DE1039197B

DE1039197B - Process for obtaining practically pure, crystalline novobiocin

Info

Publication number: DE1039197B
Application number: DEM32355A
Authority: DE
Inventors: Louis Chaiet
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1955-11-30
Filing date: 1956-11-14
Publication date: 1958-09-18

Description

Verfahren zur Gewinnung von praktisch reinem, kristallinem Novobiocin Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Novobiocin in praktisch reiner, kristalliner Form aus Lösungen, welche Stoffe mit Novobiocinaktivität enthalten, wie z. B. Fermentationsbrühen, Rohkonzentraten, verdünnten Lösungen, Extrakten u. dgl.Process for obtaining practically pure, crystalline novobiocin The invention relates to a method for obtaining novobiocin in practically pure, crystalline form from solutions which contain substances with novobiocin activity, such as B. fermentation broths, raw concentrates, dilute solutions, extracts and. like

Novobiocin ist ein Antibiotikum mit einem breiten antibakteriellen Wirkungsspektrum, das besonders gegen grampositive Mikroorganismen wirksam ist, obwohl es auch eine gewisse Aktivität gegen gramnegative Mikroorganismen aufweist, und sich bei der aerobischen Züchtung von Streptomyces spheroides in einem geeigneten wäßrigen Nährmedium unter geregelten Bedingungen bildet. Die Herstellung von Nov obiocin unter Verwendung von Streptomyces spheroides, z. B. des Stammes NRRL 2449, oder dessen natürlichen oder künstlichen Mutanten, ist Gegenstand der Patentanmeldung M 30263 IV a/30 h.Novobiocin is an antibiotic with a broad antibacterial Spectrum of activity that is particularly effective against gram-positive microorganisms, although it also has some activity against gram-negative microorganisms, and in aerobic cultivation of Streptomyces spheroides in a suitable aqueous nutrient medium forms under controlled conditions. The making of Nov obiocin using Streptomyces spheroides, e.g. B. of strain NRRL 2449, or its natural or artificial mutants, is the subject of the patent application M 30263 IV a / 30 h.

Praktisch reines Novobiocin wurde in zwei gelben kristallinen Modifikationen erhalten: die eine Form kristallisiert als Rosetten und schmilzt bei etwa 152 his 1S4° C, während die andere das Aussehen flacher Nadeln besitzt und bei 170 bis 172° C schmilzt. Jede dieser kristallinen Formen des Antibiotikums läßt sich in eine normalisierte Form überführen, die amorph oder submikrokristallin sein kann, indem man die Kristalle in Aceton löst, die Lösung schnell mit einer verhältnismäßig großen Menge Petroläther versetzt und das ausgefallene normalisierte Produkt durch Filtrieren gewinnt.Virtually pure novobiocin came in two yellow crystalline modifications preserved: the one form crystallizes as rosettes and melts at about 152 his 1S4 ° C, while the other has the appearance of flat needles and at 170 to 172 ° C melts. Each of these crystalline forms of the antibiotic can be broken down into a convert normalized form, which can be amorphous or sub-microcrystalline, by adding one dissolves the crystals in acetone, the solution quickly with a relatively large one Amount of petroleum ether was added and the normalized product which had precipitated was filtered off wins.

Erfindungsgemäß gewinnt man reines kristallines NTovohiocin aus einer rohen konzentrierten Lösung, und zwar entweder aus einer alkalischen, wäßrigen Lösung des novobiocinaktiven Materials oder aus einer Lösung desselben in einem niederen aliphatischen Alkohol, indem man die Lösung mit einer in Wasser und in wäßrigen Lösungen niederer aliphatischer Alkohole löslichen aliphatischen Carbonsäure behandelt, die höchstens 6 Kohlenstoffatome und mindestens eine Carboxylgruppe je Molekül besitzt und eine Dissoziationskonstante im Bereich von 10-s bis 10-s aufweist, und zwar in Gegenwart von Wasser und einem einwertigen aliphatischen Alkohol mit höchstens 4 Kohlenstoffatomen im Molekül, der in jedem Verhältnis mit Wasser vollständig mischbar ist, worauf man das Produkt aus der Lösung gewinnt.According to the invention, pure crystalline NTovohiocin is obtained from a crude concentrated solution, either from an alkaline aqueous solution of the novobiocin-active material or from a solution of the same in a lower one aliphatic alcohol by mixing the solution with one in water and one in aqueous Solutions of lower aliphatic alcohols treated with soluble aliphatic carboxylic acid, which has a maximum of 6 carbon atoms and at least one carboxyl group per molecule and has a dissociation constant in the range of 10-s to 10-s in the presence of water and a monohydric aliphatic alcohol with at most 4 carbon atoms in the molecule, which are completely miscible with water in any ratio is how to get the product out of the solution.

Im engeren Sinne besteht das erfindungsgemäße Verfahren darin, daß man eine rohe, wäßrige, konzentrierte Lösung des novobiocinaktiven Materials, welche einen in jedem Verhältnis mit Wasser vollkommen mischbaren einwertigen aliphatischen Alkohol mit höchstens 4 Kohlenstoffatomen im Molekül enthält, mit einer in Wasser und in wäßrigen Lösungen niederer aliphatischer Alkohole löslichen aliphatischen Carbonsäure mit höchstens 6 Kohlenstoffatomen und mindestens einer Carboxylgruppe je Molekül sowie einer Dissoziationskonstante im Bereich von 10-s bis 10-s behandelt und das praktisch reine, kristalline N ovobiocin aus der so behandelten Lösung gewinnt. Handelt es sich bei der rohen Lösung um ein alkalisches wäßriges Konzentrat, so setzt man diesem den aliphatischen Alkohol zu, wenn die Lösung mit der aliphatischen Säure behandelt wird. Der aliphatische Alkohol kann jedoch auch als Lösungsmittel für die rohe Lösung dienen; in diesem Fall setzt man der alkoholischen Lösung Wasser zu, wenn sie mit der aliphatischen Säure behandelt wird.In the narrower sense, the inventive method consists in that one is a crude, aqueous, concentrated solution of the novobiocin-active material, which a monovalent aliphatic which is completely miscible in all proportions with water Contains alcohol with a maximum of 4 carbon atoms in the molecule, with one in water and aliphatic ones soluble in aqueous solutions of lower aliphatic alcohols Carboxylic acid with a maximum of 6 carbon atoms and at least one carboxyl group per molecule and a dissociation constant in the range of 10-s to 10-s and the practically pure, crystalline N ovobiocin is obtained from the solution treated in this way. If the crude solution is an alkaline aqueous concentrate, so one sets this to the aliphatic alcohol, if the solution with the aliphatic Acid is treated. However, the aliphatic alcohol can also be used as a solvent serve for the raw solution; in this case water is added to the alcoholic solution when treated with the aliphatic acid.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich auch folgendermaßen beschreiben: Man läßt praktisch reines Novobiocin aus einer rohen, konzentrierten, sauren, wäßrigen Lösung des novobiocinaktiven Materials kristallisieren, welche erstens einen in jedem Verhältnis mit Wasser vollkommen mischbaren einwertigen aliphatischen Alkohol mit höchstens 4C-Atomen im Molekül und zweitens eine in Wasser und in wäßrigen Lösungen niederer aliphatischer Alkohole lösliche aliphatische Carbonsäure mit höchstens 6 C-Atomen und mindestens einer Carboxylgruppe je Molekül sowie einer Dissoziationskonstante im Bereich von 10-s bis 10-s enthält. Vorzugsweise sollen die Komponenten der Lösung, aus welcher das kristalline Produkt gewonnen wird, nämlich der aliphatische Alkohol, das Wasser und die aliphatische Säure, in einem Volumenverhältnis von ungefähr 10:4: 1 anwesend sein.The method according to the invention can also be described as follows: Virtually pure novobiocin is left from a crude, concentrated, acidic, aqueous solution Solution of novobiocin-active material crystallize, which firstly has an in Monohydric aliphatic alcohol which is completely miscible with water in any proportion with at most 4C atoms in the molecule and secondly one in water and in aqueous solutions lower aliphatic alcohols soluble aliphatic carboxylic acid with at most 6 carbon atoms and at least one carboxyl group per molecule as well as a dissociation constant in the range of 10-s to 10-s. The components of the solution should preferably from which the crystalline product is obtained becomes, namely the aliphatic alcohol, the water and the aliphatic acid, in a volume ratio be present at approximately 10: 4: 1.

Zu den für die Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendbaren aliphatischen Säuren gehören die Monocarbonsäuren Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Isobuttersäure, Valeriansäure und Isovaleriansäure und die Polycarbonsäuren Citronensäure, Apfelsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure und Methylbernsteinsäure. Von diesen wird Essigsäure zur Zeit bevorzugt.Among those which can be used for carrying out the method according to the invention aliphatic acids include the monocarboxylic acids formic acid, acetic acid, propionic acid, Butyric acid, isobutyric acid, valeric acid and isovaleric acid and the polycarboxylic acids Citric acid, malic acid, malonic acid, succinic acid and methyl succinic acid. Of these, acetic acid is currently preferred.

Zu den zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendbaren aliphatischen Alkoholen gehören Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol und tert. Butanol. Von diesen wird Methanol zur Zeit bevorzugt.Among those which can be used for carrying out the method according to the invention aliphatic alcohols include methanol, ethanol, propanol, isopropanol, and tert. Butanol. Of these, methanol is currently preferred.

Die nachfolgenden Beispiele sollen einige gegenwärtig bevorzugte, besondere Ausbildungsformen der Erfindung erläutern, den Umfang der Erfindung jedoch nicht einschränken. Beispiel 1 Ein Novobiocin erzeugender Stamm von Streptomyces spheroides (NRRL 2449, wäßrig) wird durch aerobische Submersfermentation in einem geeigneten Nährmedium während einer solchen Zeitdauer und unter solchen Bedingungen gezüchtet, daß die Bildung von Novobiocin in der Fermentationsflüssigkeit stattfindet. Die gesamte Fermentationsflüssigkeit wird bei dem pH der Gewinnung, gewöhnlich 7,0 bis 8,0, mit einem Filterhilfsmittel, wie Diatomeenerde, versetzt, dann filtriert und der Filterkuchen mit warmem Wasser gewaschen. Das Volumen der vereinigten Filtrate und Waschflüssigkeiten ist um etwa ein Fünftel größer als das der Fermentationsflüssigkeit vor dem Filtrieren.The following examples are intended to illustrate some of the currently preferred explain particular embodiments of the invention, but the scope of the invention do not restrict. Example 1 A novobiocin producing strain of Streptomyces spheroides (NRRL 2449, aqueous) is produced by aerobic submerged fermentation in one suitable nutrient medium for such a period of time and under such conditions cultivated that the formation of novobiocin takes place in the fermentation liquid. All of the fermentation liquor is at the pH of the recovery, usually 7.0 up to 8.0, mixed with a filter aid such as diatomaceous earth, then filtered and washed the filter cake with warm water. The volume of the combined filtrates and wash liquors are about one fifth larger than that of the fermentation liquor before filtering.

Die Brühe wird in einer Gegenstrom-Extraktionsvorrichtung mit einer Menge Amylacetat extrahiert, die ein Zehntel des Volumens der filtrierten Fermentationsflüssigkeit beträgt. Die Extraktion wird mit einer weiteren, gleichen Volumenmenge Amylacetat wiederholt und die Extrakte werden vereinigt. Es ist wesentlich, daß das pH der wäßrigen Phase während dieser Extraktion durch Zusatz einer geeigneten 14tineralsäure, z. B. Schwefelsäure, auf etwa 6,5 eingestellt wird.The broth is in a countercurrent extractor with a Amount of amyl acetate extracted, which is one tenth of the volume of the filtered fermentation liquor amounts to. The extraction is carried out with another, equal volume of amyl acetate repeated and the extracts combined. It is essential that the pH of the aqueous phase during this extraction by adding a suitable 14tineral acid, z. B. sulfuric acid, is adjusted to about 6.5.

In der nächsten Verfahrensstufe arbeitet man mit einem wäßrigen Extraktionslösungsmittel, das aus Gründen der Einfachheit hier nur als alkalische Pufferlösung bezeichnet wird und folgendermaßen hergestellt werden kann: Man löst 10g Natriumcarbonat und 8 g Natriumbicarbonat in 950 ccm Wasser und füllt mit 50 ccm Methanol auf 1 1 auf. Mit dieser alkalischen Pufferlösung werden die vereinigten Amylacetatextrakte in einer Gegenstrom-Extraktionsvorrichtung extrahiert, wobei die Volumenmenge der Pufferlösung ein Fünftel des Volumens der Amylacetatextrakte beträgt, und die Extraktion wird noch einmal mit der gleichen Volumenmenge des wäßrigen Extraktionsmittels wiederholt. Es ist sehr wichtig, das PH der wäßrigen Phase während dieser Extraktion in der Nähe von 10 zu halten, keineswegs aber unter 9,5 absinken zu lassen, was man erreicht, indem man im Bedarfsfalle mehr Alkali zusetzt.In the next process step one works with an aqueous extraction solvent, which for the sake of simplicity is referred to here as an alkaline buffer solution and can be prepared as follows: Dissolve 10g sodium carbonate and 8 g of sodium bicarbonate in 950 ccm of water and make up to 1 l with 50 ccm of methanol. With this alkaline buffer solution, the combined amyl acetate extracts are in a countercurrent extraction device extracted, the volume amount of the buffer solution one fifth the volume of the amyl acetate extracts, and the extraction will repeated once more with the same volume of the aqueous extractant. It is very important to keep the pH of the aqueous phase in the during this extraction To keep close to 10, but by no means let what you achieve below 9.5, by adding more alkali if necessary.

Die auf diese Weise erhaltenen wäßrigen Pufferextrakte werden vereinigt und durch Eindampfen konzentriert, wodurch gleichzeitig das gelöste Amylacetat abgetrieben wird. Dann bringt man das pH der Lösung durch Zusatz einer Mineralsäure, wie Salzsäure, auf 2,3 bis 2,6. Hierdurch zersetzt sich das Natriumsalz des Novobiocins in der Lösung, und es fällt Novobiocin aus, welches durch Filtrieren gewonnen wird.The aqueous buffer extracts obtained in this way are combined and concentrated by evaporation, thereby simultaneously driving off the dissolved amyl acetate will. Then bring the pH of the solution by adding a mineral acid, such as hydrochloric acid, to 2.3 to 2.6. This causes the sodium salt of novobiocin to decompose in the Solution, and it precipitates novobiocin, which is obtained by filtration.

Der Filtrationsrückstand wird gewogen und in Methanol zu einer Lösung gelöst, die etwa 10 Gewichtsprozent Feststoffe enthält. Dann setzt man genügend Wasser und Essigsäure zu, damit das Volumenverhältnis von Methanol zu Wasser zu Essigsäure in der so erhaltenen Lösung 10:4:1 beträgt. Das sich aus der Lösung ausscheidende reine, kristalline Novobiocin wird abfiltriert. Die Kristalle werden mit einer Mischung von 10 Raumteilen Methanol und 4 Raumteilen Wasser gewaschen und dann im Vakuum bei einer Temperatur unterhalb 45° C getrocknet. Beispiel 2 Ein Novobiocin erzeugender Stamm von Streptomyces spheroides (NRRL 2449) wird durch aerobische Submersfermentation in einem geeigneten wäßrigen Nährmedium während einer solchen Zeitdauer und unter solchen Bedingungen gezüchtet, daß die Bildung von Novobiocin in der Fermentationsflüssigkeit stattfindet. Die gesamte Flüssigkeit wird mit einem Filterhilfsmittel, wie Diatomeenerde od. dgl., versetzt, dann bei dem PH der Gewinnung, gewöhnlich etwa 7,0 bis 8,0, filtriert und der Filterkuchen mit warmem Wasser gewaschen. Das Volumen des mit den Waschflüssigkeiten vereinigten Filtrats ist um etwa ein Fünftel größer als das der Fermentationsflüssigkeit vor dem Filtrieren.The filtration residue is weighed and made into a solution in methanol dissolved, which contains about 10 weight percent solids. Then you bet enough Water and acetic acid too, thus increasing the volume ratio of methanol to water Acetic acid in the solution thus obtained is 10: 4: 1. The one leaving the solution pure, crystalline novobiocin is filtered off. The crystals are made with a mixture washed by 10 parts by volume of methanol and 4 parts by volume of water and then in vacuo dried at a temperature below 45 ° C. Example 2 A Novobiocin Producer Streptomyces spheroides strain (NRRL 2449) is produced by submerged aerobic fermentation in a suitable aqueous nutrient medium for such a period of time and below grown in such conditions that the formation of novobiocin in the fermentation liquor takes place. All of the liquid is filtered with a filter aid, such as diatomaceous earth or the like, added, then at the pH of the extraction, usually about 7.0 to 8.0, filtered and the filter cake washed with warm water. The volume of the with the filtrate combined with the washing liquids is about a fifth larger than that the fermentation liquid before filtering.

Das pH der filtrierten Fermentationsflüssigkeiten wird durch Zusatz einer geeigneten Mineralsäure, wie Schwefelsäure, auf 6,5 eingestellt und die Flüssigkeit mit einer Menge Amylacetat extrahiert, die ein Zehntel des Volumens der filtrierten Fermentationsflüssigkeit beträgt. Die Extraktion wird mit einer weiteren, gleichen Volumenmenge Amylacetat wiederholt, und die Extrakte werden vereinigt.The pH of the filtered fermentation liquors is adjusted by addition a suitable mineral acid, such as sulfuric acid, adjusted to 6.5 and the liquid extracted with an amount of amyl acetate that is one-tenth the volume of the filtered Fermentation liquid is. The extraction is carried out with another, same Repeated volume of amyl acetate and the extracts combined.

In der nächsten Verfahrensstufe arbeitet man mit einem wäßrigen Extraktionslösungsmittel, nämlich einer aus einer wäßrigen Ammoniumhydroxydlösung mit einem Gehalt von etwa 5 Volumprozent Methanol bestehenden alkalischen Pufferlösung. Mit dieser methanolischen Pufferlösung werden die vereinigten Amylacetatextrakte extrahiert, wobei die Volumenmenge der Pufferlösung ein Fünftel des Volumens der Amvlacetatextrakte beträgt, und die Extraktion wird noch einmal mit der gleichen Volumenmenge des wäßrigen Extraktionsmittels wiederholt.In the next process step one works with an aqueous extraction solvent, namely one from an aqueous ammonium hydroxide solution with a content of about 5 percent by volume of methanol existing alkaline buffer solution. With this methanolic Buffer solution, the combined amyl acetate extracts are extracted, the volume amount the buffer solution is one fifth of the volume of the amvlacetate extracts, and the Extraction is done again with the same volume of aqueous extractant repeated.

Die Konzentration der Pufferlösung an Ammoniumhydroxyd wird so eingestellt, daß das pH des wäßrigen Extraktes nach der Extraktion der Amylacetatlösung nicht niedriger als etwa 9,5 ist.The ammonium hydroxide concentration of the buffer solution is adjusted so that that the pH of the aqueous extract after the extraction of the amyl acetate solution is not is lower than about 9.5.

Die vereinigten wäßrig-ammoniakalisch-methanolischen Extrakte werden in zwei Stufen mit Amylacetat extrahiert, wobei man in jeder Stufe eine Menge Amylacetat verwendet, die etwa ein Zehntel des Volumens der zu extrahierenden wäßrigen Lösung beträgt, während man das pH auf einen Wert von 6,5 einregelt. Die so erhaltenen Amylacetatextrakte werden vereinigt und ihrerseits einer zweistufigen Extraktion mit einer 30 Volumprozent Methanol enthaltenden wäßrigen Ammoniumhydroxydlösung unterworfen, wobei das pH während der Extraktion auf 9,5 gehalten wird. Das Volumen des in jeder Stufe dieses Extraktionsvorganges angewandten wäßrigen Extraktionsmittels beträgt ungefähr ein Fünftel des Volumens der vereinigten Amylacetatextrakte. Diese wäßrigen Extrakte enthalten etwa 50 mg Novobiocin j e ccm.The combined aqueous-ammoniacal-methanolic extracts are extracted with amyl acetate in two stages, with an amount of amyl acetate in each stage used, which is about one tenth of the volume of the aqueous solution to be extracted while adjusting the pH to a value of 6.5. The so obtained Amyl acetate extracts are combined and, in turn, subjected to a two-step extraction with an aqueous ammonium hydroxide solution containing 30 percent by volume of methanol subjected, keeping the pH at 9.5 during the extraction. The volume the aqueous extractant used in each stage of this extraction process is approximately one fifth the volume of the combined amylacetate extracts. These aqueous Extracts contain around 50 mg novobiocin per ccm.

Durch Zusatz von Methanol und Essigsäure zu den vereinigten wäßrigen Extrakten stellt man ein Gemisch her, welches Methanol, Wasser und Essigsäure im Volumenverhältnis von 10:4:1 enthält, wobei sich reines kristallines Novobiocin als Niederschlag abscheidet, welches gewonnen wird. Dieses Produkt ist mit demjenigen des Beispiels 1 identisch. Beispiel 3 Ein Novobiocin erzeugender Stamm von Streptomyces spheroides wird in einem geeigneten Nährmedium nach den vorhergehenden Beispielen gezüchtet, dann wird das PH der gesamten Fermentationsflüssigkeit auf 9,0 eingestellt, diese filtriert, das Filtrat mit Diatomeenerde als Filterhilfsmittel versetzt und die Mischung durch langsamen Zusatz einer Mineralsäure auf ein pH von 2,0 angesäuert und dann filtriert. Der Filterkuchen wird mit Wasser gewaschen, bei einem pI, von 9,0 mit 85o/oigem wäßrigem Methanol extrahiert und der Extrakt durch Abdampfen des Methanols eingeengt. Die so erhaltene wäßrig-alkalische Lösung wird mit einer Mineralsäure, wie Salzsäure, versetzt, bis ein pH von etwa 2,3 bis 2,6 erreicht ist. Hierdurch wird das Alkalisalz des Novobiocins zersetzt, und es fällt Novobiocin aus, welches durch Filtration gewonnen wird.By adding methanol and acetic acid to the combined aqueous Extracts are prepared a mixture, which methanol, water and acetic acid in Volume ratio of 10: 4: 1, with pure crystalline Novobiocin separates as a precipitate, which is obtained. This product is with one of example 1 identical. Example 3 A Novobiocin producing strain of Streptomyces spheroides is grown in a suitable nutrient medium according to the preceding examples cultured, then the pH of the total fermentation liquid is adjusted to 9.0, this is filtered, the filtrate is mixed with diatomaceous earth as a filter aid and the mixture was acidified to a pH of 2.0 by the slow addition of a mineral acid and then filtered. The filter cake is washed with water at a pI of 9.0 extracted with 85% aqueous methanol and the extract by evaporating the Concentrated methanol. The aqueous-alkaline solution obtained in this way is treated with a mineral acid, such as hydrochloric acid, added until a pH of about 2.3 to 2.6 is reached. Through this the alkali salt of novobiocin is decomposed, and it precipitates novobiocin, which is recovered by filtration.

Der Filterrückstand wird gewogen und in Methanol zu einer Lösung gelöst, die etwa 10 Gewichtsprozent Feststoffe enthält. Dann setzt man genügend Wasser und Essigsäure zu, damit das Volumenverhältnis von Methanol zu Wasser zu Essigsäure in der so erhaltenen Lösung ungefähr 10:4:1 beträgt. Das sich aus der Lösung ausscheidende kristalline Novobiocin wird durch Filtration gewonnen. Die Kristalle werden mit einer Mischung von 10 Raumteilen Methanol und 4 Raumteilen- Wasser gewaschen und dann im Vakuum bei einer Temperatur unterhalb 45° C getrocknet. Beispiel 4 Etwa 500 ccm einer Lösung von Novobiocin in Amylacetat mit einer Aktivität von 50 000 Novobiocin-Einheiten je ccm und einem Gehalt von 10 mg Novobiocin je ccm wird einem zweistufigen Extraktionsverfahren unterworfen, wobei in jeder Stufe 50 ccm einer 30 Volumprozent Methanol enthaltenden wäßrigen 1 n-Ammoniumhydroxydlösung angewandt werden. Die abgetrennten wäßrigen Extrakte werden vereinigt und unter Rühren mit 94 ccm Methanol und 14 ccm Eisessig versetzt. Nach etwa 10 bis 15 Minuten beginnt die Abscheidung von reinem kristallinem Nov obiocin aus der Lösung, worauf man die Kristallisation etwa weitere 12 Stunden fortschreiten läßt und die Lösung während dieser ganzen Zeitdauer in Bewegung hält. Die Kristalle werden aus der Lösung abfiltriert, zuerst mit 10 ccm wäßrigem Methanol (33:67 Volumprozent) und dann mit 10 ccm Diäthyläther gewaschen und getrocknet. Man erhält 4,5 g des kristallinen Produktes, welches einer Analyse zufolge eine Aktivität von 5000 Novobiocin-Einheiten je mg besitzt und in Lösung in 0,1 n-Natronlauge ein charakteristisches Absorptionsmaximum im Ultraviolett bei 3070 A aufweist, (E'11,. = 588).The filter residue is weighed and dissolved in methanol to form a solution, which contains about 10 weight percent solids. Then you put enough water and Acetic acid too, thus the volume ratio of methanol to water to acetic acid in the solution thus obtained is approximately 10: 4: 1. The one leaving the solution crystalline novobiocin is obtained by filtration. The crystals are made with a mixture of 10 parts by volume of methanol and 4 parts by volume of water and washed then dried in vacuo at a temperature below 45 ° C. Example 4 Approx 500 cc of a solution of novobiocin in amyl acetate with an activity of 50,000 Novobiocin units per ccm and a content of 10 mg Novobiocin per ccm is one subjected to two-stage extraction processes, with 50 ccm in each stage Aqueous 1N ammonium hydroxide solution containing 30 percent by volume of methanol is used will. The separated aqueous extracts are combined and with stirring 94 cc of methanol and 14 cc of glacial acetic acid were added. After about 10 to 15 minutes it starts the deposition of pure crystalline Nov obiocin from the solution, whereupon the Allow crystallization to proceed for about another 12 hours and dissolve during keeps moving all this time. The crystals are filtered off from the solution, first with 10 cc of aqueous methanol (33:67 percent by volume) and then with 10 cc of diethyl ether washed and dried. 4.5 g of the crystalline product are obtained, which one According to analysis, it has an activity of 5000 novobiocin units per mg and in Solution in 0.1 N sodium hydroxide solution has a characteristic absorption maximum in the ultraviolet at 3070 A, (E'11,. = 588).

Beispiel 5 124 g rohes, kristallines Novobiocin, erhalten durch Ausfällung des Antibiotikums aus seiner Lösung in Aceton mit Hilfe von Petroläther, werden in ungefähr 1350 ccm absolutem Äthanol gelöst, und 1300 ccm dieser Lösung werden unter Rühren mit 500 cem Wasser und 13 ccm Eisessig versetzt, worauf man das Gemisch über Nacht stehenläßt und dabei weiter in Bewegung hält. Das sich ausscheidende kristalline Produkt wird abfiltriert, mit 100 ccm 71volumprozentigen wäßrigen Methanols gewaschen und bei 45° C im Vakuum getrocknet. Die Menge des Produktes beträgt 108 g und die Aktivität 4040 Novobiocin-Einheiten je mg. Beispiel 6 50 ccm einer konzentrierten Lösung von NovoNocin in Aceton, deren Aktivität 2200 Novobiocin-Einheiten je mg Feststoffe und deren Gesamtaktivität 10 - 106 Novobiocin-Einheiten beträgt, wird mit 1 ccm Wasser und 50 ccm Petroläther versetzt. Es scheiden sich etwa 5 ccm eines Öles mit einer Aktivität von etwa 2 - 106 Novobiocin-Einheiten ab, und dieses Öl wird entfernt. Die abgetrennte Lösungsmittelschicht wird mit Petroläther versetzt, bis sich in der zunächst klaren Lösung eine ganz schwache Trübung bildet. Dann läßt man das Gemisch stehen, trennt die abgeschiedenen Kristalle des rohen Novobiocins ab, wäscht und trocknet sie. Dieses Material besitzt einer Analyse zufolge eine Aktivität von 2600 Einheiten je mg und wiegt 0,55 g. Ungefähr 0@,5 g dieses Rohproduktes werden in 5 ccm Äthanol gelöst, und die Lösung wird mit 2 ccm Wasser und einem Tropfen Eisessig versetzt und dann 17 Stunden der Kristallisation überlassen, wobei sie beständig in Bewegung gehalten wird. Die Kristalle werden abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Das so erhaltene Produkt besitzt eine Aktivität von 3680 Novobiocin-Einheiten je mg und wiegt 0,45 g. Beispiel 7 1 1 einer nach Beispiel 1 erhaltenen, filtrierten Fermentationsflüssigkeit, die einer mikrobiologischen Analyse zufolge 1190 Novobiocin-Einheiten an aktivem Material je ccm enthält, wird einer zweistufigen Extraktion bei einem pH von etwa 6,5 unterworfen, wobei man in jeder Stufe mit WO ccm Amylacetat arbeitet. Die Extrakte werden vereinigt und in zwei Stufen mit je 40 ccm einer nach Beispiel 1 hergestellten, 5 Volumprozent Methanol enthaltenden alkalischen wäßrigen Pufferlösung extrahiert. Die vereinigten wäßrigen Extrakte werden zur Abtreibung des Amylacetats eingeengt und dann mit wäßriger Salzsäure auf ein pH von 2,5 angesäuert, wodurch sich rohes Novobiocin abscheidet, welches abfiltriert wird. Der halbfeuchte Filterkuchen des Rohmaterials wird in 5 ccm Methanol gelöst und die Lösung mit 2 ccm Wasser, welche 0,5 ccm Eisessig enthalten, versetzt. Die Mischung wird ungefähr 17 Stunden in Bewegung gehalten, worauf man das abgeschiedene, reine, kristalline Novobiocin abtrennt, mit 70volumprozentigem wäßrigem Methanol wäscht und trocknet. Dieses Produkt besitzt eine Aktivität von 4800 Novobiocin-Einheiten je mg.Example 5 124 g of crude, crystalline novobiocin, obtained by precipitating the antibiotic from its solution in acetone with the aid of petroleum ether, are dissolved in approximately 1350 cc of absolute ethanol, and 500 cc of water and 13 cc of glacial acetic acid are added to 1300 cc of this solution while stirring , whereupon the mixture is left to stand overnight while continuing to move. The crystalline product which separates out is filtered off, washed with 100 cc of 71 percent by volume aqueous methanol and dried at 45 ° C. in vacuo. The amount of the product is 108 g and the activity 4040 novobiocin units per mg. Example 6 50 cc of a concentrated solution of NovoNocin in acetone, the activity of which is 2200 novobiocin units per mg of solids and the total activity of which is 10-106 novobiocin units, is mixed with 1 cc of water and 50 cc of petroleum ether. About 5 cc of an oil with an activity of about 2-106 novobiocin units separate and this oil is removed. Petroleum ether is added to the separated solvent layer until a very slight cloudiness forms in the initially clear solution. The mixture is then left to stand, the crystals of the crude novobiocin which have separated out are separated off, washed and dried. This material has been analyzed to have an activity of 2600 units per mg and weighs 0.55 g. Approximately 0.5 g of this crude product are dissolved in 5 cc of ethanol, and 2 cc of water and a drop of glacial acetic acid are added to the solution and then left to crystallize for 17 hours while being kept constantly in motion. The crystals are filtered off, washed and dried. The product obtained in this way has an activity of 3680 novobiocin units per mg and weighs 0.45 g. Example 7 1 1 of a filtered fermentation liquid obtained according to Example 1, which, according to a microbiological analysis, contains 1190 novobiocin units of active material per ccm, is subjected to a two-stage extraction at a pH of about 6.5, with WO cc amyl acetate works. The extracts are combined and extracted in two stages with 40 cc each of an alkaline aqueous buffer solution prepared according to Example 1 and containing 5 percent by volume of methanol. The combined aqueous extracts are concentrated to abort the amyl acetate and then acidified to a pH of 2.5 with aqueous hydrochloric acid, as a result of which crude novobiocin separates, which is filtered off. The semi-moist filter cake of the raw material is dissolved in 5 cc of methanol and the solution is mixed with 2 cc of water containing 0.5 cc of glacial acetic acid. The mixture is kept agitated for about 17 hours, after which the separated, pure, crystalline novobiocin is separated off, washed with 70% by volume aqueous methanol and dried. This product has an activity of 4800 novobiocin units per mg.

Beispiel 8 11 einer Lösung von Novobioein in Äthanol mit einer Aktivität von 1260 Novobiocin-Einheiten je mg Feststoffe wird mit 21 Wasser gemischt und die Mischung mit Salzsäure auf ein pH von etwa 2,0 angesäuert. Es scheidet sich rohes Novobiocin ab, welches nach Zusatz von 15 g Diatomeenerde als Filterhilfsmittel abfiltriert wird. Der Filterkuchen wird in wäßriger Ammoniumhydroxydlösung bei einem pA von etwa 10 aufgeschlämmt, und die Aufschlämmung wird filtriert, wobei man 600 ccm Filtrat erhält. Etwa 400 ccm dieses Filtrats werden in eine Kolonne eingeführt, die 150 ccm eines Ionenaustauschharzes (in Form seines Chlorides) enthält, das Harz wird mit 850%igem illethanol gewaschen und das Novobiocin mit einer Lösung von 85 Volumprozent Methanol und 16 Volumprozent konzentrierter Salzsäure eluiert. Das in diesem Eluat enthaltene rohe Novobiocin, welches eine Aktivität von 3700 Novobiocin-Einheiten je mg Feststoffe aufweist, wird durch Zusatz der doppelten Volumenmenge Wasser ausgefällt. Der Niederschlag wird abfiltriert, in Äthanol gelöst und an 20 g mit Säure gewaschener Tonerde chromatographiert. Die aus der Kolonne austretende Flüssigkeit, etwa 25 ccm, wird gesammelt, mit 0,5 ccm Eisessig und dann langsam mit Wasser versetzt. Es scheiden sich Kristalle von reinem Novobiocin ab, die durch Filtrieren gewonnen werden. Beispiel 9 Das Verfahren des Beispiels 7 wird mit der Abänderung ausgeführt, daß das Methanol durch Isopropanol ersetzt wird. Das Produkt ist mit demjenigen des Beispiels 4 identisch. Beispiel 10 Das Verfahren des Beispiels 3 wird mit der Abänderung ausgeführt, daß das Methanol durch n-Propanol ersetzt wird. Das Produkt ist mit demjenigen des Beispiels 3 identisch. Beispiel 11 Das Verfahren des Beispiels 7 wird mit der Abänderung ausgeführt, daß das Methanol durch tert. Butanol ersetzt wird. Das Produkt ist mit demjenigen des Beispiels 4 identisch. Beispiel 12 Das Verfahren des Beispiels 3 wird mit der Abänänderung ausgeführt, daß das Methanol durch Äthanol ersetzt wird. Das Produkt ist mit demjenigen des Beispiels 3 identisch. Beispiel 13 Das Verfahren des Beispiels 1 wird mit der Abänderung ausgeführt, daß die in der Endstufe der Kristallisation des reinen Produktes angewandte Essigsäure durch eine stöchiometrisch äquivalente Menge Citronensäure ersetzt wird. Das so erhaltene Produkt ist mit demjenigen des Beispiels 1 identisch. Beispiel 14 Das Verfahren des Beispiels l wird im Sinne des Beispiels 13, jedoch unter Verwendung von Propionsäure an Stelle der Essigsäure, abgeändert. Das Ergebnis ist das gleiche. Beispiel 1.5 Das Verfahren des Beispiels l wird im Sinne des Beispiels 13, jedoch unter Verwendung von Buttersäure an Stelle der Essigsäure, abgeändert. Das Ergebnis ist das gleiche.Example 8 11 of a solution of novobioein in ethanol with activity of 1260 Novobiocin units per mg of solids is mixed with 21 water and the Mixture acidified with hydrochloric acid to a pH of about 2.0. It part raw Novobiocin, which after adding 15 g of diatomaceous earth as a filter aid is filtered off. The filter cake is in aqueous ammonium hydroxide solution at a pA of about 10, and the slurry is filtered to obtain 600 cc of filtrate is obtained. About 400 cc of this filtrate are introduced into a column, which contains 150 cc of an ion exchange resin (in the form of its chloride), the resin is washed with 850% illethanol and the novobiocin with a solution of 85 Eluted percent by volume methanol and 16 percent by volume concentrated hydrochloric acid. That in this eluate contained crude novobiocin, which has an activity of 3700 novobiocin units per mg of solids is precipitated by adding twice the volume of water. The precipitate is filtered off, dissolved in ethanol and washed on 20 g with acid Chromatographed clay. The liquid emerging from the column, about 25 ccm, is collected, with 0.5 ccm of glacial acetic acid and then slowly with water. Crystals of pure novobiocin separate, which are obtained by filtration will. Example 9 The procedure of Example 7 is followed with the modification that that the methanol is replaced by isopropanol. The product is with the one of example 4 identical. Example 10 The procedure of Example 3 is followed by the Modification carried out that the methanol is replaced by n-propanol. The product is identical to that of Example 3. Example 11 The procedure of the example 7 is carried out with the modification that the methanol by tert. Butanol replaced will. The product is identical to that of Example 4. Example 12 That The procedure of Example 3 is followed except that the methanol is replaced by ethanol. The product is identical to that of Example 3. Example 13 The procedure of Example 1 is followed except that the acetic acid used in the final stage of crystallization of the pure product is replaced by a stoichiometrically equivalent amount of citric acid. That so The product obtained is identical to that of Example 1. Example 14 That The method of Example 1 is carried out in the same way as in Example 13, but using modified by propionic acid instead of acetic acid. The result is the same. Example 1.5 The procedure of Example 1 is carried out in accordance with Example 13, however using butyric acid instead of acetic acid. The result is the same.

Beispiel 16 Das Verfahren des Beispiels l wird im Sinne des Beispiels 13, jedoch unter Verwendung von Ameisensäure an Stelle der Essigsäure, abgeändert. Das Ergebnis ist das gleiche.Example 16 The procedure of Example 1 is followed by the example 13, but using formic acid instead of acetic acid. The result is the same.

Beispiel 17 Das Verfahren des Beispiels l wird im Sinne des Beispiels 13, jedoch unter Verwendung von Isobuttersäure an Stelle der Essigsäure, abgeändert. Das Ergebnis ist das gleiche.Example 17 The procedure of Example 1 is followed by the example 13, but using isobutyric acid instead of acetic acid. The result is the same.

Claims

PATEN TA \ si'RCCETE: 1. Process for obtaining practically pure, crystalline novobiocin from concentrated solutions of substances with novobiocin activity, characterized in that the solution is treated with a water-soluble aliphatic carboxylic acid in an aqueous-alcoholic medium, the alcohol used is completely miscible with water in any quantity, and wins the practically pure, crystalline Novobiocin.

2. The method according to claim 1, characterized in that that the aliphatic carboxylic acid is one with a maximum of 6 carbon atoms and at least one carboxyl group per molecule that is water soluble and a dissociation constant in the range from 10-3 to 1 ", in particular acetic acid, formic acid, propionic acid, Butyric acid, isobutyric acid, citric acid are used.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the alcohol is a monohydric aliphatic Alcohol with a maximum of 4 carbon atoms in the 'molecule, in any proportion with Water is completely miscible, in particular ethanol, propanol, isopropanol, Butanol used.