Verfahren zur Herstellung von Dextranabbauprodukten für pharmazeutische Zwecke
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Dextranabbauprodukten mit Molekulargewichten von 104 bis 4-10s für pharmazeutische Zwecke, insbesondere in gelöster Form für Injektionszwecke, wie sie durch Vergärung von Zuckerlösungen und Hydrolyse der erhaltenen Dextranlösungen erha, lten werden.
Um aus Dextran ein leichtlösliches, insbesondere als Blutinfusionsmittel brauchbares Produkt zu erhalten, muss es partiell depolymerisiert werden. Dies ist auf verschiedene Weise möglich, z. B. durch saure Hydrolyse (vgl. Stacey und Youd, Biochem. Journal 32, 1943-45 [1938], und amerikanisehe Patentschrift Nr. 2565507), alkalisehe Hydrolyse (vgl. deutsehe Patentschrift Nr. 836704) und durch enzymatische Spaltung (vgl. deutsche Patentschrift Nr. 837007, französische Pa tentschrift Nr. 1015147 und österreichische Patentschrift Nr. 172062).
Weiterhin ist es notwendig, aus dem mole kulardispersen Hydrolysat die Molekülgrössen zu gewinnen, die weder die Nieren zu schnell passieren, noch infolge zu hohen Molekulargewichts unerwünschte Nebenerscheinungen, wie erhöhte Blutsenkung und Speicherung, naeh sich ziehen. Vorwiegend sind Molekular- grössen von 25 000 bis 200 000 als erwünscht anzusehen.
Polydisperse hochmolekulare Stoffe lassen sich nun gemäss allgemein bekannter Verfahren mit Hilfe eines Gemisches, bestehend aus einem Lösungsmittel und einem Nichtlösungs- mittel, in zwei Fraktiohen von versehiedenem Molekulargewicht trennen, von denen die schwerer lösliche Fraktion das höhere Molekulargewicht hat
Die theoretischen Grundlagen dieser fraktionierten Fällung sind von G. V. Schulz untersucht worden [vgl. Journal phys. Chem.
A. 179,321-55 (1937]. Später hat dann H. J. Staudinger diese Methode auf Glykogen [vgl. Makromol. Chemie 2,89 (1948)] und Schoch auf Stärke [vgl. Journal Am. Chem.
Soc. 64,2957-61 (1942)] angewandt. In einer Dissertation von G. Swift, Birmingham, 1946, Seiten 93-94, ist erstmalig die Fraktio- nierung von Dextran mit Alkohol beschrieben worden. Diese Methode wurde dann auch technisch ausgenutzt und die Fraktionierung mit Aeeton wurde beispielsweise in der ame rikanischen Patentschrift Nr. 2565507 und die Fraktionierung vorwiegend mit Alkohol in der schweizerischen Patentschrift Nr. 282873, der englischen Patentschrift Nr. 673103, der französischen Patentschrift Nr. 1015148 und der österreichischen Patentschrift Nr. 172943 beschrieben.
Bei der fraktionierten Fällung von Dex tranabbauprodukten treten zwei flüssige Phasen auf, deren Scheidung durch Dekantieren oder Abhebern Tage benötigt.
Erfindlmgsgemäss wird eine wesentliche Beschleunigung der Aufarbeitung von abgebauten Dextranen dadurch erreicht, dass man die Trennung der spezifisch verschieden schweren flüssigen Phasen nicht der Schwerkraft überlässt ; sondern durch Separatoren vornimmt. Bei grosseren Mengen verwendet man zweckmässig Trennseparatoren, bei kleineren Mengen können Klärseparatoren angewandt werden. In manchen Fällen ist es zweckmässig, den Ablauf aus dem Trennsepa rator durch einen Klärseparator gehen zu lassen.
Auch zur Zeitersparnis ist eine Kombination beider Separatoren angebracht, indem man beim Trennseparator nicht den sonst üblichen langsamen Durchsatz beibehält, sondern durch einen schnelleren Zulauf die spezifiseh leichtere Phase leicht trübe erhält lmd diese auf einem Klärseparator blank schleu dert. Die Spuren der spezifisch schwereren Phase verbleiben dann in der Trommel des Klärseparators und können mit dem untern Ablauf des Trennseparators vereinigt oder besser einem neuen zu fraktionierenden Gemisch zugeführt werden. Auf diese Weise werden sowohl die zu niedrigmolekularen als auch die zu hochmolekularen Fraktionen von den gewünschten mittelmolekularen Fraktio- nen abgetrennt.
In dem einen Falle verwertet man die spezifisch schwerere, in dem andern Falle die spezifisch leichtere Phase direkt, während die nicht brauchbare Phase erneut den Aufarbeitungsprozess durchläuft. Durch Wahl einer geeigneten Trennscheibe beim Separator kann man jeweils die obere oder untere Schicht frei von der andern Phase erhalten.
Die Zugabe des Niehtlösungsmittels zu der wässrigen Lösung der Dextranabbauprodukte kann bei Zimmertemperatur erfolgen und bei dieser Temperatur auch die Zentrifugie- rung vorgenommen werden. Zweekmässig wird aber die wässrige Losung zunächst bei Zimmertemperatur durch Zusatz des Nichtlösungsmittels partiell gefällt, bis zur Wiederauflösung erwärmt und erst nach Abkühlung zentrifugiert.
Man kann aber auch die Zugabe des Niehtlösungsmittels in der Wärme vornehmen und dann abkiihlen. Grundsätz- lich kann das Zentrifugieren bei jeder Temperatur unter derjenigen, bei welcher sich eine flüssige Phase aus dem Lösungsmittelgemisch auszuscheiden beginnt, vorgenommen werden ; doch ist die Zimmertemperatur wegen der beim Zentrifugieren erwünschten Tempera turkonstanz am vorteilhaftesten. Die Abküh lungsgeschwindigkeit kann durch künstliche Kühlung gesteigert werden, so dass man schon kurze Zeit nach der Zugabe des Niehtlösungs- mittels zentrifugieren kann.
Zweckmässig werden die Losungen der Dextranabbauprodukte wie folgt hergestellt : Die durch Vergärung von Zuekerlösungen und Fällung der vergorenen Lösungen mit Alkohol erhaltenen Bohdextrane werden getrennt und feinst gemahlen, dann zunächst mit Chlorwasserstoffsäure, vorzugsweise mit Salzsäure von 1 bis 10"/, oder Wasserstoff- superoxydlosung, vorzugsweise von 0,15 /o, angequollen und die erhaltenen Gele durch Zusatz von Wasser unter Erwärmung hydrolysiert. Der Wasserstoffsuperoxydabbau erfolgt bei Temperaturen zwischen 40 und 90 äusserst schnell und die Geschwindigkeit des Abbaues steigt mit d. er Temperatur.
Zweck- mässig wird mit der Temperatur jedoch nicht über die Siedetemperatur der Flüssigkeit ge gangen, damit keine Verfärbung des Dextrans durch Karamellisation erfolgt. Weiterhin ist es zweelundbig, den pH-Wert der Losung auf 7 zu halten, beispielsweise durch Zusatz von Alkalien oder alkalisehen Salzen, zur Neutra lisiervmg der gebildeten Säuren, z. B. von Carbonsäuren. Der Abbau der Moleküle wird, wie auch beim bekannten Salzsäureabbau, fortlaufend durch Ermittlung der Viskosität überwacht. Sobald die gewünschte Viskosität erreicht ist, kann ein weiterer Abbau durch Zusatz von Reduktionsmitteln, z. B. von Glucose oder Ascorbinsäure, verhindert werden.
Das IIydrolysenprodukt wird dann fraktio- niert.
Zur Herstellung der Ausgangsstoffe kon- den in bekannter Weise Rohzuekerlösungen von z. B.. 12 /o mit Nährsalzen versetzt und mit geeigneten Bakterien, z. B. einer Reinkultur von Leuconostoc mesenteroides, bye- impft und, beispielsweise bei 25 C, drei Tage lang vergoren werden. Das gebildete Rohdextran kann mit Alkohol gefällt, der Nie dersehlag zur weitgehenden Entwässerung mit Alkohol ausgewaschen, gemahlen, getrock- net und noch einmal feinst gemahlen werden.
Beispiel 1
82 1 einer durch Aufsehluss von Rohdextran mittels 0,056-n HCl gewonnenen 8 /oigen Dextranlösung mit einer relativen Viskosität von 2,96 bei 3,630/o wurden mit 601 93% oigem Alkohol versetzt. Bei 48 C entstand dabei eine Trübung. Es wurde 45 Minuten unter Rühren mit Wasser gekühlt und bei 18 C mit einer Geschwindigkeit von 60 1/h zentrifugiert. Das in der leichteren Phase enthaltene Dextran hatte eine relative Visko sität von 4,33 bei 5, 96 % in wässriger Lösung, während die höhermolekulare Fraktion die relative Viskosität von 9,14 bei 6,01 /o Rückstand hatte.
Beispiel 2
Eine 5 /oige Dextranlosung mit der relativen Viskosität von 8,8 wurde der Einwirkung von Dextranase aus Cellvibrio fulva unterworfen, bis der Wert auf 4,1 abgesunken war und dann wurde auf 61 C erhitzt, Alkohol zugegeben, bis eine schwache Trübung auftrat, weiter bis zum Verschwinden der Trübung erhitzt und auf Zimmertemperatur abgelkiihlt.
Die beiden entstandenen Phasen wurden in einem Separator der Bauart La- val getrennt. Bei einer Durchlaufgeschwin- digkeit von 60 1/h war die spezifisch leichtere Phase ohne suspendierte Tropfchen. Bei der Fällung in übersehüssigem Alkohol lieferte sie einen Niedersehlag von der relativen Viskosität von 2,6 bei 5,9 /o.
Beispiel 3
Eine Losung von grösstenteils niedermolekularem Dextran in wäRrigem Alkohol, die bei Abtrennung von niedermolekularem Dextran aus polydispersen mit HCl aufgeschlossenen Dextranlösungen durch Fraktionierung erhalten worden war, wurde bis zum Siedepunkt erwärmt und Alkohol bis zur schwa- chen Trübung zugegeben. Nach dem Abkühlen hatte sich nur wenig von der schwereren Phase gebildet. Das Gemisch ivurde lediglich durch einen Elärseparatorlaufen gelassen, wobei ein klarer Ablauf erhalten wurde, dessen Inhalt eine relative Viskosität von nur r 1,42 bei 6, 04% hatte. Die in der Trommel verbleibende Phase hatte eine relative Visko sität von 2,51 bei 5, 90 %.
Beispiel 4
Eine einem salzsauren Aufschluss entstammende Losung von Dextranabbauprodukten mit der relativen Viskosität von 3,61 bei 5,97-0/o Riiekstand, der durch vorhergegangenes Fraktionieren der grösste Teil der Hoehpolymeren entzogen worden war, wurde in der Hitze mit Alkohol versetzt, bis bei 80 C sich eine schwache Trübung zu zeigen b, egann. Nach dem Abkiihlen wurde mittels eines Separators getrennt. Die schwerere Phase hatte nach Entfernung des Alkohols eine relative Viskosität von 5,86 bei 5,95 /o.
Die leichtere Phase wurde nochmals klar zentrifugiert und wies in wässriger Losung , eine relative Viskosität von 2,48 bei 6, 23 % Rüekstand auf.
Beispiel 5
Eine Dextranfraktion zu hohen Moleku- largewichtes wurde durch salzsaure Hydrolyse abgebaut. Die 7 /oige Lösung mit einer relativen Viskosität von 3,63 bei 5, 68 % wurde mit so viel Alkohol versetzt, dass das Gemisch bei 40 C sich zu trüben begann. Nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur wurde das Gemisch in einem Trennseparator getrennt.
Die spezifisch leichtere Phase lief dann noch nicht ganz klar ab und wurde zweimal mittels eines Klärseparators geklärt. Das in der schwereren Phase enthaltene Dextranabbau- produkt hatte eine relative Viskosität von 6,73 bei 5,790/o, während die leichtere Phase ein Dextranabbauprodukt mit einer relativen Viskosität von 3,54 bei 5,99 /o enthielt.
Beispiel 6
Eine Dextranlosung mit der relativen Viskosität von 8,91 bei 6,0 /o wurde in einer 0, 34 % oigen HCl-Losung bei 84 C 50 Minuten lang hydrolysiert. Sie hatte nach dem Neutralisieren eine Viskosität von 4,55 bei 5,75 und wurde bei einer mit dem Refraktometer gemessenen Konzentration von 7 Bx mit so viel Alkohol versetzt, dass bei 49 C eine Trübung eintrat. Es wurde auf 13 C abgekühlt und in einem Trennseparator in zwei Phasen getrennt. Die leichtere Schicht liess sich in einem weiteren Arbeitsgang völlig klären und enthielt ein Dextranabbauprodukt mit einer relativen Viskosität von 3,01 bei 5,95 /o, während die Untersehicht ein Dextranabbauprodukt mit einer relativen Viskosität von 6,25 bei 5,85 /o aufwies.
Beispiel 7
Dextran der relativen Viskosität von 8, 15 bei 5, 9"/o'wurde in einer 10 /oigen NaOH- Lösung 7 Stunden gekocht, bis die Viskosität auf 5,3 bei 5,76 /o gesunken war, dann neutralisiert und in Alkohol gefällt. Eine 8 % oige Lösung dieser DextranabbauprodWtkte mit einer relativen Viskosität von 5,30 bei 5, 76 % Rückstand wurde bei einer Temperatur von 56 C mit Alkohol versetzt, bis sich eine starke Trübung zeigte. Die Temperatur war dabei auf 49 C gesunken. Es wurde unter Rühren und Kühlen eine Temperatur von 19 C eingestellt.
Darauf wurden mit einem Trennseparator die zwei Phasen getrennt und die spezifisch leichtere, in der die pharmazeu- tisch interessierenden MolekülgröBen enthal- ten waren, noch zweimal mittels eines Klärsystems nachsepariert. Die relative Viskosität des Dextranabbauproduktes der leichteren Schicht betrug bei einer Konzentration von 5,76"/o in'Wasser 2,46, bei der schwereren Schicht wurde eine relative Viskosität von 8,75 bei 5,98 /o gemessen.
Beispiel 8
Rohdextran wurde durch Erhitzen in 0,15"/oiger Wasserstoffsuperoxydlösung a. uf eine relative Viskosität von 2,85 bei 3,231/o abgebaut. Die Lösung wurde bei 59 C unter Ruhren mit Alkohol versetzt, bis eine sehr starke Trübung eintrat und die Temperatur auf 51 C abgesunken war. Es wurde bis zum Verschwinden der Trübung erhitzt und nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur mittels eines Separators getrennt und in einem zweiten Arbeitsgang die leichtere Phase nachgeklärt. In dieser war ein Dextranabbaupro dukt mit einer relativen Viskosität von 2,63 bis 6,03 /o in wässriger Losung enthalten, während bei der schwereren Phase eine relative Viskosität von 8,91 bis 6,000/o festgestellt wurde.
In den folgenden Beispielen wird nur ein Teil des erfindungsgemässen Verfahrens er läutert.
Beispiel 9
21,47 kg Rohdextran mit 92,33 /o Trockensubstanz (= 19,83 kg Trockendextran) werden in 350 1 Wasser bei Zimmertemperatur gelöst und mit 1,275 /o H202 (auf Trok- kendextran berechnet) versetzt. Die Temperatur wird im Laufe von 40 Minuten auf 600 C erhöht und bei dieser Temperatur gehalten. Die Ausgangslösung spindelt 5,0 Bx und hat einen p$-Wert von 7.
Relative Viskosität nach 120 Minuten 14, 6 180 10,4 240 5 > 6, 58 300 4,65 360 3,90 420 3,38 480 2,76
Das H202 ist restlos verbraucht. Die Losung wird mittels Na, OH auf pg 7 eingestellt und aufgekocht.
Beispiel 10
24, 17 kg Rohdextran (= 21,75 kg Trockendextran) werden in 450 1 Wasser bei 20 C gelöst. Es werden 1,3 /o H202 zugesetzt und die Temperatur auf 80 C erhöht und bei dieser Temperatur gehalten. Der pu-vert beträgt 7.
Relative Viskosität nach 90 Minuten 10,9 , 120 6,86 150 5,40 170 4,72 190 4,02
Die oxydative Spaltung wird durch den Zusatz von 500 g Glucose unterbunden, mittels Na2CO3 auf einen pg-Wert von 7 eingestellt und aufgekocht.