DE890563C

DE890563C - Process for the production of neomycin A and its salts

Info

Publication number: DE890563C
Application number: DEM4651A
Authority: DE
Inventors: Robert Lawrence Peck
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1949-06-28
Filing date: 1950-06-25
Publication date: 1953-11-05

Description

Verfahren zur Gewinnung von Neomycin A und seinen Salzen In einer Veröffentlichung von Waksman und Le Chevalier (Sience, 109, 305 bis 307 [z949]) ist erwähnt, daß gewisse Stämme von Actinomyces, insbesondere solche, welche zu der Gattung Streptomyces gehören, beim Wachsen in geeigneten Nährmedien ein Material liefern, das aktiv ist gegen streptomycinbeständige Bakterien, insbesondere gegen streptomycinbeständige Stämme von M. tuberculosis. Weiterhin ist in der Arbeit erwähnt, daß ein Organismus, der als Actinomyces fradii bzw. Streptomyces fradiae identifiziert wurde, ein Produkt liefert, das als Neomycin bezeichnet wurde. Das Neomycin wurde als basische Verbindung gekennzeichnet, welche in Wasser löslich und in organischen Lösungsmitteln unlöslich, wärmebeständig und gegen zahlreiche grampositive und gram-negative Bakterien, aber nicht gegen Pilze aktiv ist und bei alkalischer Reaktion besondere Aktivität zeigt. Schließlich ist in der Veröffentlichung an Hand vergleichender antibiotischer Spektren gezeigt, daß das rohe Neomycin verschieden ist vom Streptomycin und Streptothrycin und sich auch mit Bezug auf Aktivität von diesen Verbindungen unterscheidet.Method for obtaining neomycin A and its salts In a publication by Waksman and Le Chevalier (Sience, 109, 305 to 307 [z949]) it is mentioned that certain strains of Actinomyces, in particular those belonging to the genus Streptomyces, grow provide in suitable nutrient media a material which is active against streptomycin-resistant bacteria, in particular against streptomycin-resistant strains of M. tuberculosis. Furthermore, it is mentioned in the work that an organism which has been identified as Actinomyces fradii or Streptomyces fradiae supplies a product which has been designated as neomycin. Neomycin was identified as a basic compound, which is soluble in water and insoluble in organic solvents, heat-resistant and active against numerous gram-positive and gram-negative bacteria, but not against fungi and shows particular activity in the case of an alkaline reaction. Finally, the publication shows on the basis of comparative antibiotic spectra that the crude neomycin is different from streptomycin and streptothrycin and also differs from these compounds with regard to activity.

Im Gegensatz zu der vorstehend erwähnten Veröffentlichung, nach der das rohe Neomycin eine einzige aktive Verbindung darstellt, wurde gefunden, daß das Rohprodukt in Wirklichkeit eine Mehrzahl von antibiotischen Substanzen enthält. Nach den Feststellungen der Patentinhaberin sind dreiverschiedene antibiotische Verbindungen zugegen, die als Neomycin A, Neomycin B und Neomycin C bezeichnet werden. Der Anteil des Neomycin A ist größer als der an Neomycin C. Der Anteil an Neomycin C ist größer als der an Neomycin B. Der Anteil an Neomycin A ist geringer als die vereinigten Anteile von Neomycin B und Neomycin C. Im übrigen variieren die Anteile der antibiotischen aktiven Fraktionen in den einzelnen Ansätzen je nach dem Medium, das zur Herstellung des Rohneomycins Verwendung gefunden hat.In contrast to the aforementioned publication, according to which the crude neomycin is a single active compound, it has been found that the raw product actually contains a plurality of antibiotic substances. According to the findings the patent holder are three different antibiotic compounds present as Neomycin A, Neomycin B and Neomycin C to be designated. The proportion of neomycin A is greater than that of neomycin C. The proportion of neomycin C is greater than that of neomycin B. The proportion of neomycin A is less than the combined proportions of neomycin B and neomycin C. Otherwise the proportions of the antibiotic active fractions vary in the individual batches depending on the medium used to produce the rohneomycin.

Neomycin A unterscheidet sich von Neomycin B und Neomycin C durch seine größere Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln. Neomycin B ist durch seine geringe Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln gekennzeichnet. Neomycin C besitzt eine Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln, welche zwischen der von Neomycin A und Neomycin B liegt.Neomycin A differs from Neomycin B and Neomycin C by its greater solubility in organic solvents. Neomycin B is by its marked low solubility in organic solvents. Neomycin C possesses a solubility in organic solvents which is between that of neomycin A and neomycin B lies.

Die Erfindung befaßt sich mit der Trennung der drei aktiven Neomycinkomponenten und insbesondere mit der Isolierung von Neomycin A. Die Erfindung gestattet die Gewinnung von praktisch reinem Neomycin A und von sauren Salzen dieser Verbindung aus Kulturflüssigkeiten, die durch Wachsen ausgewählter Stämme von Actinomyces in geeigneten Kulturmedien erhalten werden.The invention is concerned with the separation of the three active neomycin components and in particular with the isolation of neomycin A. The invention allows Obtaining practically pure neomycin A and acid salts of this compound from culture fluids obtained by growing selected strains of Actinomyces in suitable culture media can be obtained.

Erfindungsgemäß wird zunächst ein pikrinsaures Salz hergestellt, indem ein rohes, saures Neomycinsalz in wässeriger Lösung mit Pikrinsäure in Reaktion gebracht wird und das so erhaltene Neomycinpikrat durch Einwirkung einer Mineralsäure in ein mineralsaures Salz von Neomycin übergeführt wird. Das Pikrat oder das daraus gewonnene mineralsaure Salz kann nun der chromatographischen Adsorption und Extraktion unterworfen werden und das so erhaltene, weitgehend gereinigte Produkt mit einem Arylazosulfonsäuresalz zwecks Bildung eines kristallinen Salzes von Neomycin A behandelt werden, das dann in ein praktisch reines mineralsaures Neomycinsalz, z. B. Neomycin-A-Hydrochlorid, übergeführt werden kann.According to the invention, a picric acid salt is first prepared by a crude, acidic neomycin salt in aqueous solution with picric acid in reaction is brought and the neomycin picrate thus obtained by the action of a mineral acid is converted into a mineral acid salt of neomycin. The picrat or that from it Recovered mineral acid salt can now be subjected to chromatographic adsorption and extraction are subjected and the largely purified product thus obtained with a Treated arylazosulfonic acid salt to form a crystalline salt of neomycin A. are then converted into a practically pure mineral acid neomycin salt, e.g. B. Neomycin A Hydrochloride, can be transferred.

Wenn ein Konzentrat von Neomycinhydrochlorid, das nach der eingangs erwähnten Veröffentlichung von Waksman und Le Chevalier gewonnen worden ist, mit Pikrinsäure in Reaktion gebracht wird und das so erhaltene pikrinsaure Salz bzw. der so erhaltene Komplex in Neomycinhydrochlorid übergeführt wird, ist die Gesamtaktivität des so erhaltenen Hydrochlorids fast immer erheblich größer als die Gesamtaktivität des Ausgangsmaterials und oft zweibis dreimal so groß. Dies spricht dafür, daß die Pikrinsäure eine chemische Veränderung bewirkt, z. B. die Spaltung einer kombinierten bzw. komplexen Form von Neomycin unter Freimachung von aktiven Molekülen, welche eine größere Aktivität besitzen als die komplexe Form des Neomycins. Die Zunahme der Aktivität kann aber auch zum Teil auf einer Trennung der Komponenten mit antibiotischer Aktivität von die Aktivität hemmenden Substanzen beruhen, welche in dem Kulturkonzentrat vorhanden waren.If a concentrate of neomycin hydrochloride, which after the initially publication by Waksman and Le Chevalier mentioned above Picric acid is reacted and the picric acid salt or salt obtained in this way is reacted. the complex thus obtained is converted to neomycin hydrochloride, is the total activity of the hydrochloride obtained in this way is almost always considerably greater than the total activity of the starting material and often two to three times as large. This suggests that the Picric acid causes a chemical change, e.g. B. the split of a combined or complex form of neomycin with the liberation of active molecules, which have a greater activity than the complex form of neomycin. The increase The activity can also be partly due to a separation of the components with antibiotic Activity of the activity-inhibiting substances based, which in the culture concentrate were present.

Die Herstellung des pikrinsauren Salzes kann mit Vorteil derart erfolgen, daß z Gewichtsteil Rohneomycinhydrochlorid, gelöst in etwa 6 Raumteilen Wasser, auf etwa 7o° erwärmt und mit einer Lösung von etwa 1,5 Gewichtsteilen Pikrinsäure in etwa 3o Raumteilen Wasser in Reaktion gebracht wird. Die Neomycinhydrochloridlösung wird zweckmäßig rasch zu der nahezu kochenden Lösung der Pikrinsäure gegeben. Hierbei scheidet sich unmittelbar ein öliger Niederschlag von Neomycinpikrat ab. Die Mischung wird dann gekühlt und die Mutterlauge von dem gummiartigen Niederschlag durch Dekantieren getrennt. Der Niederschlag wird in etwa 3 Teilen Aceton gelöst und die erhaltene Lösung mit etwa 54 Teilen Aceton, das o,5 Teile Chlorwasserstoffsäure enthält, gemischt. Hierbei erfolgt Fällung von Neomycinhydrochlorid. Das regenerierte Hydrochlorid hat im allgemeinen eine Aktivität je Gewichtseinheit, die zumindest drei- bis viermal so groß ist wie die Aktivität des Ausgangskonzentrats. Das Neomycin kann auch in Form anderer mineralsaurer Salze gewonnen werden, z. B. derart, daß das pikrinsaure Salz in Acetonlösung mit Mineralsäuren, wie Schwefelsäure, in Reaktion gebracht wird.The production of the picric acid salt can advantageously be carried out in such a way that that z part by weight of crudeomycin hydrochloride dissolved in about 6 parts by volume of water, heated to about 7o ° and with a solution of about 1.5 parts by weight of picric acid in about 3o parts by volume of water is reacted. The neomycin hydrochloride solution is expediently quickly added to the almost boiling solution of the picric acid. Here an oily precipitate of neomycin picrate separates out immediately. The mixture is then cooled and the mother liquor from the gummy precipitate by decanting separated. The precipitate is dissolved in about 3 parts of acetone and the resulting Solution mixed with about 54 parts of acetone containing 0.5 parts of hydrochloric acid. Here, neomycin hydrochloride is precipitated. The regenerated hydrochloride generally has an activity per unit weight that is at least three to four times is as great as the activity of the starting concentrate. The neomycin can also be found in Form of other mineral acid salts are obtained, z. B. such that the picric acid Salt in acetone solution brought into reaction with mineral acids such as sulfuric acid will.

Die Reinigung von Neomycin und Isolierung von Neomycin A kann erfindungsgemäß durch chromatographische Adsorption und Elution mit Hilfe geeigneter Adsorptionsmittel, wie Holzkohle, mit Säure gewaschener Holzkohle, Tonerde, mit Säure gewaschener Tonerde, Diatomeenerde und Silikagel, vorgenommen werden. Holzkohle und sauer gewaschene Tonerde haben sich als besonders geeignet erwiesen.The purification of neomycin and isolation of neomycin A can according to the invention by chromatographic adsorption and elution using suitable adsorbents, such as charcoal, acid washed charcoal, clay, acid washed clay, Diatomaceous earth and silica gel. Charcoal and acid washed Alumina have proven particularly suitable.

Das Neomycinsalz, das der chromatographischen Reinigung unterworfen wird, soll genügend konzentriert und so weit vorgereinigt werden, daß es eine Aktivität von Zoo bis 25o oder mehr Einheiten je Milligramm besitzt. Die gewünschte Aktivität kann durch wiederholtes Ausfällen des Rohneomycinsalzes aus organischen Lösungsmitteln erzielt werden. Vorteilhafter wird die Aktivitätserhöhung mit Hilfe des oben beschriebenen Neomycinpikrats bewirkt.The neomycin salt subjected to chromatographic purification should be sufficiently concentrated and pre-cleaned to such an extent that it becomes an activity von Zoo has up to 25o or more units per milligram. The activity you want can by repeated precipitation of the rohneomycin salt from organic solvents be achieved. The increase in activity becomes more advantageous with the help of the one described above Neomycin picrats causes.

Zwecks Durchführung des chromatographischen Verfahrens wird das Neomycinsalz in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Methanol oder wässerigem Methanol, gelöst und die Lösung mit dem Adsorptionsmittel, das vorteilhaft in einer Kolonne vorgesehen ist, in Berührung gebracht. Die Kolonne wird alsdann mit zusätzlichem Lösungsmittel ausgewaschen und die abfließende Lösung von Zeit zu Zeit geprüft, indem ein paar Tropfen der Lösung Aceton oder Äther zugefügt werden. Hierbei zeigt das Auftreten eines Niederschlags an, daß antibiotische Substanzen begonnen haben, die Kolonne zu verlassen. Die Kolonne kann in getrennte Zonen unterteilt und Fraktionen für die Extraktion von antibiotischen Stoffen gewonnen werden. Es empfiehlt sich aber, die Fraktionierung durch kontinuierliches Auswaschen der Kolonne mit einem Lösungsmittel, wie Methanol, wässerigem Methanol oder saurem wässerigem Methanol, durchzuführen und eine Anzahl verschiedener Fraktionen zu sammeln, aus denen das Neomycinsalz entweder direkt oder nach Eindampfen auf ein geeignetes Volumen durch Zugabe eines mit der Lösung mischbaren Lösungsmittels, in dem das Salz praktisch unlöslich ist, wie z. B. Aceton oder Äther, ausgefällt wird.To carry out the chromatographic process, the neomycin salt dissolved in a suitable solvent such as methanol or aqueous methanol and the solution with the adsorbent, which is advantageously provided in a column is brought into contact. The column is then filled with additional solvent washed out and the draining solution checked by a few from time to time Drops of the solution acetone or ether are added. Here shows the occurrence of a precipitate that antibiotic substances have begun the column to leave. The column can be divided into separate zones and fractions for the extraction of antibiotic substances can be obtained. It is recommended, however, fractionation by continuously washing the column with a solvent, such as methanol, aqueous methanol or acidic aqueous methanol and to collect a number of different fractions from which the neomycin salt either directly or after evaporation to a suitable volume by adding a a solvent which is miscible with the solution and in which the salt is practically insoluble, such as B. acetone or ether, is precipitated.

Das zum Auswaschen der Kolonne dienende Lösungsmittel ist dem verwendeten Adsorptionsmittel anzupassen. Bei Verwendung von mit Säure gewaschener Tonerde als Adsorptionsmittelempfiehlt sich z. B. die Anwendung von Methanol mit einem Wassergehalt bis zu etwa 13 °/o. Hierdurch wird der Hauptteil der Verunreinigungen von dem adsorbierten Neomycin getrennt. Methanol, das etwa 15 bis 50 °/o Wasser enthält, ist gut geeignet für das Auswaschen der Zone von aktivem Material. Bei Verwendung von alkalischer Tonerde als Adsorptionsmaterial ist die Anwendung von Methanol mit Wassergehalten bis zu 5o °/a zur Entfernung von löslichen Verunreinigungen gut geeignet, während die aktiven Zonen hierbei vorteilhaft mit Methanol extrahiert werden, das etwa 5o bis 70 °/o Wasser enthält.The solvent used to wash out the column is the same as that used Adsorbent adapt. When using acid washed Alumina as an adsorbent is recommended e.g. B. the use of methanol with a water content of up to about 13%. This removes the bulk of the impurities separated from the adsorbed neomycin. Methanol, which is about 15 to 50% water contains, is well suited for washing out the zone of active material. at Use of alkaline clay as an adsorbent material is the application of Methanol with a water content of up to 50% / a to remove soluble impurities well suited, while the active zones are advantageously extracted with methanol which contains about 50 to 70% water.

Bei Prüfung verschiedener Fraktionen von Auszügen durch das Gegenstromverteilungsverfahren hat sich gezeigt, daß die Zusammensetzung von aufeinanderfolgenden Auszugsfraktionen beträchtliche Schwankungen aufweisen kann. Bei Anwendung von sauer gewaschener Tonerde als Adsorptionsmaterial und wässerigem Methanol als Extraktionsmittel enthalten die ersten Fraktionen vorwiegend ein einziges antibiötisches Material, nämlich Neomycin A. Die nachfolgenden Fraktionen enthalten noch beträchtliche Mengen von Neomycin A neben zunehmenden Mengen von Neomycin B und Neomycin C. Anscheinend hat die Tonerde die Neigung, Neomycin B und C zurückzuhalten. Diese Neigung kann aber durch Auswaschen der Kolonne mit etwa o,i n-wässeriger Salzsäure weitgehend überwunden werden.When examining different fractions of extracts by the countercurrent distribution method has been shown that the composition of successive extract fractions can vary considerably. When using acid washed clay contained as adsorption material and aqueous methanol as extractant the first fractions predominantly a single antibiotic material, namely neomycin A. The following fractions still contain significant amounts of neomycin A alongside increasing amounts of neomycin B and neomycin C. Apparently the clay has the tendency to withhold neomycin B and C. This tendency can, however, by washing out the column can be largely overcome with about o, i n aqueous hydrochloric acid.

Die selektive Extraktion unter Gewinnung von Fraktionen, welche vorwiegend Neomycin A enthalten, und die Wirkung des Pikrinsäureverfahrens im Sinne der erhöhten Gewinnung von Neomycin A sind aus den nachfolgenden Vergleichsdaten ersichtlich.The selective extraction with the recovery of fractions which predominantly Contain neomycin A, and the effect of the picric acid process in terms of increased Obtaining Neomycin A can be seen from the following comparative data.

Eine Probe von 2o g Neomycinhydrochlorid mit einer Aktivität von etwa 23o E/mg, welche nicht die Pikratstufe durchlaufen hatte, wurde in einer Kolonne chromatographisch behandelt, die mit iooo g einer sauer gewaschenen Tonerde beschickt war. Die Ergebnisse sind aus der nachfolgenden Tabelle ersichtlich: Gewicht Aktivität Extraktionsmittel der wieder- der Fraktion gewonnenen Fraktions- festen Fraktion einheften Volumen # Methanol ccm °/o . g Je mg 1 140o go 4,53 304 2 2800 85 4,10 427 3 2020 8o 2,5o 31o 4 1950 70 2,37 38o Zwei weitere Proben von 2o g Neomycinhydrochlorid mit einer Aktivität von 239 E/mg, welche durch Regeneration von Neomycinpikrat gewonnen worden sind, wurden in gleicher Weise in zwei Kolonnen chromatographisch behandelt, welche je iooo g sauer gewaschene Tonerde enthielten. Entsprechende Fraktionen aus den beiden Kolonnen wurden miteinander vereinigt. Es wurden die nachstehenden Ergebnisse erhalten Geeicht Aktivität Extraktionsmittel der wieder- der Fraktion gewonnenen Fraktions- festen einheiten Volumen Methanol Fraktion ccm % g je mg 1 3200 ! go 18,i 29o 2 582o 85 g,6 76o 3 642o 8o 5,4 683 Aus Tabelle i ist ersichtlich, daß die Fraktionen 2 und 4 eine höhere Aktivität besitzen als die Fraktion 3. Es hat also eine Trennung von zumindest zwei aktiven Komponenten stattgefunden. Ein Vergleich der Aktivität des aus Fraktion 2 gewonnenen Materials (Neomycin A) mit der erhöhten Aktivität der Fraktion 2 in Tabelle 2 zeigt, daß die Pikratstufe zu einer erhöhten Ausbeute an Neomycin A geführt hat.A sample of 20 g neomycin hydrochloride with an activity of about 23 ° U / mg, which had not passed the picrate stage, was chromatographed in a column which was charged with 100 g of an acid-washed clay. The results can be seen in the table below: Weight activity Extractant of the re-the Faction won faction attach fixed fraction Volume # methanol ccm ° / o . g each mg 1 140o go 4.53 304 2 2800 85 4.10 427 3 2020 8o 2.5o 31o 4 1950 70 2.37 38o Two further samples of 20 g of neomycin hydrochloride with an activity of 239 U / mg, which had been obtained by regeneration of neomycin picrate, were chromatographically treated in the same way in two columns, each containing 100 g of acid-washed clay. Corresponding fractions from the two columns were combined with one another. The following results were obtained Calibrated activity Extractant of the re-the Faction won faction fixed units Volume of methanol fraction ccm% g per mg 1 3200! go 18, i 29o 2 582o 85 g, 6 76o 3 642o 8o 5.4 683 From table i it can be seen that fractions 2 and 4 have a higher activity than fraction 3. At least two active components have therefore been separated. A comparison of the activity of the material obtained from fraction 2 (neomycin A) with the increased activity of fraction 2 in Table 2 shows that the picrate stage has led to an increased yield of neomycin A.

Eine einfache chromatographische Reinigungsbehandlung liefert zumindest einen Teil der Aktivität in Form eines gereinigten Materials, dessen Aktivität zwei- bis fünfmal so hoch ist wie die Aktivität des Ausgangskonzentrats. Aufeinanderfolgende chromatographische Behandlungen von aus den Auszugsfraktionen wiedergewonnenen Neomycinsalzen ergeben eine weitere Reinigung und Trennung der verschiedenen Neomycinkomponenten. Man kann mit Hilfe des chromatographischen Verfahrens Konzentrate von Neomycin A erhalten, welche eine Aktivität von 5oo bis iooo E/mg aufweisen. Die durch chromatographische Reinigung erhältlichen Neomycin-A-Salze, welche bereits einen beträchtlichen Reinigungsgrad aufweisen, können in praktisch reine Produkte übergeführt werden. Diese Reinigung kann durch Reaktion mit gewissen arylazosulfonsauren Salzen erfolgen, welche kristalline Salze von Neomycin A bilden, die durch Umkristallisation leicht gereinigt und dann in ein praktisch reines Neomycin-A-Mineralsäuresalz übergeführt werden können.A simple chromatographic purification treatment provides at least part of the activity in the form of a purified material, the activity of which is two- up to five times as high as the activity of the starting concentrate. Consecutive chromatographic treatments of neomycin salts recovered from the extract fractions result in further purification and separation of the various neomycin components. Neomycin A concentrates can be obtained using the chromatographic process obtained which have an activity of 50 to 100 U / mg. The chromatographic Purification available neomycin A salts, which already have a considerable degree of purification can be converted into practically pure products. This purification can take place by reaction with certain arylazosulfonic acid salts, which are crystalline Forms salts of Neomycin A, which are easily purified by recrystallization and then can be converted into a practically pure neomycin A mineral acid salt.

Wie gefunden wurde, bildet u. a. das Natriump-(p'-oxyphenylazo)-benzolsulfonat ein leicht zu reinigendes Salz mit Neomycin A, wenn ein Säuresalz von Neomycin A mit einer Aktivität von mindestens 400 E/mg, vorzugsweise etwa 7oo E/mg, damit in Wasser, Methanol oder einem wasserhaltigen Gemisch von niedrigen aliphatischen Alkoholen in Reaktion gebracht wird. Vorteilhaft wird Wasser oder wässeriges Methanol verwendet. Sehr befriedigende Ergebnisse werden erzielt, wenn das Umkristallisieren des arylazosulfonsauren Salzes von Neomycin A aus wässerigem Methanol erfolgt, das 5 bis 5o °/o Methanol enthält. Zwecks Bildung des Salzes wird vorteilhaft das mineralsaure Salz von Neomycin A und das arylazosulfonsaure Salz in einem Gewichtsverhältnis von etwa 2 : 1 verwendet. Die Reaktion kann bei Temperaturen zwischen . Raumtemperatur und ioo° durchgeführt werden. Vorteilhaft wird bei etwa 6o bis 7o° gearbeitet. Hierbei verläuft die Reaktion fast augenblicklich. Das kristalline p-(p'-oxyphenylazo)-benzolsulfonsaure Salz von Neomycin A hat nach Reinigung durch Umkristallisieren eine Aktivität von etwa 65o E/mg; bei etwa 225° beginnt es, sich ohne zu schmelzen zu zersetzen; bei ultravioletten Adsorptionsprüfungen zeigt sich ein ausgesprochenes Band bei 3700 (E i cm = 400).As has been found, inter alia. the sodium p- (p'-oxyphenylazo) benzene sulfonate an easy-to-clean salt with neomycin A, if an acid salt of neomycin A with an activity of at least 400 U / mg, preferably about 7oo U / mg, so that in Water, methanol or a water-containing mixture of lower aliphatic alcohols is brought into reaction. Water or aqueous methanol is advantageously used. Very satisfactory results are achieved when the recrystallization of the arylazosulfonsauren Salt of neomycin A is made from aqueous methanol, the 5 to 5o% methanol contains. The mineral acid salt of neomycin is advantageous for the formation of the salt A and the arylazosulfonic acid salt used in a weight ratio of about 2: 1. The reaction can take place at temperatures between. Room temperature and 100 ° carried out will. It is advantageous to work at about 6o to 7o °. The reaction takes place here almost instantly. The crystalline p- (p'-oxyphenylazo) -benzenesulfonic acid Salt of neomycin A after purification by recrystallization has an activity of about 65o U / mg; at about 225 ° it begins to decompose without melting; at ultraviolet adsorption tests show a pronounced band at 3700 (E i cm = 400).

Verwendet man zur Herstellung des kristallinen Salzes z. B. Natrium-p-(p'-oxyphenylazo)-benzolsulfonat in einer Menge, die geringer ist als die äquivalente Menge, so erhält man unmittelbar einen kristallinen, verhältnismäßig reinen Niederschlag. Bei Anwendung größerer Mengen der genannten Verbindung erhält man weniger reine Produkte, die anscheinend kristalline Formen von Neomycin B und C enthalten. Auch das angewendete mineralsaure Salz von Neomycin kann den Kristallisationsvorgang beeinflussen. Wenn z. B. das mineralsaure Salz des Neomycins aus einer späteren Fraktion des chromatographischen Verfahrens stammt und' wesentliche Mengen von Neomycin B und C enthält, so ist es schwierig, ein kristallines reines Salz von Neomycin A zu erhalten. Wenn dagegen ein mineralsaures Salz von Neomycin A, das eine Aktivität von wenigstens 7oo E/mg aufweist, angewendet wird, so bleiben etwa noch anwesende geringe Mengen von Neomycin B oder C während der Kristallisationsstufe anscheinend in Lösung. In diesem Fall wird bei Zugabe von weiterem Natrium-p-(p'-oxyphenylazo)-benzolsulfonat zu der Mutterlauge nach der Kristallisation von Neomycin A ein kristallines, nadelförmiges Produkt erhalten, das bei der Elementaranalyse andere Werte ergibt als Neomycin A.If one uses for the production of the crystalline salt z. B. Sodium p- (p'-oxyphenylazo) benzene sulfonate in an amount which is less than the equivalent amount, one obtains immediately a crystalline, relatively pure precipitate. When using larger Amounts of the compound mentioned give less pure products that appear to be contain crystalline forms of neomycin B and C. Also the applied mineral acid Neomycin salt can affect the crystallization process. If z. B. that mineral acid salt of neomycin from a later fraction of the chromatographic Process originates and 'contains substantial amounts of Neomycin B and C, so it is difficult to obtain a crystalline pure salt of neomycin A. If against a mineral acid salt of neomycin A, which has an activity of at least 7oo U / mg is applied, any small amounts of neomycin still present remain B or C apparently in solution during the crystallization stage. In this case becomes upon addition of further sodium p- (p'-oxyphenylazo) -benzenesulfonate to the mother liquor after the crystallization of neomycin A a crystalline, needle-shaped product obtained, which in the elemental analysis gives different values than neomycin A.

Für die Tatsache, daß die Mutterlauge nach Auskristallisieren des arylazosulfonsauren Salzes von Neomycin noch restliche Mengen von Neomycin A sowie Neomycin B enthält, spricht auch folgender Versuch Eine Portion eines Materials, das aus einem Auszug stammte, der zu Beginn der chromatographischen Behandlung in einer Kolonne erhalten wurde, wurde mit der Hälfte ihres Gewichts an Natrium-p-(p'-oxyphenylazo)-benzolsulfonat behandelt. Hierbei wurde ein im wesentlichen reines, kristallisiertes Neomycin-A-Salz in einer Ausbeute von etwa 40 °/o des Ausgangsgewichts erhalten. Die Mutterlauge des Salzes wurde durch Extraktion der angesäuerten Lösung mit Butanol von der Sulfonsäure befreit. Die wässerige Lösung wurde dann neutralisiert und durch Behandlung mit Pikrinsäure ein Pikrat erzeugt, das anschließend in das chlorwasserstoffsaure Salz übergeführt wurde. Die nach Abtrennung des unlöslichen Pikrats verbleibende Mutterlauge wurde von Pikrinsäure befreit und zu einem Sirup eingedampft, der mit Methanol verdünnt und durch Eingießen der Lösung in Aceton niedergeschlagen" wurde. Das erhaltene Produkt wurde getrocknet. Das Neomycin-A-Hydrochlorid, das aus dem Pikrat gewonnene Hydrochlorid und das aus der Pikratmutterlauge gewonnene Produkt wurden mit Hilfe von Verteilungsverfahren geprüft. Hierbei wurde für die Gegenstromverteilung ein Zweiphasensystem verwendet, 'das aus den folgenden Phasen bestand: einer M/2-Borat-Puffer-Lösung vom pn-Wert 7,3 als wässerige Phase und einer 5 °/Qigen Lösung von Stearinsäure in Pentasol als zweite organische Lösungsmittelphase. Unter Pentasol wird eine Mischung von fünf Alkoholen verstanden. Die beiden Phasen wurden vor dem Gebrauch miteinander gesättigt. Die unter Vergleichsbedingungen in jedem Rohr erzielten Aktivitäten sind aus der nachfolgenden Tabelle ersichtlich: Aktivität in jedem Rohr am Ende der Verteilung I 1I IN Rohr Neomycin-A- Hydrochlorid Produkt aus der Hydrochloridl) des Pikrats2) Pikratmutterlauge3) E/ccm E/ccm E/ccm I (Wasserlöslicher Rest) ......... 0 310 2740 2 .............................. 0 53 970 3 .... - ......................... 0 50 592 4 .........:.................... 54 145 733 5 .............................. 168 98o- 739 6 . « ............................ 517 1700 692 7 .............................. 742 2280 309 8 (Lösungsmittel löslicher Rest) . . . 410 1) 7,2 mg laufen in acht Röhren 2) 32,2 mg laufen in sieben Röhren 3) roq,o mg laufen in sieben Röhren Aus Spalte I der vorstehenden Tabelle geht hervor, daß das aus p-(p'-oxyphenylazo)-benzolsulfonsaurem Salz regenerierte Neomycin-A-Hydrochlorid eine einzelne homogene Komponente ist. Die Spalte 1I zeigt, daß die Behandlung der Mutterlauge aus der Bildung des kristallinen arylmosulfonsauren Salzes von Neomycin A mit Pikrinsäure und anschließende Reaktion des Pikrats zu Hydrochlorid eine weitergehende Trennung von Neomycin A aus der Mutterlauge bewirkt, daß aber das so gewonnene Material zumindest noch eine andere aktive Komponente enthält. Spalte III veranschaulicht die trennende Wirkung der Pikratbehandlung, da die Spitzenaktivitäten in den Rohren I und 5 die Gegenwart von zwei aktiven Komponenten anzeigen und der niedrige Wert in Rohr 7 anzeigt, daß der Neomycin-A-Gehalt dieses Materials sehr niedrig ist. Der nachfolgende Vergleich der Aktivitäten gegen verschiedene Mikroorganismen zeigt die verschiedenen spezifischen Wirkungen des Neomycin-A-Hydrochlorids und des aus der Pikratmutterlauge gewonnenen Hydrochlorids: Anzahl ccm, die für die Hemmung erforderlich sind Neomycin-A- Produkt Hydrochlorid aus Pikrat- E#mg mutterlauge r7oo 300 E/mg 1. Aspergillus niger MF 442 ......... < 59 < 150 2. Trichophyton mentogrophytes MF 1932 ........ < 59 < 150 3. Bodenheimers bacillus MB 265.- 15 1g 4. B. cereus MG 1g 1,5 37 5. M. Lisodeikticus MB 79 . . . . . . . . . 1,5 3,7 6. B. subtilis MB 249 2,0 15 7. E. coli W MB 2o8 7,4 7,5 B. E. coli W, strepto- mycin resistant . . 30 1g g. E. coli C MB 61/MB 273. . 7,4 7,5 1o. E. coli C neomy- cin resistant ..... 59 75 11. S. aureus MB log 0,74 15 Aus den gereinigten kristallinen arylazosulfonsauren Salzen von Neomycin A können im wesentlichen reine mineralsaure Salze des Neomycin A dadurch berggestellt werden, daß das komplexe Salz mit einem Überschuß einer Mineralsäure, z. B. Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure in Wasser, Methanol oder einer wässerigen Mischung von niederen aliphatischen Alkoholen in Reaktion gebracht wird. Die hierbei in Freiheit gesetzte Arylazosulfonsäure wird durch Filtration oder Extraktion mit Butanol entfernt und das mineralsaure Salz von Neomycin A, das im Filtrat oder in der wässerigen Phase verblieben ist, nach erfolgter Extraktion durch Eingießen des Filtrats oder der wässei i en Lösung in ein Lösungsmittel, z. B. Aceton oder tgher oder ein Gemisch beider, das mit der zu behandelnden Lösung mischbar ist, aber nicht lösend auf das antibiotische Salz wirkt, niedergeschlagen. Der so erhaltene Niederschlag ist nach Befreiung von den Lösungsmitteln und Trocknen ein praktisch reines mineralsaures Salz von Neomycin A, das eine Aktivität von etwa 17oo E/mg besitzt und nach Trocknen bei Raumtemperatur und Erhitzen auf dem Mikroblock (Koller Mikroschmelzblock) bei etwa 2oo° zu dunkeln beginnt und bei etwa 25o bis 26o° unter Zersetzung schmilzt. Das Salz hat eine Drehung im Wasser von etwa [a] D -f- 83° (c, 1,o in Wasser). Eine wässerige Lösung zeigt im wesentlichen nur eine Absorption im ultravioletten Gebiet. Die potentiometrische Titration von Neomycin-A-Hydrochlorid ergibt ein Äquivalentgewicht von 128. Der Mittelpunkt der Titrationsspanne ist bei pH 7,7o bis 7,8o. Neomycin-A-Hydxochlorid ergibt einen positiven Ninhydrintest; dagegen sind der Sakaguchitest für Guanidingruppen, der Elson-Morgan-Test für Glukosamine und Teste für Maltol negativ.The following experiment also speaks for the fact that the mother liquor still contains residual amounts of neomycin A and neomycin B after the arylazosulfonic acid salt of neomycin has crystallized out: A portion of a material that came from an extract obtained at the beginning of the chromatographic treatment in a column was treated with half its weight of sodium p- (p'-oxyphenylazo) benzene sulfonate. An essentially pure, crystallized neomycin A salt was obtained in a yield of about 40% of the starting weight. The mother liquor of the salt was freed from the sulfonic acid by extracting the acidified solution with butanol. The aqueous solution was then neutralized and a picrate was generated by treatment with picric acid, which was then converted into the hydrochloric acid salt. The mother liquor remaining after separation of the insoluble picrate was freed from picric acid and evaporated to a syrup, which was diluted with methanol and precipitated by pouring the solution into acetone. The product obtained was dried. The neomycin-A hydrochloride, which is obtained from the picrate The hydrochloride obtained and the product obtained from the picrate mother liquor were tested with the aid of distribution methods, using a two-phase system for countercurrent distribution, which consisted of the following phases: an M / 2 borate buffer solution with a pn value of 7.3 as an aqueous phase and a 5% solution of stearic acid in pentasol as the second organic solvent phase. Pentasol is understood to be a mixture of five alcohols. The two phases were saturated with one another before use. The activities achieved in each tube under comparison conditions are from the can be seen in the following table: Activity in each tube at the end of the distribution I 1I IN Tube neomycin A hydrochloride product from the Hydrochloride1) of picrate2) Picrate mother liquor3) E / ccm E / ccm E / ccm I (water-soluble residue) ......... 0 310 2740 2 .............................. 0 53 970 3 .... - ......................... 0 50 592 4 .........: .................... 54 145 733 5 .............................. 168 98o- 739 6th «............................ 517 1700 692 7 .............................. 742 2280 309 8 (solvent soluble residue). . . 410 1) 7.2 mg run in eight tubes 2) 32.2 mg run in seven tubes 3) roq, o mg run in seven tubes Column I of the table above shows that the neomycin A hydrochloride regenerated from p- (p'-oxyphenylazo) -benzenesulfonic acid salt is a single homogeneous component. Column 1I shows that the treatment of the mother liquor from the formation of the crystalline arylmosulfonic acid salt of neomycin A with picric acid and subsequent reaction of the picrate to hydrochloride causes a further separation of neomycin A from the mother liquor, but that the material obtained in this way at least has another effect contains active component. Column III illustrates the separating effect of the picrate treatment since the peak activities in tubes I and 5 indicate the presence of two active components and the low value in tube 7 indicates that the neomycin A content of this material is very low. The following comparison of the activities against different microorganisms shows the different specific effects of neomycin A hydrochloride and the hydrochloride obtained from the picrate mother liquor: Number of cc required for the escapement e are required Neomycin A product Picrat hydrochloride E # mg mother liquor r 7 oo 300 U / mg 1. Aspergillus niger MF 442 ......... <59 <150 2. Trichophyton mentogrophytes MF 1932 ........ <59 < 150 3. Bodenheimers bacillus MB 265.- 15 1g 4. B. cereus MG 1g 1.5 37 5. M. Lisodeikticus MB 79 . . . . . . . . . 1.5 3.7 6. B. subtilis MB 249 2.0 15 7. E. coli W MB 2o8 7.4 7.5 BE coli W, strepto- mycin resistant. . 30 1g G. E. coli C MB 61 / MB 273.. 7.4 7.5 1o. E. coli C neomy- cin resistant ..... 59 75 11. S. aureus MB log 0.74 15 Essentially pure mineral acid salts of neomycin A can be obtained from the purified crystalline arylazosulfonic acid salts of neomycin A by treating the complex salt with an excess of a mineral acid, e.g. B. hydrochloric acid or sulfuric acid in water, methanol or an aqueous mixture of lower aliphatic alcohols is reacted. The arylazosulfonic acid set free in this way is removed by filtration or extraction with butanol and the mineral acid salt of neomycin A, which has remained in the filtrate or in the aqueous phase, after the extraction has taken place, by pouring the filtrate or the aqueous solution into a solvent, z. B. acetone or tgher or a mixture of both, which is miscible with the solution to be treated, but does not have a dissolving effect on the antibiotic salt, deposited. The precipitate obtained in this way, after being freed from the solvents and dried, is a practically pure mineral acid salt of neomycin A, which has an activity of about 17oo U / mg and, after drying at room temperature and heating on the micro-block (Koller micro-melting block) at about 2oo ° begins to darken and melts at around 25o to 26o ° with decomposition. The salt has a rotation in water of about [a] D -f- 83 ° (c, 1, o in water). An aqueous solution shows essentially only absorption in the ultraviolet region. The potentiometric titration of neomycin A hydrochloride gives an equivalent weight of 128. The midpoint of the titration range is at pH 7.7o to 7.8o. Neomycin A hydroxochloride gives a positive ninhydrin test; on the other hand, the Sakaguchi test for guanidine groups, the Elson-Morgan test for glucosamines and tests for maltol are negative.

Eine Gegenstromverteilung von Neomycin-A-Hydrochlorid in gegenseitig gesättigten Phasen mit M/2 PH 7,3 Borat-Puffer und einer Lösung von 5 °/o Stearinsäure in Pentasol zeigt die Anwesenheit einer einzigen Komponente durch Teste für biologische Aktivität und quantitative Ninhydrinversuche an. Der Teilungskoeffizient bei diesem System ist etwa 5. Elementaranalysen von Neomycin-A-Hydrochlorid ergaben: C = 32,52; H = 6,86; N = 11,57; Cl = 28,65. Der Gewichtsverlust beim Trocknen der analytischen Probe während 2 Stunden bei ioo° im Vakuum betrug 9,7 %. Eine analytische Bestimmung des Aminostickstoffs ergab einen Wert von 11,25 °/o. Die Tatsache, daß der Aminostickstoff gleich dem Totalstickstoff ist, ist eine charakteristische Eigenschaft des Neomycin A. Eine weitere charakteristische Eigenschaft ist das Infrarot-Absorptionsspektrum des wasserfreien Neomycin-A-Hydrochlorids, welches charakteristische Absorptionsstreifen von - O H- und > N H+- Gruppen zeigt, und die Abwesenheit von Absorption in dem Bereich, der für Ester, Carbonyl und monosubstituierte Aminogruppen charakteristisch ist.A countercurrent distribution of neomycin A hydrochloride in one another saturated phases with M / 2 PH 7.3 borate buffer and a solution of 5% stearic acid in Pentasol shows the presence of a single component through tests for biological Activity and quantitative ninhydrin experiments. The division coefficient at this System is about 5. Elemental analyzes of neomycin A hydrochloride gave: C = 32.52; H = 6.86; N = 11.57; Cl = 28.65. The weight loss on drying the analytical Sample for 2 hours at 100 ° in a vacuum was 9.7%. An analytical determination the amino nitrogen gave a value of 11.25%. The fact that the amino nitrogen is equal to total nitrogen is a characteristic property of neomycin A. Another characteristic property is the infrared absorption spectrum of the anhydrous neomycin A hydrochloride, which has characteristic absorption strips of - O H and> N H + groups, and the absence of absorption in the Area characteristic of ester, carbonyl and monosubstituted amino groups is.

Das Acetyl-Neomycin-A zeigt Absorptionsstreifen, die charakteristisch sind für NH-Gruppen, Estergruppen, Carbonylgruppen und monosubstituierte Amidogruppen, zusammen mit einem scharfen reinen Absorptionsstreifen bei 9,3 ,cc. Der letztgenannte Streifen ist auch in dem Spektrum des Hydrochlorids vorhanden, aber durch Hydroxylabsorption etwas maskiert.The acetyl-neomycin-A shows absorption streaks which are characteristic of NH groups, ester groups, carbonyl groups and monosubstituted amido groups, together with a sharp pure absorption streak at 9.3 , cc. The latter stripe is also present in the spectrum of the hydrochloride, but somewhat masked by hydroxyl absorption.

Neomycin-A-Sulfat hat eine Aktivität von @ etwa 17oo E/mg. Die optische Drehung des bei Raumtemperatur getrockneten Materials war [a] D + 72° (c, 1,0 in Wasser) ; Neomycin-A-Sulfat, im Vakuum bei ioo° getrocknet, zeigt bei der Analyse einen Stickstoffgehalt von etwa 11,25 °/o.Neomycin A sulfate has an activity of about 17oo U / mg. The optical one Rotation of the material dried at room temperature was [a] D + 72 ° (c, 1.0 in Water) ; Neomycin A sulfate, dried in vacuo at 100 °, shows in the analysis a nitrogen content of about 11.25%.

Neomycin-A-Sulfat kann in die freie Neomycin-A-Base durch Reaktion mit einer verdünnten wässerigen Lösung von z. B. etwa o,2 n-Bariumhydroxyd, Abtrennen des Bariumsulfatniederschlags und Zugabe von Methanol und Aceton im Verhältnis von etwa i : 1o zu der resultierenden Lösung gewonnen werden. Die freie, bei Raumtemperatur getrocknete Base hat eine Aktivität von etwa 2345 E/mg und eine optische Drehung von [a1 2D5 + 79° (c, 0,57 in Wasser). Beim Erhitzen 'auf dem Mikroblock beginnt die Verbindung bei 21o° zu dunkeln; bei 27o° findet Zersetzung ohne Schmelzen statt. Die Lösung der freien Base zeigt eine stark alkalische Reaktion.Neomycin A sulfate can be converted into the neomycin A free base by reaction with a dilute aqueous solution of e.g. B. about o, 2 n-barium hydroxide, separating the barium sulfate precipitate and adding methanol and acetone in a ratio of about i: 1o to the resulting solution can be obtained. The free base, dried at room temperature, has an activity of about 2345 U / mg and an optical rotation of [a1 2D5 + 79 ° (c, 0.57 in water). When heated on the micro-block, the connection begins to darken at 210 °; at 270 ° decomposition takes place without melting. The solution of the free base shows a strongly alkaline reaction.

Alle in der vorliegenden Beschreibung gegebenen Konzentrationen (c) bedeuten Gramm je Zoo ccm Lösungsmittel. Reines Neomycin-A-Hydrochlorid zeigt Aktivität gegen verschiedene Mikroorganismen, insbesondere auch gegen Mikroorganismen, welche beständig sind gegen Streptomycin (vgl. hierzu die folgende Tabelle) Neomycin-A- Hy drochlorid Konzentration 14likroorganismen mg/ccm er- forderlich für vollständige Hemmung Staph. aureus MB zog ........... .0007q B. subtilis MB 249 . . . . . . . . . . . . . . .002 E. coli W (streptomycinbeständig) .030 B.cereus MB ig ....... ....... .0015 E. coli C (neomycinbeständig) .... .059 Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen die verschiedenen Stufen der Herstellung von reinen mineralsauren Salzen von Neomycin A gemäß Erfindung. Beispiele 1. 50 g Rohneomycinhydrochlorid (8o E/mg) würden in 30o ccm Wasser gelöst und die Lösung auf 7o° erwärmt. Diese Lösung wurde auf einmal zu einer nahezu kochenden Lösung von 75 g Pikrinsäure, die io °/fl Feuchtigkeit enthielt, in 1400 ccm Wasser gegeben. Hierbei bildete sich sofort ein öliger Niederschlag von Neomycinpikrat. Beim Abkühlen bis auf etwa 6o° wurde der Niederschlag viskos. Nunmehr wurde die Flüssigkeit durch Dekantation entfernt und das gummiartige Produkt mit 50 ccm Wasser gewaschen. Die abgetrennte Lösung und die Waschflüssigkeit wurden auf o bis 5° gekühlt, wobei ein weiterer dicker gummiartiger Niederschlag erhalten wurde, der durch Pikrinsäurekristalle verunreinigt war. Die Mutterlauge wurde durch Dekantatiön entfernt und der Rückstand mit ioo ccm Wasser gewaschen.All the concentrations (c) given in the present description mean grams per zoo ccm of solvent. Pure neomycin A hydrochloride shows activity against various microorganisms, especially against microorganisms that are resistant to streptomycin (see the following table) Neomycin A Hydrochloride concentration 14 microorganisms mg / ccm required for complete inhibition Staph. aureus MB moved ........... .0007q B. subtilis MB 249. . . . . . . . . . . . . . .002 E. coli W (streptomycin resistant) .030 B.cereus MB ig ....... ........ 0015 E. coli C (neomycin resistant) .... .059 The following examples illustrate the various stages in the preparation of pure mineral acid salts of neomycin A according to the invention. Examples 1. 50 g of crudeomycin hydrochloride (8o U / mg) were dissolved in 30o ccm of water and the solution was heated to 70 °. This solution was added all at once to a nearly boiling solution of 75 g of picric acid, which contained 100% moisture, in 1400 cc of water. An oily precipitate of neomycin picrate formed immediately. On cooling to about 60 °, the precipitate became viscous. The liquid was then removed by decantation and the gummy product was washed with 50 cc of water. The separated solution and the washing liquid were cooled to 0 to 5 °, whereby another thick gummy precipitate was obtained, which was contaminated with picric acid crystals. The mother liquor was removed by decantation and the residue was washed with 100 cc of water.

Der zuerst erhaltene ölige Niederschlag von Neomycinpikrat aus zwei 5o-g-Ansätzen, die in der vorstehend beschriebenen Weise verarbeitet wurden, wurde in etwa Zoo ccm Aceton gelöst. Die Lösung jedes öligen Niederschlags in etwa 75 ccm Aceton unter Rühren ging glatt vonstatten. Die vereinigten Lösungen wurden mit Aceton auf etwa 6oo-ccm verdünnt und der so erhaltenen Lösung eine Lösung von 2o ccm konzentrierter Chlorwasserstoffsäure in 28o ccm Aceton unter Rühren zugefügt. Hierbei fand sofort Ausfällung von Neomycinhydrochlorid statt. Der Niederschlag war gegen Ende der Reaktion gummiartig. Durch Zufügung von 2o ccm Wasser wurde die Lösung des gummiartigen Produktes vervollständigt. Die wässerige Lösung wurde mit z80 ccm Methanol verdünnt und dann in 2 1 Aceton gegossen, wobei Neomycinhydrochlorid als rötlichgelbes Pulver ausgeschieden wurde. Im allgemeinen wird bei der ersten Abtrennung des Hydrochlorids ein fester Niederschlag erhalten. Das Gewicht des Neomycinhydrochlorids, das aus der ersten Pikratfraktion aus zwei vereinigten Ansätzen gewonnen wurde, betrug 28,6 g, die Aktivität 250 E/mg.The first obtained oily precipitate of neomycin picrate from two 50 g batches processed in the manner described above dissolved in about zoo cc of acetone. The solution of any oily precipitate in about 75 cc of acetone with stirring proceeded smoothly. The combined solutions were with Acetone diluted to about 600 ccm and the resulting solution a solution of 2o cc of concentrated hydrochloric acid in 28o cc of acetone was added with stirring. Precipitation of neomycin hydrochloride took place immediately. The precipitation was rubbery towards the end of the reaction. By adding 20 cc of water, the Solution of the gummy product completed. The aqueous solution was with diluted z80 ccm of methanol and then poured into 2 l of acetone, taking neomycin hydrochloride was excreted as a reddish yellow powder. In general, the first Separation of the hydrochloride obtained a solid precipitate. The weight of the neomycin hydrochloride, which was obtained from the first picrate fraction from two combined batches, was 28.6 g, the activity 250 U / mg.

Der zweite ölige Niederschlag von Neomycinpikrat, der durch Kühlen der von dem ersten Pikrat abgegetrennten Flüssigkeit auf o bis 5° erhalten wurde, wurde in gleicher Weise aufgearbeitet. Diese durch Vereinigung von zwei 5o-g-Ansätzen entstandene Fraktion wurde in das Hydrochlorid übergeführt. Die Ausbeute betrug 22,7 g, die Aktivität 29o E/mg. Die Ausbeuten sind aus der nachfolgenden Zusammenstellung ersichtlich Fraktion Gewicht Aktivität Gesamt- in Gramm E/mg einheften Ausgangsmaterial . . . . . . . . . . . . . . . ioo 8o 8000000 Erste Pikratfraktion umgewandelt in Hydrochlorid . . . . . . . . . . . . . . . 28,6 250 7150000 Zweite Pikratfraktion umgewandelt in Hydrochlorid............... 22,7 29o 6 60o ooo Die Diskrepanz der Aktivitäten beruht vermutlich nicht auf Variationen bei Durchführung der Versuche, da es sich um Durchschnittswerte handelt. Möglicherweise wurde durch Einwirkung der Pikrinsäüre aus einer gebundenen Form von Neomycin eine aktivere Form in Freiheit gesetzt. Weiterhin besteht die Möglichkeit, daß hemmende Substanzen zugegen waren, das Neomycin als Pikrat niedergeschlagen wurde und die hemmenden Stoffe in Lösung verblieben sind.The second oily precipitate of neomycin picrate obtained by cooling the liquid separated from the first picrate to 0 ° to 5 ° was worked up in the same way. This fraction formed by combining two 50 g batches was converted into the hydrochloride. The yield was 22.7 g, the activity 29o U / mg. The yields can be seen from the table below fraction Weight activity total File in grams U / mg Source material. . . . . . . . . . . . . . . ioo 8o 8000000 First picrate fraction converted in hydrochloride. . . . . . . . . . . . . . . 28.6 250 7150000 Second picrate fraction converted in hydrochloride ............... 22.7 29o 6 60o ooo The discrepancy in activities is presumably not due to variations in the performance of the experiments, since the values are averages. It is possible that the action of picric acid released a bound form of neomycin into a more active form. There is also the possibility that inhibiting substances were present, that the neomycin was precipitated as a picrate and that the inhibiting substances remained in solution.

2. ioo g Neomycinhydrochlorid (8q. E/mg) wurden in 60o ccm Wasser gelöst und die Lösung auf 7o° erwärmt. Hierauf wurde eine nahezu kochende Lösung von 15o g Pikrinsäure in 3 1 Wasser zugefügt, die Mischung auf etwa io° gekühlt und die Mutterlauge durch Dekantieren von dem gummiartigen Niedarschlag von Neomycinpikrat getrennt. Der Niederschlag wurde in etwa 300 ccm Aceton gelöst und die Lösung mit 3400 ccm Aceton, enthaltend 50 ccm konzentrierter Chlorwasserstoffsäure, vermischt. Das ausgefällte Neomycinhydrochlorid wog 64,7 g. Nach Waschen mit Aceton und Trocknen zeigte das Produkt eine Aktivität von etwa 240 E/1119-3. Eine 2-g-Probe von zwei verschiedenen Röhneomycinkonzentraten wurde in 12 ccm Wasser gelöst und die Lösung auf 6o° erhitzt. Zu jeder Probe wurde eine Lösung von 5 g Pikrinsäure in 6o ccm auf go° erhitztem Wasser zugegeben. Jede Probe wurde dann auf 5° gekühlt und die Flüssigkeit von dem ausgeschiedenen gummiartigen Pikrat getrennt. In jedem Falle wurden die Pikrate in je 15 ccm Aceton gelöst und die Acetonlösung unter heftigem Rühren in i50 ccm Aceton, enthaltend 1,5 ccm konzentrierte Salzsäure, gegossen. Das niedergeschlagene Neomycinhydrochlorid wurde auf einem Filter gesammelt, mit Aceton und Äther gewaschen. und im Vakuum getrocknet. Die Ergebnisse von sorgfältig durchgeführten Vergleichsversuchen mit Originalmaterialien und regenerierten Hydrochloriden sind aus der nachfolgenden Zusammenstellung ersichtlich: Probe Produkt Gewicht Original- Gewicht Parallel- Prozentuale in Gramm Versuche versuch in Gramm versuch Wieder- gewinnung der E/mg E/mg E/mg Aktivität 1 2,0 195 84 1.32 310 105 2 2,0 157 ioo o,88 336 94 Die vergleichenden Prüfungen zeigen eine etwa quantitative Erhaltung der Aktivität; auf der Basis von früheren Prüfungen des Ausgangsmaterials sind bei der vorliegenden Prüfung über ioo % in der Mutterlauge erhalten geblieben. Diese Erhaltung der Aktivität ist ausnahmsweise hoch. Es besteht infolgedessen die Möglichkeit einer Spaltung von weniger aktiven Formen von Neomycin A oder der Beseitigung von hemmend wirkenden Stoffen.2. 100 g of neomycin hydrochloride (8q. U / mg) were dissolved in 60o ccm of water and the solution was heated to 70 °. A nearly boiling solution of 150 g of picric acid in 3 liters of water was then added, the mixture was cooled to about 10 ° and the mother liquor was separated from the gummy precipitate of neomycin picrate by decanting. The precipitate was dissolved in about 300 cc of acetone and the solution mixed with 3400 cc of acetone containing 50 cc of concentrated hydrochloric acid. The precipitated neomycin hydrochloride weighed 64.7 g. After washing with acetone and drying, the product showed an activity of about 240 U / 1119-3. A 2 g sample of two different Röhneomycin concentrates was dissolved in 12 cc of water and the solution heated to 60 °. A solution of 5 g of picric acid in 60 ccm of water heated to 100 ° was added to each sample. Each sample was then cooled to 5 ° and the liquid separated from the excreted rubbery picrate. In each case the picrates were each dissolved in 15 cc of acetone and the acetone solution was poured, with vigorous stirring, into 150 cc of acetone containing 1.5 cc of concentrated hydrochloric acid. The precipitated neomycin hydrochloride was collected on a filter, washed with acetone and ether. and dried in vacuo. The results of carefully carried out comparative tests with original materials and regenerated hydrochlorides can be seen in the following summary: Sample product Weight original weight parallel percentage in grams try try in grams try again winning the U / mg U / mg U / mg activity 1 2.0 1 9 5 84 1.32 31 0 105 2 2.0 1 57 ioo o, 88 336 94 The comparative tests show an approximately quantitative maintenance of the activity; On the basis of earlier tests of the starting material, over 100% was retained in the mother liquor in the present test. This maintenance of activity is exceptionally high. As a result, there is the possibility of splitting less active forms of neomycin A or the elimination of inhibitory substances.

4. 22g Neomycinhydrochlorid (Aktivität 29o E/mg), hergestellt über das Pikrat wie im Beispiel 1 beschrieben, wurden in 18 ccrn Wasser gelöst und die Lösung in eine chromatographische, mit 1 kg Tonerde beschickte Kolonne eingeführt, welche durch Waschen mit Schwefelsäure auf pli 4,5 gebracht worden ist. Die Kolonne wurde mit absolutem Methanol beschickt und aufeinanderfolgend 25oo ccm go%iges Methanol, 5000 ccm 85%iges Methanol und 2ooo ccm 8o%iges Methanol eingeführt. Nachdem die durch Pikrinsäure verursachte gelbe Färbung in Erscheinung trat, wurden drei entsprechende Fraktionen aufgefangen und im Vakuum zu einem dünnen Sirup konzentriert. Die sirupösen Produkte wurden unter absolutem Äthanol zerrieben, filtriert und getrocknet. Die Ergebnisse sind nachstehend zusammengefaßt Gewicht Prozent der Fraktion Volumen in Gramm Aktivität Gesamt- Ausgangs- von Fest- einheiten aktivität ccm körpern E/mg 1 1700 5,69 300 1700000 26 2 - 3000 4,77 700 3340000 52 3 2000 2,12 500 1 o6o ooo 16 Ausgangs- probe ... 22,0 290 6400000 ioo Eine 2-g-ProbevonNeomycinhydrochlorid (175E/mg) wurde in 2 ccm Wasser gelöst und die Lösung mit 18 ccm Methanol verdünnt. Diese Lösung wurde chromatographisch in einer Kolonne behandelt, die mit ioo g nicht sauer gewaschener, mit Methanol behandelter Tonerde beschickt war. Der Vorgang in der Kolonne wurde mit 25o-ccm-Portionen von go%igem, 85%igem, 8o%igem, 7o%igem, 50%igem und 30%igem Methanol und schließlich mit Wasser durchgeführt. Erst in dem 70%igen Methanolauszug trat Aktivität schwach in Erscheinung. Infolgedessen wurden Feststoffe nur aus den 5o%igen und 30%igen Methanolauszügen und dem Wasserauszug gewonnen. Folgende Ergebnisse wurden erzielt: Fraktion Gewicht Aktivität in Gramm I E/mg 50 % Methanolauszug ..... o,287 242 3o 0/0 Methanolauszug . . . -. 0,287 315 Wasserauszug ........... 01155 285 Mit einem Präparat von rohem Neomycinhydrochlorid (loo E/mg) wurde eine sehr zufriedenstellende Reinigung durch direkte chromatographische Behandlung mit sauer gewaschener Tonerde in wässerigem Methanol erzielt. Es wurde eine Spitzenfraktion mit 700 E/mg erhalten. Diese Fraktion erschien in einem 70%igen Methanolauszug; eine Fraktion mit 40o bis 5oo E/mg wurde durch weitere Extraktion mit 50%igem Methanol erhalten.4. 22 g of neomycin hydrochloride (activity 29o U / mg), prepared via the picrate as described in Example 1, were dissolved in 18 cc of water and the solution was introduced into a chromatographic column charged with 1 kg of clay, which was washed with sulfuric acid to pli 4.5 has been brought. The column was charged with absolute methanol and successively 25oo cc of go% methanol, 5000 cc of 85% methanol and 2,000 cc of 80% methanol were introduced. After the yellow coloration caused by picric acid appeared, three appropriate fractions were collected and concentrated in vacuo to a thin syrup. The syrupy products were triturated under absolute ethanol, filtered and dried. The results are summarized below Weight percent of Fraction Volume in grams Activity Total Starting of festivities activity ccm body rn E / mg 1 1700 5.6 9 300 1700000 26 2 - 3000 4.77 700 3340000 52 3 2000 2.12 500 1 o6o ooo 16 Initial sample ... 22.0 290 6400000 ioo A 2 g sample of neomycin hydrochloride (175E / mg) was dissolved in 2 cc of water and the solution diluted with 18 cc of methanol. This solution was treated by chromatography in a column which was charged with 100 g of non-acidic washed clay treated with methanol. The process in the column was carried out with 25o cc portions of go%, 85%, 80%, 70%, 50% and 30% methanol and finally with water. Activity was only weakly evident in the 70% methanol extract. As a result, solids were only recovered from the 50% and 30% methanol extracts and the water extract. The following results were achieved: Group weight activity in grams of IU / mg 50% methanol extract ..... o, 287 242 3o 0/0 methanol extract. . . -. 0.287 315 Water extract ........... 01 155 285 With a preparation of crude neomycin hydrochloride (100 U / mg) a very satisfactory purification was achieved by direct chromatographic treatment with acid washed clay in aqueous methanol. A peak fraction of 700 U / mg was obtained. This fraction appeared in a 70% methanol extract; a fraction of 40 to 500 U / mg was obtained by further extraction with 50% methanol.

5. 2 g Rohneomycinhydrochlorid (loo E/mg) wurden in 20 ccm 85%igem Methanol gelöst und chromatographisch mit ioo g sauer gewaschener Tonerde behandelt. Die erhaltenen Auszüge, die Gewichtsausbeuten nach Isolierung der festen Fraktionen und die Aktivitäten der festen Fraktionen sind aus der nachfolgenden Zusammenstellung ersichtlich (Tabelle s. Seite 8, oben).5. 2 g of crudeomycin hydrochloride (100 U / mg) were added in 20 cc of 85% strength Dissolved methanol and treated chromatographically with 100 g of acid-washed clay. The extracts obtained, the weight yields after isolation of the solid fractions and the activities of the fixed factions are from the table below can be seen (table see page 8, above).

6. Eine Kolonne wurde mit einer Mischung von Zoo g aktiver Holzkohle und 75 g Fasern beschickt. Die Trockenmischung wurde portionsweise eingefüllt und nach jeder Zugabe festgestampft. Hierauf wurde eine Lösung von ioo g Rohneomycinhydrochlorid in 6oo ccm 75%igem Methanol eingeführt. Anschließend wurden 21 Methanol (75 0/0) und darauf 1 1 Methanol (5004) in die Kolonne eingeführt. Vier Fraktionen von je 5oo ccm (75 % Methanol) wurden gesammelt und dann eine Fraktion von 1 1 (Methanol 5004) abgenommen. Die ersten beiden Fraktionen wurden in etwa die zehnfache Menge Aceton eingegossen, wobei eine gummiartige Ausfällung Gewicht Fraktion Lösungsmittel Extrakt- der festen Volumen Fraktionen @tät in Gramm E/mg 1 go °/a Methanol ....... 250 0505 < io 2 850/, Methanol ....... 250 0,125 < 20 3 8o0/, Methanol ....... 500 0,232 250 4 7o"/, Methanol ....... 250 o,126 700 5 50°/o Methanol ....... 250 o,ig6 400 6 Wasser............... 250 0,170 125 erhalten wurde, die beim Verrühren mit absolutem Äthanol körnige Beschaffenheit annahm. Die letzten beiden 5oo-ccm-Fraktionen wurden nach Ausfällung und Körnung miteinander vereinigt. Die 5o°/oigen Methanolauszüge wurden nicht aufgearbeitet, da sie nur eine Gesamtaktivität von 75 ooo E enthielten. Die Gewichte und Aktivitäten der drei festen Fraktionen waren: 1. 5397 g, 94 E/mg, 2. 27,67 g, 143 E/mg; 3. und 4. vereinigt 2,o g, 97 E/mg. Die Farbe der Feststoffe war blaß gelbrot.6. A column was charged with a mixture of Zoo g active charcoal and 75 g fiber. The dry mixture was poured in in portions and tamped down after each addition. A solution of 100 g of crude neomycin hydrochloride in 600 cc of 75% methanol was then introduced. Then 21 methanol (75 0/0) and then 1 1 methanol (5004) were introduced into the column. Four fractions of 500 cc each (75% methanol) were collected and then a fraction of 1 l (methanol 5004) was removed. The first two fractions were poured into about ten times the amount of acetone, causing a gummy precipitate weight Fraction solvent extract of the solid volume fractions @ ity in grams of U / mg 1 go ° / a methanol ....... 250 0505 <io 2,850 /, methanol ....... 250 0.125 <20 3 8o0 /, methanol ....... 500 0.232 250 4 7o "/, methanol ....... 250 o, 126 700 5 50 ° / o methanol ....... 250 o, ig6 400 6 water ............... 250 0.170 125 which assumed a granular nature when stirred with absolute ethanol. The last two 500 cc fractions were combined with one another after precipitation and granulation. The 50% methanol extracts were not worked up because they only contained a total activity of 75,000 units. The weights and activities of the three solid fractions were: 1. 5397 g, 94 U / mg, 2. 27.67 g, 143 U / mg; 3rd and 4th combined 2, above, 97 U / mg. The color of the solids was pale yellow-red.

7. 500 mg von Neomycin-A-Konzentrat (75o E/mg), erhalten durch chromatographische Behandlung, wurden einer nochmaligen chromatographischen Behandlung in einer Kolonne unterworfen, welche mit 25 g sauer gewaschener Tonerde beschickt war. Die aufgefangenen Extraktfraktionen wurden zu Sirupen eingedampft, unter Äthanol gekörnt und getrocknet. . Auszug Feststoffe aus dem Auszug Fraktion Volumen Methanol Gewicht Aktivität ccm I_ °@a mg E/mg 1 6o go 199 710 2 go 85 118 1220 3 ioo 80 58 925 4 ioo 70 75 300 Die Fraktion 2 war sehr reich an Neomycin A; sie dürfte mindestens 6o °/o Neomycin A enthalten.7. 500 mg of neomycin A concentrate (75o U / mg) obtained by chromatographic treatment was subjected to another chromatographic treatment in a column which was charged with 25 g of acid-washed clay. The collected extract fractions were evaporated to syrups, granulated under ethanol and dried. . Extract solids from the extract Fraction volume methanol weight activity ccm I _ ° @ a mg E / mg 1 6o go 199 710 2 go 85 118 1220 3 ioo 80 58 925 4 ioo 70 75 300 Fraction 2 was very rich in neomycin A; it should contain at least 60% neomycin A.

B. 1 g Neomycin-A-Hydrochlorid (70o E/mg), das nach den vorstehenden Beispielen erhalten wurde, wurde in 15 ccm 4o°/oigen Methanols gelöst und die Lösung auf 70° erwärmt. Alsdann wurde eine heiße Lösung (etwa go°) von o,5 g Natrium-p-(p'-oxyphenylazo)-benzolsulfonat in 15 ccm Wasser zugegeben. Aus der zunächst klaren Mischung schieden sich bald gelbe, durchscheinende Rosetten ab. Nach zweistündigem Stehen bei Raumtemperatur wurde das kristalline Produkt auf einem Filter gesammelt, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute betrug etwa 500 mg von kristallinem Neomycin-A-p-(p'-oxyphenylazo)-benzolsulfonat. Das Produkt war praktisch rein. Beim Erhitzen begann Zersetzung bei etwa 225°. Die Aktivität betrug etwa 65o E/mg. Spuren von noch vorhandenen Verunreinigungen konnten durch Umkristallisieren entfernt werden, z. B. derart, daß die Verbindung in heißem 5- bis 50°/oigem Methanol gelöst wurde, die Lösung abkühlen gelassen wurde, die Verbindung auf einem Filter in Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet wurde. Die Analyse ergab: C = 50,42; H = 5,0z; N = ii,2o. Die Ergebnisse wiederholter Umkristallisationen sind nachstehend zusammengestellt: Ultraviolette Umkristallisation Beginn der Biologische Absorption Lösungsmittel beiretwa°C Aktivität Intensität E/mg E r lm 200/, Methanol i. Kristallisation 225 645 419 5o0/, Methanol 2. Kristallisation 225 625 403 50/, Methanol 3. Kristallisation 225 66o 400 504 Methanol 4. Kristallisation 225 645 395 Bei dem vorstehend beschriebenen Verfahren, bei dem das Natrium-p-(p'-oxyphenylazo)-benzolsulfonat in einer Menge angewendet wurde, die geringer war als die äquivalente Menge, wurde ein kristalliner Niederschlag in praktisch reiner Form erhalten. Bei Verwendung größerer Mengen kann man einen größeren Betrag der ursprünglich vorhandenen Aktivität erhalten.- Es empfiehlt sich, für dieses Verfahren Neomycinkonzentrate mit mindestens 70o E/mg anzuwenden.B. 1 g of neomycin A hydrochloride (70o U / mg), which was obtained according to the preceding examples, was dissolved in 15 ccm of 40% methanol and the solution was heated to 70 °. Then a hot solution (about go °) of 0.5 g of sodium p- (p'-oxyphenylazo) benzenesulfonate in 15 cc of water was added. Yellow, translucent rosettes soon separated from the initially clear mixture. After standing for two hours at room temperature, the crystalline product was collected on a filter, washed with water and dried in vacuo. The yield was about 500 mg of crystalline neomycin Ap- (p'-oxyphenylazo) benzene sulfonate. The product was practically pure. On heating, decomposition started at about 225 °. The activity was about 65o U / mg. Traces of impurities still present could be removed by recrystallization, e.g. B. such that the compound was dissolved in hot 5 to 50% methanol, the solution was allowed to cool, the compound was washed on a filter in water and dried in vacuo. Analysis showed: C = 50.42; H = 5.0z; N = ii, 2o. The results of repeated recrystallizations are summarized below: Ultraviolet Recrystallization Start of biological absorption Solvent at about ° C activity intensity E / mg E r lm 200 /, methanol i. Crystallization 225 645 419 50 /, methanol 2. Crystallization 225 625 403 50 /, methanol 3. Crystallization 225 66o 400 504 methanol 4. Crystallization 225 645 395 In the above-described method in which the sodium p- (p'-oxyphenylazo) benzene sulfonate was used in an amount less than the equivalent amount, a crystalline precipitate was obtained in a practically pure form. If larger amounts are used, a larger amount of the originally present activity can be retained. It is advisable to use neomycin concentrates with at least 70o U / mg for this procedure.

9. 14M9 Neomycin-A-Hydrochlorid wurden in 1,5 ccm 3o°/oigen Methanols gelöst, die Lösung auf etwa- 6o° erwärmt und mit einer heißen Lösung von 12,2 mg Methylorange in i ccm Wasser gemischt. Hierbei bildet sich sofort ein Niederschlag, der nach Abkühlung auf Raumtemperatur auf einem Filter gesammelt wird. Ausbeute 12,6 mg. Das Produkt wurde aus 2 ccm 5o°/oigem Methanol umkristallisiert, wobei 3 mg kurze Nadeln erhalten wurden, die sich beim Erwärmen in dem Bereich von 235 bis 285° zersetzen. Die Aktivität betrug 500 E/mg.9. 14M9 neomycin A hydrochloride were dissolved in 1.5 cc of 30% methanol, the solution was heated to about -60 ° and mixed with a hot solution of 12.2 mg of methyl orange in 1 cc of water. A precipitate forms immediately, which is collected on a filter after cooling to room temperature. Yield 12.6 mg. The product was recrystallized from 2 cc of 50% methanol to give 3 mg of short needles which decompose on heating in the range from 235 to 285 °. The activity was 500 U / mg.

io. i g Neomycin-A-p-(p`-oxyphenylazo)-benzolsulfonat wurde in io ccm Wasser und 2o ccm n-Butanol suspendiert und etwa 2,5 ccm 2,5 n-Schwefelsäure zugemischt. Das Butanol, das viel frei gewordene Schwefelsäure enthält, wurde abgetrennt. Drei Portionen von frischem n-Butanol wurden zur Extraktion der verbliebenen Schwefelsäure verwendet. Die rückständige farblose wässerige Lösung wurde in die zwanzigfache Menge Aceton gegossen. Der entstehende weiße amorphe Niederschlag von Neomycin-A-Sulfat wurde durch Zentrifugieren gesammelt, mit Aceton ausgewaschen und getrocknet. Ausbeute: 282 mg [a] D -I-- 72° (Konzentration: i g in ioo ccm Wasser) ; Aktivität etwa i7oo E/mg. Analyse: N 11,25.ok i g neomycin A-p- (p`-oxyphenylazo) -benzenesulfonate was in io ccm of water and 20 ccm of n-butanol suspended and about 2.5 ccm of 2.5 n-sulfuric acid mixed in. The butanol, which contains a large amount of sulfuric acid that has been released, was separated off. Three servings of fresh n-butanol were used to extract the remaining sulfuric acid used. The remaining colorless aqueous solution became twenty times Poured amount of acetone. The resulting white amorphous precipitate of neomycin A sulfate was collected by centrifugation, washed with acetone and dried. Yield: 282 mg [a] D -I- 72 ° (concentration: i g in 100 ccm of water); Activity around i7oo U / mg. Analysis: N 11.25.

ii. Eine Lösung von 57,3 mg Neomycin-A-Sulfat in 3 ccm Wasser wurde auf etwa 7o° erwärmt und ziemlich rasch mit 2,i8 ccm von o,193 n-Bariumhydroxydlösung vermischt, wobei ein körniger Niederschlag von Bariumsulfat ausfiel. Nach Kühlen wurde die Mischung filtriert und das klare farblose Filtrat und das Waschwasser mit Methanol auf ein Volumen von 2o ccm aufgefüllt und das Ganze in Zoo ccm Aceton gegossen, wobei ein amorpher weißer Niederschlag von freiem Neomycin A entstand. Das Produkt wurde durch Zentrifugieren gesammelt, mit Aceton ausgewaschen und getrocknet. Ausbeute: 15 mg, [a] D + 72° (Konzentration: i g in ioo ccm Wasser); Aktivität etwa 2345 E/mg. Eine wässerige Lösung zeigt stark alkalische Reaktion. Beim Erhitzen auf dem Mikroblock beginnt das Neomycin A bei 21o° zu dunkeln und zersetzt sich allmählich beim Weitererhitzen auf 27o°, ohne zu schmelzen.ii. A solution of 57.3 mg of neomycin A sulfate in 3 cc of water was made warmed to about 70 ° and fairly quickly with 2.18 cc of 0.193 n-barium hydroxide solution mixed, with a granular precipitate of barium sulfate precipitated. After cooling the mixture was filtered and the clear, colorless filtrate and wash water made up to a volume of 20 cc with methanol and the whole thing in zoo cc acetone poured, an amorphous white precipitate of free neomycin A formed. The product was collected by centrifugation, washed with acetone and dried. Yield: 15 mg, [a] D + 72 ° (concentration: i g in 100 ccm of water); Activity 2345 U / mg. An aqueous solution shows a strongly alkaline reaction. When heated on the microblock the neomycin A begins to darken at 210 ° and decomposes gradually as you continue to heat to 27o ° without melting.

12. 240 mg reines Neomycin-A-p-(p'-oxyphenylazo)-benzolsulfonat wurden in io ccm n-Butanol und io ccm Wasser suspendiert und 3 ccm n-i-Chlorwasserstoffsäure unter Umrühren zugegeben. Das Salz ging hierbei sehr rasch in Lösung. Die die freie Sulfonsäure enthaltende Butanolschicht wurde abgetrennt und zwei Portionen von frischem Butanol nach und nach verwendet, um die verbliebene p-(p'-Oxyphenylazo)-benzolsulfonsäure zu extrahieren. Die verbliebene wässerige Lösung von Neomycin-A-Hydrochlorid wurde in die zwanzigfache Menge Aceton gegossen, wobei ein schneeweißes Pulver ausfällt. Der Niederschlag von Neomycin-A-Hydrochlorid wurde durch Zentrifugieren gesammelt, mit Aceton ausgewaschen und getrocknet. Ausbeute 6o mg. Aktivität etwa 1420 E/mg. [a] D + 81° (Konzentration: i g in ioo ccm Wasser).12. 240 mg of pure neomycin A-p- (p'-oxyphenylazo) -benzenesulfonate suspended in 10 cc of n-butanol and 10 cc of water and 3 cc of n-i-hydrochloric acid added with stirring. The salt went into solution very quickly. The free Butanol layer containing sulfonic acid was separated and two servings of fresh Butanol gradually used to make up the remaining p- (p'-oxyphenylazo) -benzenesulfonic acid to extract. The remaining aqueous solution of neomycin A hydrochloride was poured into twenty times the amount of acetone, whereupon a snow-white powder precipitates. The precipitate of neomycin A hydrochloride was collected by centrifugation, washed out with acetone and dried. Yield 60 mg. Activity about 1420 U / mg. [a] D + 81 ° (concentration: i g in 100 ccm of water).

13. 2 g von einmal umkristallisiertem Neomycin-A-p-(p'-oxyphenylazo)-benzolsulfonat wurden in 40 ccm Methanol suspendiert und die Suspension auf 5o bis 6o° erwärmt. Zu der heißen Suspension wurden 16o ccm kochenden Wassers schnell zugegeben, um Lösung herbeizuführen. Beim Kühlen schied sich ein voluminöses Produkt aus, das auf einem Filter gesammelt wurde. Eine im Vakuum getrocknete Portion zeigte eine Aktivität von etwa 6oo E/mg und zersetzte sich bei etwa 22o bis 24o°. Der Rest des Materials wurde in noch feuchtem Zustand in 30 ccm heißem Methanol suspendiert und die Suspension mit 120 ccm kochendem Wasser gemischt. Aus der so erhaltenen klaren Lösung schied sich ein voluminöses Produkt aus; ein kleiner Teil desselben wurde getrocknet. Aktivität etwa 730 E/mg; Zersetzung zwischen 225 und 245°. Der Rückstand des voluminösen Materials wurde zweimal in der gleichen Weise umkristallisiert unter Verwendung von 2o ccm Methanol und 8o ccm kochendem Wasser. Das erhaltene feinkristalline Produkt wog 6oo mg, zeigte eine Aktivität von 75o E/mg und zersetzte sich bei 22o bis 25o°.13. 2 g of neomycin Ap- (p'-oxyphenylazo) benzenesulfonate, which had been recrystallized once, were suspended in 40 cc of methanol and the suspension was heated to 50 to 60 °. To the hot suspension, 160 cc of boiling water was quickly added to induce solution. A voluminous product separated out on cooling and was collected on a filter. A portion dried in vacuo showed an activity of about 600 U / mg and decomposed at about 22o to 24o °. The remainder of the material was suspended while still moist in 30 cc of hot methanol and the suspension was mixed with 120 cc of boiling water. A voluminous product separated from the clear solution thus obtained; a small part of it was dried. Activity about 730 U / mg; Decomposition between 225 and 245 °. The residue of the bulky material was recrystallized twice in the same manner using 20 cc of methanol and 8o cc of boiling water. The finely crystalline product obtained weighed 600 mg, showed an activity of 75o U / mg and decomposed at 220 to 250 °.

Analyse: C =.5o,62; H = 5,o5; N = 1131; Gewichtsverlust beim Trocknen während 2 Stunden bei ioo° im Trockenschrank 5,8; 4,8.Analysis: C = 50.62; H = 5, o5; N = 1131; Weight loss while drying for 2 hours at 100 ° in a drying cabinet 5.8; 4.8.

Zwecks Rückführung von 540 mg des vorstehend beschriebenen Salzes in Hydrochlorid wurde die Trockenprobe in 3 ccm 2,5 n-Chlorwasserstoffsäure suspendiert und 2o ccm n-Butanol in io ccm Wasser unter kräftigem Rühren zugegeben. Es bildeten sich zwei Phasen, von denen die Butanolphase am meisten gefärbt war. Die Butanolphase wurde abgetrennt und die wässerige Phase mit drei weiteren Portionen von mit Wasser gesättigtem n-Butanol extrahiert. Diese Extrakte wurden zwecks Wiedergewinnung von darin vorhandenem Neomycin-A-Hydrochlorid mit dem ersten Extrakt vereinigt. Die farblose wässerige Phase wurde in 25o ccm Aceton gegossen, wobei ein körniges Material erhalten wurde. Ausbeute: 162 mg; Aktivität i7oo E/mg [a] D -(- 83° (Konzentration: i g in ioo ccm Wasser) ; Durchschnittsaktivität i7oo E/mg. - Analyse: C = 32,40; H = 6,42; Gewichtsverlust bei 2stündigem Trocknen bei ioo° im Trockenschrank 9,6; 1o,4.To recycle 540 mg of the salt described above In the hydrochloride, the dry sample was suspended in 3 cc of 2.5 N hydrochloric acid and 20 cc of n-butanol in 10 cc of water are added with vigorous stirring. It formed two phases, of which the butanol phase was the most colored. The butanol phase was separated and the aqueous phase with three further portions of with water extracted saturated n-butanol. These extracts were used for the recovery of neomycin A hydrochloride present therein combined with the first extract. the colorless aqueous phase was poured into 250 ccm acetone, leaving a granular material was obtained. Yield: 162 mg; Activity i7oo U / mg [a] D - (- 83 ° (concentration: i g in 100 cc of water); Average activity i7oo U / mg. - Analysis: C = 32.40; H = 6.42; Weight loss on drying for 2 hours at 100 ° in a drying cabinet 9.6; 1o, 4.

Da die Probe nur schwierig ohne Inkaufnahme von Verlusten durch Zerkleinerung der Körner zu trocknen war, wurde sie in 5 ccm go°/@gem Methanol gelöst, die Lösung durch 50 mg Aktivholzkohle geleitet und in 70 ccm Aceton gegossen, wobei ein typisch flockiger Niederschlag entstand. Die so erhaltene Probe hatte eine Aktivität von 1723 E/mg. Beim Erhitzen auf dem Mikroblock dunkelte die Verbindung von 22o° an und schmolz bei 25o bis 26o° unter Bildung eines schwarzen Teers.Since the sample was difficult to dry without accepting losses by crushing the grains, it was dissolved in 5 ccm go ° / @ gem methanol, the solution passed through 50 mg activated charcoal and poured into 70 ccm acetone, which resulted in a typical flaky precipitate . The sample obtained in this way had an activity of 1723 U / mg. When heated on the microblock, the joint darkened from 22o ° and melted at 25o to 26o ° to form a black tar.

Analyse: C = 32,52; H = 6,86; N = 11,57; primärer Aminostickstoff =11,25 ; Cl = 28,65; Gewichtsverlust bei 2stündigem Trocknen bei ioo° im Trockenschrank 5,9; 9,7; 6,9.Analysis: C = 32.52; H = 6.86; N = 11.57; primary amino nitrogen = 11.25; Cl = 28.65; Weight loss on drying for 2 hours at 100 ° in a drying cabinet 5.9; 9.7; 6.9.

Die folgenden Teste gaben negative Resultate Sakaguchi (Guanidingruppen), Elson-Morgan (Glukosamine; Maltol). Der Ninhydrintest war positiv. Absorption wurde nur im Ende des ultravioletten Gebiets beobachtet.The following tests gave negative results for Sakaguchi (guanidine groups), Elson-Morgan (Glucosamine; Maltol). The ninhydrin test was positive. Absorption was observed only in the end of the ultraviolet region.

Durch Gegenstromverteilung, quantitative Ninhydrinbestimmungen und biologische Prüfungen wurde festgestellt, daß Neomycin A eine einheitliche Substanz darstellt und die geprüfte Probe als rein anzusehen war. Auf Grund von Prüfungen, die mit acetyliertem Neomycin A durchgeführt wurden; dürfte das Molekulargewicht von Neomycin-A-Hydrochlorid etwa 35o bis 40o betragen. Das Acetyl-Neomycin-A wurde wie folgt hergestellt: 1q.. Eine Mischung von 105,5 mg reinem Neomycin-A-Hydrochlorid, 75 mg geschmolzenem Natriumacetat und 15 ccm Essigsäureanhydrid wurde 1'/2 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die farblose Lösung wurde zwecks Entfernung von gebildetem unlöslichem Natriumchlorid filtriert, das Filtrat -zur Trockene gedampft, der Rückstand in Chloroform gelöst, durch 1o8 mg aktive Tierkohle filtriert und das Filtrat und das Chloroformwaschmittel in 6o ccm Petroläther gegossen. Erhalten wurde Acetyl-Neomycin-A in Form eines weißen amorphen Produktes, das bei 1q.5° zu erweichen beginnt und bei etwa 15o bis 16o° schmilzt.Countercurrent distribution, quantitative ninhydrin determinations and biological tests showed that neomycin A is a uniform substance and that the tested sample was to be regarded as pure. Based on tests carried out with acetylated neomycin A; the molecular weight of neomycin A hydrochloride is believed to be about 35o to 40o. The acetyl-neomycin-A was prepared as follows: 1q .. A mixture of 105.5 mg of pure neomycin-A hydrochloride, 75 mg of molten sodium acetate and 15 cc of acetic anhydride was refluxed for 1/2 hour. The colorless solution was filtered to remove any insoluble sodium chloride formed, the filtrate - evaporated to dryness, the residue dissolved in chloroform, filtered through 108 mg of active animal charcoal and the filtrate and the chloroform detergent poured into 60 cc of petroleum ether. Acetyl-neomycin-A was obtained in the form of a white amorphous product which begins to soften at 1 ° 5 ° and melts at around 150 to 160 °.

Analyse: N = 7,78; Acetyl = 56,43. Eine Molekulargewichtsbestimrnung ergab einen Wert von 570 -- 10.Analysis: N = 7.78; Acetyl = 56.43. A molecular weight determination gave a value of 570-10.

Claims

PATENT CLAIMS: 1. Process for the conversion of a crude neomycin salt into a mineral acid salt of neomycin with higher neomycin activity, characterized in, that a crude acid salt of neomycin in aqueous solution by the action of picric acid converted into neomycin picrate and this by the action of a mineral acid, e.g. B. hydrochloric acid, is converted into a mineral acid salt of neomycin.

2. The method according to claim 1, characterized in that that according to claim 1 obtained 3final acid salt for the purpose of separating neomycin A from the more water-soluble salts of neomycin B and neomycin C to a chromatographic adsorption treatment and Subjected to extraction with solutions consisting of water and organic solvents whose organic solvent content is progressively reduced.

3. The method according to claim 1, characterized in that the neomycin A obtained by chromatographic treatment according to claim 2 is reacted with an alkali metal salt of an arylazosulfonic acid and the arylazosulfonic acid salt of neomycin A thus obtained is optionally recrystallized from methanol and then with an aqueous mineral acid, e.g. . B. hydrochloric acid or sulfuric acid is treated. q .. Process according to claims 1 to 3, characterized in that neomycin A sulphate obtained according to claim 3 is reacted with aqueous barium hydroxide, the barium sulphate which has precipitated is separated off and the remaining solution is processed into practically pure neomycin A. 5. The method according to claims 1 to q., Characterized in that the mineral acid salt obtained according to claim 1 is subjected to a chromatographic adsorption treatment and extraction with water and organic solvent-containing solutions with progressively decreasing contents of organic solvents, the neomycin-A-mineral acid salt the first fraction rich in organic solvents is obtained and is reacted with an alkali metal salt of an arylazo sulfonic acid and further neomycin A is obtained from the separated solution by first extracting the arylazo sulfonic acid with butanol, then neutralizing the aqueous solution and reacting it with picric acid whereby a precipitate is formed which contains predominantly the picrate of neomycin A, while the solution contains predominantly the picrate of neomycin B and C. 6. The method according to claims 1 to 5, characterized in that the extraction is carried out in the chromatographic treatment with the aid of a water-methanol mixture with progressively decreasing contents of methanol. 7. The method according to claims 1 to 6, characterized in that an acid salt of neomycin, predominantly of neomycin A, with an activity of about 700 U / mg with an alkali metal salt of an arylazosulfonic acid is reacted. B. Process according to Claims 1 to 7, characterized by the use of an alkali metal salt of p- (p'-oxyphenylazo) -benzenesulfonic acid.