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Absorptionsschattenmikroskop Zur Darstellung der Struktur mikroskopischer
Objekte sind bisher neben den Strahlen des sichtbaren Spektrums Ultraviolettstrahlen,Infrarotstrahlen,
Elektronenstrahlen und Röntgenstrahlen zur Anwendung gelangt.
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Die bei Verwendung unsichtbaren Lichtes an Stelle von sichtbarem Licht
in der Mikroskopie gegebenen erschwerten Arbeitsbedingungen wurden in Kauf genommen,
weil viele Substanzen für Ultraviolettstrahlen sowohl als auch für Infrarotstrahlen
ein Absorptionsvermögen aufweisen, das von dem im sichtbaren Licht völlig abweicht,
so daß es bei Darstellung im ultravioletten oder infraroten Licht gelingt, im Objekt
Strukturen abzubilden, die man im sichtbaren Licht kaum oder nur unter Zuhilfenahme
von Färbungen, die das Objekt mehr oder weniger stark beeinflussen, unterscheiden
kann. So läßt sich das bekannte Verfahren der Ultraviolettmikroskopie nach K ö hl
e r mit Vorteil zur Erkennung von Chromosomen, zur Untersuchung von Protoplasmastrukturen
und zur Aufsuchung von kleinsten Bakterien in ungefärbtem Zustand verwenden. Diese
Besonderheit der Verhältnisse beim Arbeiten mit ultraviolettem Licht erklärt es
auch, daß in der Ultraviolettmikroskopie neben Objektiven hoher Eigenvergrößerung
auch solche schwacher und mittlerer Eigenvergrößerung herangezogen werden.
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Bei der Verwendung von Ultraviolettstrahlen an Stelle von sichtbarer
Lichtstrahlung in der Mikroskopie in der von Köhler vorgeschlagenen Weise
gelingt
es, das Auflösungsvermögen des Mikroskops gegenüber dem Arbeiten mit sichtbarem
Licht um etwa 3o"/, zu verbessern.
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Die technischen Schwierigkeiten beim Arbeiten mit dem Ultraviolettmikroskop
nach Köhler, die insbesondere darin gelegen sind, daß das Bild des Objektes nicht
unmittelbar wahrgenommen werden kann, haben zu einem Vorschlag von Zworykin (USA-Patent
2 om go7) geführt, das mit dem Ultraviolettmikroskop gewonnene unsichtbare Bild
durch Abtastung in einer Bildfängerröhre (Ikonoskop) in ein sichtbares Bild zu verwandeln.
Dieses Verfahren erfordert allerdings eine komplizierte und kostspielige Apparatur.
Auch ist die Abbildungsgüte der bekannten Ikonoskopröhren bei dem gegenwärtigen
Stand der Technik noch nicht so groß, daß ihr Einsatz in der Ultraviolettmikroskopie
heute bereits Erfolg verspräche.
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Auch mit anderen Zielen wird Ultraviolettlicht in der Mikroskopie
verwandt. Es sind Lumineszenzmikroskope bekannt, die nach dem Prinzip des zusammengesetzten
Lichtmikroskops gebaut sind und es erlauben, Strukturen darzustellen, die bei Durchleuchtung
mit Ultraviolettlicht in verschiedenem Grade Eigenfluoreszenz zeigen. Mit diesen
bekannten Anordnungen gelingt es auch in ebenfalls bekannter Weise, Objektelemente,
die durch Ultraviolettlicht selbst nicht zur Lumineszenz anregbar sind, nach voraufgegangener
Anfärbung mit sog. Fluorochromen bei Durchstrahlung mit Ultravriolettlicht unmittelbar
sichtbar zu machen.
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In neuerer Zeit schließlich sind Mikroskope bekanntgeworden, bei denen
das Objekt zur Darstellung seiner Struktur. mit Elektronenstrahlen durchstrahlt
wird. Diese Mikroskope sind analog den bekannten Lichtmikroskopen konstruiert, wobei
von der Tatsache Gebrauch gemacht wird, daß es möglich ist, Elektronenstrahlen mit
Hilfe von Elektronenlinsen in ihrer Fortpflanzungsrichtung ebenso zu beeinflussen
wie sichtbares Licht durch Glaslinsen.
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Während in der Lichtmikroskopie die Differenzierung von Objektstrukturen
nur möglich ist, wenn die zu differenzierenden Elemente entweder in verschiedenem
Grade Anteile der zur Durchstrahlung des Objektes verwandten Strahlung absorbieren,
oder sich in ihrem Lichtbrechungsvermögen unterscheiden oder durch die zur Durchstrahlung
des Objektes verwandte Strahlung in verschiedenem Grade zur Lumineszenz angeregt
werden, liegt dem Abbildungsprinzip der bekannten Elektronenmikroskope die Beobachtung
zugrunde, daß Elektronenstrahlen, die auf Masseteilchen auftreffen, zum Teil aus
ihrer Fortpflanzungsrichtung abgelenkt bzw. in ihrer Geschwindigkeit geändert und
dadurch in verschieden hohem Grade von der Bilderzeugung durch die dem Objekt nachgeschaltete
Elektronenoptik ausgeschlossen werden. Beim Arbeiten mit den bekannten Elektronenmikroskopen
gelangen Objektstrukturen nur dann zur Darstellung, wenn sie durch verschiedene
Massendicke des Objekte, worunter das Produkt aus Dicke und Dichte der Objektschicht
verstanden wird, bedingt sind. Hierdurch sind die bekannten Verfahren der Elektronenmikroskopie
auf bestimmte Objekte beschränkt und insbesondere zur Differenzierung biologischer
Objekte einheitlicher Massendicke nicht geeignet. Als Vorteil der bekannten Anordnungen
der Elektronenmikroskopie gegenüber denjenigen der Mikroskopie mit sichtbarem Licht
ist es dagegen anzusehen, daß auch ungefärbte Objekte elektronenmikroskopisch dargestellt
werden können.
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Für die Darstellung miskroskopischer Objekte mit den bekannten mit
Objektdurchstrahlung arbeitenden Elektronenmikroskopen ist es erforderlich, die
sehr dünnen Objekte entweder frei tragend in Netzen oder in feinen Bohrungen oder
auf extrem dünnen Folien anzuordnen. Die Vorbereitung der Objekte zur Untersuchung
ist dadurch gegenüber der in der Lichtmikroskopie üblichen Unterbringung der Objekte
auf stabilen Objektträgern sehr erschwert.
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Es ist bekannt, daß Elektronenstrahlen beim Durchgang durch dünne
Objektschichten nicht nur gestreut und in ihrer Geschwindigkeit geändert, sondern
auch in verschieden hohem Grade absorbiert werden. Bei den normalen Anodenspannungen
der Elektronenmikroskope (io4 bis io5 Volt) findet allerdings eine merkliche Stromabschwächung
durch Elektronenabsorption in der Objektschicht noch nicht statt, so daß die Strommodulation
durch unterschiedliche Absorption am Objektelement bei der Erzeugung der Kontraste
im Bild bei den bekannten Anordnungen praktisch keine Rolle spielt. Brauchbare Verfahren
zur Darstellung von Objektstrukturen mit Hilfe von Elektronenstrahlen, bei denen
von der Eigenschaft genügend langsamer Elektronenstrahlen, bereits beim Durchgang
durch dünne Objektschichten in erheblichem Grade absorbiert zu werden, Gebrauch
gemacht wird, sind nicht bekanntgeworden.
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Die Verwendung von Elektronenstrahlen geringerer Geschwindigkeit in
den bekannten elektronenmikroskopischen Anordnungen, die an sich grundsätzlich wohl
möglich wäre, wurde bisher nicht vorgeschlagen, weil bei Verwendung langsamer Strahlen
der Hauptvorteil der bekannten elektronenmikroskopischen Anordnungen die Steigerung
des Auflösungsvermögens gegenüber demjenigen des Lichtmikroskops in Fortfall käme
und damit der für den Aufbau der bekannten elektronenmikroskopischen Anordnungen
erforderliche beträchtliche Aufwand das Verfahren nicht mehr als lohnend erscheinen
ließe.
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Es ist schließlich noch ein Verfahren zur Darstellung mikroskopischer
Objektstrukturen bekannt, bei dem an Stelle von Elektronenstrahlen Röntgenstrahlen
zur Objektdurchstrahlung zur Anwendung gelangen. Bei diesem bekannten, als Mikroradiographie
bezeichneten Verfahren wird eine Röntgenaufnahme des darzustellenden mikroskopischen
Objektes in natürlicher Größe auf einer möglichst feinkörnigen photographischen
Platte gemacht und nachträglich in der üblichen Weise mikrophotographisch vergrößert,
soweit es das Plattenkorn zuläßt. Die Anwendbarkeit dieses Verfahrens zur Differenzierung
mikroskopischer Objektstrukturen setzt voraus, daß in den verschiedenen Objektelementen
unterschiedliche Anteile der zur Durchstrahlung des Objektes verwandten Röntgenstrahlung
in erheblichem Grade absorbiert werden, was für sehr dünn,. Objekte, insbesondere.
biologische
Objekte, nicht zutrifft. Da bei diesen bekannten Verfahren
die Vergrößerung erst nachträglich auf photographischem Wege erzeugt wird, handelt
es sich streng genommem gar nicht um ein mikroskopisches Verfahren.
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Es ist jedoch auch vorgeschlagen worden, in Abwandlung dieses bekannten
Verfahrens vergrößerte Abbildungen der Struktur mikroskopischer Objekte dadurch
zu erzielen, daß das Objekt mit Röntgenstrahlen durchstrahlt und auf einer kornlosen
fluoreszierenden Kristallfläche (Willemit, Kunzit) ein Fluoreszenzbild des Absorptionsschattens
des Objektes erzeugt wird, das direkt mikrophotographisch vergrößert dargestellt
wird.
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Abgesehen von dem bereits oben gegen die Verwendung von Röntgenstrahlen
zur Darstellung mikroskopischer Objekte erhobene Einwand, daß die zur Durchstrahlung
des Objektes verwandte Strahlung im Objekt nicht in ausreichendem Maße absorbiert
wird, ist diese Anordnung mit dem grundsätzlichen Nachteil verbunden, daß die im
Objekt nicht absorbierten Röntgenstrahlen die Leuchtsubstanz in erheblichem Grade
durchdringen und hierbei in ihrer ganzen Tiefe Fluoreszenzlicht anregen. Es ist
zwar bekannt, daß es mit Hilfe von Immersionsobjektiven hoher Apertur in Anordnungen
des zusammengesetzten Lichtmikroskops bei der Abbildung raumtiefer Obj ekte mit
hoher Vergrößerung gelingt, den Bereich der tiefenscharfen Abbildung so stark einzuengen,
daß Objektteile, die größenordnungsmäßig etwa o,5 x i0-3 mm vor bzw. hinter der
Einstellungsebene liegen, nicht mehr abgebildet werden (:Methode des optischen Querschnitts).
Die Übertragung dieses an sich bekannten Prinzips auf die vorstehend beschriebene
bekannte Anordnung ist jedoch deswegen nicht möglich, weil Röntgenstrahlenquellen
ausreichender Strahldichte für die Durchführung dieses ausschließlich auf hohe Vergrößerungen
beschränkten Verfahrens nicht zur Verfügung stehen, zumal bei Ausgestaltung des
bekannten Verfahrens in dieser Richtung ja nur ein ganz geringer Anteil der das
Objekt durchsetzenden Strahlung, nämlich ausschließlich der in der Einstellungsebene
des Mikroskops Fluoreszenzlicht erzeugende Anteil, bei der Abbildung nutzbar werden
würde. In der bekannten Anordnung wird daher auch abweichend von diesen Überlegungen
so vorgegangen, daß das Objekt mit einem Bündel nahezu paralleler Röntgenstrahlen,
die mit Hilfe von Lochblenden ausgesondert werden, durchstrahlt wird und daß das
auf dem der abbildenden Optik zugewandten Austrittsquerschnitt des Kristalls entstehende
Leuchtbild des Absorptionsschattens lichtoptisch dargestellt wird. Es ist jedoch
bei Anwendung bekannter Röntgenstrahlenquellen nach diesem bekannten Verfahren bisher
nicht gelungen, auch nur bei schwachen Vergrößerungen genügend lichtstarke Abbildungen
zu erzielen.
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Die vorliegende Erfindung betrifft eine Weiterbildung dieses bekannten
Verfahrens zur Darstellung der Struktur mikroskopischer Objekte im Absorptionsschatten,
bei dem die der Anwendung des bekannten Verfahrens entgegenstehenden Schwierigkeiten
durch die erfindungsgemäße Verwendung von Elektronenstrahlen bzw. Ultraviolettstrahlen
zur Durchstrahlung des Objektes an Stelle von Röntgenstrahlen völlig beseitigt sind.
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Bei dem Verfahren nach der Erfindung wird das Objekt ebenfalls wie
bei der bekannten Anordnung in direkten Kontakt mit einer durch die zur Durchstrahlung
des Objektes verwandte Strahlung zur Lumineszenz anregbaren Substanz gebracht, jedoch
im Gegensatz zu der bekannten oben beschriebenen Anordnung ausschließlich das in
unmittelbarem Kontakt mit dem Objekt in der Berührungsebene zwischen Objekt und
Leuchtsubstanz gelegene Lumineszenzbild des Absorptionsschattens des Objektes lichtoptisch
vergrößert dargestellt. Es ist bekannt, daß Elektronenstrahlen im Gegensatz zu Röntgenstrahlen
in Leuchtsubstanzen nur sehr wenig tief eindringen. Die Eindringungstiefe läßt sich
mittels des exponentiellen Absorptionsgesetzes der Kathodenstrahlen nach L e n a
r d errechnen. Sie beträgt beispielsweise für Strahlen der Beschleunigungsspannung
von 105 Volt 30o bis 4001c, für solche der Beschleunigungsspannung von 5 x i04 Volt
etwa io if, für solche der Beschleunigungsspannung von Zoo Volt nur noch etwa z
,@@ und für solche der Beschleunigungsspannung von i03 Volt nur noch etwa 0,02 /c.
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Bei dem Verfahren nach der Erfindung werden daher, soweit Elektronenstrahlen
zur Durchstrahlung des Objektes verwandt werden, vorzugsweise solche von Zoo Volt
Beschleunigungsspannung und weniger, bei sehr dicken Objekten auch solche bis zu
etwa i05 Volt Beschleunigungsspannung verwandt. Im letzteren Falle wird ebenso wie
bei der Verwendung von Ultraviolettstrahlen zur Durchstrahlung des Objektes in Durchführung
des Erfindungsgedankens, der Darstellung des in unmittelbarer Berührung mit dem
Objekt entstehenden Lumineszenzbildes, von der Anwendung eines Lichtmikroskops hoher
Apertur nach der Methode des optischen Querschnitts in der weiter oben näher dargelegten
Weise Gebrauch gemacht. Hierdurch gelingt es, auch in diesen Fällen das ausschließlich
in unmittelbarer Berührung mit dem Ob-
jekt entstehende Lumineszenzbild des
Absorptionsschattens des Objektes zur Darstellung zu bringen, während die von tiefer
in die Leuchtsubstanz eingedrungener Strahlung herrührende Lumineszenzstrahlung
die Abbildungsgüte hinsichtlich des Auflösungsvermögens nicht verschlechtern kann.
Das Verfahren in dieser Ausführungsform ist unter Verwendung von Elektronenstrahlen
bzw. Ultraviolettstrahlen im Gegensatz zur Verwendung von Röntgenstrahlen durchführbar,
weil sowohl Elektronenstrahlenquellen als auch Ultraviolettstrahlenquellen ausreichender
Strahldichte bekannt sind, was für Röntgenstrahlenquellen nicht der Fall ist. Diese
Tatsache ist darin begründet, daß die Röntgenstrahlen Sekundärstrahlen sind, die
ihrerseits durch Elektronenstrahlen erzeugt werden, wobei die Ausbeute jedoch nur
etwa i bis :2 07,
beträgt.
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Durch die Anwendung bekannter elektronenoptischer Hilfsmittel, Kombination
einer fast punktförmig emittierenden Glühkathode mit einer negativ vorgespannten,
die Emissionsquelle rotationssymmetrisch umgebenden Elektrode (Wehneltelektrode),
gelingt es in bekannter Weise, die von der Strahlenquelle abgegebene
Strahlung
sehr stark auf das Objekt zu zu bündeln.
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Da bei dem Verfahren nach der Erfindung im Gegensatz zu dem bekannten
Verfahren mit Röntgenstrahlen das unmittelbar auf dem Objekt selbst gelegene Lumineszenzbild
des Absorptionsschattens des Objektes zum Gegenstand der lichtmikroskopischen Abbildung
gemacht wird, ist es möglich, die Bestrahlungsintensität des Objektes dadurch um
mehrere Größenordnungen gegenüber dem bekannten Verfahren zu erhöhen, daß die erfindungsgemäß
zur Anwendung gelangende Strahlenquelle auf dem Objekt abgebildet wird.
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In Abb. i ist eine beispielsweise Ausführungsform einer Anordnung
nach der Erfindung unter Verwendung von Elektronenstrahlen, in Abb. 2 eine solche
unter Verwendung von Ultraviolettstrahlen zur Durchstrahlung des Objektes dargestellt.
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In Abb. i wird der kleinste Querschnitt i eines von einer Glühkathode
in bekannter Weise erzeugten, durch eine Wehneltelektrode in bekannter Weise eingeengten
und auf die Anodenblende 2 beschleunigten Elektronenstrahlenbündels 3 mit Hilfe
der ebenfalls bekannten Kondensorspule q., vorzugsweise einer eisengekapselten Spule
mit innerem eisenfreiem Spalt, auf dem Objekt 5 elektronenoptisch abgebildet. Hierbei
entsteht in der durch die Schnittlinie A-B gekennzeichneten Ebene des Lumineszenzträgers
6 das durch das Immersionsobjektiv 7 zur Abbildung gelangende Lumineszenzschattenbild
des Objektes.
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Die Abb. 2 entspricht in allem der Abb. i mit dem Unterschied, daß
die Elektronenstrahlenquelle durch die Ultraviolettstrahlenquelle i und die Kondensorspule
durch die Kondensorlinse q. ersetzt ist. Es ist bei der Verwendung von Ultraviolettstrahlen
zur Durchstrahlung des Objektes selbstverständlich auch möglich, die Strahlenquelle
statt durch ein Linsensystem durch eine Spiegeloptik auf dem Objekt abzubilden.
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In Abb. 3 ist dargestellt, daß bei Verwendung eines auf das Objekt
5 konvergierenden Strahlenbündels 3 der Öffnung 2 cc in der Berührungsebene mit
dem Träger der Lumineszenz 6, die durch den Schnitt A -B
angedeutet ist, in
der dem Lumineszenzträger abgewandten Seite des Objektes 5 gelegene Objektpunkte
durch Zerstreuungskreise mit dem Durchmesser x abgebildet werden. Für die Errecbnung
der Größe dieser Zerstreuungskreise ergibt sich folgende Beziehung:
worin d die Objektdicke bezeichnet.
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Hieraus errechnet sich beispielsweise für eine Objektdicke von i ,es
bei einem im Hinblick auf das Auflösungsvermögen des Lichtmikroskops für zulässig
gehaltenen Durchmesser des Zerstreuungskreises von o,2 ,u eine zulässige Apertur
der Strahlenquelle von o,i, für eine Objektdicke von o,i @u unter im übrigen gleichen
Bedingungen eine solche von o,7.
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Da bei der Anordnung nach der Erfindung im Gegensatz zu den bekannten
Anordnungen der Elektronenmikroskopie eine elektronenoptische Abbildung bildseitig
nicht mehr stattfindet, ist es bei der Anordnung nach der Erfindung unter Verwendung
von Elektronenstrahlen zur Durchstrahlung des Objektes möglich, die nach vorstehender
Berechnung zulässigen Aperturen der Strahlenquelle, die um eine bis mehrere Größenordnungen
über den in der Elektronenmikroskopie bisher üblichen und bei den bekannten Elektronenmikroskopen
zulässigen Aperturen liegen, voll auszunutzen. Hieraus ergibt sich wiederum die
Möglichkeit, auch mit Elektronenstrahlen wesentlich geringerer Geschwindigkeiten
zu arbeiten, als sie bisher in der Elektronenmikroskopie zur Anwendung gelangten.
Daher ist es mit dem Verfahren nach der Erfindung auch möglich, selbst von sehr
massedünnen Objekten ohne besondere Vorbehandlung derselben differenzierte Abbildungen
der Struktur zu erhalten. Die Anforderungen an die Abbildungsgüte der Kondensorspuie
sind dabei selbstredend gering. Es ist sogar vorteilhaft, die Elektronenquelle etwas
unscharf auf dem Objekt abzubilden, Bei der bekannten Anwendungsart der bekannten
Immersionsobj ektive in der Lichtmikroskopie ist es erforderlich, das Objekt selbst
in der Immersionsflüssigkeit oder in einer Immersionsmasse einzubetten, die den
gleichen oder einen ähnlichen Brechungsindex n wie die Frontlinse hat. Im Unterschied
zu dieser bekannten Anwendungsart der bekannten Immersionsobjektive wird bei dem
Verfahren nach der Erfindung das Objekt selbst gar nicht mit der Immersionsflüssigkeit
in Berührung gebracht. Es ist daher möglich, an Stelle der in der Mikrobiologie
fast ausschließlich verwandten Wasser- und Ölimmersionen auch für die Untersuchung
empfindlicher Objekte die ebenfalls bekannte Monobromnaphthalinimmersion heranzuziehen.
Darüber hinaus ist esmöglich, für dieDurchführung des Verfahrens nach der Erfindung
nach bekannten Grundsätzen Immersionsobj ektive zu errechnen und herzustellen, bei
denen als Immersionsflüssigkeit andere, an sich bekannte Flüssigkeiten mit sehr
hohem Brechungsindex, z. B. Lösungen von Quecksilberjodid in Anilin und Chinolin
oder Mischungen von Schwefelarsen mit Bromarsen (n = 2,i bis 2,q.), zur Anwendung
gelangen. Leuchtsubstanzen mit hohem Brechungsindex, z. B. Zinksulfid- undZinkkadmiumsulfidphosphore
(7a = 2,3), sowie geeignete Materialien zur Herstellung der Frontlinse der Immersion
(schwerste Flintgläser, Diamant u. a.) sind bekannt. Auch ist ein Verfahren bekannt,
nach welchem es gelingt, durch Einführung geeigneter Substanzen in die Glasschmelze
künstlich hergestellten Gläsern die Eigenschaften kornlos leuchtender Leuchtsubstanzen
zu geben.
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Besondere Vorteile bietet es bei dem Verfahren nach der Erfindung,
den Träger der Lumineszenz in Form eines dünnen planparallelen Plättchens nach Art
der mikroskopischen Deckgläser zur Anwendung zu bringen und gleichzeitig als stabile
Tragschicht für das an
ihm adhärente Objekt zu verwenden. Unter
Auswahl geeigneter Materialien, beispielsweise von blau leuchtendem Zinkkadmiumsulfid
(;t = 2,3) sowie einem Immersionsobjektiv, dessen Frontlinse aus Dizmant (fa = 2,5)
hergestellt ist, und einer Mischung von Schwefelarsen mit Bromarsen (ft
= 2,3) als Immersionsflüssigkeit, kann auf diese Weise eine Immersion der
Apertur 2,2, die universell anwendbar ist, verwirklicht werden.
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Bei dem Verfahren nach der Erfindung wird durch das zwischen Objekt
und Bild eingeschaltete Lumineszenzbild des Absorptionsschattens, das als das eigentliche
Objekt zur vergrößerten Abbildung dient, aus jedem darzustellenden Objekt künstlich
ein Selbstleuchter gemacht.
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Es ist das Verdienst von M. B e r e k , durch praktische Versuche
den Nachweis geführt zu haben, daß eine Abbildung gemäß den Vorschriften der Nichtselbstleuchtertheorie
nicht immer zu günstigen Resultaten führt (Betrachtungen zur Darstellung des Abbildungsvorganges
im Mikroskop und zur Frage des Auflösungsvermögens im Hellfeld und Dunkelfeld, Z.
Mikr. 41 ;=i924] i) und darüber hinaus den Zusammenhang zwischen Selbstleuchter-
und Nichtselbstleuchtertheorie aufgedeckt zu haben (Über Kohärenz und Konsonanz
des Lichtes, Z. Physik 36 [z926] 675, 824; 37 U926] 387 und 40 [i927] 42o). Eine
genaue Darstellung der Theorie der mikroskopischen Abbildung nach dem gegenwärtigen
Stand der Forschung wird durch G. Stade und H. Staude in ihrem Buch: Mikrophotographie
(Leipzig Akademische Verlagsgesellschaft) auf S. zo bis 23 gegeben. Hiernach errechnet
sich der kleinste Abstand, den zwei Punkte, die getrennt wahrgenommen werden sollen,
bei der Selbstleuchterabbildung noch haben dürfen, zu
worin 7z einen von der Fähigkeit der abbildenden Schicht, Helligkeitsunterschiede
zur Darstellung zu bringen, abhängigen Proportionalitätsfaktor bedeutet. Dieser
Proportionalitätsfaktor beträgt im Grenzfall nach Stade und Staude (a. a. 0.) für
sehr hart arbeitendes Photomaterial 0,45, während er für das Auge ungefähr gleich
o,6 ist.
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Während bei der Abbildung eines Selbstleuchters vom Objekt ein Strahlenkegel
ausgeht, der vom Objektiv aufgenommen und in der Bildebene wieder vereinigt wird,
findet bei der Abbildung eines Nichtselbstleuchters eine der Selbstleuchterabbildung
gleichwertige Abbildung gemäß der Berekschen Theorie immer nur dann statt, wenn
an irgendeiner Stelle des Strahlenganges zwischen Objekt und Bild eine Helligkeitsverteilung
besteht, die gleich derjenigen bei Abbildung eines Selbstleuchters ist. Charakteristisch
für ein nicht selbstleuchtendes Objekt ist es, daß es Licht (die Beugungsmaxima)
in bestimmter Richtung des Raumes aussendet. Beleuchtet man das Objekt in verschiedenen
Richtungen, so daß sich die Beugungsmaxima überlagern und dadurch das abbildende
Objekt gleichmäßig ausleuchten, so erhält man im Bildraum eine Lichtverteilung,
die von der eines Selbst-Leuchters nicht mehr zu unterscheiden ist. Hieraus folgt,
daß eine der Selbstleuchterabbildung äquivalente Abbildung nur im Hellfeld vorhanden
ist, und zwar dann, wenn die Apertur des Kondensors der des Objektivs gleich ist.
Abblendung des Kondensors oder Verschieben der Blende führt zur Nichtselbstleuchterabbildung,
bei der keine objektähnliche Wiedergabe mehr erfolgt. Nur im günstigsten Fall entspricht
das Auflösungsvermögen eines nicht selbstleuchtenden Objektes gerade demjenigen,
das oben für ein selbstleuchtendes Objekt abgeleitet wurde.
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Der kleinstmögliche Abstand zweier Punkte, die noch getrennt wahrgenommen
werden können, beträgt mithin in der Anordnung nach der Erfindung unter Verwendung
eines Objektivs der Apertur 2,2 und eines blau lumineszierenden Zinkkadmiumsulfids
bei subjektiver Beobachtung
bei photographischer Wiedergabe
während der gleiche Wert für das Köhlersche Ultraviolettmikroskop bei Forderung
objektähnlicher Abbildung (zentrale Beleuchtung)
bei Verzicht auf objektähnliche Abbildung und Ersatz derselben durch Auszählbarkeit
der Strukturelemente (schiefe Beleuchtung)
beträgt. Bei Forderung obj ektähnlicher Abbildung und photographischer Gewinnung
des Bildes ist das Verfahren nach der Erfindung unter Verwendung eines Objektivs
der Apertur 2,2, wie beschrieben, dem Köhlerschen Ultraviolettmikroskop mithin hinsichtlich
des Auflösungsvermögens um mehr als das Doppelte überlegen.
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Erfindungsgemäß ist es aber darüber hinaus auch möglich, unter Verwendung
nach bekannten Grundsätzen errechneter Objektive auch bei der Anwendung höchster
Aperturen gänzlich ohne die Verwendung jeglicher Immersionsflüssigkeit auszukommen,
wenn die plangeschliffene Frontlinse des zur Abbildung verwandten Immersionsobjektivs
selbst aus einer Substanz hergestellt ist, die durch die zur Bestrahlung des Objektes
verwandte Strahlung zur Lumineszenz angeregt wird, beispielsweise aus einem an sich
bekannten Lumophorglas mit hohem Brechungsindex oder einem blau lumineszierenden
Zinksulfidkadmiumleuchtkristall (n = 2,3) oder einem bei Bestrahlung mit Elektronenstrahlen
bzw. Ultraviolettstrahlen kräftig blau lumineszierenden Diamanten (n = 2,5), sofern
das Objekt direkt mit der plan geschliffenen Seite der Frontlinse in Kontakt gebracht
wird bzw. an der
Frontlinse adhärent ist. Die Wirkungsweise eines
solchen erfindungsgemäßen Mikroskopobjektivs wird in Abb. 4 aus der homogenen Immersion
abgeleitet. In Abb. 4a insbesondere stellt 8 die Frontlinse eines an sich bekannten
Immersionsobjektivs, beispielsweise einer homogenen Ölimmersion, g die Immersionsflüssigkeit,
io das Deckglas, 5 das Objekt in der Einbettungsmasse ii und 12 den Objektträger
dar. In Abb. 4b ist die Wirkungsart eines Objektivs gleicher Leistung nach der Erfindung
schematisch dargestellt. 8 bedeutet hier wiederum die Frontlinse des Objektivs,
5 das Obj ekt und 5' das als scheinbares Obj ekt dienende Lumineszenzbild des Absorptionsschattens
des Objektes, das in der Masse der Frontlinse gelegen ist. Der unterhalb des Schnittes
C-D gelegene Anteil der überhalbkugeligen Frontlinse ersetzt mithin lediglich die
Immersionsflüssigkeit und das Deckglas sowie teilweise die Einbettungsmasse des
Objektes. Die Abb. 4 dient ausschließlich zur Darstellung des Prinzips des erfindungsgemäßen
Mikroskopobjektivs. Es ist ohne Schwierigkeiten möglich, ein Objektiv für einen
Öffnungswinkel bis zu i8o° nach den an Hand der Abb. 4 erläuterten Grundsätzen zu
errechnen. Die Apertur dieses Objektivs erreicht mithin den Wert des Brechungsindex
der Frontlinse. Bei Herstellung der Frontlinse beispielsweise aus Diamant ist hiermit
ein Trockensystem mit allen Qualitäten einer homogenen Immersion und der hohen Apertur
von 2,5 verwirklicht, dessen Auflösungsvermögen bei Verwendung eines blau lumineszierenden
Diamanten zur Herstellung der Frontlinse mithin für photographische Wiedergabe den
Wert von go m 1c, für subjektive Betrachtung denjenigen von i2o in ,u. erreicht.
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Es ist schließlich erfindungsgemäß auch möglich, in der in Abb. 5
dargestellten Weise die zur Durchstrahlung des Objektes verwandte Strahlung in dem
gleichen Raum zu erzeugen, in dem sich das Objekt befindet, während das Lichtmikroskop
selbst außerhalb dieses Raumes untergebracht ist, wenn bei Verwendung eines planparallelen
Plättchens als Lumineszenzträger das Objekt auf diesem adhärent ist und das planparallele
Plättchen gleichzeitig als Fenster der die Strahlung erzeugenden Röhre dient. In
ganz entsprechender Weise ist es auch möglich, bei Erzeugung des Lumineszenzbildes
in der Frontlinse des Objektivs die Fassung des Objektivs so auszugestalten, daß
das Objektiv selbst den Verschluß der die Strahlung. erzeugenden Röhre bildet. Eine
beispielsweise Ausführungsform einer Anordnung nach diesem Erfindungsgedanken ist
in Abb. 6 dargestellt.
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In den Abb. 5 und 6 bedeutet 7 das Mikroskopobjektiv und 13 die Glaswand
der Röhre, auf die die Metallkappe 14 aufgekittet ist. In Abb. 5 stellt 6 den Träger
der Lumineszenz dar, der zu gleicher Zeit als Objektträger dient. Die Metallkappe
der Röhre ist mit dem als Fenster dienenden Objektträger unter Zuhilfenahme zweier
Gummiringe 15 und 16 und eines übergreifenden Gewinderinges 17 gasdicht verbunden.
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In der Anordnung nach Abb.6 dagegen ist das Objekt 5 direkt auf der
Frontlinse des Mikroskopobjektivs 7 aufgebracht. Der gasdichte Ver'sehluß zwischen
Röhre 13 und Objektiv 7 wird hier durch den scheibenförmig gestalteten Ansatz 18
der Fassung des Objektivs in Zusammenwirken mit dem Gummiring 15 und dem übergreifenden
Gewindering 17 bewirkt.
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Als besonderer Vorzug des Verfahrens nach der Erfindung unter Verwendung
von Elektronenstrahlen zur Durchstrahlung des Objektes ist es zu betrachten, daß
es in einfacher Weise gelingt, das Durchdringungsvermögen der zur Durchstrahlung
des Objektes verwandten Elektronenstrahlen durch Änderung der Beschleunigungsspannung
innerhalb weitester Grenzen zu ändern und damit der jeweiligen Objektdicke anzupassen;
so daß einwandfreie Abbildungen massedünner Objekte neben derjenigen relativ massedicker
Objekte in raschem Wechsel möglich sind.
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Auch bei der erfindungsgemäßen Verwendung ultravioletter Strahlung
zur Darstellung des Objektes gelingt die Differenzierung der Struktur urvorbehandelter,
insbesondere ungefärbter Objekte, wobei die Anordnung nach der Erfindung dem Köhlerschen
Ultraviolettmikroskop, abgesehen von der Möglichkeit der unmittelbaren subjektiven
Betrachtung des Bildes nach dadurch überlegen ist, daß es nicht erforderlich ist,
wie bei dem Köhlerschen Ultraviolettmikroskop ausschließlich monochromatisches Licht
zur Durchstrahlung des Objektes zu verwenden und daß es im Gegensatz zum Köhlerschen
Ultraviolettmikroskop auch möglich ist, die Untersuchung unter Verwendung der gleichen
Optik in raschem Wechsel mit Ultraviolettlicht verschiedener Wellenlänge vorzunehmen,
beispielsweise mit demjenigen der Wellenlänge von 28o m,u und dem hinsichtlich der
Absorption in dünnen Objektschichten besonders günstigen Flußspatultraviolett, ja
sogar im Wechsel zwischen Ultraviolettlicht und Elektronenstrahlen.
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Andererseits ist es bei dem Verfahren nach der Erfindung entsprechend
dem Vorgehen in der Lichtmikroskopie auch möglich, die Absorptionsverhältnisse in
der Objektschicht durch geeignete Vorbehandlung, z. B. durch elektive Färbung, Versilberung
oder Vergoldung, mit einem der bekannten oder zweckmäßig abgeänderten Verfahren
zu ändern.
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Auch ist es möglich, ultravisible Teilchen, die abgebildet werden
sollen, aber selbst wegen zu geringer Absorption bei der verwandten Strahlenart,
z. B. Elektronenstrahlen der Geschwindigkeit io' Volt, nicht darstellbar sind oder
bei der Abbildung in der bisher beschriebenen Weise durch den stark strählenden
Untergrund des Lumineszenzbildes völlig überstrahlt werden würden, dadurch zur Darstellung
zu bringen, daß man sie in dünner Schicht in die Erregungsstrahlung stärker absorbierenden
Lösungen suspendiert und eintrocknen läßt, so daß sie dann hell auf dunklem Grunde
abgebildet werden. . Geeignete Verfahren der Einbettung in solchen dünnen Schichten
sind aus der Lichtmikroskopie bekannt, beispielsweise die Negativdarstellung von
Bakterien in Collargolpräparaten nach dem von N i e t s c h e angegebenen Verfahren
oder die Einbringung in dünner Schicht in Objektkammern, wie sie für die Dunkelfeldmikroskopie
angegeben wurde.
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Bei der Verwendung solcher Strahlenarten zur Durchstrahlung des Objektes,
die ein Lenardfenster
oder ein dünnes Quarz- oder Flußspat- oder
Lithiumfluoridfenster od. dgl. noch zu durchdringen vermögen, sind auch Anordnungen
möglich, in denen das darzustellende Objekt sich außerhalb des Vakuumraumes der
Röhre in freier Luft befindet, deren Handhabung gegenüber den bekannten Elektronenmikroskopen
sehr erleichtert ist. Dies läßt einerseits den Vorteil der Untersuchungsmöglichkeit
von ungefärbten Präparaten, z. B. Ausstrichen aus Bakterienkulturen, mit dem Verfahren
nach der Erfindung in einem neuen Lichte erscheinen und ermöglicht andererseits
die Untersuchung auch solcher Objekte, die bei Einbringung in ein Vakuum in ihren
biologischen Eigenschaften verändert werden. Eine beispielsweise Ausführungsform
einer Anordnung mit Unterbringung des Objektes in freier Luft ist in Abb. 7 dargestellt.
Hierin bedeutet 13 wiederum die Glaswandung der Röhre, i..} eine aufgekittete Metallkappe,
die durch das Lenardfenster ig oder ein anderes strahlendurchlässiges Fenster in
bekannter `reise verschlossen ist, während 5 das auf dem Objektträger 6 angebrachte
Objekt und 7 das Objektiv des Mikroskops darstellt.