DE884367C - Verfahren zur Herstellung von Lactoflavin-monophosphorsaeureestern - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung von Lactoflavin-monophosphorsäureestern Die Erfindung betrifft ein neuartiges Verfahren zur Herstellung von Lactoflav in-monophos.phorsäureestern und zur Isolierung des Lactoflavin-5'-monophosphorsäureesters aus den Mischungen ,desselben mit anderen isomeren Lactoflavin-monophospliorsäureestern.
• Das Verfahren gemäß der Erfindung -ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Vorläufer des Lactoflavins, wie beispielsweise Dihydrolactoflavin, i-D-i'-Ribitylamino-3, 4-dimethyl-benzol oder i-D-i'-Ribitylamino-6-arylazo-3, 4-dimethyl-benzol, oder, im Falle der Phosphorylnerung mit Chlorphosphorsäureall:ylestern, auch Lactoflavin selbst mittels einer Chlorphosphorsäure, einem Chlorpbosphorsäure-all"ylester oder einer Mischung derselben phosphoryliert, das Reaktionsprodukt zum phosphorylierten Lactoflavin bzw. zum phosphorylierten Lactoflavin-Vorläufer hy drolysiert, letzterer auf üblichem Weg-, in .das phosp'horylierte Lactoflavin umgewandelt, die erhaltene Mischung der Isomeren des Lactoflavin-tnonophosphorsäureesters gegebenenfalls mit Diäthanolamin oder Morpholin umgesetzt, das 5'-Isomere aus der Mischung der gebildeten Salze isoliert und gegebenenfalls in den freien Lactoflav in-5'-monophosphorsäureester übergeführt wird.
• Der Ausdruck Chlorphosphorsäure, wie er hier gebraucht wird, bezeichnet zwei Verbindungen, d.h. Monochlorphosp'horsäure und Dichlorp'hosphorsäure, deren Formeln die folgenden sind: (H O)2 P O Cl und H O P O C12. Die Bildung dieser zwei Verbindungen erfolgt durch Umsetzung zwischen Phosphoroxychlorid und Wasser oder zwischen Phosphoroxychlorid und Phosphorsäure.
• Der Ausdruck Chlorphosphorsäurealkylester bezeichnet einen Dichlorp'hosphorsäure-monoalkylester oder einen Monochlorp'hosphorsäure-dialkylester. Die Bildung dieser zwei Verbindungen erfolgt durch Umsetzung von Phospboroxychlorid mit i bis 2 Molekülen eines Alkanols, wie beispielsweise Methanol oder Äthanol. Wenn i Mol Alkanol! mit dem Phosphoroxychlorid zur Reaktion gebracht wird, erhält man den Dichlorphosphorsäure-monoalkylester. Wenn 2 Mol des Alkanols zur Verwendung gelangen, erhält man den Monochlorphosphorsäure-dial'kylester. Diese- Verbindungen brauchen nicht aus dem Reaktionsgemisch isoliert zu werden, denn zur Phosphorylierung kann man einfach das Lactoflavin zusetzen.
• Die Chlorphosphorsäuren werden leicht durch Umsetzen von P'hosphoroxychlorid mit i bis 2 Mol Wasser gewonnen. Die Reaktion nimmt folgenden Verlauf

  POC13 + H20 -> HOPOCI2 -f- HCI

  P O C13 + 2 11,0 -> (H 0) 2 P 0 Cl -f- a H Cl

  Die zwei Ver(bin@dwnbgen, bilden sich auch bei der Umsetzung von Phosphoroxychlorid mit ortho-P'hosphorsäure. Beispielsweise kann ein geeignetes Chlorphosphorsäurereagens durch langsamen Zusatz von 61,3 g (0,4 MOI) Phosphoroxychlori.d zu 19,6 g (o,z Mol) wasserfreier ortho Phosphorsäure, wobei gerührt und auf Raumtemperatur gekühlt werden muß, erhalten werden. Die Reaktionsmischung wird während etwa i Stunde gerührt. Um eine möglichst hohe Ausbeute an Chlorphosphorsäure zu gewinnen, läßt man das Produkt über Nacht stehen. Die Wartezeit ist jedoch nicht unerläßlich, denn die Chlorphosphorsäure bildet sieh leicht und in guter Ausbeute, sobald Phosphoroxychlorid mit Wasser oder Phosphorsäure reagiert. Es versteht sieh, daß die Phosphorsäure auch wässerig sein kann, in welchem Falle beide Reaktionen zur Bildung der Chlorphosphorsäure beitragen, d. 'h. eine Reaktion zwischen dem Phosphoroxychlorid und Wasser und eine Reaktion zwischen dem Phosphoroxychlorid und der orfho-Phosp'horsäure. Die Chlorphosphorsäure kann selbstverständlich auch in Gegenwart des zu phosphorylierenden Körpers gebildet werden, wobei sie dann sofort mit letzterem reagiert.
• Die Produkte der Phosphorylierunig mit der ChIorplhosp'horsäure bestehen aus. mono-(chlorphosphorsauren) Salzen der Phosphorsäureester und Chlorphosphorsäureester von i-D-i'-Ribitylamino-3, 4-dimethyl-benzol und i-D-i'-Ribitylamino-6-arylazo-3, 4-dimethyl Benzol, aus mono-(chlorphosphorsauren) Salzen und mono- (dichlorphosphorsauren) Salzen der Dihydrolactoflavinester mit Phosphorsäure, aus Polyphosphorsäuren, chlorenthaltender Phosphorsäure und chlorenthaltenden Polyphosphorsäuren. Cyclische Phosphorsäureester der Zwischenprodukte können auch gebildet werden. Der Grad der Phosphorylierung ist abhängig von der Zeitdauer, während der die Ausgangsverbindungen mit der Chlorphosphorsäure reagieren können. Die hier angegebenen Reaktionen stellen eine Synthese mithypotbetischenZwischenproduktsstrukturen dar. Obwohl das Vorangehende und das nachstehende Reaktionsschema auf -dem gründen, was als der wahrscheinlichste Reaktionsverlauf angesehen wird, versteht es sich, daß die Erfindung keinesfalls auf irgendeine Reaktionstheorie oder Zwischenproduktsstruktur beschränkt ist.
• Im Falle .der Dichlorphosphorsäure kann die Reaktion wie folgt formuliert werden: Das obige monochlorphosphorylierte Produkt kann weiterchlorphosphoryliert werden, je nach Reaktionszeit wie folgt: und/oder Die Verbindungen (b) und (c) können weiterphosphoryliert werden.
• Im Falle der Monochlorphosphorsäure sind die entsprechenden Reaktionen die folgenden: Nach weiterer Behandlung mit Monochlorphosphorsäure ergibt sich folgendes: Die Verbindung (e) kann weiterphosphoryliert werden.
• In den obigen Formeln bedeutet R O H Dihydrolactoflavin, i-D-i' Ri@bitylamino-3,4-dimefhyl-benzol oder i-D-i'-Ribitylamino-6-arylazo-3, 4-dimethylbenzol.
• Die Hydrolyse .der Zwischenprodukte der Reaktion mit den Chlorphosphorsäuren bewirkt je nachdem zuerst die Abspaltung der salzbildenden H O P O Cl.., oder (H 0)2P O C1, gefolgt von der Freisetzung des Monophosp'horsäureesters,welcher entsprechend als R0 P 0 (O H.) bezeichnet werden kann. Der P'hosp'horylierungsgrad ist belanglos, da das Endprodukt der Hydrolyse in jedem Falle der Monophosphorsäureester des Zwischenproduktes ist. Das Hauptprodukt ist ein 5'-Ester, doch besteht eine kleine Menge aus den anderen Isomeren, d. h. den 2'-, 3'- und 4'-Isomeren.
• Obwohl die vorgenanntenEstersalzederZwischenprodükte isoliert werden können, um sie zu reinigen oder um daraus deren Derlivate herzustellen, z. B. durch Umsetzung mit Ammoniak, ist es nicht erforderlich, diese Isolierung vorzunehmen, wenn inan dies.lben in Lactoflavin-nionophosphorsäureester umwandeln will. Im letzten Falle wird die nach Phosphorvlierung der Zwischenprodukte erhaltene Reaktionsmischung einfach in mehrere Volumen Wasser gegossen und für einige Stunden stehengelassen.Während dieser Zeit hy drolysieren die restlichen, nicht umgesetzten Chlorphosphorsäuren vollständig zu Phosphorsäure und Salzsäure, und die Zwiscbenestersalze erleiden ebenfalls eine I3vclrolyse, welche zu den Monophosp!horsäureestern der Zwischenprodukte führt. Die letzteren können dann leicht in Lactoflavin-monophospborsäure übergeführt werden. So kann der durch Hydrolyse, während der er sich in Lösung befindet, erhaltene Dilivdrolactoflavin - monophosphorsäureester, beispielsweise mit Wasserstoffperoxyd, zum stabilen Lactoflavin-monophosp'horsäureester oxydiert werden. Die Monophosphorsäureester des i-D-i'-Ribitylainino-6-arylazo-3, q.-dimethyl-benzol, die ,durch Hydrolyse erhalten werden, können mit Barbitursäure zum Lactoflav in - monopliosphorsäureester kondensiert werden; oder sie können zum Monophosphorsäureester des i-D-i'-Riliitvlaminofi-amino-3, 4-dimethyl-benzol reduziert «-erden, «-elch letzteres durch Kondensation mit Alloxan, Alloxantin oder deren Mischungen den Lactoflavinmonophosphorsäureester liefert. Der Monophosphorsäureester von i-D-i'-Ribityla,mino-3, 4.-dimethyl-benzol kann leicht mit Aryldiazoniumsalzen zu den Monopliosphorsäureestern des i-D-i'-Ribitylainino-6-arylazo-3, 4-dimethyl-benzols, welches seinerseits, wie oben besschrieben, in Lactoflavininonophosphorsäureester überführbar ist, gekuppelt «-erden.
• Wenn man bei der Phosphory lierung des Lactoflavins mit einem Chlorpbosphorsäurealkylester einen Dichlorphosphorsäure-monoalkylester verwendet, so bildet sich anscheinend zuerst das Hydrochlorid eines Zwischenesters, nämlich das Hydrochlorid des Lactoflavvlchlorphosphorsäure-monoalkvIesters, das nach milder Hydrolyse den entsprechenden Lactoflavylphosphorsäure-monoalkylester liefert. Wenn bei derselben Reaktion ein Monochlorphosphorsäure - dialkylester verwendet wird, .entsteht vermutlich zuerst das Hydrochlorid eines Zwischenesters, nämlich das Hydrochlorid des L actoflavvlphospliorsäure-dialkylesters, das bei der milden Hydrolyse den entsprechenden Lactoflavylliliospliorsäure-diall;ylest-er liefert. Die obigen Ausführungen gründen auf das, was als der wahrscheinlichste -'erlauf der Reaktionen mit dem Clilorphosphorsäuremono- und -diallzylester anwird, wobei es sich versteht, das keine Einschränkung der Erfindung auf irgendeine spezifische Meaktionstlierorie erfolgen soll.
• Die Lactoflavylphospliorsäureinono- und -dialkylesterkönnen weiter zum Lactoflav in-monophosphorsäureester 'livdroly siert werden. So gibt der Lactoflavylpliospliorsäure - monoalkylester mit i Mol Wasser den entsprechenden Alkanol und Lactoflavin-monopliosphorsäureester. Im Falle der Lactoflav_vlpliospliorsäure-diallcylester sind 2 Mol Wasser zur Hydrolyse erforderlich. Die Hydrolyse wird mit Vorteil in Gegenwart einer Mineralsäure, z. B. Salzsäure, durchgeführt. Gelindes Erwärmen erleichtert die Reaktion.
• Da die vollständige Hydrolyse zum Lactoflavinmonophosphorsäureester direkt mit der Reaktionsmischung .zwischen Lactoflavin und den C'hlorpliospborsäureallcylestern erfolgen kann, ist es nicht nötig, die Hydrochloride der intermediären Ester oder die Lactoflavylphospliorsäure-mono- oder dialkylester aus der Reaktionsmischung zu isolieren. In diesem Falle ist die Reaktionsmischung sauer genug, so daß weitere Säure nicht zugesetzt werden muß, um die Hydrolyse zu erleichtern; der Zusatz von Wasser allein genügt.
• Wie oben hervorgehoben, entstehen neben dem Hauptprodukt, nämlich dem Lactoflavin-5'-monopbosphorsäureester, eine kleine Menge der Lactoflavin-2'-, 3'- oder .4'-monophospborsäureester. Von diesen Isomeren des f,actoflavin-inonophosphorsäureesters ist allein der 5'-Isomere biologisch voll wirksam. Es ist daher wünschenswert, diese Substanz in reiner Form, frei von den anderen Isomeren, zu gewinnen. Die Eigenschaften der verschiedenen Isomeren sind allerdings so weitgehend ähnlich, daß die Abtrennung des 5'-Isomeren von den anderen sehr schwierig ist.
• Es ist nun unerwarteterweise festgestellt worden, daß die Diäthanolamin- und Morpbolinsalze des Lactoflavin-5'-monophospliorsäureesters in ihren Löslichkeitseigenschaften so weit verschieden sind von den entsprechenden Salzen der anderen Isomeren, daß die Abtrennung des gewünschten 5'-Isomeren in reiner Form leicht erfolgt. Diese neuen Diäthanolamin- und -lorp'liolinsalze des Lactoflavin-5'-monophospliorsäureesters sind auch an sich physiologisch wertvolle Verbindungen, denn sie enthalten das biologisch aktive 5'-Isomere in einer leichtlöslichen, nicht toxischen Form, die sich für therapeutische Verwendung eignet. Wenn gewünsc'lit,können diese Salze mühelos in den freien ,'-'-lonophosphorsäureester durch einfaches Ansäuern ihrer wässerigen Lösung, z. B. mit einer Mineralsäure, umgewandelt werden, wobei der 5'-Ester in reiner Form kristallisiert.
• Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt also auch die Isolierung des Lactoflavin-5'-inonop,hosphorsäureesters aus den Mischungen desselben mit anderen Isomeren des Lactoflavinmonophospliorsäureesters sowie die Herstellung der neuen Diäthanolamin- und Morpholinsalze des Lactoflavin - monopliosphorsäureesters. Die den Lactoflavin-j'-monop'hosphorsäureester und die andern Isomeren enthaltende Mischung wird einfach mit Diäthanolamin oder lIorpholin umgesetzt, wobei sich eine -Mischung der entsprechendenAminsal.ze der Isomeren des Lactoflav in-monophospliorsäureesters bildet. Die Aminsalze des Lactoflavin-5'-monophosphorsäureesters «erden sodann von der Mischung abgetrennt, beispielsweise durch frah tionierte Kristallisation. Letztere kann so durchgeführt werden, daß ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel, wie Äthanol, Isopropanol oder Aceton, einer wässerigen Lösung der Mischung der Aminsalze der Isomeren zugesetzt wird. Die entsprechenden Aminsalze,der anderen Isomeren bleiben in der Mutterlauge in Lösung. Die Diäthanolamin-und t\/Iorpholinsalze des Lactoflavin - 5' - monophosphorsäureesters werden leicht durch Behandlung mit einer geeigneten Säure in den freien Lactoflavin-5'-monophosphorsäureester umgewandelt.
• Während der Umsetzung der Mischung der Isomeren des Lactoflavin-monophosphorsäureesters mit den vorgenannten Aminen bilden sich entweder die Mono- oder die Diaminsalze oder Mischungen derselben, je nach der Menge des verwendeten Amins. Bei der Titration mit Diäthanolamin oder Morpholin zeigt die potentiometrische Titrationskurve des Lactoflavin - monophosphorsäureesters einen scharfen Knick bei ungefähr pH 4 in dem Augenblick, wo i Mol des Amins pro Mol des Lactoflavin-monophosphorsäureesters addiert worden ist. Wenn ein weiteres Mol Amin zugesetzt wird, steigt das pH langsam auf etwa 7, wo ein kaum wahrnehmbarer Knick in der Kurve zeigt, daß das zweite Mol Amin in dem Disalz nur sehr schwach gebunden ist. Beim Zusatz eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, z. B. Äthanol, Isopropanol oder Aceton, zur wässerigen Lösung der Aminsalze fällt ein Salz aus, das je nach dem pH, an dem die Ausfällung erfolgt, aus .dem Monoode, Diaminsalz oder einer Mischung derselben besteht. Bei einem PH von etwa 4 ist das ausgefällte Salz praktisch ausschließlich ein Monoaminsalz, während bei einem pH von mindestens etwa 9 das ausgefällte Salz zur Hauptsache ein Diaminsalz ist. Bei dazwischenliegenden pH-Werten werden Mischungen der Mono- und Diaminsalze erhalten, wobei allerdings bei PH 7 zur Hauptsache das Monoaminsalz gewonnen wird. Unabhängig davon, ob das Mono- oder das Diaminsalz oder Mischungen derselben erhalten werden, erlaubt die fraktionierte Kristallisation die Abtrennung des entsprechenden Aminsalzes des gewünschten 5'-Isomeren,des Lactoflavin-monophosphorsäureesters. Infolge ihrer Stabilität werden indessen die Monoaminsalze bevorzugt.
• Gemäß einer empfehlenswerten Ausführungsform des Isolierungsverfahrens für das 5'-Isomere wird eine wässerige Lösung, die sowohl den Lactoflavin-5'-monophosphorsäureester wie auch die anderen Isomeren enthält, auf -ein pH von mindestens etwa 4, mit Vorteil innerhalb eines pH-Intervalls vonetwa 4 bis i o, mittels Diäthanolamin oder Morpholin gebracht, worauf die Lösung mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, z. B. Äthanol, Isopropanol oder Aceton, fraktioniert kristallisiert wird, um die entsprechenden Salze .des Lactoflavin - 5' - monophosp'horsäureesters zu gewinnen; wie oben hervorgehoben, werden entweder die Mono- oder Diaminsalze oder Mischungen derselben erhalten, je nach dem verwendeten pH. Wenn gewünscht, können die Aminsalze der Mischung der Isomeren des Lactoflavin-monop'hosphorsäureesters nach Einstellung des pH durch Eindampfen der Lösung im Vakuum vor der Fraktionierungsstufe hergestellt werden. Es versteht sich, daß das Verfahren zur Isolierung des Lactoflavin-5'-monophosphorsäureesters und der Diäthanolamin- und Morpholinsalze .desselben auf jede Mischung des 5'-Isomeren mit anderen Isomeren anwendbar ist, ohne Rücksicht auf den Ursprung dieser Mischung. Auch versteht es sich, daß der Ausdruck Diäthanolamin- und Morpholinsalze auch .die Hydratformen dieser Salze umfaßt. Beispiel i Zu 61,3 g (0,4 Mol) Phosphoroxychlorid werden langsam unter gutem Schütteln und Kühlen auf Zimmertemperatur 7,2 g (0,4 Mol) Wasser zugegeben. Die Mischung wird gerührt, bis die Entwicklung von Chlorwasserstoff beendet ist, und während ungefähr 16 Stunden stehengelassen. Dann werden 3,78 g Dihydrolactoflavin unter Rühren zugesetzt. Letzteres löst sich nach kurzer Zeit auf unter Entwicklung von Chlorwasserstoff. Die Lösung wird während 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und hernach in 6oo ccm Wasser gegossen. Der so erhaltenen Lösung von Dihydrolactoflavin-monophosphorsäureester wird so viel Wasserstoffperoxyd zugegeben, daß Oxydation eintritt, was ersichtlich ist am Farbwechsel auf typisch gelb und am Erscheinen der typischen Fluoreszenz des Lactoflavin - monophosphorsäureesters. Nach Stehen kristallisiert der Lactoflavin-monophosphorsäureester aus. Die Verbindung schmilzt bei ungefähr z95° C. Deren Analyse stimmt auf die Formel C17H1eN40sP 03H2. Die optische Drehung einer 2o/oigen Lösung in konzentrierter Salzsäure ist [a] 20 = -I- 44,5°. Bei potentiometrischer Titration mit Natriumhydroxyd zeigt die Titrationskurve nach Zugabe von einem genauen Äquivalent Alkali bei PH 4,5 einen deutlichen Knick. Einen zweiten Knick bei PH 8,5 zeigt die Kurve nach Zugabe eines zweiten Äquivalents Alkali.
• Beispiel e 7,2 g (0,4 M01) Wasser werden langsam unter gutem Schütteln und unter Kühlen auf Zimmertemperatur mit 61,3 g (0,4 Mol) Phosphoroxychlori.d langsam versetzt. Die Mischung wird gerührt, bis die Entwicklung von Chlorwasserstoff beendet ist, und während ungefähr 16 Stunden stehengelassen. Dann werden unter Rühren 5,1 g (o,o2 Mol) i-D-i'-Ribitylamino-3, 4-dimethylbenzol (Ribitylxylidin) zugegeben. Letzteres löst sich unter Entwicklung von Chlorwasserstoff auf. Die Lösung wird während 6 Stunden bei Zimmertemperatur geschüttelt. Unter Kühlen werden 5oo ccm wasserfreier Äther zugefügt. Ein Öl scheidet sich ab. Nach Verrühren mit frischem Äther wird es fest. Diese Substanz wird mit 25o ccm Wasser gekocht, um Hydrolyse zum beständigen Monophosphorsäureester zu. bewirken. Die dadurch erhaltene wässerig,,- Lösung wird im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt, dann werden mehrere Teile Aceton zugegeben. Der Monophospborsäureester des i-D-i'-Ribitylamino-3, 4-dim-ethyl-benzols scheidet sich als ölige Masse ab, die beim Stehen hart wird. Sie wird abfiltriert, mit Aceton und Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Verbindung ist sehr hygroskopisch und im Gegensatz zum Ribitylxyli.din selbst bei Zimmertemperatur sehr wasserlöslich. Bei der potentiometrischen Titration mit Natriumhydroxyd zeigt sie nach dem Zusatz von 2 Äquivalenten Alkali einen Knick bei ungefähr pH 9.
• Wird für die Herstellung des Lactoflavin-monophosphorsäureesters der Monophosphorsäureester des Ribitylxylidins verwendet, so ist es nicht notwendig, die Verbindung in fester Form zu isolieren. DurchWiederholen des Phosphorylierungspro,zesses und Zugeben der P'hosphorylierungsreaktionslösung in mehrere Volumen Wasser an Stelle von Äther und Neutralisieren der erhaltenen Lösung auf ungefähr PH 3 mit Ätznatron erhält man eine wässerige Lösung der Verbindung, die sich zur Umwandlung in den Lactoflavin-monophospliorsäureester eignet.
• Beispiel 3 Der wässerigen Lösung des Monophosphorsäureesters des erhaltenen Ribitylxylidins, wie im letzten Abschnitt von Beispiele beschrieben, wird eine gleichwertige Menge Benzoldiazoniumchloridlösung, die durch Diazotieren von Anilin mittels Natriumnitrits inGegenwartvonSalzsäurehergestelltwurde, zugegeben. Die Temperatur wird zwischen io und 20° C gehalten. In ungefähr 5 Minuten scheiden sich rote Kristalle von Monophosphorsäureester des i - D - i' - Ribitylamino -3, 4- dimethyl -6 -phenylazobenzols ab. Durch gelegentlichen Zusatz von Natriumacetat wird das pH während ungefähr 6 Stunden auf ungefähr 3 gehalten. Die roten Kristalle werden abfiltriert und mit gesättigter N atriumchlori.dlösung gewaschen, bis sie von anorganischen Phosphaten befreit sind; hernach werden sie mit Luft getrocknet. Diese ;Mischung von Natriumchlorid und von Monophosphorsäureester des i - D - i' - Ribitylamino - 3, 4 - dimethyl-6-ph-enylazo-benzols ist ohne weitere Reinigung .zur Umwandlung in den Monophosphorsäureester des Lactoflavins zu gebrauchen. Der reine Monophosphorsäureester des i-D-i'-Ribitylamino-3, 4-dimefhyl-6-phenylazo-benzols wird durch Extraktion der Mischung mit Butylal'kohol, Einengen auf ein kleines Volumen und Fällen mit Äther erhalten. Bei der potentiometrischen Titration mit Natriumhydroxyd zeigt dieTitrationskurve des so erhaltenen Produktes einen scharfen Knick bei ungefähr PH g, d. h. nach Zugabe von 2 Mol Alkali.
• Beispiel 4 ' 14,4g (0,8 110l) Wasser werden langsam unter starkem Schütteln und Kühlen auf Raumtemperatur zu 122,6g (o,8 Mol) P'hosphoroxychlorid zugegeben. Die Mischung wird gerührt, bis die Entwicklung von Chlorwasserstoff beendet ist, und über Nacht stehengelassen. Unter Rühren werden hernach 7,18 g (0,8 Mol) i-D-i'-Ribitylamino-3, 4-dimethyl-6-phenylazo-henzol zugefügt. Letzteres löst sich unter Entwicklung von Chlorwasserstoff auf. Die Lösung wird während 6 Stunden bei Zimmertemperatur geschüttelt. Sie wird .dann langsam in 300 ccm Wasser gegossen. Die Temperatur steigt auf 8o bis 85° C und bewirkt dabei die Hydrolyse zum beständigen Monophosphorsäureester des i-D-i'-Ribitylamino-3, 4-dimethyl-6-phenylazobenzols. Die Lösung wird gekühlt und auf pH 2,5 durch vorsichtige Zugabe von Natriumhydroxyd eingestellt. Der Monophosphorsäureester des i -D-i'-Ribitylamino-3, 4--dimethyl-6-phenylazobenzols kristallisiert aus. Er wird abfiltriert und mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, bis er frei von anorganischen Phosphaten ist; dann wird er an der Luft getrocknet. Im Gegensatz zur verwandten unphosphorylierten Verbindung ist der Monophosphorsäureester äußerst löslich.
• Ein reines Bariumsalz wird durch Suspension der Natriumchlorid-i-D-i'-ribitylamino-3, 4-dim.ethyl - 6 - phenylazo - benzol - monophosphorsäureester-Mischung in Wasser, Einstellen des pH mit Natriumhydroxyd auf g, um die Auflösung zu bewirken, und Zugabe von Bariumchloridlösung erhalten. Das abgeschiedene unlösliche Bariumsalz des Monophosphorsäureesters wird abfiltriert, mit Wasser chloridfrei, dann mit Alkohol und Äther gewaschen und getrocknet. Die Substanz enthält 5,53% Phosphor.
• Be.ispiel5 3 g Bariumsalz des Monophosphorsäureesters des i -D - i'-Ribitylamino - 3, 4--dimethyl-6-phenylazobenzols., erhalten wie im letzten Abschnitt des Beispiels 4 beschrieben, werden in 50 ccm Wasser suspendiert. 5 ccm n-Schwefelsäure werden zugegeben, um den Ester .zu befreien. i g Palladiumkohlekatalysator wird zugesetzt und die Mischung bei 70° C unter einem Druck von 35 Atm. während Stunden hydriert. Der Katalysator und das Bariumsulfat werden a.bfiltriert. Die erhaltene Lösung ist nun praktisch farblos, was die vollständige Reduktion des Monophosphorsäureesters von i-D-i'-Ribitylamino-3, 4-dimethyl-6-phenylazobenzol anzeigt. Die Lösung wird mit Natriumhydroxy d alkalisch gemacht und das gebildete Wasser und Anilin im Vakuum abdestilliert. Nach Zusatz von Alkohol zum Rückstand scheidet sich das Natriumsalz des Monophosphorsäureesters von i -D- i'-Ribitylamino-3, 4-dimethyl-6-amino-benzol aus.
• Beispiel 6 Die Suspension in Alkohol des Natriumsalzes des Monophosphorsäureesters des i-D-i'-Ribitylamino-3, 4-dim,ethyl-6-amino-benzols, erhalten nach Beispie15, wird mit konzentrierter Salzsäure angesäuert und unter Rückfluß erhitzt. 2 g Alloxantin werden ,zugegeben und die Mischung unter Rückfluß und Rühren während 5 Stunden gekocht. Es entsteht die typische gelbe Farbe und Fluoreszenz des Lactoflavin-monophosphorsäureesters. Die Lösung wird gekühlt, mit Wasser versetzt und nicht umgesetztes Alloxantin durch Filtration entfernt. Der Ester wird auf Fullererde adsorbiert und gut mit Wasser gewaschen. Er wird mit Natriumhydroxyd eluiert, wobei eine von anorganischen Phosphaten völlig freie Lösung des Natriumsalzes von Lactoflavin-monophosphorsäureester entsteht. An Stelle von Alloxantin kann in der Reaktion auch Alloxan oder eine Mischung von Alloxan und Alloxantin verwendet werden.
• Beispiel Eine Lösung von o;oi Mol Mononatriumsalz des Monophosphorsäureesters des r-D-z'-Ribitylam.ino-3, 4-dimefihyl-6-phenylazo=benzols in 94ccm Wasser wird durch Zusatz von o,oi Mol Natriumhydroxyd zu einer wässerigen Suspension von o,oi Mol der freien Es ternatriumchloridmischung, erhalten nach Beispiel 4, bereitet. Dieser Lösung werden 3o g Natriumchlorid zugegeben. Das bewirkt die Abscheidung des Mononatriumsalzes des Monophosphorsäureesters des i-D-i'-Ribitylamino-3, 4-dimethyl-6-phenylazo-benzols, das abfiltriert, mit gesättigter Natriumchl-oridlösung gewaschen und an der Luft getrocknet wird. Das trockene Produkt wird mit 3 g Barbitursäure in einer Mischung von 62 ccm Dioxan und 12 ccm Eisessig während 61/2 Stunden unter RückfluB ,zum Sieden erhitzt. Die Reaktionsmischung wird gekühlt und von nicht umgesetzten Materialien abfiltriert. Das Filtrat zeigt die typische Fluoreszenz des Lactoflavinmonoph-osp'h.orsäureesters. Die Substanz wird durch Zusatz von Bariumchloridlösung und Filtration des erzielten Niederschlages .des schwerlöslichen Bariumsalzes des Lactoflavin-monophosphorsäureesters isoliert.
• Beispiel 8 16,2 ccm Methanol (0,4 Mol) werden langsam unter Rühren und Kühlen auf Raumtemperatur in 36,6 ccm Phosphoroxychlorid (0,4 Mol) gegossen. Nachdem die Entwicklung von Sälzsäuregas aufgehört hat, wird die den Dichlorphosphorsäuremonomethylester enthaltende Reaktionsmischung während ungefähr 16 Stunden stehengelassen. 3,76 g (o,oi Mol) Lactoflavin werdien zugesetzt. Rasche Auflösung erfolgt; die Lösung wird während 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Sie wird hernach unter Kühlen auf Raumtemperatur in 5oo ccm wasserfreien Äther gegossen. Der erhaltene gelbe Niederschlag -des Zwischenestersalzes (Lactoflavyl - chlorphosphorsäure - monomethylesterhydro = chlorid) wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die trockene Substanz wird in einer Mischung von 36 ccm Dioxan und 4cem Wasser gelöst. Kurze Zeit, nachdem sich alles gelöst hat, beginnt der I.actoflavyl-phospliorsäuremonomethylester auszukristallisieren. Das Produkt wird abfiltriert, mit Dioxan und Äther gewaschen und getrocknet. Bei der potentiometrischen Titration mit Natriumhydroxyd zeigt sieh ein einzelner Knick der Kurve bei pH 5.
• Der Lactoflavyl-phosphorsäure-monomethylester wird in 5 ccm 36o/oiger konzentrierter Salzsäure gelöst und mit 30 ccm Wasser versetzt. Es scheidet sich -ein Syrup ab, der beim Reiben kristallisiert. Der so erhaltene Lactoflavin-monophosphorsäureester wird abfiltriert, mit Äthanol gewaschen und getrocknet.
• Beispiel 9 32,4 ccm (0,8 Mol) Methanol werden unter Kühlen auf Zimmertemperatur und Rühren zu 36,6 ccm P'hosphoroxycblorid gegossen. Nachdem die Entwicklung von Salzsäuregas aufgehört hat, wird das den Chlorphosphorsäuredimethylester enthaltende Reaktionsprodukt während 16 Stunden stehengelassen. 3,76g Lactoflavin werden zugefügt. Es tritt rasche Auflösung ein. Die Lösung wird bei Raumtemperatur während 61/2 Stunden gerührt. Sie wird dann unter Kühlen in 5oo ccm wasserfreien Äther gebracht. Das Zwischenestersalz (Lactoflavyl - phosphorsäuredimetlivlester - hvdrochlorid) scheidet sich als ein Sirup aus, der mit Xtlier gewaschen ,wird. Beim Behandeln mit Eis bildet der Sirup Lactoflavvl-phosphorsäuredimethylester, der kristallisiert. DieerhalteneMasse wird filtriert, die Kristalle werden mit Wasser, Alkohol und Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Der so erhaltene Lactoflavyl-p'hosphorsäuredimethylester ist eine neutrale Verbindung.
• o,5 g Lactoflavyl - phosphorsäuredimethylester werden in i ccm konzentrierter Salzsäure gelöst und die Lösung mit 5 Volumen Wasser verdünnt. Das auskristallisierte Produkt ist Lactoflavinmonophosphorsäureester.
• Beispiel io 23,3 ccm (0,4 Mol) wasserfreies Äfhanol werden unter langsamem Rühren und Kühlen auf Zimmertemperatur in - 36,6 ccm Phosphoroxychlorid gegossen. Nachdem die Entwicklung von Salzsäuregas beendet ist, wird die Dichlorphosphorsäureäthylester enthaltende Mischung während ungefähr 1,6 Stunden ,steherngelassen. 3,76 g Lactoflavin werden zugegeben. Letzteres löst sich rasch auf. Die erhaltene Lösung wird während 71/2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Unter Kühlen wird sie in 5oo ccm trockenen Äther gegossen. Der sich ergebende Niederschlag des Zwischenestersa:l.zes (Lactoflavyl - chlorphosphorsäure - monoäthylester -hydrochlorid) wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die trockene Substanz wird in einer Mischung von 36 ccm Dioxan und 4 ccm Wasser gelöst. Nach 2o Minuten kristallisiert der Lactoflavyl-phosphorsäure-monoäthylester aus. Das Produkt wird abfiltriert, mit Dioxan und Äther gewaschen und getrocknet. Die potentiometrische Titration mit Natriumhydroxyd zeigt einen einzigen Knick bei ungefähr pH 5.
• Beispiel ii Bei einer Temperatur zwischen 2o und 25'C werden 46,6 ccm (o,8 Mol) wasserfreies Äthanol langsam unter Rühren in 36,6 ccm Phosphoroxychlorid gegossen. Nachdem die Salzsäuregasentwicklung beendet ist, wird die Chlorphospborsäurediäthylester enthaltende Reaktionsmischung während ungefähr 16 Stunden stehengelassen. 3,76 g Lactoflavin werden zugegeben und die erhaltene Mischung gerührt und auf 50° C erwärmt. Die Lösung wird nach ungefähr io Minuten klar. Sie wird auf Raumtemperatur gekühlt und 3 Stunden hei dieser Temperatur stehengelassen. 5oo ccm wasserfreier Äther werden dann zugegeben. Der erhaltene Niederschlag des Zwischenestersalzes (L actoflavyl - pl-iosphorsätzrediäthylester - hydrochlorid) wird abfiltriert, mit Äther gewaschen lind getrocknet. Die Substanz wird mit 50 g einer Eiswasserinischung behandelt, wobei sich Lactoflavylliliospliorsäurediäthylester bildet, der durch Zentrifugieren abgetrennt. mit Alkohol gewaschen und g getrocknet wird.
• Beispiel 1:2 Bei einer Temperatur zwischen 20 und 25'C werden .I6,6 ccm wasserfreies Äthanol langsam unter Rühren mit 36,6 ccm Phosphoroxychlorid vermischt. Nachdem die Sal.zsäuregasentwicklung beendet ist, wird die Chlorphosphorsäurediäthylester enthaltende Reaktionsmischung während ungefähr 16 Stunden steheng gelassen. 3,76g Lactoflaviri werden zugegeben, diese Mischung gerührt und während d. Stunden auf 5o° C erhitzt. Sie wird gekühlt, und die klare Lösung wird in 6oo ccm wasserfreien Äther gegossen. Das erhaltene Zwischenestersalz (Lactoflavvl - pliosphorsäurediätli_vlester - hvdrochlorid) scheidet sich gummiartig aus: es wird mit Äther gewaschen. Die Substanz wird in 5o ccm Wasser unter leichtem Temperaturanstieg aufgelöst. Nach dem Abkühlen kristallisiert Lactoflavinphosphat aus; es wird filtriert, mit i n-Salzsäure, Äthanol und Äther gewaschen und getrocknet.
• Das folgende Beispiel zeigt die direkte Herstellung von Lactoflavinpliosphat ohne Isolierung des Zwischenestersalzes oder des niederen AlkyllactoflavvlpIiosphats.
• Bei spiel13 64,8 ccin (i,6 llol) lletlianol «-erden unter Kühlen auf Raumtemperatur und unter Rühren in 73,2 ccm (0,8 Mol) Phosphoroxychlorid gegossen.
• acli Beendigung der Salzsäuregasentwicklung wird das Nlonochlorphosphorsäuredimethylester enthaltende Reaktionsprodukt während ungefähr 16 Stunden stehengelassen. 15,0.1g (0,0d Mol) Lactoflavin werden zugegeben. Die Auflösung ist in 5 Minuten beendet. Die erhaltene Lösung wird während 8 Stunden bei Ziminerternperatur gerührt. Idernach werden langsam 5o ccm Wasser zugefügt, wobei die Temperatur auf 85° C steigt. Man setzt weitere ioo ccm Wasser zu. Die Kristallisation von I,actoflavin-monophosphorsäureester dauert ungefähr 16 Stundeil. Das Produkt wird filtriert, mit i n-Salzsäure, Äthanol und Äther ge-,vaschen und getrocknet. Es besteht im wesentlichen aus reinem Lactoflav inphos-phat.
• Beispiel 1q.
• 61,3g (04M01) Phosp:horoxychlorid werden unter Rühren und Kühlen auf 2o bis 25°C langsam mit 7.-2g (0,4 -.%101) Wasser versetzt. Das Schütteln wird so lange fortgesetzt, bis die Salzsäuregasentwicklung beendet ist. Die Mischung wird während ungefähr 16 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. 7,52 g (o,oa Mol) Lactoflav in werden unter Rühren darin aufgelöst. Das Schütteln wird während 6 Stunden bei Raumtemperatur fortgesetzt, wobei sich Salzsäuregas entwickelt. Die Lösung wird dann in 150 ccm Wasser gegossen. Man läßt die Temperatur auf 8o bis 9o° C steigen. Nach 15 Minuten wird die erhaltene klare, dunkelrote Lösung auf ungefähr 2o° C abgekühlt. Die Mischung der Isomeren des Lactoflavin-monophosphorsäureesters kristallisiert langsam. Das Produkt wird abfiltriert, mit n-Salzsäure, Alkohol und Äther gewaschen und getrockriet. Das Produkt besteht zu 681/o aus Lactoflavin-5'-monophosphorsäureester. Der Rest enthält mehr oder weniger von den 2'-, 3'- und 4'-Isomeren des Lactoflaviri-monophosphorsäureesters.
• 9,2 g einer Lactoflav in-5'-monopliosphorsäure-°ster und andere Isomere des Lactoflav in-monophosphorsäureesters enthaltenden Mischung, wie man sie gemäß den vorhergehenden Beispielen erhalten kann, werden in ungefähr i5o ccm Wasser aufgeschlämmt. Das PH wird durch Zusatz von Morpholin auf 7 gebracht, wobei sich nach gelindem Erwärmen fast alles auflöst. Die Lösung wird von kleinen Mengen ungelöstem Material abfiltriert und mit 5 Volumen Äthanol versetzt. Das llonomorpholinsalz des Lactoflavin-5'-monophosphorsäureesters scheidet sich ab und wird abfiltriert, mit Äthanol gewaschen und getrocknet. Die anderen I_actoflavin-monophosphorsäureester-isomere sind in der Mutterlauge enthalten und werden daraus durch Verdampfen der Mutterlauge im Vakuum "ewonneil.
• Das Lactoflavin - 5'- lnonophosphorsäureestermonomorpholinsalz wird als wasserlösliches gelbes Pulvererhalten, das gewöhnlich 2MoleküleKristallwasser enthält. Beim Erhitzen wird die Verbindung dunkel und schmilzt bei 202 bis 20.4° C unter Zers-etzung.
• Beispiel i5 einer Lactoflavin-5'-moriophospliorsäureester und andere Lactoflavin-monophosphorsätireester-isomere enthaltenden Mischung werden in 2o ccm Wasser aufgeschlämmt und mit so viel Diäthanolamin versetzt, daß das pH auf 8,8 steigt und Auflösung erfolgt. Die Lösung wird von ungelöstem Material filtriert. Durch Zusatz einer kleinen Menge Essigsäure wird das pH auf 4,8 gebracht. Man gibt 5 Volumen Äthanol zu. Der dadurch erzeugte Niederschlag wird abfiltriert und in io Teilen Wasser durch Zusatz von Diäthanolamin bei einem pH von 8 wieder gelöst. Die Lösung wird von ein wenig ungelöstem Material abfiltriert. Das pH wird durch Zusatz von Essigsäure auf 4,8 gebracht. Beim Versetzen mit 5 Volumen Äthanol fällt das Diätlian.olaminsalz des Lactoflavin-monophosp'horsäureesters aus. Das Produkt wird abfiltriert, mit Äthanol gewaschen und getrocknet. Es besteht im wesentlichen aus reinem Lactoflavin- 5'-mono@hosp'-horsäureester-diäthanolamin@salz. Eine Mischung der Diäthanolaminsalze der anderen Isomeren ist in der Mutterlauge enthalten und kann daraus durch Verdampfen im Vakuum isoliert werden.
• Das Lactoflavin - 5' - monophosphorsäureester -monodiät'hanolaminsalz wird als gut wasserlösliches gelbes Pulver erhalten, welches ?,Moleküle Kristallwasser enthält. Das pH seiner wässerigen Lösung ist ungefähr 4 bis 5. Die Verbindung wird beim Erhitzen dunkel und schmilzt bei toi bis 2o3° C unter Zersetzung.
• Beispiel 16 5 g einer Lactoflavin-5'-monophosphorsäureester und andere isomere Lactoflavin monoplhosphorsäureester enthaltenden Mischung werden in ioo ccm Wasser aufgeschlämmt. Man :gibt so viel Diäihanolamin zu, daß das pH auf 9,6 steigt. Die dadurch erzeugte Lösung wird von einer kleinen Menge ungelöstem Material filtriert. 6 Teile Aceton werden langsam unter Rühren zugegeben. Das Lactoflavin-5' - monophosphorsäureester - ,didiäthanolaminsal.z kristallisiert in feinen Nadeln. Das kristallisierte Produkt wird abfiltriert, mit Aceton und Äther gewaschen und getrocknet.
• Beispiel 17 5 g einer Lactoflavin-5'-monop'hosphorsäuree.ster und andere isomere Lactoflavin-monophosp'horsäureester enthaltenden Mischung werden in ioo ccm Wasser aufgeschlämmt. Man setzt so viel Morpholin zu, daß pH io erreicht wird. Es erfolgt Auflösung. Die Lösung wird von einem kleinen Teil ungelöstem Material filtriert. Ungefähr io Teile Isopropanol werden zugegeben. Das Dimorpholinsalz des Lactoflavin-5'-monophosphorsäureesters kristallisiert in feinen Nadeln. Das kristallisierte Produkt wird abfiltriert, mit Isopropanol und Äther gewaschen und getrocknet.
• Die Diäthanolamin- und Morpholinsalze des Lactoflavin-5'-monophosp'horsäureesters können durch Behandlung mit einer geeigneten Säure, wie im folgenden Verfahren beschrieben, in den freien Lactoflävin-5'-monophosphorsäureester übergeführt werden. Dabei ist zu beachten, daß bei den Monosalzen wenigstens i Äquivalent der Säure und bei den Disalzen wenigstens 2 Äquivalente verwendet werden: 5 g des hIonodiäthanolaminsalzes des Lactoflavin - 5' - monophosphorsäureesters werden in 75 ccm Wasser gelöst und mit 7 ccm konzentrierter Salzsäure versetzt. Lactoflavin-5'-monophosphorsäure.ester fällt aus und wird abfiltriert. In ähnlicher Weise können die Monomorpholin-, die Didiäihanolamin- und Dimorpholinsalze des Lactoflavin-5'-monophospborsäureesters in den Lactoflavin - 5' - monophosphorsäureester umgewandelt werden.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH: Verfahren zur Herstellung von Lactoflavinmonophosphorsäureestern, dadurch gekennzeichnet, daß ein Vorläufer des Lactoflavins, wie beispielsweise Di;hydrolactoflavin, i-D-i'-Ribitylamino-3, 4,dimethyl-benzol oder i-D-i'-Ribitylamino-6-arylazo-3, 4-dimethyl-benzol, oder, im Falle der Phosphorylierung mit Clilorphosphorsäurealky lestern, auch Lactoflavin selbst mittels einer Chlorphosphorsäure, einem Chlorphosphorsäure-alkylester oder einer Mischung derselben phosphoryliert, das Reaktionsprodukt zum phosphorylierten Lactoflavin bzw. zum phosphorylierten Lactoflavin-Vorläufer hydro-;lysiert, letzterer auf Üblichem Wege in das phosphorylierte Lactoflavin umgewandelt, die erhaltene Mischung der Isomeren des Lactoflavin-monophosphor.säureesters gegebenenfalls mit Diäthanolamin oder Morpholin umgesetzt, ,das 5'-Isomere aus -der Mischung der gebildeten Salze isoliert und gegebenenfalls in den freien Lactoflavin-5'-monop'hosphorsäureester übergeführt wird.