/o wird in einer Io°/oigen Na 0 H -Lösung 7 Stunden gekocht, bis die Viskosität des Dextrans auf 5,3 bei 5,760/0 gesunken ist, dann wird neutralisiert und in Alkohol gefällt. Eine 80/oige Lösung dieses Dextrans mit einer relativen Viskosität von 5,30 bei 5,760/0 Rückstand und einer Temperatur von 560 wird mit Alkohol versetzt, bis sich eine starke Trübung zeigt. Die Temperatur ist dabei auf 490 gesunken. Es wird unter Rühren und Kühlen eine Temperatur von 190 eingestellt.
Darauf wird mit einem Trennseparator in zwei Phasen getrennt und die spezifisch leichtere, in der die pharmazeutisch interessierenden Molekülgrößen enthalten sind, noch zweimal mittels eines Klärsystems nachsepariert. Die relative Viskosität des Dextrans der leichteren Schicht beträgt bei einer Konzentration von 5,760/0 in Wasser 2,46, bei der schwereren Schicht wird eine relative Viskosität von 8,75 bei 5,980/0 gemessen.
Beispiel 8 Rohdextran wird durch Erhitzen in o,I50/oiger Wasserstoffsuperoxydlösung auf eine relative Viskosität von 2,85 bei 3,23 0/o abgebaut. Die Lösung wird bei 590 unter Rühren mit Alkohol versetzt, bis eine sehr starke Trübung eintritt und die Temperatur auf 510 abgesunken ist. Es wird bis zum Verschwinden der Trübung erhitzt und nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur mittels eines Separators getrennt und in einem zweiten Arbeitsgang die leichtere Phase nachgeklärt. In dieser ist Dextran mit einer relativen Viskosität von 2,63 bei 6,030/0 in wäßriger Lösung enthalten, während bei der schwereren Phase eine relative Viskosität von 8,9t bei 60/o festgestellt wird.

Claims

PATENTANSPR ÜCHE.

I. Verfahren zur Herstellung von für pharmazeutische Zwecke, insbesondere in gelöster Form für Injektionszwecke, geeignetem Dextran mit einem Molekulargewicht von IO4 bis 4 X Io: durch Vergärung von Zuckerlösungen und Hydrolyse der erhaltenen Dextranlösungen, dadurch gekennzeichnet, daß das neutralisierte Hydrolysenprodukt durch Zusatz eines Nichtlösungsmittels, wie Alkohol oder Aceton, und Zentrifugieren mit Trenn- oder Klärseparatoren in eine leichtere und eine schwerere flüssige Phase, gegebenenfalls wiederholt getrennt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die neutralisierte Hydrolysenlösung bei Zimmertemperatur mit dem Nichtlösungsmittel teilweise gefällt, dann bis zur Wiederauflösung erwärmt und erst nach erneuter Abkühlung auf Zimmertemperatur zentrifugiert wird.
3, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Nichtlösungsmittel in der Wärme zugegeben wird, worauf das Gemisch abgekühlt wird.
4. Verfahren nach Anspruch I bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zuerst mit einer Trennzentrifuge bei schnellerem Zulauf zentrifugiert und die noch leicht trübe erhaltene spezifisch leichtere Phase auf einer Klärzentrifuge blank schleudert.
5. Verfahren nach Anspruch I bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolyse des Dextrans in saurer Lösung vorgenommen wird.
- 6. Verfahren nach Anspruch I bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolyse des Dextrans in alkalischer Lösung vorgenommen wird.
7. Verfahren nach Anspruch I bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolyse des Dextrans durch Enzyme vorgenommen wird.
8. Verfahren nach Anspruch I bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrolyse des Dextrans durch Wasserstoffsuperoxydvorgenommen wird.